Composé fluorescent à l'état solide dans l'eau, procédé de synthèse etSolid state fluorescent compound in water, synthesis process and
utilisation dans des capteurs L'invention concerne des composés fluorescents utilisés dans de très nombreuses applications telle que la sécurité ou au sein de certains types de détecteurs d'explosifs. Ils sont également utilisés dans les biotechnologies comme marqueurs. The invention relates to fluorescent compounds used in many applications such as security or within certain types of explosive detectors. They are also used in biotechnology as markers.
II existe de nombreuses variétés de composés fluorescents (ou fluorophores). Certains sont fluorescents en solution dans l'eau. On peut par exemple citer la fluorescéine (utilisée comme marqueur en biologie ou encore en ophtalmologie) ou encore la famille des Rhodamines (utilisée comme colorant laser). D'autres sont solubles dans les solvants organiques (le (E)-stilbène utilisé lui aussi comme colorant laser par exemple). II est à noter cependant que la plupart des matériaux fluorescents en solution ne le sont pas ou très peu à l'état solide. En effet, lorsqu'ils se trouvent sous forme de matière condensée, il se forme la plupart du temps des dimères non-•fluorescents (excimères). De plus, les composés non solubles dans l'eau mais fluorescents à l'état solide voient en général leur fluorescence diminuer sérieusement, allant même jusqu'à disparaître, lorsqu'ils sont en contact avec de l'eau. Alors qu'en biologie et dans d'autres applications, l'utilisation de fluorophore à l'état solide pour des applications en milieu aqueux est très prometteuse. There are many varieties of fluorescent compounds (or fluorophores). Some are fluorescent in solution in water. For example, fluorescein (used as a marker in biology or in ophthalmology) or the Rhodamine family (used as a laser dye) may be mentioned. Others are soluble in organic solvents ((E) -stilbene also used as a laser dye for example). It should be noted, however, that most fluorescent materials in solution are not or very little in the solid state. In fact, when they are in the form of condensed matter, non-fluorescent (excimer) dimers are formed most of the time. In addition, non-water-soluble but solid-state fluorescent compounds generally see their fluorescence decrease substantially, and even disappear, when in contact with water. While in biology and other applications, the use of solid state fluorophore for aqueous applications is very promising.
En effet, il existe un réel besoin dans ces domaines et notamment des sociétés impliquées dans les biosenseurs ont exprimé le besoin de disposer de chromophores fluorescents à l'état solide dans l'eau. Dans ce contexte et pour répondre aux besoins exprimés ci-dessus, la présente invention a pour objet une nouvelle famille de composés fluorescents capables de conserver leur fluorescence lorsqu'ils se trouvent en dispersion dans l'eau ou au contact de l'eau et de rester stable chimiquement et photochimiquement au contact de l'eau. Un avantage supplémentaire de ces molécules fluorescentes à l'état solide est leur aptitude à amplifier la diminution de l'intensité de fluorescence 30 par effet d'antenne sur une distance au rayon de Foster ( quelques nanonmètres). 5 2 Plus précisément, l'invention a pour objet un composé fluorescent à l'état solide dans l'eau, à base de naphtalimide répondant à la formule chimique suivante : avec : R : une chaîne alkyl ou alkenyl, ramifiée ou non, ou un groupement 10 contenant un cycle aromatique ; RI, R2, R3, R4, R5 : des chaînes alkyl ramifiées ou non ou des atomes d'hydrogène. Le groupement R peut également comprendre une fonction réactive afin de permettre un greffage sur par exemple une subtance biologique 15 (ADN) ou d'une manière générale sur un transducteur. La fonction réactive peut être avantageusement choisie parmi les groupes suivants : alcool, amine, acide, uréthane, époxy, halogène. Selon une variante de l'invention, le composé de l'invention 20 comprend un groupement R allyl, des groupements R2, R3, R5 hydrogène et des groupements RI et R4 terbutyl. L'invention a aussi pour objet un procédé de fabrication d'un composé fluorescent à base de naphtalimide comprenant les étapes suivantes : 25 - la réaction d'un anhydride bromo-naphtalique ou chloronaphtalique) et d'une amine aromatique en présence d'acétate de zinc permettant d'obtenir un premier produit intermédiaire ( bromo ou chloro naphtalimide ) la réaction dudit produit intermédiaire avec une amine en présence de carbonate de potassium et de diméthyltétrahydropyrimidone (DMPU). Avantageusement la réaction de l'anhydride bromo-naphtalique ou 5 chloro-naphtalique et del' acétate de zinc est effectuée à température élevée voisine de 200 C. Avantageusement, après réaction de l'anhydride bromo-naphtalique ou chloro-naphtalique et de l'acétate de zinc, effectuée à température élevée voisine de 200 C, puis refroidissement , le produit ainsi obtenu est coulé 1 o dans de l'eau acide. 15 Avantageusement, après réaction dudit produit intermédiaire avec une amine en présence de carbonate de potassium et de diméthyltétrahydropyrimidone, puis refroidissement, le produit ainsi obtenu est coulé dans de l'eau acide. L'invention a également pour objet un capteur ou un biosenseur 20 comportant un composé selon l'invention. L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre donnée à titre non limitatif et grâce à la figure 1 qui illustre les principales étapes d'un exemple de synthèse d'un 25 composé selon l'invention. De manière générale, les composés selon l'invention permettent d'éviter la formation d'excimères (dimères à l'état excité, généralement non fluorescents) afin de conserver les propriétés de fluorescence à l'état solide. 30 En effet, pour éviter le II-stacking correspondant à l'empilement de composés aromatiques du fait d'interactions entre leurs orbitales n du groupement naphtalimide, un substituant encombrant (par exemple, un Avantageusement, la réaction dudit produit intermédiaire avec une carbonate de potassium et de est effectuée à une température voisine de amine en présence de diméthyltétrahyd ropyrimidone 80 C. 10 groupement 2,5-ddertiobutylphényl) est pour cela greffé sur l'atome d'azote de la fonction imide. La présence de l'amine secondaire sur le cycle aromatique permet de conserver la fluorescence en présence d'eau. L'invention va être décrite ci-après pour une famille particulièrement intéressante de composés à base de 1,8-naphtalimide répondant à la formule chimique suivante : H // \N R avec R une chaîne alkyl, alkényl ou aromatique, par exemple un groupe hexyl , RI, R4, étant des chaînes alkyl encombrées par exemple des groupes tertiobutyle ; 15 R2, R3, R5 étant des atomes d'hydrogène. Ces molécules sont stables chimiquement et photochimiquement. Elles ont une bonne tenue au flux pour éviter le photoblanchiment. L'emcombrement au niveau du groupement phényl permet d'éviter la formation d'excimères. 20 Elles peuvent posséder une fonction réactive, utile pour le greffage sur des molécules biologiques (ADN par exemple). Exemple de procédé de synthèse de composés selon l'invention 25 La synthèse comporte les 2 étapes suivantes illustrées en figure 1 : Etape 1 : Synthèse du 4-bromo-N-2,5ditertiobutylphenvl-1,8-naphtalimide 1 : A 25 g d'anhydride 4-bromo-1,8-naphthalique (0.09 mol) et 37 g de 2,5-ditertiobutylaniline (0,18 mol) en solution dans 125mL de quinoléine, sont ajoutés à température ambiante, 5,9 g d'acétate de zinc (0.027 mol). Le mélange réactionnel est chauffé à 210 C pendant 5 heures. 5 Après avoir refroidi à température ambiante, le milieu réactionnel est coulé dans 3 litres d'eau acide (HCI 1M). Le solide qui précipite est récupéré et rincé avec de l'eau puis séché sous vide. Le produit brut est ensuite purifié par chromatographie sur colonne 1 o avec pour éluant le toluène. Le produit est ensuite repurifié par recristallisation dans l'Ethanol. Un solide beige est récupéré (m=28,05 g, Rdt=65 %). Indeed, there is a real need in these areas and in particular companies involved in biosensors have expressed the need to have fluorescent chromophores in the solid state in water. In this context and to meet the needs expressed above, the subject of the present invention is a new family of fluorescent compounds capable of maintaining their fluorescence when they are dispersed in water or in contact with water and water. remain chemically and photochemically stable on contact with water. A further advantage of these solid-state fluorescent molecules is their ability to amplify the decrease in fluorescence intensity by antenna effect over a distance to Foster's radius (a few nanometers). More specifically, the subject of the invention is a solid-state fluorescent compound in water based on naphthalimide having the following chemical formula: with: R: an alkyl or alkenyl chain, branched or unbranched, or a group 10 containing an aromatic ring; R1, R2, R3, R4, R5: branched or unbranched alkyl chains or hydrogen atoms. The R group may also include a reactive function to allow grafting on eg biological substance (DNA) or generally on a transducer. The reactive function may advantageously be chosen from the following groups: alcohol, amine, acid, urethane, epoxy, halogen. According to a variant of the invention, the compound of the invention comprises a group R allyl, groups R2, R3, R5 hydrogen and groups R1 and R4 terbutyl. The invention also relates to a method of manufacturing a fluorescent compound based on naphthalimide comprising the following steps: - the reaction of a bromo-naphthalic or chloronaphthalic anhydride) and an aromatic amine in the presence of acetate zinc to obtain a first intermediate product (bromo or chloro naphthalimide) the reaction of said intermediate product with an amine in the presence of potassium carbonate and dimethyltetrahydropyrimidone (DMPU). Advantageously, the reaction of bromo-naphthalic or chloro-naphthalic anhydride and zinc acetate is carried out at an elevated temperature of about 200 C. Advantageously, after reaction of bromo-naphthalic or chloro-naphthalic anhydride and of zinc acetate, carried out at an elevated temperature of about 200 ° C., then cooling, the product thus obtained is poured into acidic water. Advantageously, after reaction of said intermediate product with an amine in the presence of potassium carbonate and dimethyltetrahydropyrimidone, followed by cooling, the product thus obtained is poured into acidic water. The invention also relates to a sensor or a biosensor comprising a compound according to the invention. The invention will be better understood and other advantages will become apparent on reading the following description given by way of non-limiting example and with reference to FIG. 1 which illustrates the main steps of an example of synthesis of a compound according to FIG. 'invention. In general, the compounds according to the invention make it possible to avoid the formation of excimers (dimers in the excited state, generally non-fluorescent) in order to preserve the fluorescence properties in the solid state. Indeed, to avoid the II-stacking corresponding to the stacking of aromatic compounds due to interactions between their n-orbitals of the naphthalimide group, a bulky substituent (for example, an Advantageously, the reaction of said intermediate product with a carbonate of potassium and is carried out at a temperature close to amine in the presence of dimethyltetrahydropyrimidone 80 C. 2,5-dertiobutylphenyl) group is for this grafted on the nitrogen atom of the imide function. The presence of the secondary amine on the aromatic ring makes it possible to preserve the fluorescence in the presence of water. The invention will be described hereinafter for a particularly interesting family of 1,8-naphthalimide-based compounds having the following chemical formula: ## STR2 ## with R an alkyl, alkenyl or aromatic chain, for example a group hexyl, R1, R4 being hindered alkyl chains, for example tert-butyl groups; R2, R3, R5 being hydrogen atoms. These molecules are chemically and photochemically stable. They have a good resistance to the flow to avoid photobleaching. The size at the phenyl group prevents the formation of excimer. They may have a reactive function useful for grafting on biological molecules (DNA for example). Example of Process for the Synthesis of Compounds According to the Invention The synthesis comprises the following 2 steps illustrated in FIG. 1: Step 1: Synthesis of 4-bromo-N-2,5-di-tert-butylphenyl-1,8-naphthalimide 1: A 25 g d 4-bromo-1,8-naphthalic anhydride (0.09 mol) and 37 g of 2,5-di-tert-butylaniline (0.18 mol) dissolved in 125 ml of quinoline are added at ambient temperature, 5.9 g of acetate. zinc (0.027 mol). The reaction mixture is heated at 210 ° C. for 5 hours. After cooling to room temperature, the reaction medium is poured into 3 liters of acidic water (1M HCl). The solid which precipitates is recovered and rinsed with water and then dried under vacuum. The crude product is then purified by column chromatography with toluene as eluent. The product is then repurified by recrystallization in ethanol. A beige solid is recovered (m = 28.05 g, yield = 65%).
Etape 2 : Synthèse du 4-(N-allyl)-N-2,5ditertiobutvlphenvl-1,8-naphthalimide 15 2 : A 4,64 g de 1 (10 mmol) et 1,71 g de N-allylamine (30 mmol) en solution dans 40 ml de DMPU sont ajoutés 1,38 g de carbonate de potassium (10 mmol). Le mélange réactionnel est ensuite chauffé à 80 C pendant 16 20 heures. Après avoir refroidi à température ambiante, le milieu réactionnel est coulé dans 1 L d'eau acide (HCI 1M). Le précipité jaune marron obtenu est ensuite récupéré par filtration, rincé et séché sous vide.Step 2: Synthesis of 4- (N-allyl) -N-2,5-ditertiobutylphenyl-1,8-naphthalimide 2: A 4.64 g of 1 (10 mmol) and 1.71 g of N-allylamine (30 mmol) ) in solution in 40 ml of DMPU are added 1.38 g of potassium carbonate (10 mmol). The reaction mixture is then heated at 80 ° C. for 16 hours. After cooling to room temperature, the reaction medium is poured into 1 L of acidic water (1M HCl). The brown yellow precipitate obtained is then recovered by filtration, rinsed and dried under vacuum.
25 Le produit brut est ensuite purifié par chromatographie sur colonne avec pour éluant le toluène. Un solide jaune orangé est récupéré (m=3,80 g, Rdt=86 %) Le composé obtenu est non soluble dans l'eau et sa durée de vie de 30 fluorescence n'est pas modifiée en milieu aqueux et présente un déclin biexponentiel. Les temps d'extinction sont les suivants : T = 0,89 ns pour 66% de fluorescence persistante T = 2,4 ns pour 16% de fluorescence persistante et ce aussi bien en absence qu'en présence d'eau.The crude product is then purified by column chromatography eluting with toluene. An orange-yellow solid is recovered (m = 3.80 g, Yield = 86%). The compound obtained is insoluble in water and its fluorescence lifetime is not modified in aqueous medium and has a biexponential decline. . The extinction times are as follows: T = 0.89 ns for 66% of persistent fluorescence T = 2.4 ns for 16% of persistent fluorescence, both in the absence and in the presence of water.
5 Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission sont dans le visible, respectivement Xabs= 441 nm, et lem= 556nm. 10The excitation and emission wavelengths are in the visible, respectively Xabs = 441 nm, and lem = 556 nm. 10