FR2908786A1

FR2908786A1 - Kit for specific detection of yeast contamination of a harvest product by Brettanomyces, by a real time polymerized-chain-reaction amplification test with specific primer sequences of a DNA sequence of virulent strains of Brettanomyces

Info

Publication number: FR2908786A1
Application number: FR0610103A
Authority: FR
Inventors: Henry Roy
Original assignee: PREDEL SARL
Current assignee: PREDEL SARL
Priority date: 2006-11-17
Filing date: 2006-11-17
Publication date: 2008-05-23

Abstract

Kit for specific detection of yeast contamination of a harvest product by Brettanomyces, comprising a test by real time polymerized-chain-reaction amplification, with specific primer sequences of a DNA sequence of at least one of the most virulent strains of Brettanomyces hardly susceptible to develop in the wine medium.

Description

1 KIT DE DETECTION DE BRETTANOMYCES POUR L'OENOLOGIE La présente invention1 BRETTANOMYCES DETECTION KIT FOR OENOLOGY The present invention

se rapporte à un système pour la détection d'une contamination levurienne par Brettanomyces d'un produit issu de la vendange, en vu de maîtriser le caractère phénolé dans le vin. La viticulture est sans cesse à la recherche d'une meilleure maîtrise de la qualité 5 de ses vins. En effet, le vin peut subir des attaques, en particulier d'origine microbiologique, qui altèrent sa qualité et son goût. Certaines levures notamment sont susceptibles d'altérer le vin, on peut citer en particulier les Brettanomyces. Ces Brettanomyces peuvent engendrer d'importantes modifications gustatives et olfactives. En particulier elles 10 induisent des goûts et arômes prononcés de type animal ou cuir qui masquent la typicité aromatique du vin et déprécient sa qualité gustative. Les composés produits par les Brettanomyces responsables de ce caractère dit phénolé sont des éthyl-phénols et des éthyl-gaïacols. Dans les cas les plus graves, l'arôme est très fortement modifié et le vin devient inconsommable. 15 Les Brettanomyces peuvent se développer au cours de n'importe quelle étape de la fabrication du vin : sur la vigne, pendant la vendange, au niveau des moûts, des jus, pendant l'élevage, etc., la période la plus critique se situant généralement entre la fin de la fermentation alcoolique et la fermentation malolactique. Leur présence entraîne la perte de lots et de revenus pour les viticulteurs et peuvent 20 également avoir un impact sur leur image, en particulier pour les grands crus. Il est très difficile de prévenir une contamination par Brettanomyces, et ce malgré de bonnes mesures d'hygiène. Elles sont résistantes au 502, dépendantes de divers facteurs, comme le pH et la température par exemple, et peuvent se 2908786 2 développer en anaérobiose même sur des vins ayant achevé complètement leurs fermentations. Seule la détection précoce du développement des Brettanomyces permet d'agir au bon moment, en mettant en place des mesures correctives et une méthode de désinfection adaptée. En effet, il existe bien des moyens pour lutter contre les Brettanomyces mais il faut pouvoir les mettre en pratique au plus tôt car si la multiplication est déjà fortement engagée, le succès du traitement risque d'être compromis et il y aura un retentissement sur la qualité du vin. Il est donc nécessaire de faire un suivi très strict et d'effectuer des analyses ICI régulières, mais la présence des Brettanomyces dans le vin est difficile à surveiller. Actuellement la méthode de détection principale s'effectue en laboratoire qui demande des délais de l'ordre d'une semaine au moins et engendre des coûts inadaptés à une détection préventive. 15 Il existe également une méthode de dénombrement microbiologique sous forme de kit prêt à l'emploi mais il ne s'agit que d'une simple mise en évidence sur un milieu gélosé. La détection suppose des concentrations très importantes de Brettanomyces dans l'échantillon, et le milieu n'est pas sélectif : le screening est très large et les résultats très peu précis. Une confusion est aisée entre les 20 Brettanomyces et les autres micro-organismes levuriens en général. De plus, l'analyse demande là aussi un délai de 7 à 8 jours ce qui est beaucoup trop long car passé un certain stade, la contamination par les Brettanomyces peut s'avérer trop importante pour une éventuelle cure. Enfin, il est possible d'avoir recours à la biologie moléculaire, mais les techniques 25 utilisées actuellement sont coûteuses, peu sensibles, non quantitatives et ne permettent pas de distinguer précisément la présence des germes morts ou vivants. 2908786 3 Il subsiste donc un besoin pour un système de détection préventive des Brettanomyces pour le milieu de l'cenologie, facile à mettre en oeuvre et rapide, permettant aux établissements vinicoles et producteurs d'établir un suivi régulier pour un diagnostic précoce et précis de la contamination et de se situer 5 par rapport au risque d'apparition d'un défaut détectable à la dégustation. Aussi, la présente invention vise à répondre à ce besoin en proposant un moyen pour une détection sélective simple, rapide et reproductible permettant de détecter les Brettanomyces dans le vin. A cet effet, l'invention a pour objet un kit pour la détection spécifique d'une contamination levurienne par Brettanomyces d'un produit issu de la vendange, qui intègre des moyens de détection déterminés à partir des caractéristiques d'au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. L'invention est notamment basée sur le fait que si une telle souche, virulente, 15 ayant des difficultés à se développer est détectée à un seuil donné, la propension d'avoir une cuvée agressée par des Brettanomyces est grande. Par produit issu de la vendange on entend tout produit, de la récolte du raisin frais ou du jus de raisin jusqu'à la mise en bouteille du vin, quel que soit le stade de traitement : égrappage, éraf lage. et foulage, mise en cuve, fermentation 20 alcoolique, écoulage et pressurage, débourbage, fermentation malolactique, élevage, conservation et mise en bouteille. Les moyens de détection du kit selon l'invention sont réalisés à partir des caractéristiques d'au moins une des souches de Brettanomyces qui à la fois : - poussent le plus difficilement dans le milieu du vin, et 25 - sont les plus virulentes c'est-à-dire qui produisent le plus de phénols et présentent les plus mauvais arômes dans le vin. Ce choix confère une grande sélectivité au kit de détection. La détection d'au moins une des souches se développant difficilement dans le milieu du vin implique 2908786 4 la détection des autres souches. De plus ces souches étant également les plus néfastes pour la qualité du vin, le test est notamment spécifique des Brettanomyces présentant de forts risques d'apparition d'un défaut détectable à la dégustation. 5 Parmi les souches de Brettanomyces répondant aux critères de choix selon la présente invention on connaît notamment : Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces intermedius, Brettanomyces lambicus, Brettanomyces anomala, Brettanomyces custerii. Parmi les souches de Brettanomyces répondant spécialement bien aux critères 10 de choix selon la présente invention, on peut citer en particulier les souches de type Bruxellensis et de type Anomala. De manière préférentielle, les moyens de détection sont déterminés à partir des caractéristiques des souches de Brettanomyces bruxellensis CB12 et/ou CB63 et/ou CB28 dont le profil génétique est représenté sur les figures 2A à 2C. relates to a system for the detection of a yeast contamination by Brettanomyces of a product resulting from the harvest, in order to control the phenol character in the wine. Viticulture is constantly looking for better control of the quality of its wines. Indeed, the wine can undergo attacks, in particular of microbiological origin, which alter its quality and its taste. Some yeasts are particularly likely to alter the wine, we can mention in particular the Brettanomyces. These Brettanomyces can cause important taste and odor modifications. In particular, they induce pronounced tastes and aromas of animal or leather type which mask the aromatic character of the wine and depreciate its taste quality. The compounds produced by Brettanomyces responsible for this so-called phenol character are ethyl phenols and ethyl guaiacols. In the most serious cases, the aroma is very strongly modified and the wine becomes unconscious. Brettanomyces can develop during any stage of wine making: on the vine, during the harvest, at the level of musts, juices, during aging, etc., the most critical period occurs. generally lying between the end of the alcoholic fermentation and the malolactic fermentation. Their presence leads to the loss of lots and income for the winemakers and can also have an impact on their image, especially for the grands crus. It is very difficult to prevent Brettanomyces contamination, despite good hygiene measures. They are resistant to 502, dependent on various factors, such as pH and temperature for example, and can develop anaerobically even on wines having completely completed their fermentations. Only the early detection of the development of Brettanomyces makes it possible to act at the right moment, by putting in place corrective measures and a suitable method of disinfection. Indeed, there are many ways to fight against Brettanomyces but it must be put into practice at the earliest because if the multiplication is already strongly committed, the success of treatment may be compromised and there will be a repercussion on the wine quality. It is therefore necessary to follow very strict and to perform regular ICI tests, but the presence of Brettanomyces in the wine is difficult to monitor. Currently the main detection method is carried out in the laboratory which requires delays of the order of at least one week and generates costs unsuitable for preventive detection. There is also a microbiological count method in the form of a ready-to-use kit, but it is only a simple demonstration on an agar medium. The detection assumes very high concentrations of Brettanomyces in the sample, and the medium is not selective: the screening is very wide and the results very inaccurate. There is easy confusion between Brettanomyces and other yeast microorganisms in general. In addition, the analysis also requires a delay of 7 to 8 days which is much too long because past a certain stage, contamination by Brettanomyces may be too important for a possible cure. Finally, it is possible to resort to molecular biology, but the techniques currently used are expensive, insensitive, non-quantitative and do not allow to distinguish accurately the presence of dead or living germs. There is therefore a need for a rapid, easy-to-implement and rapid Brettanomyces detection system for the Cen- terland environment, allowing wineries and producers to establish regular monitoring for early and accurate diagnosis of contamination and to be situated 5 with respect to the risk of occurrence of a detectable defect in the tasting. Also, the present invention aims to meet this need by providing a means for a simple, fast and reproducible selective detection for detecting Brettanomyces in wine. For this purpose, the subject of the invention is a kit for the specific detection of yeast contamination by Brettanomyces of a product derived from the harvest, which incorporates detection means determined from the characteristics of at least one of the strains. the most virulent of Brettanomyces hardly susceptible to develop in the middle of the wine. In particular, the invention is based on the fact that if such a strain, virulent, having difficulties in developing, is detected at a given threshold, the propensity to have a cuvée attacked by Brettanomyces is great. By product from the harvest is meant any product, from the harvest of fresh grapes or grape juice to the bottling of the wine, whatever the stage of treatment: destemming, scraping. and crushing, bottling, alcoholic fermentation, draining and pressing, settling, malolactic fermentation, aging, storage and bottling. The detection means of the kit according to the invention are made from the characteristics of at least one of the strains of Brettanomyces which both: - grow the most difficult in the middle of the wine, and 25 - are the most virulent c ' that is to say that produce the most phenols and have the worst aromas in the wine. This choice confers a great selectivity to the detection kit. The detection of at least one of the strains developing with difficulty in the middle of the wine involves the detection of the other strains. In addition, these strains are also the most detrimental to the quality of the wine, the test is particularly specific Brettanomyces with high risk of appearance of a detectable defect in the tasting. Among the Brettanomyces strains meeting the selection criteria according to the present invention, there are notably known: Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces intermedius, Brettanomyces lambicus, Brettanomyces anomala, Brettanomyces custerii. Among the Brettanomyces strains which respond especially well to the selection criteria according to the present invention, mention may in particular be made of the Bruxellensis and Anomala type strains. Preferably, the detection means are determined from the characteristics of the strains of Brettanomyces bruxellensis CB12 and / or CB63 and / or CB28 whose genetic profile is represented in FIGS. 2A to 2C.

Le kit de détection selon l'invention peut se présenter sous différentes formes. Un modèle préférentiel du kit de détection selon l'invention se présente sous la forme d'un test par filtration d'un échantillon du produit susceptible d'être contaminé par Brettanomyces, avec un milieu de culture réalisé à partir des caractéristiques d'au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. Un deuxième modèle préférentiel du kit de détection selon l'invention se présente sous la forme d'un test immuno-enzymatique réalisé avec un anticorps capable de reconnaître au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. The detection kit according to the invention can be in different forms. A preferred model of the detection kit according to the invention is in the form of a test by filtration of a sample of the product likely to be contaminated by Brettanomyces, with a culture medium made from the characteristics of at least one of the most virulent strains of Brettanomyces hardly susceptible to develop in the middle of the wine. A second preferred model of the detection kit according to the invention is in the form of an immunoenzymatic test carried out with an antibody capable of recognizing at least one of the most virulent strains of Brettanomyces which are difficult to develop in the medium of wine.

Un troisième modèle préférentiel du kit de détection selon l'invention se présente sous la forme d'un test par Amplification en Chaîne par Polymérisation en temps réel réalisé avec des séquences d'amorce spécifiques d'une séquence 2908786 5 d'ADN d'au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. Le kit de détection selon l'invention est facile d'utilisation, et permet de détecter en moins de 48 heures, et de façon très sélective et très sensible la 5 présence de Brettanomyces dans le produit issu de la vendange quel que soit le stade de traitement. Avantageusement, le kit de détection selon l'invention permet aux producteurs de réaliser les analyses de détection de Brettanomyces par eux-mêmes ce qui, outre la fiabilité et la rapidité d'analyse, présente un grand intérêt en terme de 10 rentabilité et d'économie. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description qui va suivre de l'invention, description donnée à titre d'exemple uniquement en regard de trois modèles de forme du kit de détection et des figures annexées sur lesquelles : 15 - la figure 1 représente un exemple de résultat obtenu avec le modèle 1, - la figure 2A représente le profil génétique de la souche de Brettanomyces bruxellensis CB12 obtenu après digestion par l'enzyme Notl et migration dans un gel d'électrophorèse en champ pulsé, -la figure 2B représente le profil génétique de la souche de Brettanomyces 20 bruxellensis CB63 obtenu après digestion par l'enzyme Notl et migration dans un gel d'électrophorèse en champ pulsé, et - la figure 2C représente le profil génétique de la souche de Brettanomyces bruxellensis CB28 obtenu après digestion par l'enzyme Notl et migration dans un gel d'électrophorèse en champ pulsé. 25 1. Modèle 1 : kit sous la forme d'un média filtrant Selon une première variante, le kit de détection se présente sous forme d'un test par filtration sur média avec un milieu de culture particulier, pour filtrer un 2908786 6 échantillon d'un produit issu de la vendange susceptible d'être contaminé par Brettanomyces. La filtration sur média est une technique qui permet de séparer un liquide des microorganismes qu'il contient à l'aide d'un appareillage de filtration. Le média 5 agit comme un filtre très spécifique qui laisse passer le liquide et retient les microorganismes quantitativement à sa surface. En utilisant des milieux de culture particuliers on peut identifier et dénombrer une ou plusieurs souches microbiennes particulières. Le milieu de culture selon l'invention est un milieu qui permet l'identification et le 10 dénombrement spécifique des Brettanomyces, en particulier des Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Le milieu de culture selon l'invention présente un pH basique compris entre 7 et 10. Préférentiellement, il présente un pH compris entre 7,5 et 8,5. A third preferred model of the detection kit according to the invention is in the form of a real-time polymerase chain reaction test carried out with primer sequences specific for a DNA sequence of least one of the most virulent strains of Brettanomyces hardly susceptible to develop in the middle of the wine. The detection kit according to the invention is easy to use, and makes it possible to detect in less than 48 hours, and in a very selective and very sensitive manner, the presence of Brettanomyces in the product resulting from the harvest whatever the stage of production. treatment. Advantageously, the detection kit according to the invention enables the producers to carry out the Brettanomyces detection analyzes by themselves which, in addition to the reliability and speed of analysis, is of great interest in terms of profitability and efficiency. economy. Other features and advantages will become apparent from the following description of the invention, a description given by way of example only with regard to three shape models of the detection kit and the appended figures in which: FIG. an example of a result obtained with model 1; FIG. 2A represents the genetic profile of the strain of Brettanomyces bruxellensis CB12 obtained after digestion with the NotI enzyme and migration in a pulsed field gel electrophoresis gel; FIG. the genetic profile of the strain Brettanomyces bruxellensis CB63 obtained after digestion with the NotI enzyme and migration in a pulsed field gel electrophoresis, and - Figure 2C represents the genetic profile of the strain of Brettanomyces bruxellensis CB28 obtained after digestion by the NotI enzyme and migration in a pulsed field gel electrophoresis. 1. Model 1: kit in the form of a filter medium According to a first variant, the detection kit is in the form of a test by filtration with a medium with a particular culture medium, to filter a sample of a sample. a product from the harvest likely to be contaminated by Brettanomyces. Media filtration is a technique that separates a liquid from the microorganisms it contains using filtration equipment. Media 5 acts as a very specific filter that lets the liquid through and retains microorganisms quantitatively on its surface. Using particular culture media, one or more particular microbial strains can be identified and counted. The culture medium according to the invention is a medium which allows the identification and the specific counting of Brettanomyces, in particular Brettanomyces likely to contaminate a product resulting from the harvest. The culture medium according to the invention has a basic pH of between 7 and 10. Preferably, it has a pH of between 7.5 and 8.5.

15 La présence de Brettanomyces au niveau de ce milieu de culture basique provoque une acidification . Cette diminution de pH, indicateur de la présence de colonies de Brettanomyces, se traduit visuellement par un changement de couleur claire, caractéristique au niveau du milieu de culture, comme illustré sur la figure 1.The presence of Brettanomyces at this basic culture medium causes acidification. This decrease in pH, an indicator of the presence of Brettanomyces colonies, results visually in a clear color change, characteristic at the level of the culture medium, as illustrated in FIG.

20 Le système tampon et le pH du milieu de culture sont optimisés pour la meilleure détection possible des Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Ils sont déterminés pour la détection d'au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. En particulier, ils sont déterminés pour la détection des 25 souches de Brettanomyces CB28 et/ou CB63 et/ou CB12. Selon un mode de réalisation permettant une détection optimisée des Brettanomyces selon l'invention, le milieu de culture contient notamment : 2908786 7 - entre 0,1 et 0,2 g de KH2PO4, - une quantité de NaOH ajustée par rapport au KH2PO4 pour obtenir un pH compris entre 7,5 et 8,5, - entre 5 et 20 g de Glucose, et 5 - entre 5 et 30 q de Thiamine. Le milieu de culture selon l'invention est préférentiellement un milieu sélectif prêt à l'emploi. Il peut se présenter sous différentes formes notamment sous forme d'un milieu gélosé pré coulé ou prêt à couler, ou sous forme d'un milieu prédisposé et pré imprégné sur cartons déshydratés à réhydrater avec de l'eau 1Ci stérile (milieu NKS) ou sous forme liquide en flacons. De manière préférentielle, le milieu de culture est un NKS, la présence de Brettanomyces se traduisant visuellement par l'apparition d'unités formantes de colonies de couleur jaune. Ce milieu de culture est très spécifique des Brettanomyces.The buffer system and the pH of the culture medium are optimized for the best possible detection of Brettanomyces likely to contaminate a product resulting from the harvest. They are determined for the detection of at least one of the most virulent strains of Brettanomyces difficult to develop in the wine environment. In particular, they are determined for the detection of Brettanomyces strains CB28 and / or CB63 and / or CB12. According to one embodiment allowing optimized detection of Brettanomyces according to the invention, the culture medium contains in particular: between 0.1 and 0.2 g of KH 2 PO 4, an amount of NaOH adjusted with respect to KH 2 PO 4 to obtain a pH between 7.5 and 8.5, between 5 and 20 g of Glucose, and between 5 and 30 g of Thiamine. The culture medium according to the invention is preferably a ready-to-use selective medium. It may be in various forms, in particular in the form of a pre-poured or ready-to-flow agar medium, or in the form of a predisposed and pre-impregnated medium on dehydrated cartons to be rehydrated with sterile 1Ci water (NKS medium) or in liquid form in flasks. Preferably, the culture medium is a NKS, the presence of Brettanomyces being visually reflected by the appearance of forming units of yellow colonies. This culture medium is very specific to Brettanomyces.

15 Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, pour augmenter la sélectivité du milieu de culture on peut également y inclure des inhibiteurs des autres souches microbiennes présentes dans le milieu du vin, telles Saccharomyces par exemple. Le milieu de culture selon l'invention présente l'avantage d'être sensible et 2,0 spécifique. Il est simple d'utilisation et permet d'obtenir des résultats entre 24 et 48 heures après mise en culture. L'analyse s'effectue par simple observation du milieu de culture : il suffit de dénombrer le nombre d'unités formantes de colonies de couleur spécifique de la présence de Brettanomyces.According to a particular embodiment of the invention, to increase the selectivity of the culture medium can also include inhibitors of other microbial strains present in the middle of the wine, such as Saccharomyces for example. The culture medium according to the invention has the advantage of being sensitive and 2.0 specific. It is easy to use and provides results between 24 and 48 hours after culture. The analysis is carried out by simple observation of the culture medium: it is sufficient to count the number of colony forming units specific to the presence of Brettanomyces.

25 Ce premier modèle de kit de détection de Brettanomyces selon l'invention est donc facile et rapide d'utilisation. 2908786 8 2. Modèle 2 : kit sous la forme d'un test immuno-enzymatique Selon une deuxième variante, le kit de détection selon l'invention se présente sous forme d'un test immuno-enzymatique. Le test immuno-enzymatique ou ELISA (Enzyme-linked Immuno5orbent Assay) 5 permet de détecter et doser un micro-organisme dans un liquide. Il est basé sur l'utilisation combinée d'anticorps dont l'objectif est de fixer le micro-organisme et d'anticorps qui portent le système de mesure. Le test immuno-enzymatique selon l'invention est un test ELISA dit sandwich , qui permet l'identification et la quantification spécifique des 10 Brettanomyces, en particulier des Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Le kit se présente sous forme d'une microplaque pré-coatée prête à l'emploi. Les puits de la microplaque sont tapissés avec un anticorps de capture capable de lier spécifiquement l'antigène recherché spécifique de la présence de 15 Brettanomyces, en particulier de Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Lors de cette opération, appelée coating , l'anticorps de capture se fixe au plastique des puits par interactions électrostatiques. L'échantillon du produit issu de la vendange à tester est ensuite déposé dans les 20 puits de la microplaque et si l'antigène recherché, caractéristique de la présence de Brettanomyces, est présent, il se lie spécifiquement à l'anticorps de capture. Un deuxième anticorps, l'anticorps traceur, capable de se lier à l'antigène capturé est alors ajouté dans le puits. Cet anticorps traceur est couplé à une enzyme catalysant la formation d'un produit coloré. La réaction peut ainsi ensuite 25 être quantifiée par colorimétrie. C'est l'anticorps de capture qui assure la spécificité du test ELISA. Selon l'invention, on utilise des anticorps de capture capables de reconnaître spécifiquement des souches de levures appartenant au genre Brettanomyces.This first model of Brettanomyces detection kit according to the invention is therefore easy and fast to use. 2. Model 2: Kit in the form of an enzyme immunoassay According to a second variant, the detection kit according to the invention is in the form of an immunoenzymatic test. Enzyme-linked Immuno5orbent Assay (ELISA) 5 is used to detect and assay a microorganism in a liquid. It is based on the combined use of antibodies whose purpose is to fix the microorganism and antibodies that carry the measurement system. The enzyme immunoassay according to the invention is a so-called sandwich ELISA, which allows the identification and specific quantification of Brettanomyces, in particular Brettanomyces, which may contaminate a product derived from the harvest. The kit is in the form of a pre-coated microplate ready for use. The wells of the microplate are lined with a capture antibody capable of specifically binding the targeted antigen specific to the presence of Brettanomyces, in particular Brettanomyces, which may contaminate a product derived from the harvest. During this operation, called coating, the capture antibody binds to the plastic of the wells by electrostatic interactions. The sample of the product from the harvest to be tested is then deposited in the 20 wells of the microplate and if the desired antigen, characteristic of the presence of Brettanomyces, is present, it specifically binds to the capture antibody. A second antibody, the tracer antibody, capable of binding to the captured antigen is then added to the well. This tracer antibody is coupled to an enzyme catalyzing the formation of a colored product. The reaction can then be quantified by colorimetry. It is the capture antibody that ensures the specificity of the ELISA test. According to the invention, capture antibodies capable of specifically recognizing yeast strains belonging to the genus Brettanomyces are used.

2908786 9 En particulier, on utilise des anticorps de capture capables de reconnaître spécifiquement au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. De manière préférentielle, on utilise des anticorps de capture capables de reconnaître spécifiquement les souches de Brettanomyces CB28 et/ou CB63 et/ou CB12. Le procédé d'obtention des anticorps de capture spécifique des Brettanomyces selon l'invention comprend les étapes suivantes : -préparation des immunogènes : des cellules de Brettanomyces, 10 préférentiellement des souches CB28 et/ou CB63, sont cultivées soit dans les conditions naturelles de contamination, à savoir du vin, soit dans un milieu contenant un extrait de malt. On utilise ensuite en tant qu'immunogènes soit les cellules entières telles quelles non traitées, soit les cellules entières mortes, tuées par chaleur, soit des extraits de 15 membranes de cellules. - immunisation d'un animal : on injecte les immunogènes à l'animal, de préférence une souris. Après plusieurs injections on récupère le sang de l'animal immunisé et on teste l'antisérum récupéré. - production des anticorps monoclonaux : des cellules de la rate de 20 l'animal immunisé sont mélangées avec une lignée de cellules de miscellium, puis fusionnées. Les cellules sont ensuite cultivées et 12 jours après la fusion, les surnageants de la culture cellulaire sont prélevés de manière à récupérer les anticorps anti-Brettanomyces. Ce sont ensuite ces anticorps qui sont utilisés pour le test immuno-enzymatique 25 selon l'invention. Ces anticorps sont spécifiques des Brettanomyces, en particulier des Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Ils ne 2908786 10 détectent pas les autres souches le.vuriennes présentes dans le milieu du vin, telles que Saccharomyces par exemple. Le test immuno-enzymatique selon "invention présente donc l'avantage d'être sensible et spécifique.In particular, capture antibodies capable of specifically recognizing at least one of the most virulent strains of Brettanomyces that are difficult to develop in the wine medium are used. Preferably, capture antibodies capable of specifically recognizing the strains of Brettanomyces CB28 and / or CB63 and / or CB12 are used. The process for obtaining the Brettanomyces-specific capture antibodies according to the invention comprises the following steps: preparation of the immunogens: Brettanomyces cells, preferably CB28 and / or CB63 strains, are cultured either under the natural conditions of contamination. , namely wine, or in a medium containing a malt extract. Immunogens are then used either whole cells as they are untreated, dead whole cells killed by heat, or cell membrane extracts. immunization of an animal: the immunogens are injected into the animal, preferably a mouse. After several injections, the blood of the immunized animal is recovered and the recovered antiserum is tested. Production of Monoclonal Antibodies: Spleen cells from the immunized animal are mixed with a miscellium cell line and then fused. The cells are then cultured and 12 days after the fusion, the supernatants of the cell culture are removed so as to recover the anti-Brettanomyces antibodies. These antibodies are then used for the immunoassay according to the invention. These antibodies are specific for Brettanomyces, in particular Brettanomyces, which may contaminate a product resulting from the harvest. They do not detect the other LeVurian strains present in the wine milieu, such as Saccharomyces, for example. The immunoenzymatic test according to the invention therefore has the advantage of being sensitive and specific.

5 Ce deuxième modèle de kit de détection selon l'invention est simple d'utilisation et rapide : il permet d'obtenir des résultats en moins de quatre heures. L'analyse des résultats pour la quantification par colorimétrie peut être effectuée automatiquement à l'aide de logiciel informatique qui évalue l'intensité de la coloration obtenue dans les différents puits. L'analyse peut être réalisée 10 par visualisation optique directe. 3. Modèle 3 : kit sous la forme d'un test par PCR quantitative Selon une troisième variante, le kit de détection selon l'invention se présente sous la forme d'un test par Amplification en Chaîne par Polymérisation (PCR pour 15 Polymerase Chain Reaction) en temps réel. La PCR est une technique de réplication in vitro qui permet d'obtenir d'importantes quantités d'une séquence spécifique d'ADN à partir d'une quantité initiale très faible. Chaque réaction de réplication met en oeuvre deux amorces oligonucléotidiques 20 qui définissent, en la bornant, la séquence d'ADN à amplifier. L'amplification de l'ADN est réalisée par cycles successifs qui comprennent trois étapes : dénaturation, hybridation et extension. C'est la séquence d'amorce qui assure la spécificité du test. La PCR en temps réel est une amélioration de la PCR classique, qui permet 25 d'obtenir des résultats quantitatifs et d'estimer la quantité d'ADN initial. Elle consiste à mesurer la quantité d'ADN polymérisée à chaque cycle de réplication par fluorescence.This second model of detection kit according to the invention is easy to use and fast: it provides results in less than four hours. The analysis of the results for the colorimetric quantification can be performed automatically using computer software that evaluates the intensity of the coloration obtained in the different wells. The analysis can be performed by direct optical display. 3. Model 3: kit in the form of a quantitative PCR test According to a third variant, the detection kit according to the invention is in the form of a chain amplification polymerization test (PCR for Polymerase Chain Reaction) in real time. PCR is an in vitro replication technique that yields large amounts of a specific DNA sequence from a very small initial amount. Each replication reaction uses two oligonucleotide primers which define, by limiting it, the DNA sequence to be amplified. The amplification of the DNA is carried out in successive cycles which comprise three steps: denaturation, hybridization and extension. It is the primer sequence that ensures the specificity of the test. Real-time PCR is an improvement of conventional PCR, which allows quantitative results to be obtained and the amount of initial DNA to be estimated. It consists of measuring the amount of DNA polymerized during each fluorescence replication cycle.

2908786 11 Le test par Amplification en Chaîne par Polymérase selon l'invention est une PCR en temps réel qui permet d'obtenir des résultats quantitatifs sur une séquence d'ADN spécifique des Brettanomyces, en particulier des Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Il permet de détecter 5 la présence de Brettanomyces dans un produit issu de la vendange en déterminant la quantité d'ADN spécifique des Brettanomyces présente initialement dans un échantillon dudit produit. Pour réaliser la PCR selon l'invention, on utilise des séquences d'amorces spécifiques d'une séquence d'ADN d'au moins une des souches les plus virulentes 10 de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. De manière préférentielle, on utilise des séquences d'amorces spécifiques d'une séquence d'ADN des souches de Brettanomyces CB28 et/ou CB63 et/ou CB12. Selon une caractéristique de l'invention les séquences d'amorce utilisées sont 15 relativement longues. Leur taille est supérieure à 15 paires de bases. Préférentiellement, leur taille est comprise entre 16 et 30 paires de bases. Le procédé de réalisation de la PCR spécifique des Brettanomyces selon l'invention consiste dans un premier temps à introduire dans un tube notamment : - un échantillon d'un produit issu de la vendange à analyser 20 ou l'ADN extrait de cette échantillon, - des amorces selon l'invention spécifiques d'une séquence d'ADN d'au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin, 25 - de l'ADN polymérase, et - un mélange des quatre désoxyribonucéotides constitutifs de l'ADN. Préférentiellement on utilise directement l'échantillon, sans extraction de l'ADN.The Polymerase Chain Amplification Test according to the invention is a real-time PCR which makes it possible to obtain quantitative results on a Brettanomyces-specific DNA sequence, in particular Brettanomyces, which may contaminate a product derived from the vintage. It makes it possible to detect the presence of Brettanomyces in a product resulting from the harvest by determining the amount of Brettanomyces-specific DNA initially present in a sample of said product. To carry out the PCR according to the invention, primer sequences specific for a DNA sequence of at least one of the most virulent strains of Brettanomyces that are difficult to develop in the wine medium are used. Preferably, primer sequences specific for a DNA sequence of Brettanomyces strains CB28 and / or CB63 and / or CB12 are used. According to one characteristic of the invention, the primer sequences used are relatively long. Their size is greater than 15 base pairs. Preferably, their size is between 16 and 30 base pairs. The method for producing the Brettanomyces-specific PCR according to the invention consists first of introducing into a tube in particular: a sample of a product resulting from the harvest to be analyzed or the DNA extracted from this sample; primers according to the invention which are specific for a DNA sequence of at least one of the most virulent strains of Brettanomyces which are difficult to develop in the medium of wine, - DNA polymerase, and - a mixture of four deoxyribonucleotides constituting the DNA. Preferably, the sample is used directly, without extraction of the DNA.

2908786 12 Le tube est ensuite placé dans un thermocycleur où sont réalisés les cycles successifs de réplication. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les conditions de la PCR sont les suivantes : -on réalise une première phase de dénaturation pendant 1 minute à 94 C, puis - on réalise 35 fois le cycle suivant : • dénaturation pendant 30 secondes à 94 C, • hybridation pendant 1 minute à 55 C, et • élongation pendant 30 secondes à 72 C, - et enfin on réalise une élongation pendant 5 minutes à 72 C. Pour la fluorescence, la PCR en temps réel selon l'invention utilise préférentiellement une sonde dite Taqman , spécifique d'une séquence interne 15 au fragment d'ADN amplifié. La fluorescence peut également être obtenue à l'aide d'un colorant telle que SYBRGreen . L'analyse des résultats s'effectue par mesure de fluorescence, l'intensité de l'émission de la fluorescence étant proportionnelle au nombre de fragments 20 d'ADN présents correspondants à la séquence à identifier. Les séquences d'amorces selon l'invention sont spécifiques des Brettanomyces, en particulier des Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Elles ne permettent pas d'amplifier par PCR les autres souches microbiennes présentes dans le milieu du vin, telles que Saccharomyces par 25 exemple. Ce troisième modèle de kit de détection selon l'invention présente donc l'avantage d'être sensible et spécifique.The tube is then placed in a thermal cycler where successive cycles of replication are performed. According to a particular embodiment of the invention, the PCR conditions are as follows: a first denaturation phase is carried out for 1 minute at 94 ° C., and then the following cycle is carried out 35 times: denaturation for 30 seconds at 94 ° C., hybridization for 1 minute at 55 ° C., and elongation for 30 seconds at 72 ° C., and finally elongation for 5 minutes at 72 ° C. For fluorescence, the real-time PCR according to the invention preferably uses a so-called Taqman probe, specific for a sequence internal to the amplified DNA fragment. The fluorescence can also be obtained using a dye such as SYBRGreen. The analysis of the results is carried out by fluorescence measurement, the intensity of the emission of the fluorescence being proportional to the number of DNA fragments present corresponding to the sequence to be identified. The primer sequences according to the invention are specific for Brettanomyces, in particular Brettanomyces, which may contaminate a product derived from the harvest. They do not make it possible to amplify by PCR the other microbial strains present in the wine medium, such as Saccharomyces for example. This third model of detection kit according to the invention therefore has the advantage of being sensitive and specific.

5 10 2908786 13 Le test est rapide à mettre en oeuvre et permet d'obtenir des résultats en moins de 4 heures. Bien entendu, l'invention n'est évidemment pas limitée aux modèles de réalisation 5 représentés et décrits ci-dessus, mais en couvre au contraire toutes les variantes.The test is rapid to carry out and allows results to be obtained in less than 4 hours. Of course, the invention is obviously not limited to the embodiments 5 shown and described above, but covers all variants.

Claims

1. Kit for the specific detection of yeast contamination by Brettanomyces of a product resulting from the harvest whatever the stage of treatment, characterized in that it integrates detection means comprising a Chain Amplification by polymerization test in real time, with primer sequences specific for a DNA sequence of at least one of the most virulent strains of Brettanomyces difficult to develop in the wine environment.

2. Kit according to claim 1, characterized in that the strains or the most virulent Brettanomyces difficult to develop in the middle of the wine are selected from the strains of Brettanomyces CB28 and / or CB63 and / or CB12.