FR2902440A1 - METHOD OF DETECTING AND DETECTING CELLS IN CYTODIERESE - Google Patents

METHOD OF DETECTING AND DETECTING CELLS IN CYTODIERESE Download PDF

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Abstract

Méthode de détection et de dénombrement de cellules en cytodiérèse, comprenant :- la fixation des cellules et optionnellement la perméabilisation des cellules,- la coloration quantitative de l'ADN des cellules par un colorant fluorescent vital ou non,- la mesure par tout moyen approprié de l'intensité de fluorescence du pic d'ADN et de l'aire sous la courbe,- le dénombrement des cellules en cytodiérèse selon les caractéristiques suivantes : les cellules en cytodiérèse possèdent une aire sous la courbe similaire à celle de cellules en phase G2 ou M du cycle cellulaire et un pic de fluorescence similaire à celui des cellules en phase G0 ou G1 du cycle cellulaire ;méthode de tri des cellules en cytodiérèse et méthode de criblage d'agents capables d'accélérer ou de ralentir, d'activer ou d'inhiber la cytodiérèse.A method for the detection and enumeration of cells in cytodiérèse, comprising: - the attachment of the cells and optionally the permeabilization of the cells, - the quantitative staining of the DNA of the cells with a vital or non-vital fluorescent dye, - measurement by any appropriate means the fluorescence intensity of the DNA peak and the area under the curve, - the counting of the cells in cytodiérèse according to the following characteristics: the cells in cytodiérèse have an area under the curve similar to that of cells in phase G2 or M of the cell cycle and a fluorescence peak similar to that of cells in the G0 or G1 phase of the cell cycle, a method for screening cells for cytodiesesis and a method for screening agents capable of accelerating or slowing down, of activating or to inhibit cytodiesesis.

Description

METHODE DE DETECTION ET DE DENOMBREMENT DES CELLULES EN CYTODIERESE.METHOD OF DETECTING AND ENCRYPTING CELLS IN CYTODIERESE.

La présente invention concerne le domaine de la biologie, en particulier de la santé, en fournissant une méthode de détection et de dénombrement de cellules en cytodiérèse. La présente invention fournit aussi une méthode de tri des cellules en cytodiérèse, ainsi qu'une méthode de criblage d'agent capable d'interférer avec la cytodiérèse, i.e. visant à inhiber ou activer la division cellulaire, pour des applications dans les domaines de la thérapie antitumorale, l'infectiologie, l'agro-alimentaire ou l'agronomie.  The present invention relates to the field of biology, in particular to health, by providing a method for detecting and counting cells in cytodiesesis. The present invention also provides a method of screening cells for cytodeueresis, as well as a method for screening for an agent capable of interfering with cytodiesesis, ie for inhibiting or activating cell division, for applications in the fields of antitumor therapy, infectiology, agri-food or agronomy.

La cytodiérèse (ou cytokinèse) est une étape clé dans le processus de prolifération cellulaire (Field C et al. Cytokinesis in eukaryotes: a mechanistic comparison. Curr Opin Cell Biol 1999;11(1):68-80. Glotzer M. The molecular requirements for cytokinesis. Science 2005;307(5716):1735-9. Guertin DA et al. Cytokinesis in eukaryotes. Microbiol Mol Biol Rev 2002;66(2):155-78. Robinson DN et Spudich JA. Mechanics and regulation of cytokinesis. Curr Opin Cell Biol 2004;16(2):182-8. Balasubramanian MK et al. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol 2004;14(18):R806-18.). Certains types cellulaires présentent une absence physiologique de cytodiérèse (notamment les hépatocytes, les cellules pancréatiques, les mégacaryocytes, les neurones). En revanche, dans la grande majorité des cellules, la perturbation de la cytodiérèse entraîne soit la mort cellulaire, soit des anomalies de la ploïdie qui sont caractéristiques de la transformation cancéreuse. Les cellules cancéreuses présentent en effet très souvent des anomalies chromosomiques qui portent sur leur structure ou sur leur nombre. L'anomalie de nombre de chromosomes (aussi appelée aneuploïdie) est dans de très nombreux cas un facteur de mauvais pronostic. L'aneuploïdie est par exemple associée à un mauvais pronostic dans les cancers du sein et les cancers colorectaux (Bottger et al., 1993, Cancer ; 72 :3579-87). Des cellules ayant échoué la cytodiérèse sont génétiquement instables et peuvent ainsi se transformer (Fujiwara, T et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells., Nature 2005 ; 437 :1043-1047). Le cycle cellulaire est divisé en plusieurs phases : - la phase G1, première phase de croissance, - la phase S durant laquelle le matériel génétique est répliqué, - la phase G2, seconde phase de croissance cellulaire, - et la phase M, durant laquelle a lieu la mitose. La mitose (figure 1) permet la division cellulaire : lors de la division mitotique, la cellule mère donne naissance à deux cellules filles génétiquement identiques (Mitchison TJ, Salmon ED. Mitosis: a history of division. Nat Cell Biol 2001;3(1):E17-21.). La mitose comprend quatre phases majeures : la prophase, la métaphase, l'anaphase et la télophase. Les étapes de prophase et métaphase sont considérées comme des étapes précoces de la mitose, tandis que les étapes d'anaphase et télophase sont considérées comme des étapes tardives de la mitose. La cytodiérèse, étape finale du cycle cellulaire, est initiée durant l'anaphase et a lieu après la télophase.  Cytodersis (or cytokinesis) is a key step in the process of cell proliferation (Field C et al., Cytokinesis in eukaryotes: a mechanistic comparison, Curr Opin Cell Biol 1999; 11 (1): 68-80. Glotzer M. The molecular Science 2005; 307 (5716): 1735-9, Guertin DA et al., Cytokinesis in eukaryotes, Microbiol Mol Biol Rev 2002, 66 (2): 155-78, Robinson DN and Spudich JA, Mechanics and regulation of Cytokinesis, Curr Opin Cell Biol 2004; 16 (2): 182-8, Balasubramanian MK et al., Comparative Analysis of Cytokinesis in Yeast Budding, Yeast Fission and Animal Cells, Curr Biol 2004; 14 (18): R806-18.) . Some cell types have a physiological absence of cytodiesesis (including hepatocytes, pancreatic cells, megakaryocytes, neurons). In contrast, in the vast majority of cells, the disturbance of cytodiesesis results in either cell death or abnormalities of ploidy that are characteristic of the cancerous transformation. Cancer cells often have chromosomal abnormalities that affect their structure or their number. The chromosome number anomaly (also called aneuploidy) is in many cases a factor of poor prognosis. For example, aneuploidy is associated with poor prognosis in breast and colorectal cancers (Bottger et al., 1993, Cancer, 72: 3579-87). Cells that have failed cytodiérèse are genetically unstable and can thus be transformed (Fujiwara, T. et al., Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells., Nature 2005; 437: 1043-1047). The cell cycle is divided into several phases: - the G1 phase, the first growth phase, - the S phase during which the genetic material is replicated, - the G2 phase, the second phase of cell growth, - and the M phase, during which mitosis takes place. Mitosis (Figure 1) allows cell division: in mitotic division, the mother cell gives rise to two genetically identical daughter cells (Mitchison TJ, Salmon ED, Mitosis: a history of division, Nat Cell Biol 2001, 3 (1 ): E17-21).. Mitosis comprises four major phases: prophase, metaphase, anaphase and telophase. The stages of prophase and metaphase are considered as early stages of mitosis, while the anaphase and telophase stages are considered late stages of mitosis. Cytodersis, the final stage of the cell cycle, is initiated during anaphase and occurs after telophase.

Au cours de la prophase, les chromatides soeurs se condensent et forment les chromosomes, tandis que les deux centrosomes fils prennent position aux deux pôles de la cellule. La prophase s'achève par la dissolution de l'enveloppe nucléaire. Le cytosquelette de microtubules se réorganise pour former le fuseau mitotique. Au cours de la métaphase, les microtubules alignent les chromosomes sur le plan équatorial de la cellule, pour former la plaque équatoriale. Puis, lors de l'anaphase, les chromatides soeurs se séparent et migrent en sens opposé vers les deux pôles de la cellule. Enfin, lors de la télophase, une enveloppe nucléaire commence à se reformer à chaque pôle de la cellule autour des chromatides soeurs qui se décondensent. Lors de l'étape finale du cycle de division cellulaire, la cytodiérèse, un sillon de division formé dès l'anaphase dans un plan perpendiculaire à l'axe du fuseau mitotique, sépare la cellule en deux cellules filles identiques. Le sillon de division se resserre jusqu'à former un pont cytoplasmique contenant un corps intermédiaire, formant un passage étroit entre les deux cellules filles, riche en microtubules. Lorsque le pont cytoplasmique sera clivé en début de G1, les cellules filles pourront se séparer complètement. L'inhibition ou la perturbation de la cytodiérèse peuvent produire des cellules binucléées, ou entraîner une mauvaise ségrégation des chromosomes, conduisant à la formation de cellules filles polyploïdes ou aneuploïdes. Pour mieux comprendre moléculairement le mécanisme de cytodiérèse et évaluer l'effet thérapeutique de nouveaux agents sur l'inhibition ou l'activation d'un tel mécanisme, il est nécessaire de disposer d'une méthode permettant de détecter et de dénombrer les cellules en cytodiérèse. A l'heure actuelle, le seul moyen disponible pour détecter des cellules en cytodiérèse repose sur la morphologie des cellules analysées individuellement par microscopie. Les cellules peuvent être vivantes en culture ou in vivo, ou fixées. Par exemple, des cellules sont fixées puis l'ADN est coloré et/ou un marquage de protéines caractéristiques de la cytodiérèse est réalisé. Après photographie de plusieurs champs microscopiques (au minimum 5), les cellules en cytodiérèse sont alors comptées manuellement sur un nombre significatif de cellule (au minimum 500 cellules). La réalisation de film de cellules vivantes a plus récemment permis le suivi en temps réel de la cytodiérèse. Cette technique repose sur la vidéo-microscopie en temps réel en chambre de culture ou imagerie intra-vitale d'un organe sur organisme vivant. Cette technique implique de posséder un équipement de vidéo-microscopie dédié à cette analyse puisqu'un seul échantillon cellulaire peut être filmé à chaque fois, pendant 2 à 48h, de monter manuellement le film et de visionner le film pour dénombrer les évènements de cytodiérèse au cours du temps.  During prophase, the sister chromatids condense and form the chromosomes, while the two son centrosomes take up position at the two poles of the cell. Prophase ends with the dissolution of the nuclear envelope. The microtubule cytoskeleton is reorganized to form the mitotic spindle. During metaphase, microtubules align the chromosomes on the equatorial plane of the cell to form the equatorial plate. Then, during anaphase, the sister chromatids separate and migrate in opposite directions to the two poles of the cell. Finally, during the telophase, a nuclear envelope begins to reform at each pole of the cell around sister chromatids that decondensate. In the final stage of the cell division cycle, cytodieseresis, a division furrow formed from anaphase in a plane perpendicular to the axis of the mitotic spindle, separates the cell into two identical daughter cells. The dividing groove tightens to form a cytoplasmic bridge containing an intermediate body, forming a narrow passageway between the two daughter cells, rich in microtubules. When the cytoplasmic bridge is cleaved at the beginning of G1, the daughter cells will be able to separate completely. Inhibition or disruption of cytodiesesis can produce binucleate cells, or lead to poor segregation of chromosomes, leading to the formation of polyploid or aneuploid daughter cells. To better understand the molecular mechanism of cytodiérèse and evaluate the therapeutic effect of new agents on the inhibition or activation of such a mechanism, it is necessary to have a method for detecting and counting cells in cytodiérèse . At present, the only available means for detecting cells in cytodiesesis is based on the morphology of the cells individually analyzed by microscopy. The cells can be alive in culture or in vivo, or fixed. For example, cells are fixed and then the DNA is stained and / or protein labeling characteristic of cytodiesesis is performed. After photographing several microscopic fields (at least 5), the cells in cytodiérèse are then counted manually on a significant number of cells (at least 500 cells). The production of living cell films has more recently enabled real-time monitoring of cytodiesesis. This technique is based on real-time video microscopy in a culture chamber or intravital imaging of an organ on a living organism. This technique involves having a video-microscopy equipment dedicated to this analysis since a single cell sample can be filmed each time, for 2 to 48 hours, to manually mount the film and watch the film to count the cytodiérèse events at course of time.

Les techniques disponibles à l'heure actuelle ne permettent pas de réaliser facilement et rapidement la détection et le dénombrement de cellules en cytodiérèse. En effet, le débit d'analyse des échantillons dépend de la disponibilité des microscopes et de la vitesse d'analyse manuelle. De plus, la signification statistique des valeurs obtenues (pourcentage de cellules en cytodiérèse) est limitée par la taille de l'échantillon cellulaire analysé (nombre total de cellules filmées ou analysées). La demanderesse a donc cherché à mettre au point une autre méthode de détection et de dénombrement de cellules en cytodiérèse qui soit plus facilement et rapidement mise en œuvre, et qui permette de réaliser une analyse d'échantillons en série de manière industrielle. La demanderesse a trouvé qu'après coloration quantitative de l'ADN par un colorant fluorescent, les cellules en cytodiérèse présentent un signal de fluorescence caractéristique, qui définit la population C (figure 2). 10 15 20 Le signal de fluorescence comprend deux paramètres qui 25 correspondent aux composantes spatio-temporelles du signal : - l'aire sous la courbe - la hauteur du pic.  The techniques available at the present time do not make it easy and quick to carry out the detection and enumeration of cells in cytodiesesis. Indeed, the rate of analysis of the samples depends on the availability of the microscopes and the speed of manual analysis. In addition, the statistical significance of the values obtained (percentage of cells in cytodiesesis) is limited by the size of the cell sample analyzed (total number of cells filmed or analyzed). The Applicant has therefore sought to develop another method of detecting and counting cells in cytodiérèse which is more easily and rapidly implemented, and which allows an analysis of samples in series industrially. The Applicant has found that after quantitative staining of the DNA with a fluorescent dye, the cells in cytodiérèse have a characteristic fluorescence signal, which defines the population C (Figure 2). The fluorescence signal comprises two parameters which correspond to the spatio-temporal components of the signal: the area under the curve the height of the peak.

Au sens de la présente invention, l'aire sous la courbe 30 correspond à l'intensité du signal de fluorescence pour une cellule donnée. L'aire sous la courbe correspond au contenu en ADN des cellules ou DNA index (DI), et est égale à 1 lorsque les cellules sont en phase GO ou G1 du cycle cellulaire ou est égale à 2 lorsque les cellules sont en phase G2 ou M du cycle cellulaire, i.e. lorsqu'elles ont dupliqué leur ADN.  For the purpose of the present invention, the area under the curve corresponds to the intensity of the fluorescence signal for a given cell. The area under the curve corresponds to the DNA content of the cells or DNA index (DI), and is equal to 1 when the cells are in phase GO or G1 of the cell cycle or is equal to 2 when the cells are in phase G2 or M cell cycle, ie when they duplicated their DNA.

La hauteur du pic correspond à la hauteur maximale de l'intensité du signal de fluorescence pour une cellule donnée à un instant t. La hauteur du pic correspond au contenu en ADN des cellules ou DNA index (DI), et est égale à 1 lorsque les cellules sont en phase GO ou G1 du cycle cellulaire ou est égale à 2 lorsque les cellules sont en phase G2 ou M du cycle cellulaire, i.e. lorsqu'elles ont dupliqué leur ADN. La demanderesse a ainsi observé que de manière caractéristique les cellules en cytodiérèse présentent une aire sous la courbe similaire à celle de cellules en phase G2 ou M du cycle cellulaire, i.e. DI=2 et une hauteur de pic similaire à celle de cellules en phase GO/G1, i.e. DI=1. En effet, les cellules en cytodiérèse correspondent à deux cellules filles qui ont chacune un contenu en ADN DI=1 puisqu'elles sortent de mitose ; en revanche, ces deux cellules filles sont toujours reliées entre elles par un pont, ce qui résulte en deux courbes de fluorescence très proches correspondant à DI=1, qui sont confondues en une seule courbe de fluorescence dont l'aire sous la courbe est équivalente à DI=2.  The height of the peak corresponds to the maximum height of the fluorescence signal intensity for a given cell at a time t. The height of the peak corresponds to the DNA content of the cells or DNA index (DI), and is equal to 1 when the cells are in phase GO or G1 of the cell cycle or is equal to 2 when the cells are in the G2 or M phase of the cell. cell cycle, ie when they have duplicated their DNA. The Applicant has thus observed that, in a characteristic manner, the cells in cytodiérèse have an area under the curve similar to that of cells in the G2 or M phase of the cell cycle, ie DI = 2 and a height of peak similar to that of cells in the GO phase. / G1, ie DI = 1. Indeed, the cells in cytodiérèse correspond to two daughter cells which each have a DNA content DI = 1 since they come out of mitosis; on the other hand, these two daughter cells are always interconnected by a bridge, which results in two very close fluorescence curves corresponding to DI = 1, which are combined into a single fluorescence curve whose area under the curve is equivalent. at DI = 2.

Ainsi, la présente invention a pour but de proposer une méthode alternative de détection et de dénombrement de cellules en cytodièrèse, qui permet d'analyser en série un grand nombre d'échantillons et d'obtenir des résultats quantitatifs par mesure du pourcentage et/ou du nombre de cellules en cytodiérèse dans l'échantillon cellulaire analysé.  Thus, the purpose of the present invention is to propose an alternative method of detecting and counting cells in cytodièrèse, which makes it possible to analyze in series a large number of samples and to obtain quantitative results by measurement of the percentage and / or of the number of cells in cytodiesesis in the cell sample analyzed.

La présente invention a aussi pour but de proposer une méthode de tri des cellules en cytodiérèse, à des fins d'analyse cellulaire ou moléculaire. Enfin, la présente invention a également pour but de proposer une méthode de criblage d'agents capables d'accélérer ou de ralentir, d'activer ou d'inhiber la cytodiérèse, dans le but d'ouvrir de nouvelles pistes de recherche en cancérologie, biologie, infectiologie ou agro-alimentaire.  The present invention also aims to propose a method for sorting cells in cytodiesesis, for cell or molecular analysis purposes. Finally, the purpose of the present invention is also to propose a method of screening agents capable of accelerating or slowing down, of activating or inhibiting cytodiesesis, with the aim of opening up new research tracks in oncology, biology, infectiology or agro-food.

La présente invention a plus particulièrement pour objet une méthode de détection et de dénombrement de cellules en cytodiérèse, comprenant : la fixation des cellules et optionnellement la perméabilisation des cellules, - la coloration quantitative de l'ADN des cellules par colorant fluorescent vital ou non, la mesure par tout moyen approprié de l'intensité de fluorescence du pic d'ADN et 20 de l'aire sous la courbe, le dénombrement des cellules en cytodiérèse (population C sur la figure 2) selon les caractéristiques suivantes : les cellules en cytodiérèse présentent une aire sous la 25 courbe similaire à celle de cellules en phase G2 ou M du cycle cellulaire et un pic de fluorescence similaire à celui des cellules en phase GO ou G1 du cycle cellulaire. 30 Au sens de la présente invention, on entend par détection la mesure de l'intensité de fluorescence du pic d'ADN et de l'aire sous la courbe de cellules dont l'ADN a préalablement été coloré. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape de fixation et optionnellement de perméabilisation des cellules est réalisée par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier. La perméabilisation est requise uniquement si la coloration ultérieure de l'ADN est effectuée avec un colorant auquel la cellule est imperméable (notamment l'iodure de propidium). Dans un premier mode de réalisation, les cellules sont fixées par un agent pontant comme le formaldéhyde, puis perméabilisées par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier, par exemple par un détergent comme le triton X-1000. Dans un deuxième mode de réalisation, les cellules sont perméabilisées et fixées en même temps par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier, par exemple la perméabilisation et fixation par un solvant comme l'éthanol à 70%. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules sont dans un premier temps fixées et optionnellement perméabilisées puis la coloration de l'ADN des cellules est réalisée dans un second temps, notamment à l'aide d'un intercalant fluorescent (par exemple l'iodure de propidium, le bromure d'éthidium), d'un colorant liant les bases A :T (par exemple le Hoechst 33342 ou 33258 ) ou les bases G :C (par exemple la 7-amino-actinomycine D), d'une cyanine perméante (par exemple la série des SYT00) ou imperméante (par exemple le TOTO-1 ). Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules vivantes sont colorées à l'aide d'un colorant vital de l'ADN, par exemple le Hoechst 33342 , puis elles sont fixées par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier. La perméabilisation n'est pas indispensable Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la mesure de l'intensité de fluorescence du pic d'ADN et de l'aire sous la courbe est réalisée à l'aide d'un cytomètre en flux, et le dénombrement des cellules en cytodiérèse : détermination du pourcentage et/ou du nombre de cellules en cytodiérèse, est réalisé à l'aide d'un logiciel d'analyse approprié au cytomètre en flux, notamment CellQuest , CellQuestPro , Expo32 .  The present invention more particularly relates to a method for detecting and counting cells in cytodiesesis, comprising: the attachment of cells and optionally the permeabilization of cells, - the quantitative staining of the DNA of the cells by vital fluorescent dye or not, measuring by any appropriate means the fluorescence intensity of the DNA peak and the area under the curve, counting cells in cytodiesesis (population C in FIG. 2) according to the following characteristics: cells in cytodiérèse have an area under the curve similar to that of cells in G2 or M phase of the cell cycle and a fluorescence peak similar to that of cells in phase GO or G1 of the cell cycle. For the purposes of the present invention, the term "detection" is intended to mean the measurement of the fluorescence intensity of the DNA peak and the area under the curve of cells whose DNA has previously been colored. In one embodiment of the invention, the step of fixing and optionally permeabilizing the cells is carried out by any method known to those skilled in the art. Permeabilization is required only if subsequent staining of the DNA is performed with a dye to which the cell is impermeable (especially propidium iodide). In a first embodiment, the cells are fixed by a bridging agent such as formaldehyde, and then permeabilized by any method known to those skilled in the art, for example by a detergent such as triton X-1000. In a second embodiment, the cells are permeabilized and fixed at the same time by any method known to those skilled in the art, for example permeabilization and fixation with a solvent such as 70% ethanol. In a preferred embodiment of the invention, the cells are firstly fixed and optionally permeabilized, then the staining of the cells' DNA is carried out in a second step, in particular using a fluorescent intercalator (for example for example, propidium iodide, ethidium bromide), an A: T base-binding dye (for example Hoechst 33342 or 33258) or G: C bases (for example 7-amino-actinomycin D). , a permeant cyanine (for example the SYT00 series) or impervious cyanine (for example TOTO-1). In another embodiment of the invention, the living cells are stained with a vital dye of DNA, for example Hoechst 33342, and are then fixed by any known method of the invention. skilled person. Permeabilization is Not Necessary In a preferred embodiment of the invention, the measurement of the fluorescence intensity of the DNA peak and the area under the curve is carried out using a cytometer. flow, and the counting of cells in cytodiesesis: determination of the percentage and / or number of cells in cytodiesesis, is carried out using an appropriate flow cytometer analysis software, in particular CellQuest, CellQuestPro, Expo32.

Selon l'invention, la méthode permet de détecter toute cellule eucaryote en cytodiérèse, notamment les cellules animales, les protoplastes et les organismes unicellulaires. Ladite méthode est notamment applicable à des cellules en culture adhérentes ou en suspension, ou à des cellules primaires dissociées à partir de tissus.  According to the invention, the method makes it possible to detect any eukaryotic cell in cytodiesesis, in particular animal cells, protoplasts and unicellular organisms. Said method is particularly applicable to adherent or suspended culture cells, or to primary cells dissociated from tissues.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite méthode comprend en outre une étape préliminaire de purification des cellules mitotiques. Par étape préliminaire, on entend préalablement à toute autre étape de la méthode selon l'invention telle que décrite précédemment. Les cellules mitotiques obtenues à la suite de cette étape sont ensuite remises en culture jusqu'à la cytodiérèse pendant un laps de temps variable, afin de suivre la sortie de mitose, la cytodiérèse et le retour en interphase, de préférence de 0 à 360 minutes, plus préférentiellement de 0 à 180 minutes, et très préférentiellement de 30 à 90 minutes. Dans un premier mode de réalisation, la purification 30 des cellules mitotiques est réalisée par élutriation, qui est une méthode de centrifugation à contre-courant.  In a preferred embodiment of the invention, said method further comprises a preliminary step of purifying mitotic cells. By preliminary step is meant before any other step of the method according to the invention as described above. The mitotic cells obtained as a result of this step are then re-cultured to cytodiérèse for a variable period of time, in order to follow the exit of mitosis, the cytodièérèse and the return in interphase, preferably from 0 to 360 minutes more preferably from 0 to 180 minutes, and very preferably from 30 to 90 minutes. In a first embodiment, purification of mitotic cells is performed by elutriation, which is a countercurrent centrifugation method.

Dans un second mode de réalisation, la purification des cellules mitotiques est réalisée par tri au cytomètre en flux, après coloration vitale de l'ADN, par exemple par le Hoechst 33342 .  In a second embodiment, the purification of the mitotic cells is carried out by sorting with a flow cytometer, after vital staining of the DNA, for example with Hoechst 33342.

Dans un troisième mode de réalisation, notamment dans le cas d'une culture de cellules adhérentes, les cellules mitotiques sont séparées des cellules interphasiques, par exemple par détachement des cellules en mitose par chocs sur les boites ( mitotic shake-off ).  In a third embodiment, particularly in the case of an adherent cell culture, the mitotic cells are separated from the interphasic cells, for example by detaching the mitotic cells by shocks on the boxes (mitotic shake-off).

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite méthode comprend en outre une étape préliminaire d'enrichissement de la culture cellulaire en cellules mitotiques. Cette étape d'enrichissement en cellules mitotiques peut optionnellement être suivie d'une étape de purification des cellules mitotiques. L'enrichissement en cellules mitotiques est réalisé par synchronisation des cellules en métaphase de mitose. Cette synchronisation est obtenue par activation du point de contrôle mitotique (encore appelé point de contrôle du fuseau). Cette activation peut être obtenue par addition pendant 2 à 20h selon le type de cellules d'un inhibiteur de la polymérisation des microtubules, notamment le nocodazole, la colchicine, ou par un inhibiteur de la kinésine mitotique Eg5 (notamment le monastrol ), dans des conditions réversibles. Par condition réversible, on entend au sens de la présente invention qu'en cas d'absence de l'inhibiteur ou d'arrêt de l'ajout de l'inhibiteur les cellules peuvent reprendre leur mitose.  In a preferred embodiment of the invention, said method further comprises a preliminary step of enriching the cell culture in mitotic cells. This mitotic cell enrichment step may optionally be followed by a mitotic cell purification step. The enrichment in mitotic cells is achieved by synchronization of cells in metaphase mitosis. This synchronization is obtained by activation of the mitotic checkpoint (also called spindle control point). This activation can be obtained by addition for 2 to 20 hours depending on the cell type of a microtubule polymerization inhibitor, in particular nocodazole, colchicine, or by an inhibitor of the mitotic kinesin Eg5 (in particular monastrol), in reversible conditions. By reversible condition is meant in the sense of the present invention that in the absence of the inhibitor or stopping the addition of the inhibitor cells can resume their mitosis.

Après l'étape d'enrichissement de la culture en cellules mitotiques par synchronisation des cellules en métaphase de mitose, les cellules mitotiques peuvent être purifiées comme décrit précédemment. Les cellules mitotiques enrichies et optionnellement purifiées sont ensuite remises en culture pendant un laps de temps variable, afin de suivre la sortie de mitose, la cytodiérèse et le retour en interphase, de préférence pendant 0 à 360 minutes, plus préférentiellement pendant 0 à 180 minutes, et très préférentiellement pendant 90 minutes. Cette étape d'enrichissement en cellules mitotiques par synchronisation des cellules en métaphase de mitose, suivie d'une étape optionnelle de purification des cellules mitotiques et de remise en culture de ces cellules permet ainsi d'enrichir la culture cellulaire en cellules en cytodiérèse.  After the step of enriching the culture in mitotic cells by synchronization of the mitotic metaphase cells, the mitotic cells can be purified as previously described. The enriched and optionally purified mitotic cells are then cultured for a variable period of time in order to monitor the exit of mitosis, cytodiesesis and return to interphase, preferably for 0 to 360 minutes, more preferably for 0 to 180 minutes. and very preferably for 90 minutes. This step of enrichment in mitotic cells by synchronization of cells in metaphase mitosis, followed by an optional step of purification of mitotic cells and culture of these cells thus allows the cell culture to be enriched in cells in cytodiesesis.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite méthode comprend en outre une étape d'immunomarquage avec des marqueurs mitotiques sélectifs ou des marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse, préalablement, en même temps ou après l'étape de coloration de l'ADN. Ces marqueurs mitotiques sélectifs sont notamment cycline B1, MPM2 ou phospho-histone H3 (Juan G et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry 1998;32(2):71-7). Les marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse sont notamment les protéines présentes dans le complexe de protéines passagères, telles que Aurora B, survivine, Polo-like kinase et les kinésines associées MKLP1 et MKLP2 (Pines J. Mitosis: a matter of getting rid of the right protein at the right time. Trends Oeil Biol 2005. Clute P, Pines J. Temporal and spatial control of cyclin B1 destruction in metaphase. Nat Cell Biol 1999;1(2):82-7. Stewart S, Fang G. Destruction box-dependent degradation of aurora B is mediated by the anaphase-promoting complex/cyclosome and Cdhl. Cancer Res 2005;65(19):8730-5). La présence ou l'absence des marqueurs mitotiques sélectifs et des marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse permet en effet d'exclure les cellules en phase G1 ou en phase de mitose précoce (prophase, métaphase) ou tardive (anaphase, télophase) qui contaminent la population de cellules en cytodiérèse. Les marqueurs mitotiques présents dans les cellules en mitose mais pas dans les cellules en cytodiérèse sont notamment cycline B1, MPM2 ou phospho-histone H3. Les marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse présents dans les cellules en mitose et dans les cellules en cytodiérèse mais pas dans les cellules en G1 sont notamment les protéines présentes dans le complexe de protéines passagères, comme Aurora B, survivine, Polo-like kinase.  In a preferred embodiment of the invention, said method further comprises a step of immunostaining with selective mitotic markers or joint markers of mitosis and cytodiesesis, prior to, at the same time or after the staining step. of DNA. These selective mitotic markers include cyclin B1, MPM2 or phospho-histone H3 (Juan G et al., Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis, Cytometry 1998; 32 (2) : 71-7). The joint markers of mitosis and cytodiesesis include the proteins present in the transient protein complex, such as Aurora B, survivin, Polo-like kinase, and the associated kinesins MKLP1 and MKLP2 (Pines J. Mitosis: a matter of getting Trends of the right protein at the right time .. Trends Oeil Biol 2005. Clute P, Pines J. Temporal and spatial control of cyclin B1 destruction in metaphase, Nat Cell Biol 1999; 1 (2): 82-7 Stewart S, Fang G. Destruction Box-Dependent Degradation of Aurora B is mediated by the anaphase-promoting complex / cyclosome and Cdhl Cancer Res 2005; 65 (19): 8730-5). The presence or absence of selective mitotic markers and joint markers of mitosis and cytodiérèse makes it possible to exclude cells in the G1 phase or in the early (prophase, metaphase) or late (anaphase, telophase) mitosis phase. that contaminate the cell population in cytodiesesis. The mitotic markers present in the cells in mitosis but not in the cells in cytodiesesis are in particular cyclin B1, MPM2 or phosphohistone H3. The joint markers of mitosis and cytodiesesis present in the cells in mitosis and in the cells in cytodiesesis but not in the cells in G1 are in particular the proteins present in the complex of transient proteins, such as Aurora B, survivin, Polo-like kinase.

La présente invention a aussi pour objet de fournir une méthode de tri des cellules en cytodiérèse, ladite méthode comprenant à la suite des étapes de détection et de dénombrement des cellules en cytodiérèse telles que décrites précédemment, une étape de tri de la population de cellules en cytodiérèse à l'aide d'un trieur de cellules. Dans un mode de réalisation de l'invention, les cellules en cytodiérèse sont détectées et dénombrées par la méthode décrite précédemment, puis ces cellules sont triées à l'aide d'un trieur de cellules sur la base des signaux de fluorescence émis par la coloration de l'ADN et optionnellement par les marqueurs mitotiques sélectifs ou les marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse. Cette méthode permet d'obtenir une population de cellules comprenant en majorité soit des cellules en cytodiérèse, soit des cellules en mitose tardive.  Another object of the present invention is to provide a method for sorting cells in cytodiesesis, said method comprising, following the steps of detection and enumeration of the cells in cytodiesesis as described above, a step of sorting the cell population into cells. cytodiérèse using a cell sorter. In one embodiment of the invention, the cells in cytodiérèse are detected and enumerated by the method described above, then these cells are sorted using a cell sorter on the basis of the fluorescence signals emitted by the staining. DNA and optionally by selective mitotic markers or joint markers of mitosis and cytodiesesis. This method makes it possible to obtain a population of cells comprising in majority either cells in cytodiesesis or cells in late mitosis.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les cultures sont préalablement enrichies en cellules en cytodiérèse par synchronisation préalable en mitose comme décrit précédemment puis les cellules mitotiques sont purifiées comme décrit précédemment et cultivées jusqu'en cytodiérèse. Un marquage à l'aide de marqueurs mitotiques sélectifs ou de marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse est enfin optionnellement réalisé. L'enrichissement préalable de la culture en cellules mitotiques et la purification des cellules mitotiques permet d'éliminer une partie des cellules contaminantes préalablement à la coloration de l'ADN. L'utilisation de marqueurs sélectifs ou de marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse tels que décrits précédemment permet d'exclure au moment du tri cellulaire toute cellule qui n'est pas considérée comme étant une cellule en cytodiérèse. Ces deux étapes permettent ainsi d'obtenir une population de cellules triées comprenant plus de 90% de cellules en cytodiérèse.  In a preferred embodiment of the invention, the cultures are previously enriched in cytodiérèse cells by prior mitosis synchronization as described above, then the mitotic cells are purified as previously described and cultured until cytodiérèse. Marking with selective mitotic markers or joint markers of mitosis and cytodiesesis is finally optionally performed. The prior enrichment of the mitotic cell culture and the purification of the mitotic cells makes it possible to eliminate a portion of the contaminating cells prior to the staining of the DNA. The use of selective markers or joint markers of mitosis and cytodiérèse as described above makes it possible to exclude at the time of cell sorting any cell which is not considered to be a cell in cytodiesesis. These two steps thus make it possible to obtain a population of sorted cells comprising more than 90% of cells in cytodiesesis.

La présente invention a également pour objet de fournir une méthode de criblage d'agents capables d'accélérer ou de ralentir, d'activer ou d'inhiber la cytodiérèse, ladite méthode comprenant la culture de cellules dans un milieu adéquat en présence de l'agent à tester, et la détection et le dénombrement des cellules en cytodiérèse tel que décrit précédemment Aucune connaissance préliminaire de la ou des cible(s) moléculaire(s) des agents testés n'est nécessaire. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, une étape d'enrichissement en cellules mitotiques et une étape de purification des cellules mitotiques sont optionnellement préliminairement réalisées. Les cellules sont ensuite mises en culture dans un milieu adéquat en présence de l'agent à tester pendant un laps de temps variable, afin de suivre la sortie de mitose, la cytodiérèse et le retour en interphase. L'agent à tester peut être : un agent physique, notamment la température, les radiations ionisantes, les ultraviolets, les infrarouges, la pression ; un agent chimique, notamment des substances naturelles ou synthétiques, des espèces réactives de l'oxygène, des macromolécules ; un agent biologique, notamment un vecteur de transfert de gène, un agent pathogène comme un virus, une bactérie, un parasite eucaryote, un prion, un microorganisme. Une expérience de contrôle est aussi menée en parallèle 15 comprenant des cellules non traitées par l'agent ou traitées par le solvant de l'agent testé. Les différents paramètres de culture comme la durée, l'intensité/concentration du traitement et la cinétique d'analyse après remise en culture des cellules mitotiques sont à établir par l'homme du métier 20 en fonction du type de cellule utilisé et de l'agent testé. Les cellules sont ensuite récoltées puis fixées et optionnellement perméabilisées et l'ADN des cellules est coloré selon la méthode décrite précédemment. Optionnellement, une étape d'immunomarquage avec des marqueurs mitotiques 25 sélectifs ou des marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse peut être réalisée comme décrit précédemment. Enfin l'intensité de fluorescence des cellules est mesurée en cytométrie en flux selon la méthode décrite précédemment et le pourcentage et/ou le nombre de cellules en cytodiérèse est 30 déterminé. Cette méthode permet ainsi de tester si l'agent à tester perturbe la cytodiérèse. 10 La présente invention fournit ainsi une méthode de détection et de dénombrement des cellules en cytodiérèse, qui est facilement et rapidement mise en œuvre, qui permet une analyse quantitative, et qui permet une analyse en série d'un grand nombre d'échantillons à l'échelle industrielle. La présente invention fournit aussi une méthode de tri des cellules en cytodiérèse, qui permet d'obtenir une population fortement enrichie en cellules en cytodiérèse, ce qui facilite l'analyse cellulaire et moléculaire de ces cellules. Les cellules en cytodiérèse triées peuvent notamment être analysées in situ après collecte sur lame de microscopie, séchage, réhydratation, marquage spécifique (immunoenzymatique, immunofluorescence, hybridation in situ...) et observation au microscope, ou être lysées pour une analyse biochimique (transcriptome, protéome, lipidome...). La présente invention fournit également une méthode de criblage d'agents capables d'accélérer ou de ralentir, d'activer ou d'inhiber la cytodiérèse. De tels agents seraient intéressants en . - cancérologie : des activateurs ou inhibiteurs de la cytodiérèse pourraient enrichir le panel des substances anti-prolifératives ou pro-apoptotiques connues, biologie : des activateurs de la cytodiérèse pourraient favoriser la prolifération à l'état diploïde, in vitro ou in vivo, de cellules différenciées déficientes pour ce processus (hépatoblastes, hépatocytes, mégacaryocytes, cellules pancréatiques, cardiomyoblastes, cardiomyocytes, neurones, cellules souches, cellules épithéliales (notamment oesophage de Barrett...), - infectiologie : des activateurs ou inhibiteurs de la cytodiérèse pourraient enrichir le panel des substances anti-fongiques et anti-parasitaires, agro-alimentaire : des activateurs ou inhibiteurs de la cytodiérèse pourraient être présents dans certains composés ; considérés comme des agents carcinogènes potentiels, leur détection et leur identification grâce à la méthode proposée permettrait de les retirer avant leur mise sur le marché ou leur dissémination dans l'environnement, selon le principe de précaution . agronomie : en alternative à la colchicine, des inhibiteurs de la cytodiérèse appliqués à des cultures de protoplastes (index ADN, DI=1) pourraient permettre l'obtention de protoplastes polyploïdes (index ADN, DI=2), permettant de régénérer des plantes polyploïdes.  The present invention also aims to provide a method for screening agents capable of accelerating or slowing down, activating or inhibiting cytodiesesis, said method comprising culturing cells in a suitable medium in the presence of the agent to be tested, and the detection and enumeration of cells in cytodiesesis as described above No preliminary knowledge of the target (s) molecular (s) agents tested is necessary. In a preferred embodiment of the invention, a mitotic cell enrichment step and a mitotic cell purification step are optionally first performed. The cells are then cultured in a suitable medium in the presence of the agent to be tested for a variable period of time, in order to follow the exit of mitosis, the cytodiesesis and the return in interphase. The agent to be tested may be: a physical agent, especially temperature, ionizing radiation, ultraviolet, infrared, pressure; a chemical agent, especially natural or synthetic substances, reactive oxygen species, macromolecules; a biological agent, especially a gene transfer vector, a pathogen such as a virus, a bacterium, a eukaryotic parasite, a prion, a microorganism. A control experiment is also conducted in parallel comprising cells not treated with the agent or treated with the solvent of the agent under test. The different culture parameters such as the duration, the intensity / concentration of the treatment and the kinetics of analysis after culturing the mitotic cells are to be established by those skilled in the art depending on the type of cell used and the agent tested. The cells are then harvested and fixed and optionally permeabilized and the cell DNA is stained according to the method described above. Optionally, an immunolabeling step with selective mitotic markers or joint markers of mitosis and cytodiesesis may be performed as previously described. Finally, the fluorescence intensity of the cells is measured by flow cytometry according to the method described above and the percentage and / or the number of cells in cytodiesesis is determined. This method thus makes it possible to test whether the agent to be tested disrupts cytodiesesis. The present invention thus provides a method of detecting and counting cells in cytodiesesis, which is easily and quickly implemented, which allows for quantitative analysis, and which allows for serial analysis of a large number of samples at the same time. industrial scale. The present invention also provides a method of screening cells for cytodiesesis, which makes it possible to obtain a highly enriched population of cells in cytodieseresis, which facilitates the cellular and molecular analysis of these cells. The cells in sorted cytodiérèse can in particular be analyzed in situ after collection on slide microscopy, drying, rehydration, specific labeling (immunoenzymatic, immunofluorescence, hybridization in situ ...) and observation under the microscope, or be lysed for a biochemical analysis (transcriptome , proteome, lipidome ...). The present invention also provides a method for screening agents capable of accelerating or slowing down, activating or inhibiting cytodiesesis. Such agents would be interesting in. - oncology: activators or inhibitors of cytodiérèse could enrich the panel of known anti-proliferative or pro-apoptotic substances, biology: activators of cytodiérèse could promote the proliferation in the diploid state, in vitro or in vivo, of cells differentiated deficient for this process (hepatoblasts, hepatocytes, megakaryocytes, pancreatic cells, cardiomyoblasts, cardiomyocytes, neurons, stem cells, epithelial cells (including Barrett's esophagus ...), - infectiology: activators or inhibitors of cytodiérèse could enrich the panel anti-fungal and anti-parasitic substances, agri-foodstuffs: activators or inhibitors of cytodiérèse could be present in certain compounds, considered as potential carcinogens, their detection and identification thanks to the proposed method would allow to remove them before their bet on the mar or their release into the environment, according to the precautionary principle. agronomy: as an alternative to colchicine, cytodiérèse inhibitors applied to protoplast cultures (DNA index, DI = 1) could make it possible to obtain polyploid protoplasts (DNA index, DI = 2), enabling the regeneration of polyploid plants .

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de détection, dénombrement et tri de cellules en cytodiérèse. Dans les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, il 20 sera fait référence aux figures en annexe : la figure 3 présente l'analyse en cytométrie en flux du pourcentage de cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire à différents temps, 25 la figure 4 présente l'analyse en cytométrie en flux du pourcentage de cellules en phases G1, M ou cytodiérèse avant et après tri cellulaire, - la figure 5 présente l'analyse en 30 microscopie du cytosquelette de microtubules dans les cellules mitotiques et dans les cellules en cytodiérèse 90 minutes après collecte et mise en culture des cellules mitotiques, la figure 6 présente l'analyse en microscopie du cytosquelette de microtubules au cours du cycle cellulaire, la figure 7 présente l'analyse en microscopie de la présence de a-tubuline et phospho-histone H3 dans les cellules en cytodiérèse, la figure 8 présente l'analyse de la présence de Cycline B1 et Aurora B dans les cellules mitotiques et dans les cellules en cytodiérèse par immunoblot.  The present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples of detection, counting and sorting of cells in cytodiesesis. In the examples which follow, given by way of illustration, reference will be made to the appended figures: FIG. 3 shows the flow cytometric analysis of the percentage of cells in the different phases of the cell cycle at different times, FIG. 4 shows the flow cytometric analysis of the percentage of cells in G1, M or cytodireser phases before and after cell sorting; FIG. 5 shows microscopic analysis of the cytoskeleton of microtubules in mitotic cells and in cells Cytodiérèse 90 minutes after collecting and culturing the mitotic cells, Figure 6 shows the microscopy analysis of the microtubule cytoskeleton during the cell cycle, Figure 7 shows the microscopy analysis of the presence of a-tubulin and phospho -Histone H3 in cells in cytodiérèse, Figure 8 presents the analysis of the presence of Cyclin B1 and Aurora B in mitotic cells and in c ellules in cytodiérèse by immunoblot.

ExemplesExamples

1- Matériels et méthodes1- Materials and methods

Culture cellulaire et synchronisation Les cellules HeLa ont été cultivées dans du DMEM (Gibco/BRL Inc Life Technoligies) supplémenté avec 10% de sérum de veau fétal et de la pénicilline-streptomycine (100 IU/mL et 100 pl/mL respectivement) à 37 C et 5% CO2. Pour synchroniser les cellules en métaphase, les cellules en croissance exponentielle ont été traitées pendant 16h avec 50 ng/ml de nocodazole (Sigma). Les cellules mitotiques ont été récupérées par choc sur les boites dans du PBS, lavées deux fois dans du PBS et de nouveau, cultivées pendant 0 à 180 minutes dans du DMEM complet en absence de nocodazole.  Cell Culture and Synchronization HeLa cells were cultured in DMEM (Gibco / BRL Inc. Life Technoligies) supplemented with 10% fetal calf serum and penicillin-streptomycin (100 IU / mL and 100 μL / mL respectively) at 37 ° C. C and 5% CO2. To synchronize the cells in metaphase, the exponentially growing cells were treated for 16 h with 50 ng / ml of nocodazole (Sigma). The mitotic cells were shock-recovered from the dishes in PBS, washed twice in PBS and again, cultured for 0-180 minutes in complete DMEM in the absence of nocodazole.

Pour récupérer les cellules à chaque point de cinétique (0-90 min), les cellules ont été re-suspendues dans du milieu de culture par pipetage, de façon à dissocier les agrégats de cellules non adhérentes et à détacher de la plaque de culture les cellules ayant commencé à adhérer. Aux derniers points de cinétique, le milieu de culture contenant une minorité de cellules non adhérentes est enlevé et les cellules adhérentes sont détachées à l'aide de la trypsine. Les cellules contrôles asynchrones sont récupérées après détachement à la trypsine.  To recover the cells at each point of kinetics (0-90 min), the cells were resuspended in culture medium by pipetting, so as to dissociate the aggregates of non-adherent cells and to detach from the culture plate the cells that started to adhere. At the last points of kinetics, the culture medium containing a minority of non-adherent cells is removed and the adherent cells are detached with the help of trypsin. The asynchronous control cells are recovered after detachment with trypsin.

Fixation cellulaire et coloration de l'ADN Pour les analyses de la progression du cycle cellulaire en cytométrie en flux, les cellules ont été centrifugées et le culot a été resuspendu dans 100 pL de milieu de culture complet avant fixation dans 2 mL d'éthanol 70% dans du PBS pendant au moins 30 min à -20 C. L'utilisation du milieu complet au lieu du PBS, pour resuspendre les cellules avant la fixation, est essentielle pour minimiser la formation de doublets et plus généralement d'agrégatscellulaires. Après fixation, les cellules ont été centrifugées et re-suspendues dans 1 mL de solution de marquage (PBS contenant soit 100 pg/mL de RNAse A (Sigma) et 40 pg/mL d'iodure de propidium, soit 1 pM de Hoechst 33258) et incubées pendant 30 min à température ambiante.  Cell fixation and DNA staining For cell cycle analysis in flow cytometry, the cells were centrifuged and the pellet was resuspended in 100 μl of complete culture medium before fixation in 2 ml of ethanol. % in PBS for at least 30 min at -20 C. The use of complete medium instead of PBS, to resuspend the cells before fixation, is essential to minimize the formation of doublets and more generally of cell aggregates. After fixation, the cells were centrifuged and resuspended in 1 ml of labeling solution (PBS containing either 100 μg / ml of RNAse A (Sigma) and 40 μg / ml of propidium iodide, or 1 μM of Hoechst 33258 ) and incubated for 30 min at room temperature.

Cytométrie en flux Les analyses et les tris ont été réalisés avec un cytomètre de flux Coulter Elite-ESP (Beckman-Coulter), en utilisant un laser argon émettant 15 mW à 488 nm et une largeur de faisceau de 86,9 pm. La fluorescence de l'iodure de propidium est collectée au travers d'un filtre à bande passante de 620 nm et affichée en échelle linéaire. Lorsque le Hoechst 33258 est utilisé, l'excitation est effectuée à l'aide d'un laser argon émettant 100 mW à 350 nm et une largeur de faisceau de 81,5 pm de laser argon refroidi par l'eau, la fluorescence émise est collectée au travers d'un filtre à bande passante de 450 nm. Les cellules sont triées selon plusieurs fenêtres du cycle cellulaire basées sur l'intensité de marquage de l'iodure de propidium ou du Hoechst. La fraction de mitose tardive et cytodiérèse (population C) est fenêtrée sur la base des composants spatio-temporels du signal de fluorescence, avec une valeur du pic d'ADN correspondant à l'index d'ADN (DI=1) versus une valeur intégrée de l'ADN correspondant à DI=2. On peut noter que la largeur du faisceau est similaire à la distance entre les noyaux de deux cellules filles durant la cytodiérèse.  Flow Cytometry The analyzes and sorts were performed with a Coulter Elite-ESP flow cytometer (Beckman-Coulter), using an argon laser emitting 15 mW at 488 nm and a beam width of 86.9 μm. The fluorescence of propidium iodide is collected through a 620 nm bandwidth filter and displayed on a linear scale. When Hoechst 33258 is used, the excitation is carried out using an argon laser emitting 100 mW at 350 nm and a beam width of 81.5 μm of argon laser cooled by water, the fluorescence emitted is collected through a bandwidth filter of 450 nm. The cells are sorted according to several windows of the cell cycle based on the labeling intensity of propidium iodide or Hoechst. The late mitosis fraction and cytodiesesis (population C) is windowed based on the spatio-temporal components of the fluorescence signal, with a DNA peak value corresponding to the DNA index (DI = 1) versus a value integrated DNA corresponding to DI = 2. It can be noted that the width of the beam is similar to the distance between the nuclei of two daughter cells during cytodiérèse.

Microscopie à immunofluorescence Environ 2000 cellules de la population C décrite précédemment ont été triées directement sur des lames de microscope, séchées à l'air et preparées pour une détection immunofluorescente. Après rinçage dans du PBS, les cellules ont été incubées pendant 30 minutes avec 10% de sérum de chèvre dans du PBS à température ambiante. Après trois lavages dans du PBS, les cellules ont été incubées pendant 1h à température ambiante avec les anticorps primaires anti-atubuline (dilution 1/1000 dans du PBS, DM1A, Sigma), le phospho-épitope MPM2 mitotique (dilution 1/250 dans du PBS, O.T.181, Abcam) et l'histone H3 Serl0-phosphorylée (dilution 1/500, Sigma), ont été lavées dans du PBS et marquées pendant 1h à température ambiante avec les anticorps secondaires appropriés conjugués à Alexa 488 ou Alexa 568 (dilution 1/1000 dans du PBS, Molecular Probes). Les cellules ont été ensuite post-fixées pendant 30 minutes avec du PBS 1% paraformaldéhyde et montées dans du milieu Vectashield (Vector). Environ 500 cellules aléatoires ont été analysées au microscope pour la morphologie des microtubules et de l'ADN et pour la positivité pour MPM2 ou phospho-histone H3. Les images ont été obtenues sur un microscope à fluorescence Olympus BX41 (objectif x40) à partir d'une caméra CoolSnap pilotée par le logiciel Metaview (Universal Imaging). Les images ont été traitées avec le logiciel Adobe Photoshop (v6.0).  Immunofluorescence Microscopy About 2000 cells of the population C described above were sorted directly onto microscope slides, air dried and prepared for immunofluorescent detection. After rinsing in PBS, the cells were incubated for 30 minutes with 10% goat serum in PBS at room temperature. After three washes in PBS, the cells were incubated for 1 hour at room temperature with the primary anti-atubulin antibodies (dilution 1/1000 in PBS, DM1A, Sigma), the mitotic MPM2 phospho-epitope (dilution 1/250 in PBS, OT181, Abcam) and histone H3 Ser10-phosphorylated (1/500 dilution, Sigma), were washed in PBS and labeled for 1h at room temperature with appropriate secondary antibodies conjugated to Alexa 488 or Alexa 568 (1/1000 dilution in PBS, Molecular Probes). The cells were then post-fixed for 30 minutes with 1% paraformaldehyde PBS and mounted in Vectashield medium (Vector). Approximately 500 random cells were analyzed under the microscope for microtubule and DNA morphology and for positivity for MPM2 or phosphohistone H3. The images were obtained on an Olympus BX41 fluorescence microscope (x40 lens) from a CoolSnap camera driven by Metaview (Universal Imaging) software. The images were processed with Adobe Photoshop (v6.0).

Immunomarquage Les cellules triées ont été collectées par centrifugation et lysées pendant 5 minutes à 100 C dans du tampon Laemmli 2X (Tris-HC1 125 mM, pH 6,8, 20% glycérol, 0,04% de bleu de bromophénol, 4% SDS, 4% (3-mercaptoéthanol). Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE (12%, pH 8,7) et transférées sur membrane de nitrocellulose (Hybond C, Amersham). Les membranes ont été saturées avec 5% de lait à faible teneur en matière grasse dans du tampon TNT (25 mM Tris-HC1, pH7,5, 0,2 M MaCl, 0,1% tween 20) et incubées pendant la nuit dans du tampon TNT supplémenté avec 2% de sérum de cheval avec les anticorps contre cycline B1 (dilution 1/200, GNS1, Santa Cruz), Aurora B (dilution 1/250, AIM1, BD Bioscience) et Cdkl (p34cdc2,sc-54, dilution 1/500, Santa Cruz). Après incubation avec les anticorps secondaires appropriés conjugués à la peroxydase (dilution 1/10000, Amersham), les membranes ont été révélées en utilisant le système SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce).  Immunolabeling The sorted cells were collected by centrifugation and lysed for 5 minutes at 100 ° C. in 2X Laemmli buffer (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% glycerol, 0.04% bromophenol blue, 4% SDS , 4% (3-mercaptoethanol) Proteins were separated by SDS-PAGE (12%, pH 8.7) and transferred to nitrocellulose membrane (Hybond C, Amersham) The membranes were saturated with 5% milk low-fat in TNT buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 M MaCl, 0.1% tween 20) and incubated overnight in TNT buffer supplemented with 2% horse with antibodies against cyclin B1 (dilution 1/200, GNS1, Santa Cruz), Aurora B (dilution 1/250, AIM1, BD Bioscience) and Cdkl (p34cdc2, sc-54, dilution 1/500, Santa Cruz). After incubation with the appropriate secondary antibodies conjugated to peroxidase (1/10000 dilution, Amersham), the membranes were revealed using the SuperSignal West Pico system. Chemiluminescent Substrate (Pierce).

2- Résultats Détection d'une population cellulaire, qui apparaît transitoirement après levée de l'arrêt mitotique.30 Des cellules synchronisées en prométaphase en présence de nocodazole ont été récoltées par choc sur les boites et cultivées en absence de drogue. Dans ces conditions, il est connu que la plupart des cellules reprennent la mitose et entrent en cytodiérèse en moyenne 90 minutes après la remise en culture. Les cellules ont été récoltées et fixées à différents temps, l'ADN a été coloré avec de l'iodure de propidium ou du Hoechst et une analyse de la fluorescence a été réalisée au cytomètre. Comme montré dans la figure 3a, une population cellulaire, appelée population C, apparaît transitoirement avec un contenu en ADN total DI=2 et une valeur du pic d'ADN similaire à celle des cellules en phase Gl (DI=1). Cette population serait interprétée comme des doublets de cellules G1 en analyse classique du cycle cellulaire basée sur le contenu en ADN, et serait normalement exclue. Cependant, dans cette expérience, la population C correspond bien à l'hypothèse d'une accumulation transitoire de cellules en mitose tardive et cytodiérèse. Cette hypothèse est en outre supportée par les cinétiques, qui montrent que la population C représente un stade intermédiaire entre la métaphase et la phase G1, avec une valeur maximale de 35% 90 minutes après levée de l'arrêt mitotique (figure 3b, les barres grises représentent les cellules en mitose, les barres noires les cellules en cytodiérèse, et les barres hachurées les cellules en phase G1 ).  2- Results Detection of a cell population, which appears transiently after emergence of the mitotic stop. Synodized cells in prometaphase in the presence of nocodazole were harvested by shock on the dishes and cultured in the absence of drugs. Under these conditions, it is known that most cells resume mitosis and enter cytodiesesis on average 90 minutes after re-culture. The cells were harvested and fixed at different times, the DNA was stained with propidium iodide or Hoechst and fluorescence was analyzed by cytometer. As shown in Fig. 3a, a cell population, termed population C, transiently appears with a total DNA content DI = 2 and a DNA peak value similar to that of Gl phase cells (DI = 1). This population would be interpreted as doublets of G1 cells in classical cell cycle analysis based on DNA content, and would normally be excluded. However, in this experiment, the population C corresponds well to the hypothesis of a transient accumulation of cells in late mitosis and cytodiesesis. This hypothesis is further supported by the kinetics, which show that the C population represents an intermediate stage between the metaphase and the G1 phase, with a maximum value of 35% 90 minutes after emergence of the mitotic arrest (FIG. gray represent cells in mitosis, black bars cells in cytodiérèse, and bars hatched cells in phase G1).

La population C est fortement enrichie en cellules en cytodiérèse Pour caractériser la population C, les cellules ont été synchronisées comme décrit précédemment, récoltées 90 minutes après levée de l'arrêt mitotique et triées sur la base de leur intensité de fluorescence de l'ADN versus le pic (région R3 correspondant à la population C sur la figure 4a). Pour tester la pureté de la population C triée, les cellules ont été analysées par cytométrie en flux (figure 4b). Les résultats montrent un enrichissement de 4 fois de la population C. Dans la même expérience, les cellules de la population C ont été triées directement sur des lames pour analyse microscopique (figure 5). Pour identifier le stade du cycle cellulaire et distinguer les cellules en cytodiérèse des vrais doublets de cellules en phase G1, le cytosquelette de microtubules a été immunomarqué avec un anticorps contre l'a-tubuline (figure 5). Les cellules mitotiques ont été identifiées par immunomarquage avec MPM2 (données non montrées). L'histone H3 phosphorylée sur la sérine 10 a aussi été utilisée comme un marqueur caractéristique de la mitose. Comme illustré par la figure 7, l'histone H3 phosphorylée est détectée dans les cellules mitotiques de la métaphase à la télophase, tandis que les cellules en cytodiérèse sont négatives. Les résultats du comptage cellulaire par la méthode utilisant la microscopie sont résumés dans le tableau 1.  The population C is highly enriched in cytodiérèse cells To characterize the population C, the cells were synchronized as described previously, harvested 90 minutes after the mitotic arrest was lifted and sorted on the basis of their fluorescence intensity of the DNA versus the peak (region R3 corresponding to the population C in Figure 4a). To test the purity of the sorted population C, the cells were analyzed by flow cytometry (FIG. 4b). The results show a 4-fold enrichment of the C population. In the same experiment, the cells of the C population were sorted directly on slides for microscopic analysis (FIG. 5). To identify the stage of the cell cycle and distinguish the cells in cytodiérèse from true doublets of G1 cells, the microtubule cytoskeleton was immunostained with an antibody against α-tubulin (Figure 5). Mitotic cells were identified by immunolabeling with MPM2 (data not shown). H3 histone phosphorylated on serine was also used as a characteristic marker of mitosis. As illustrated in Figure 7, phosphorylated histone H3 is detected in mitotic cells from metaphase to telophase, while cells in cytodiesesis are negative. Cell count results using the microscopy method are summarized in Table 1.

Tableau 1 Contrôle (a) 90 minutes (b) Non Population Non Population triées C triée triées C triée Interphase 90,3% 31,7% 15,1% 4,5% Doublets G1 3,6% 37,4% 0,6% 0,8% Métaphase 3,8% 0,8% 65,0% 0,7% Anaphase/télophase 0,1% 5,7% 5,0% 17,6% cytodiérèse 2,2% 24,4% 14,3% 76,4% (a) cellules asynchrones (b) temps de récolte après mise en culture de cellules mitotiques synchronisées par le nocodazole La population C comprend une majorité (76,4%) de cellules en cytodiérèse et un pourcentage significatif de cellules en mitose tardive. Il est à remarquer que la population C présente seulement une contamination minime par des cellules G1 (au total 5,3%) et des cellules en métaphase (moins de 1%). Ces résultats démontrent que les cellules en cytodiérèse et mitose tardive sont triées efficacement par cytométrie en flux en tant que population C.  Table 1 Control (a) 90 minutes (b) No Population No Sorted population C sorted sorted C sorted Interphase 90.3% 31.7% 15.1% 4.5% Doublets G1 3.6% 37.4% 0, 6% 0.8% Metaphase 3.8% 0.8% 65.0% 0.7% Anaphase / telophase 0.1% 5.7% 5.0% 17.6% Cytodesteresis 2.2% 24.4 % 14.3% 76.4% (a) asynchronous cells (b) harvest time after culture of mitotic cells synchronized with nocodazole Population C comprises a majority (76.4%) of cells in cytodiesesis and a percentage significant cell late mitosis. It should be noted that population C has only minimal contamination by G1 cells (in total 5.3%) and cells in metaphase (less than 1%). These results demonstrate that cells in cytodiesesis and late mitosis are efficiently sorted by flow cytometry as a C population.

Il est à noter que le pourcentage de cellules en cytodiérèse est Il% plus faible lorsqu'il est déterminé par cytométrie en flux (65%, figure 4b) par rapport au comptage direct sur les lames de microscopie (76,5%, tableau 1). Cette différence peut être expliquée par la rupture du pont inter-cellulaire pendant la seconde analyse en cytométrie en flux des cellules triées. Il existe en effet une différence correspondante dans les pourcentages de cellules en G1 déterminés par ces deux méthodes (18,2% en cytométrie en flux, figure 4b versus 5,3% en microscopie, tableau 1). L'analyse microscopique des cellules triées en G1 après un second passage au cytomètre montre que la majorité des cellules présente une rupture du pont (figure 6f). De plus, une observation similaire a été faite lors de l'analyse des cellules G1 récoltées pendant le premier passage au cytomètre. Tandis que 55% de ces cellules étaient en interphase, 44% présentaient un pont typique de cytodiérèse cassé. La population C triée à partir de culture de cellules HeLa asynchrones a aussi été analysée. Comme montré dans le tableau 1, les cellules en cytodiérèse sont enrichies 10 fois après tri cellulaire. Cependant, la population C ne contient que 24% de cellules en cytodiérèse et présente une majorité de cellules en Gl. Ainsi, la mesure du pourcentage de cellules dans la population C ne permet pas une détermination exacte du pourcentage de cellules en cytodiérèse dans une culture asynchrone.  It should be noted that the percentage of cells in cytodiérèse is 11% lower when determined by flow cytometry (65%, FIG. 4b) relative to the direct count on the microscopy slides (76.5%, Table 1). ). This difference can be explained by the breaking of the inter-cellular bridge during the second flow cytometric analysis of the sorted cells. There is indeed a corresponding difference in the percentages of G1 cells determined by these two methods (18.2% in flow cytometry, Figure 4b versus 5.3% in microscopy, Table 1). Microscopic analysis of the cells sorted in G1 after a second pass to the cytometer shows that the majority of the cells show a bridge break (FIG. 6f). In addition, a similar observation was made during the analysis of G1 cells harvested during the first cytometer passage. While 55% of these cells were in interphase, 44% had a typical broken cytodiérèse bridge. Population C sorted from asynchronous HeLa cell culture was also analyzed. As shown in Table 1, cells in cytodiesesis are enriched 10 times after cell sorting. However, the population C contains only 24% of cells in cytodiérèse and has a majority of cells in G1. Thus, the measurement of the percentage of cells in the population C does not allow an exact determination of the percentage of cells in cytokinesis in an asynchronous culture.

Parce que l'arrêt du cycle cellulaire induit par le nocodazole peut affecter la croissance cellulaire et le métabolisme, une expérience permettant de détecter des cellules en cytodiérèse dans une culture de cellules mitotiques a été réalisée, en récoltant par choc sur les boites les cellules en mitose à partir d'une culture de cellules asynchrones non traitées. Comme attendu, une accumulation transitoire de cellules dans la population C a été observée, indiquant que la cytodiérèse a lieu rapidement, environ 30 minutes après la mise en culture dans ces conditions. La présence de cellules en cytodiérèse dans la population C a été confirmée par analyse microscopique de la population triée. Une majorité de cellules en cytodiérèse (60%) ou en mitose tardive (30%) ont été observées, mais aussi des cellules contaminantes en métaphase (3%) et en interphase (9% de singulets et doublets Gl). Ainsi, la population C est moins pure que celle obtenue après une synchronisation préalable par le nocodazole. Cette moins bonne pureté résulte de la méthode de choc, qui détache aussi bien les cellules en mitose tardive que les cellules en métaphase.  Because nocodazole-induced cell cycle arrest can affect cell growth and metabolism, an experiment to detect cells in cytokinesis in a mitotic cell culture was performed by harvesting the cells from mitosis from untreated asynchronous cell culture. As expected, transient accumulation of cells in the C population was observed, indicating that cytodiesesis occurs rapidly, approximately 30 minutes after culturing under these conditions. The presence of cells in cytodiérèse in population C was confirmed by microscopic analysis of the sorted population. A majority of cells in cytodiérèse (60%) or in late mitosis (30%) were observed, but also contaminating cells in metaphase (3%) and interphase (9% singlet and G1 doublets). Thus, the population C is less pure than that obtained after prior synchronization with nocodazole. This poorer purity results from the shock method, which detaches both late mitotic cells and cells in metaphase.

L'analyse biochimique après tri cellulaire montre que la population C exprime Aurora B mais pas cycline B1 Un certain nombre de protéines régulatrices sont dégradées lors de la sortie de mitose. La protéine mitotique Cycline Bl commence à être dégradée aussitôt que la cellule entre en anaphase, tandis que la dégradation de Aurora B n'a lieu que plus tard durant la cytodiérèse et la phase Gl. La population C devrait donc présenter des niveaux détectables de Aurora B mais peu ou pas de cycline B1. Les cellules triées ont été lysées directement dans du tampon dénaturant Laemmli. L'immunomarquage de 104 cellules triées, en mitose ou dans la population C, a montré la présence de Aurora B dans les deux cas. Les niveaux de Aurora B ne sont pas significativement différents entre les cellules de la population C et celles en métaphase, ce qui est en accord avec sa cinétique de dégradation en phase G1 précoce. Comme attendu, la cycline Bl est pratiquement indétectable dans la population C (figure 8).  The biochemical analysis after cell sorting shows that the C population expresses Aurora B but not B1 cyclin. A number of regulatory proteins are degraded upon the release of mitosis. Cyclin B1 mitotic protein begins to degrade as soon as the cell enters anaphase, whereas Aurora B degradation occurs only later during cytodiéresis and G1 phase. Population C should therefore have detectable levels of Aurora B but little or no cyclin B1. The sorted cells were lysed directly in denaturing Laemmli buffer. Immunostaining of 104 sorted cells, in mitosis or in population C, showed the presence of Aurora B in both cases. Aurora B levels are not significantly different between population C and metaphase cells, which is consistent with early G1 degradation kinetics. As expected, cyclin B1 is virtually undetectable in population C (Figure 8).

Ces résultats montrent que la procédure incluant la synchronisation cellulaire, la fixation à l'éthanol, la coloration de l'ADN et le tri au cytomètre en flux de la population C est compatible avec une analyse postérieure en immunomarquage.15  These results show that the procedure including cell synchronization, ethanol binding, DNA staining, and flow cytometer sorting of the C population is consistent with subsequent immunolabeling analysis.

Claims (13)

REVENDICATIONS 1. Méthode de détection et de dénombrement de cellules en cytodiérèse, comprenant : la fixation des cellules et optionnellement la perméabilisation des cellules, la coloration quantitative de l'ADN des cellules par un colorant fluorescent vital ou non, - la mesure par tout moyen approprié de l'intensité de fluorescence du pic d'ADN et de l'aire sous la courbe, le dénombrement des cellules en cytodiérèse selon les caractéristiques suivantes : les cellules en cytodiérèse possèdent une aire sous la courbe similaire à celle de cellules en phase G2 ou M du cycle cellulaire et un pic de fluorescence similaire à celui des cellules en phase GO ou G1 du cycle cellulaire.  1. A method for detecting and counting cells in cytodiesesis, comprising: the attachment of the cells and optionally the permeabilization of the cells, the quantitative staining of the DNA of the cells with a vital or non-vital fluorescent dye, - measurement by any appropriate means of the fluorescence intensity of the DNA peak and the area under the curve, the counting of the cells in cytodieseresis according to the following characteristics: the cells in cytodiesesis have an area under the curve similar to that of cells in phase G2 or Cell cycle M and a fluorescence peak similar to that of cells in phase GO or G1 of the cell cycle. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la mesure de l'intensité de fluorescence du pic d'ADN et 20 de l'aire sous la courbe est réalisée à l'aide d'un cytomètre en flux, et le dénombrement des cellules en cytodiérèse est réalisé à l'aide d'un logiciel d'analyse approprié au cytomètre en flux. 25  2. Method according to claim 1, characterized in that the measurement of the fluorescence intensity of the DNA peak and the area under the curve is carried out using a flow cytometer, and the enumeration cells in cytodiérèse is carried out using an appropriate analysis software flow cytometer. 25 3. Méthode selon quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que la coloration de l'ADN est réalisée à l'aide d'un colorant fluorescent, notamment un intercalant (l'iodure de propidium, le bromure d'éthidium), un colorant liant les bases A :T (le Hoechst 33342 ou 33258 ) ou les 30 bases G :C (la 7-amino-actinomycine D), ou une cyanine. 10 15  3. Method according to any one of claims 1 to 2, characterized in that the coloration of the DNA is carried out using a fluorescent dye, in particular an intercalant (propidium iodide, ethidium bromide), an A: T binding dye (Hoechst 33342 or 33258) or G: C bases (7-amino-actinomycin D), or a cyanine. 10 15 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est applicable à toute cellule en culture adhérente ou en suspension, ou cellule primaire dissociée à partir d'un tissu.  4. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that it is applicable to any cell in adherent culture or suspension, or primary cell dissociated from a tissue. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape préliminaire de purification et de remise en culture des cellules mitotiques. 10  5. Method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it further comprises a preliminary step of purification and culture of mitotic cells. 10 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape préliminaire d'enrichissement des cellules mitotiques suivie optionnellement d'une étape de purification des cellules 15 mitotiques.  6. Method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that it further comprises a preliminary step of enriching mitotic cells optionally followed by a mitotic cell purification step. 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'étape d'enrichissement est réalisée par synchronisation des cellules en métaphase de mitose. 20  7. Method according to claim 6, characterized in that the enrichment step is carried out by synchronization of cells in metaphase mitosis. 20 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape d'immunomarquage avec des marqueurs mitotiques sélectifs ou des marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse, 25 préalablement, en même temps ou après l'étape de coloration de l'ADN.  8. Method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that it further comprises a step of immunostaining with selective mitotic markers or joint markers of mitosis and cytodiérèse, previously, at the same time. time or after the step of staining the DNA. 9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que les marqueurs mitotiques sélectifs sont choisis parmi le 30 groupe constitué par cycline Bl, MPM2 ou phospho-histone H3.5  9. Method according to claim 8, characterized in that the selective mitotic markers are selected from the group consisting of cyclin B1, MPM2 or phospho-histone H3.5 10. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que les marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse sont choisis parmi le groupe constitué par les protéines présentes dans le complexe de protéines passagères, telles que Aurora B, survivine, Polo-like kinase, et les kinésines associées MKLP1 et MKLP2.  10. Method according to claim 8, characterized in that the joint markers of mitosis and cytodiérèse are chosen from the group consisting of the proteins present in the complex of transient proteins, such as Aurora B, survivin, Polo-like kinase , and the associated kinesins MKLP1 and MKLP2. 11. Méthode de tri des cellules en cytodiérèse, ladite méthode comprenant à la suite des étapes de détection et de dénombrement des cellules en cytodiérèse telles que décrites dans les revendications 1 à 10, une étape de tri de la population de cellules en cytodiérèse à l'aide d'un trieur de cellules.  11. A method of sorting cells in cytodiesesis, said method comprising, following the steps of detecting and counting the cells in cytodiérèse as described in claims 1 to 10, a step of sorting the population of cells into cytodieseresis. using a cell sorter. 12. Méthode de tri selon la revendication 11, caractérisée en ce que une étape d'enrichissement en cellules en cytodiérèse consécutive à une étape de purification et de remise en culture des cellules mitotiques sont préliminairement réalisées, et un marquage à l'aide des marqueurs mitotiques sélectifs ou des marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse tel que décrit dans les revendications 8 à 10 est en outre réalisé.  12. Sorting method according to claim 11, characterized in that a cell enrichment step in cytodiérèse consecutive to a step of purification and culture of mitotic cells are preliminary carried out, and marking with the help of markers. Selective mitotic or joint markers of mitosis and cytodiesesis as described in claims 8 to 10 is further provided. 13. Méthode de criblage d'agents capables d'accélérer ou de ralentir, d'activer ou d'inhiber la cytodiérèse, ladite méthode comprenant la culture de cellules dans un milieu adéquat en présence de l'agent à tester et la détection et le dénombrement des cellules en cytodiérèse tel que décrit dans les revendications 1 à 10.30  A method of screening for agents capable of accelerating or slowing down, of activating or inhibiting cytodiesesis, said method comprising culturing cells in a suitable medium in the presence of the agent to be tested and detecting and preventing counting cells in cytodiesesis as described in claims 1 to 10.30
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