FR2894031A1 - Procede pour la mise en evidence de la presence ou de l'absence de marqueurs associes a la chimiosensibilite des tumeurs - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un nouveau procédé de diagnostic pour détecter la présence ou l'absence d'une tumeur et sa sensibilité aux chimiothérapies chez un mammifère, en particulier chez l'homme, par détection et/ou quantification de la présence d'un nouveau marqueur biologique dans un échantillon biologique préalablement prélevé chez ledit mammifère : une protéine eEF1A1.L'absence d'une protéine eEF1A1 ou d'anticorps dirigés contre une protéine eEF1A1

Description

Procédé pour la mise en évidence de la présence ou de l'absence de

marqueurs associés à la chimiosensibilité des tumeurs

La présente invention concerne un nouveau procédé permettant de mettre en évidence la présence ou l'absence de marqueurs associés aux tumeurs et à leur sensibilité aux chimiothérapies. L'invention concerne également des kits de diagnostic comprenant les moyens permettant de mettre en oeuvre le procédé selon l'invention ainsi que l'utilisation de composés inhibiteurs de l'activité ou de l'expression desdits marqueurs pour inhiber la croissance de cellules tumorales. :l0 Dans le domaine des pathologies, les cancers occupent une place prépondérante en terme de prévalence, incidence et mortalité. Les phénomènes de cancérisation sont liés à des désordres cellulaires complexes, imparfaitement connus, qui peuvent affecter tous les organes. Les moyens de dépistage des cancers et de lutte restent imparfaits. Il existe une grande variété de phénomènes tumoraux qui peuvent survenir, à tous les âges 15 d'un individu et affecter la plupart des zones fonctionnelles d'un organisme humain. En particulier, le système nerveux central (SNC), organe complexe, constitué de nombreux types cellulaires différents n'échappe pas à ces phénomènes pathologiques morbides et très diversifiés. De fait, il existe de nombreux types de tumeurs solides du cerveau. Ces tumeurs correspondent au développement de phénomènes oncologiques affectant les cellules constitutives du SNC elles-20 mêmes (cellules neuronales, cellules gliales,...). Il existe en outre d'autres tumeurs localisées dans le SNC qui sont la conséquence de métastases issues de tumeurs d'autres organes. Les tumeurs du SNC se caractérisent par un certain nombre de paramètres anatomiques, biologiques et cliniques. A l'heure actuelle, l'analyse soignée de ces paramètres conditionne de manière prédominante la stratégie d'action thérapeutique engagée par le clinicien. Le phénotype spécifique des tumeurs 25 constitue un élément, qui permet, très imparfaitement encore, d'évaluer de manière pronostique les chances de survie du patient. Parmi les explorations permettant de classifier les tumeurs cérébrales on peut citer : -L'imagerie médicale (tomodensitométrie et imagerie par résonance magnétique) - L'analyse morphologique et histologique effectuée sur des biopsies 30 - L'analyse biomoléculaire : recherche de marqueurs protéiques par immuno-détection, analyse cytogénétique (eg, détection de macro-anomalies génétiques par hybridation de sondes)... Le diagnostic des tumeurs et plus particulièrement pour les tumeurs du SNC repose de manière prédominante sur une analyse histologique réalisée par l'anatomo-pathologiste. :35 Malheureusement les discordances diagnostiques observées entre experts du domaine sont énormes (jusqu'à 64% de désaccord selon les tumeurs). Pire, des discordances similaires peuvent être notées lorsque les interprétations d'échantillons identiques sont confiées à la même personne à quelques semaines d'intervalle (Mittler et al, 1996 ; Bruner et al, 1997 ; Coons et al, 1997). Ce constat est inquiétant quand on sait que des erreurs de diagnostics peuvent entraîner une radiothérapie et/ou une chimiothérapie inutile et lourde de conséquences pour le patient. En complément de l'analyse histologique, il n'existe que quelques rares tests-diagnostiques basés sur des approches moléculaires. Les observations cytologiques peuvent être ainsi complétées par la recherche d'anomalies génétiques et dans quelques laboratoires de la détection de certains marqueurs protéiques à l'aide d'anticorps spécifiques. Il n'existe pas en routine, pour l'instant, de tests basés sur une détection et quantification de concentration de marqueurs transcriptomiques des tumeurs. Les quelques tests moléculaires disponibles actuellement ne permettent pas de distinguer sans ambiguïté les différents types de cellules tumorales et surtout, de pronostiquer correctement leur sensibilité aux cytotoxiques. Il est donc important de pouvoir disposer de nouvelles méthodes permettant de détecter facilement, sensiblement et précocement la présence de tumeurs et leur sensibilité aux chimiothérapies afin de mettre en oeuvre les stratégies thérapeutiques adaptées au mieux pour le traitement de chaque patient. l 5 La présente invention concerne donc un nouveau procédé de diagnostic pour détecter la présence ou l'absence d'une tumeur et sa sensibilité aux chimiothérapies chez un mammifère, en particulier chez l'homme, par détection et/ou quantification de la présence d'un nouveau marqueur biologique dans un échantillon biologique préalablement prélevé chez ledit mammifère : une protéine eEF1Al (facteur d'élongation de la synthèse protéique; référence Swiss-Prot : 20 http://www.expasy.org/uniprot/P68104). L'absence d'une protéine eEF1Al ou d'anticorps dirigés contre une protéine eEF1Al ou un fragment comprenant au moins un épitope de ladite protéine, ou une faible concentration par rapport aux concentrations observées chez les personnes saines ou les patients atteints de cancers sensibles aux chimiothérapies est caractéristique de la présence d'une tumeur a priori résistante aux 25 chimiothérapies usuelles (chimiorésistante). A l'inverse, un taux de protéine eEF1Al ou d'anticorps dirigés contre une protéine eEF1A1 ou un fragment comprenant au moins un épitope de ladite protéine comparable à celui observé pour des personnes saines est caractéristique d'une tumeur a priori sensible aux chimiothérapies usuelles (chimiosensible). 30 La présente invention concerne donc un procédé susceptible d'être employé pour détecter la présence ou l'absence d'une tumeur et sa sensibilité aux chimiothérapies chez un mammifère, ledit procédé comprenant une étape de détecter et/ou quantifier sur un échantillon biologique préalablement prélevé sur ledit mammifère : - la présence d'une protéine eEF1Al, et/ou 35 la présence d'anticorps dirigés contre une protéine eEF1A1 ou un fragment comprenant au moins un épitope de cette protéine.

Par protéine eEFlA1, on entend selon l'invention une protéine qui comprend une séquence protéique de la protéine eEF1Al de référence (Swiss-Prot: http://www.expasy.org/uniprot/P68104), ses isoformes, ses variants et ses fragments biologiquement actifs. Les isoformes, fragments ou variants biologiquement actifs selon l'invention sont reconnus 5 par les anticorps anti-eEF1A1. Par variants, on entend selon l'invention des protéines qui présentent avantageusement au moins 75% d'identité avec la protéine eEF1Al de référence, plus préférentiellement au moins 80%, plus préférentiellement au moins environ 85% d'identité. Les méthodes d'alignement et de calcul d'identités de séquences sont bien connues de 10 l'homme du métier et accessibles directement sur Internet. On citera notamment le programme BLAST, qui peut être utilisé à partir du site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ avec les paramètres indiqués par défaut sur ce site. On peut aussi avantageusement utiliser la recherche avancée de BlastP en affinant la recherche avec un motif (PHI-BLAST). Pour l'alignement des séquences, on peut utiliser les programmes CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) ou l.5 MULTALIN ((http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/ ), avec les paramètres indiqués par défaut sur ces sites. Les différences entre les variants de eEF1Al et la séquence de référence peuvent être dues, à des délétions d'au moins un acide aminé et lorsque plusieurs acides aminés sont délétés ils peuvent être contigus ou séparés sur la séquence de référence. Les différences peuvent également 20 être dues à des mutations, au moins un acide aminé étant remplacer par un acide aminé différent dans la séquence de référence. Les différences peuvent aussi être dues à l'ajout d'au moins un acide aminé au sein de la séquence de référence. Lorsque plusieurs acides aminés sont ajoutés au sein de la séquence de référence, ils peuvent être contigus, c'est-à-dire formant un fragment protéique d'au moins 2 acides aminés, ou répartis sur la séquence ou les deux. 25 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le variant de eEF1Al comprend au moins un fragment protéique inséré dans la séquence eEF1Al de référence. Ce fragment peut comprendre jusqu'à 100 acides aminés, généralement entre 10 et 60 acides aminés. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la protéine eEF1A1 comprend la séquence protéique représentée sur la SEQ ID NO 1. 30 De manière avantageuse, l'échantillon biologique préalablement prélevé est choisi parmi un échantillon de sérum sanguin, de lymphe, de liquide kystique, d'homogénats tissulaires, de préférence un échantillon de sérum sanguin. Il est entendu que selon la méthode de détection et/ou de quantification employée, l'échantillon biologique prélevé pourra subir un traitement préalable à son analyse, par exemple de 35 broyage et/ou de dissolution. De tels traitements sont bien connus de l'homme du métier en relation avec les méthodes de détection.

Les moyens de détection et/ou de quantification de la présence d'une protéine ou d'anticorps dans un échantillon biologique sont bien connus de l'homme du métier, notamment décrites ci-après et dans les exemples. Les méthodes décrites ci-après sont présentées à titre indicatif et ne constituent en aucune manière une liste exhaustive des approches techniques pouvant être utilisées pour la mise en oeuvre de l'invention. L'homme du métier saura identifier selon l'état d'évolution et d'optimisation des techniques, à tout moment, quels sont les procédés les mieux adaptés pour réaliser les analyses destinées à mettre en oeuvre l'invention tout en substituant avantageusement les méthodes de mesures et/ou d'immunoréactions décrites ici.

Sont présentées ci-après les méthodes rassemblées par souci de simplification dans les groupes suivants : • Tests impliquant une capture sur support • Tests de détection basés sur la mise en évidence macroscopique des complexes-immuns • Tests basés sur les marquages isotopiques et le RIA (radio-immun assays) • Analyses basées sur les techniques d'immuno-histo-chimie • Tests basés sur les méthodes de transfert de fluorescence, FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), ou de transfert d'énergie basé sur la luminescence BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer). Les tests impliquant une capture sur support Dans les méthodes décrites ci-dessous, il est fait mention de l'utilisation d'antigènes correspondant à une protéine eEF 1 Al ou à un fragment de cette protéine comprenant au moins un épitope reconnu par les anticorps anti-eEFlA1. Il est donc entendu que les tests peuvent être aussi réalisés avec des fragments seulement de ces protéines-antigènes (peptides naturels ou synthétiques ou chimériques,...) ou des composés et molécules de type haptènes capables de réagir de manière sélective avec les anticorps anti-eEF1Al dont la présence dans les sérums est recherchée. Le Western-blot et la méthode ELISA décrites ci-après sont deux méthodes parmi les plus communément utilisées pour ce genre de tests. D'autres méthodes de détection de réactions antigènes-anticorps peuvent être employées exploitant divers modes d'interactions ou adsorptions des composants avec des supports, cupules de réactions ou systèmes de microdétection. Ces tests allient très souvent de hauts niveaux de performance, liés aux sensibilités élevées des méthodes, à la relative simplicité de manipulation des échantillons, à la robustesse des tests, et aux capacités de traitement à haut débit de nombreux échantillons en simultané. a) méthode basée sur le Western-blot (Towbin et al, 1979 ; I3urnette, 1981) Pour l'exécution de cette méthode, un extrait contenant au moins un antigène selon l'invention est soumis à migration électrophorétique en gel de polyacrylamide en milieu dénaturant. Cette technique est bien connue dans une de ces variantes sous l'acronyme de SPAGE : pour "SDS PolyAcrylamide Gel Electrophoresis" ; ou électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de l'agent détergent dénaturant Sodium Dodecyl Sulfate. La migration électrophorétique permet de séparer les protéines en fonction de leurs masses moléculaires respectives (Laemmli ,1970). A ]l'issue de cette séparation, et selon des protocoles classiques connus de l'homme du métier, des empreintes des protéines sont réalisées sur une membrane de type nylon et sont mises en incubation avec les sérums à analyser. Des protocoles de détection des Western-blots, très classiques, permettent de révéler la fixation des anticorps, qui étaient éventuellement présents dans les sérums, sur les antigènes fixés sur l'empreinte. Les protocoles permettent de révéler par des techniques radioactives, fluorescentes ou luminescentes la présence des anticorps. L'analyse peut être menée de manière à accéder à une estimation quantitative suffisamment précise du taux d'anticorps dans l'échantillon de départ pour réaliser un diagnostic d'intérêt clinique. Ce genre de test peut être réalisé en utilisant les équipements nécessaires à la réalisation de Western-blots distribués par Immunetics (Boston, MA, USA ; http://www.immunetics.com). b) méthode ELISA (et ses dérivés) Une des méthodes désormais classique, appelée ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assays) (Engvall et Perlmann, 1971, 1972 ; Engvall et al, 1971) consiste à provoquer la création des complexes antigènes-anticorps (complexes-immuns) sous forme immobilisée sur les parois des puits (cupules) de plaques de dosages multi-puits en matière plastique. Ce type de méthode se décline en une multitude de variantes selon que les protocoles reposent sur l'immobilisation première d'anticorps ou d'antigènes dans le fond des puits et selon les méthodes de révélation utilisées (ELISA direct ou indirect). A titre d'exemple, on peut brièvement mentionner que ce genre de test peut être exécuté selon la description qui suit pour la détection des anticorps dirigés contre l'antigène selon l'invention. Ainsi, les puits de la plaque de dosage ELISA sont remplis individuellement et de manière indépendante avec des dilutions croissantes de l'antigène. Les protéines se fixent par adsorption sur le fond des puits. Après lavage des puits, les protéines adhérentes sur les parois des puits sont mises en contact avec les anticorps recherchés et présents dans les sérums. De ce fait, s'ils sont présents dans les sérums, les anticorps s'immobiliseront dans le fond du puits par fixation aux protéines antigènes adsorbées sur la paroi de la cupule. Une étape de détection (basée par exemple sur un test colorimétrique simple) de la présence d'anticorps au fond des puits renseigne par voie de conséquence sur la présence de ces anticorps dans l'échantillon sérique de départ. La réalisation de dosages sur les dilutions de l'échantillon permet d'estimer de manière quantitative le taux des anticorps dans l'échantillon biologique. Les analyses des tests ELISA peuvent être réalisées sur des appareils tel que le système VIDAS distribué par Bio-Mérieux (http://www.biomerieux.com). c) méthodes basées sur les micro-arravs de protéines Dans une approche d'immobilisation de complexes-immuns, la technique des micro-arrays repose sur une logique de miniaturisation, automatisation et parallélisation plus ou moins massive du nombre de tests. Pour ces tests, il est nécessaire de créer des micro-arrays de protéines constitués de surfaces solides généralement planes (lames de verre, fragments de silicium, fonds de puits de plaques multi-puits en matière plastique...) comportant des antigènes fixés par divers procédés chimiques sur le support, chaque antigène étant déposé sur une petite surface du support représentant quelques micron-carrés de surface. Par exemple, les antigènes sont immobilisés sur le support par dépôt de microgouttes de suspension des antigènes sur ces supports (Peluso et al, 2003, Kusnezow et Hoheisel, 2003). Après incubation avec les échantillons à analyser, les complexes- immuns formés peuvent être détectés par divers moyens techniques, les plus courants reposant sur la détection de signaux de fluorescence ou par une méthode faisant appel à la résonance plasmonique de surface (Vikinge et al, 1998 ; Kusnezow et Hoheisel, 2003). Des tests basés sur les micro-arrays avec détection de fluorescence peuvent être envisagés selon des protocoles qui permettent même de réaliser une analyse directement sur un échantillon de sang total. Le système, tel celui proposé par Umedik (http://www.unedik.com/) comportant microarray et lecteur autorise l'analyse de plusieurs marqueurs en simultané avec quantification des intensités des signaux. La résonance plasmonique de surface repose sur un principe physique expérimental bien connu où la surface plane d'un film d'or réfléchit un rayon lumineux incident dans une direction prédite par les lois de l'optique classique. Néanmoins pour une toute petite partie du faisceau lumineux réfléchi et sous une certaine incidence, on constate une diminution significative du nombre de photons réfléchis. L'angle d'incidence de la zone de réflexion de la zone moins lumineuse dépend de la quantité de matière fixée sur la face du film d'or opposée à la face irradiée par le faisceau lumineux incident. Toute interaction d'anticorps, d'antigènes ou constitution de complexes-immuns sur la face opposée d'un détecteur basée sur la résonance plasmonique et irradiée sous une certaine incidence par un rayon lumineux provoque donc un changement sensible de l'angle de réflexion de la partie moins lumineuse du faisceau de lumière réfléchi. La détection de cette déflexion de l'angle de réflexion permet de mettre en évidence et de quantifier la fixation de composants sur le détecteur. :25 Cette dernière méthode de détection est à la base d'une technique d'analyse des interactions entre anticorps et protéines et permet de mesurer les paramètres de cinétique d'interaction entre antigènes et anticorps et d'en déduire les quantités d'anticorps présents dans un échantillon (Fagerstam et al, 1990 ; Szabo et al, 1995). Cette technique est développée sous la forme d'automates de mesure dont un exemple est connu sous le nom de BlAcore (BlAcore AB, 30 Uppsala, Suède ; http://www.biacore.com). d) méthode basée sur la spectrométrie de masse. La détection des anticorps peut être effectuée en utilisant par exemple la spectrométrie de masse dite technologie SELDI ûTOF (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization û Time Of Fly technology) (Merchant et Weinberger, 2000 ; Weinberger et al, 2000). Ce mode de réalisation 35 est effectué en exploitant la plateforme technique distribuée par la société Ciphergen (Ciphergen Biosystems, Inc. Fremont, CA, USA ; http://www.ciphergen.com). La détection des anticorps peut être réalisée en immobilisant préalablement les antigènes sur les supports d'affinité utilisables sur le spectromètre de masse Ciphergen ou tout autre spectromètre de masse approprié pour ce genre d'analyse. Il est en effet possible d'immobiliser des antigènes par greffage chimique sur les supports de silice, de métaux ou polymères et d'utiliser ces supports pour piéger les anticorps présents dans un échantillon à analyser. Les complexes-immuns ainsi formés et immobilisés sur les supports peuvent être ensuite analysés par spectrométrie de masse. Dans ce genre d'analyse, le pic des immunoglobulines fixées sur les antigènes peut être détecté dans le spectre de masse. L'utilisation des antigènes greffés sur le support permet de constituer une méthode de dosage extrêmement sensible et spécifique. Compte tenu, d'une part de l'affinité des anticorps pour les antigènes, et d'autre part de la grande sensibilité de détection du spectromètre de masse, des quantités infimes d'anticorps présents dans un échantillon pourront être détectées.

Tests de détection basés sur la mise en évidence macroscopique des complexes-immuns (test au latex, bandes d'immuno-détection) (Singer et al, 1957 ; Hechemy et al, 1974) Dans ce type de système de détection, les antigènes d'intérêt sont couplés chimiquement à des composants particulaires de tailles micrométriques telles que des billes de polymères colorées ou non. L'incubation en milieu liquide ou semi-liquide d'une suspension fluide de ces billes recouvertes d'antigènes avec l'échantillon biologique à analyser conduit à la création de complexes-immuns agrégeant plusieurs billes de polymères entre-elles. Cette agrégation se traduit par la formation de paquets de billes dont la taille devient macroscopiquement importante au point d'être visibles à l'oeil par un opérateur. Dans une variante commune et sophistiquée du système, les complexes-immuns sont soumis à migration par capillarité sur une bandelette de support de chromatographie et révélés par création d'une bande colorée indiquant la présence ou l'absence de l'antigène détecté (test symbolisé par les bandelettes d'immunodétection largement utilisées en routine par exemple pour les tests de grossesses). Des tests au latex sont commercialisés par la société Bio-Mérieux pour des diagnostics microbiologiques par exemple (www.biomerieux.com). Tests basés sur les marquages isotopiques et le RIA (radio-immuno assavs) (Yalow et Berson, 1960 ; Booth et al, 1982) Dans une des variantes de ce dosage, le complexe-immun est réalisé, en rajoutant dans le milieu réactionnel, outre l'échantillon de sérum, une quantité connue d'antigène marqué par un isotope radioactif. Après sélection des complexes-immuns formés, la quantité de radioactivité détectable dans la fraction ainsi isolée est proportionnelle à la quantité d'anticorps présente dans un échantillon. Des trousses diagnostiques utilisant le principe du RIA sont distribuées par exemple, pour divers dosages, par la société Schering/Cis-Bio International (Gif/Yvette, France ; www.cisbiointernational.fr). "L'immuno-assay" peut être également basé sur un principe de dosage ne faisant pas appel à des traceurs radioactifs mais à des marqueurs fluorescents ou de luminescence.

Anal ses basées sur les techni s ues d'immuno-histo-chimie Kiernan 1999 Une approche robuste et relativement simple dans son principe consiste à effectuer dans des coupes, frottis ou autres préparations provenant de biopsies une analyse de type immunohistologique. Dans ce cas il s'agit de tests réalisés sur un échantillon brut (coupe de tumeurs constituées de cellules plus ou moins homogènes). L'application de cette technique est donc plus généralement destinée à mettre en évidence les antigènes dans la préparation. La mise en évidence des complexes-immuns formés impose la détection d'un signal généré par l'utilisation de traceurs radioactifs, ou de réactifs fluorescents ou de méthodes colorimétriques. Les cellules tumorales contenant les antigènes montreront une réaction positive avec le réactif sélectionné spécifique vis-à-vis des antigènes. A l'inverse, les cellules non tumorales ne montreront pas de signal ou un signal d'intensité significativement plus faible. Tests basés sur le tri cellulaire utilisant la fluorescence (méthode dite cytométrie de flux ou FACS, Fluorescent Activated Cell Sorting) (Hulett et al, 1969 ; Parks et Herzenberg, 1984) : un réactif marqué par un groupement fluorescent pourra être utilisé afin de marquer des cellules entières issues et isolées de biopsies et de permettre le tri et la quantification des cellules positives pour la présence des antigènes recherchés. Dans le cadre de cette méthode, les cellules non-lysées dissociées du tissu biopsique fraîchement collecté sont mises en contact du réactif sélectif fluorescent et la suspension et ensuite analysée à l'aide d'un trieur de cellule. Le trieur de cellules détecte de manière individuelle l'intensité du signal fluorescent associé à chaque cellule, et procède au comptage du nombre de cellules détectées et éventuellement isole les cellules dans des réservoirs spécifiques. Des instruments conçus pour l'analyse FACS sont distribués par exemple par la société Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA ; http://www.bd.com). L'utilisation de paramètres techniques appropriés et optimisés (dilution des cellules, paramètres optiques,...) :20 permet d'envisager le tri et comptage sélectif des cellules contenant les antigènes et d'assurer la faisabilité de cette méthode. A noter également, qu'une approche de cytométrie de flux appliquée à l'analyse des sérums pourrait être conduite en utilisant des billes marquées par des composés fluorescents spécifiques et comportant des antigènes greffés à leurs surfaces. Les complexes-immuns peuvent être alors mis en 25 évidence par exemple avec la technologie Bio-Plex de Bio-Rad (Hercules, CA, USA ; http://www.bio-rad.com) ; ou celle nommée "Cytometric Bead array" de Becton Dickinson (http://www.bdeurope.com) ou encore le système Luminex de Miraibio (www://www.miraibio.com). Tests basés sur les méthodes de transfert de fluorescence, FRET (Fluorescence :30 Resonance Ener2y Transfer) ou BRET (Bioluminescence Resonance Eneri yTransfer) Pour une telle analyse, le dosage peut, dans sa version la plus attractive, être réalisé directement en solution (dosage en phase homogène) et ne nécessite pas d'isoler ou purifier l'un ou :l'autre des composants du complexe-immun. Cette méthode nécessite dans une de ces variantes, :l'utilisation de deux anticorps différents dirigés contre un antigène et marqués par des groupements 35 fluorescents appropriés. Les deux groupements fluorescents sont sélectionnés de telle sorte que leurs caractéristiques optiques permettent pour l'un des groupements d'être excitable par le rayonnement lumineux utilisé pour la mesure de fluorescence, puis autorisent le transfert de l'énergie d'excitation au deuxième groupement fluorescent qui émet, en dernier ressort, un rayonnement de fluorescence de longueur d'onde bien spécifique. Le transfert de fluorescence n'est effectif que si les deux molécules sont maintenues à proximité suffisamment rapprochée l'une de l'autre. Les deux anticorps marqués par les deux groupements fluorescents sont choisis pour pouvoir se fixer de manière simultanée sur les antigènes. Le complexe-immun ternaire formé (anticorps fluorescent d'excitation û antigène û anticorps fluorescent d'émission lumineuse) permet donc un rapprochement de deux anticorps et dans ce cas seulement, un signal de fluorescence peut être détecté (à la longueur d'onde d'emission du groupe fluorescent d'émission). De fait, ce type de dosage est plutôt adapté, sans exclusive, au dosage des antigènes. L'intensité du signal de fluorescence mesuré est donc directement proportionnelle à la quantité d'antigène présente dans l'extrait biologique (Mathis, 1995 ; Szollosi et al, 1998 ; Blomberg et al, 1999 ; Ueda et al, 1999 ; Enomoto et al, 2000). L'analyse de protéines par la méthode de transfert de fluorescence peut être effectuée sur l'appareil Kryptor de la société allemande B.R.A.H.M.S. (www.brahms.de). Alternativement, le composé fluorescent excité par le rayonnement lumineux d'excitation dans la technique FRET peut être substitué par un système bioluminescent qui repose sur l'activité d'une enzyme (Xu et al , 1999) La liste non-exhaustive des techniques décrites ci-dessus a valeur d'exemple des diverses techniques que l'homme du métier est en mesure d'utiliser pour réaliser une analyse d'échantillons biologiques afin de mettre en oeuvre l'invention pour détecter les anticorps dirigés contre les antigènes identifiés, analyse dont on pourra tirer une information à valeur diagnostique ou pronostique conformément à l'invention. Les analyses pourront être réalisées directement sur des prélèvements bruts ou ayant subi des traitements, etcorrespondant de manière non-exhaustive à des lysats, extraits ou sous-fractions issus de ces prélèvements. La détection et le dosage des anticorps dirigés contre les antigènes, décrits par l'invention, peuvent être réalisés en utilisant tout produits ou dérivés issus de ces antigènes ainsi que sur leurs précurseurs si tant est qu'ils respectent bien les critères de reconnaissance spécifique avec les anticorps devant être détectés. Comme indiqué précédemment, le dosage des antigènes eux-mêmes ou de leur fragments ou produits de modification métabolique peut constituer également une application analytique 30 d'intérêt clinique. Les tests basés sur l'utilisation de la spectrométrie de masse SELDI-TOF, nécessitent des supports d'affinité pour la capture spécifique des antigènes (barrettes ProteinChip de Ciphergen). Ces supports seront adaptés en fonction du mode de capture choisi : supports à réactivité chimique adaptée à la fixation des antigènes, ou anticorps monoclonaux ou polyclonaux reconnaissant tout 35 ou partie des antigènes ou de leurs peptides. De manière évidente pour l'homme du métier, les méthodes font appel pour des besoins de quantification, et pour des impératifs de contrôle-qualité (contrôle-positifs) à des protéines standards appropriées, apparentées ou non aux antigènes. De plus, les tests d'immunodétection imposent de disposer de composants (composants que l'on nommera réactifs) susceptibles d'interagir avec les anticorps d'intérêt ou les antigènes et leurs dérivés. Au chapitre de ces réactifs on peut citer bien évidemment, les anticorps polyclonaux ou monoclonaux ainsi que leurs fragments immunoréactifs, greffés ou non sur, ou avec d'autres composants ; des éléments particulaires susceptibles d'interagir avec les antigènes (phages ou bactéries recombinants exprimant à leur surface des régions polypeptidiques capables d'interaction avec des haptènes ou antigènes) (Gao et al, 1999 ; Knappik et al, 2000) ; ou des aptamères (molécules chimiques de type polynucléotides voire polypeptidiques capables d'établir des interactions non covalentes de forte affinité avec des molécules cibles) (Ellington et Szostak, 1990 ; Tuerk et Gold, 1990). Des réactifs spécifiques pour la détection des complexes-immuns formés lors des tests peuvent être choisis parmi les systèmes de détection classique appropriés à ce genre de tests d'immunodétection tels que le western-blot ou l'ELISA (ces réactifs sont par exemple des anticorps secondaires couplés à des systèmes enzymatiques autorisant l'exécution de réactions colorimétriques). De tels réactifs sont disponibles sur catalogue, par exemple sur le catalogue de la société Sigma Aldrich, accessible en ligne (http://www.sigmaaldrich.com). Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la présence de la protéine eEFlA1 est détectée et/ou quantifiée aux moyens d'anticorps dirigés contre la protéine eEF1A1 ou au moins un épitope de cette protéine. Les anticorps sont choisis avantageusement parmi les anticorps polyclonaux ou les anticorps monoclonaux.

Les méthodes d'identification et la préparation de tels anticorps sont connues de l'homme du métier en employant les techniques usuelles de préparation de tels anticorps. On notera pour référence, les méthodes décrites dans Immunobiology (5th ed., Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Shlomchik, Mark. New York and London: Garland Publishing; c2001). Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, la présence d'anticorps dirigés contre une protéine eEF1Al ou au moins un épitope de cette protéine est détectée et/ou quantifiée au moyen d'un antigène comprenant au moins un épitope d'une protéine eEF1Al. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'antigène comprend une protéine eEF1Al telle que définie ci-dessus et ci-après. Bien entendu, l'antigène peut comprendre de simples fragments d'une protéine eEF1Al, étant entendu que ledit fragment comprend au moins un épitope reconnu par les anticorps anti-eEFlA1. Un épitope est la plus petite unité structurale d'un antigène reconnue par un anticorps, structure présente à la surface de la molécule d'antigène, capable de se combiner à une seule molécule d'anticorps. D'un point de vue structurel, les épitopes peuvent être de deux types : épitopes linéaires (courte suite d'acides aminés reconnus par un anticorps), présentant une taille d'environ 8-10 acides aminés, ou épitopes conformationnels, c'est-à-dire que les anticorps reconnaissent des acides aminés qui sont proches dans l'espace lorsque la protéine présente sa structure repliée, mais qui ne sont pas localisés à proximité immédiate dans la séquence de la protéine.

Il convient de noter qu'un épitope donné peut être reconnu par plusieurs anticorps différents générés dans le cadre de réactions immunitaires distinctes, liées à des agents différents (virus, bactéries, etc...). A cet égard, le niveau de reconnaissance entre l'épitope et les différents anticorps peut varier d'un couple épitope-anticorps à un autre. Ainsi, si l'épitope est fortement reconnu par l'anticorps, de faibles concentrations en anticorps suffiront à détecter une réaction de reconnaissance entre l'épitope et l'anticorps. A l'inverse, si l'épitope est faiblement reconnu par l'anticorps, de fortes concentrations en ce dernier seront nécessaires pour détecter une réaction de reconnaissance entre l'épitope et l'anticorps. De la même façon, plusieurs épitopes distincts peuvent être reconnus par un même anticorps. Mais, là encore, les niveaux de reconnaissance d'un couple épitope-anticorps à un autre sont généralement variables. Les moyens pour l'identification d'épitopes, de fragments antigéniques et pour la préparation d'antigènes utiles dans un procédé de diagnostic sur des échantillons biologiques sont bien connus de l'homme du métier. On citera notamment une méthode consistant à synthétiser de manière systématique des peptides reprenant des fragments chevauchant de protéine eEF1Al pour tester ensuite leur capacité à stimuler une réponse immunitaire. L'homme du métier sera donc à même d'identifier le ou les épitopes les mieux adaptés pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention par simple expérimentation de routine. Un fragment comprenant au moins un épitope de la protéine eEF1A1 est par exemple un fragment englobant la partie N-terminale de la protéine eEFlAl, plus particulièrement un fragment de 12 kDA englobant cette partie N-terminale. De manière préférentielle, le procédé selon l'invention comprend une étape additionnelle de comparaison des résultats obtenus à l'étape de détection et/ou de quantification avec une valeur de référence caractéristique de la présence d'une tumeur chimiorésistante et/ou avec une valeur de référence caractéristique de la présence d'une tumeur chimiosensible.

Ces valeurs de référence peuvent être différentes selon les moyens employés pour la détection et/ou la quantification de eEF1Al ou des anticorps anti-eEF1Al. Elles peuvent être obtenues selon des méthodes usuelles où l'on va effectuer les mêmes analyses sur des échantillons provenant d'individus sains d'une part et d'individus connus pour être porteurs de tumeurs d'autre part, avec dans cette seconde population la distinction entre les individus connus pour avoir une tumeur chimiosensible et ceux connus pour avoir une tumeur chimiorésistante. Bien entendu, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre la détection et la quantification d'au moins un autre marqueur biologique caractéristique de la présence et/ou de l'invasivité d'une tumeur et/ou de sa chimio-sensibilité. On citera comme marqueur, à titre d'exemple, la protéine antigène KI67 comme marqueur de prolifération (référence SwissProt : http://www.expasy.org/uniprot/P46013), ou encore la vimentine phosphorylée, dont l'absence est caractéristique d'une tumeur invasive (PCT/EP2005/054598 déposée le 15 septembre 2005) ou encore des anticorps dirigés contre la protéine MARKS (n d'accession genebank AF387637 ; Sun T.-Q. et al. "PAR-1 is a Dishevelled-associated kinase and a positive regulator of Wnt signalling".

Nat. Cell Biol. 2001, 3, 628-636), dont la présence en forte concentration est caractéristique de la présence d'une tumeur. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé comprend également une l'étape de détecter et/ou de quantifier sur un échantillon biologique préalablement prélevé : - la protéine MARK3, et/ou - les anticorps dirigés contre la protéine MARK3 ou au moins un épitope de cette protéine. La détection et/ou la quantification des deux marqueurs peuvent être effectuées de manière simultanée, séparée ou décalée dans le temps, sur le même échantillon biologique ou sur des échantillons différents.

La présente invention concerne également un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé tel que défini précédemment et ci-après, ledit kit comprenant des moyens permettant de détecter et/ou quantifier sur un échantillon biologique préalablement prélevé : - la présence d'une protéine eEFlA1, et/ou - la présence d'anticorps dirigés contre une protéine eEF1Al ou un fragment comprenant au moins un épitope de cette protéine. De tels moyens sont bien connus de l'homme du métier, définis ci-dessus, leur forme variant selon le mode de détection sélectionné. Ils comprennent d'une part un antigène eEFlA1 défini précédemment ou un anticorps antieEF1A1 selon l'invention et des réactifs nécessaires à la mise en oeuvre du procédé de diagnostic 20 selon l'invention. De tels réactifs sont bien connus de l'homme du métier, selon la méthode de détection/quantification employée. Ils sont en particulier décrits dans les références citées précédemment et en particulier dans le catalogue de la société Sigma Aldrich, accessible en ligne (http://www.sigmaaldrich.com). 25 De manière avantageuse, le kit de détection comprend un support approprié, apte à recevoir l'échantillon biologique et les moyens de détection appropriés. Lorsque le moyen de détection est un anticorps ou un antigène, ou leurs fragments, il peut être lié au support par tout moyen approprié, par exemple une liaison covalente ou adsorbé sur le support. De tels supports sont bien connus de l'homme du métier, décrits notamment dans les références énoncées précédemment. 30 La présente invention concerne également les anticorps dirigés contre une protéine eEF1Al ou contre un fragment comprenant au moins un épitope de cette protéine, qui se lient de manière spécifique à une protéine eEF1A1 ou à au moins un épitope de cette protéine définis ci-dessus et ci-après. L'invention concerne aussi lesdits anticorps pour leur utilisation en thérapie. Outre l'invention de eEF 1 Al comme marqueur de la présence de cellules tumorales chez 35 les mammifères, en particulier chez l'homme, les inventeurs ont également constater que l'inhibition de l'activité ou de l'expression de eEF1A1 permettait d'inhiber la croissance de cellules tumorales.

La présente invention concerne donc également un procédé pour inhiber la croissance de cellules tumorales, caractérisé en ce que l'on inhibe l'expression ou l'activité de la protéine eEF1A1 au moyen d'un inhibiteur anti-eEF1A1. Les inhibiteurs anti-eEF1A1 inhibant l'activité de eEF1A1 agissent au niveau de la 5 protéine eEF1Al empêchant ou limitant sa capacité à exercer sa fonction biologique. Il peut s'agir par exemple d'un anticorps dont l'antigène est une protéine eEF1Al ou au moins un épitope de cette protéine, tel que défini ci-dessus et ci-après. Les inhibiteurs anti-eEF1A1 inhibant l'expression de eEF1Al agissent au niveau de la transcription du gène codant pour eEF1A1 ou encore au niveau de la traduction de l'ARN vers la 10 protéine. Dans ce second cas, il peut s'agir d'un ARN interférant qui vient s'hybrider à l'ARN messager (ARNm) produit d'expression du gène comprenant la séquence codant pour la protéine eEF1Al pour inhiber la traduction, soit par simple encombrement stérique soit pour favoriser le clivage de l'ARNm. Les technologies d'ARN interférants et leur usage in vitro et in vivo sont bien connues de 15 l'homme du métier, décrits dans de nombreux articles scientifiques et autres demandes de brevet. Selon les séquences d'ARN interférants sélectionnées par l'homme du métier, différents niveaux d'inhibition pourront être obtenus, permettant de moduler l'effet inhibiteur recherché. De manière préférentielle, les ARN interférants sont préparés et sélectionnés pour obtenir au moins 50% d'inhibition de l'expression du gène cible dans une cellule, voire au moins 75%, 90%, 95% 20 voire plus de 99% d'inhibition. Les siRNA, pour Small Interfering RNA ou ARN interférant de petite taille, sont des séquences courtes d'environ 15 à 30 paires de bases (bp), de préférence de 19 à 25 bp. Elles comprennent un premier brin et un brin complémentaire identiques à la région ciblée de l'ARN du gène cible. 25 Le design et la préparation de siRNA et leur utilisation pour la transfection de cellules in vivo et in vitro sont bien connues et largement décrites dans de nombreuses publications, telles que : US 6 506 559, US 2003/0056235, WO 99/32619, WO 01/75164, WO 02/44321, US 2002/0086356, WO 00/44895, WO 02/055692, WO 02/055693, WO 03/033700, WO 03/035082, WO 03/035083, WO 03/035868, WO 03/035869, WO 03/035870, WO 03/035876, WO 01/68836, 30 US 2002/0162126, WO 03/020931, WO 03/008573, WO 01/70949, WO 99/49029, US 6573099, WO 2005/00320, WO 2004/035615, WO 2004/019973, WO 2004/015107, http://www.atugen.com/sirnatechnology.htm, http://www.alnylam.com/science- technology/index.asp, http://www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/SiRNA Design/, 35 http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/Apps/sirna.html, http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html, http://www.upstate.corn/browse/categories/siRNA.q.

Les siRNA peuvent être conçus et préparés en employant des logiciels appropriés disponibles en ligne, par exemple : "siSearch Program" http://sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/siSearch_1.6.html ("Improved and automated prediction of effective siRNA", Chalk AM, Wahlesdelt C, and Sonnhammer ELL, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004). "SiDirect" http://design.rnai.ip/sidirect/index.php (Direct: highly effective, target-specific siRNA design software for mammalian RNA interference, Yuki Naito et al, Nucleic Acids Res, Vol. 32, No. Web Server issue Oxford University Press 2004). - "siRNA design tool" de Whitehead Institute of Biomedical Research au MIT http://jura.wi.mit.edu/pubint/http://iona.wi.mit.edu/siRNAext/ siRNA wizardTM de Invitrogen http://www.sirnawizard.com/, - "siRNA Target Finder" de Ambion http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html, https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai http://www.promega.com/siRNADesigner/default.htm -http://bioweb.pasteur.fr/seganal/interfaces/sirna.html D'autres programmes sont référencés sur le site http://web.mit.edu/mmcmanus/www/homel .2files/siRNAs.htm, comme http://athena.bioc.uvic.ca/cgi-bin/emboss.pl?_action=input&_app=sirna. Les outils pour la préparation de siRNA et la transfection de cellules sont à la disposition 20 du public par simple commande en ligne, comme les vecteurs de siRNA commercialisés par la société Invitrogen (http://www.invivogen.com/cat.php?ID=3). De manière avantageuse, l'inhibiteur anti-eEF1A1 est un ARN interférant qui inhibe in vitro et/ou in vivo l'expression d'un gène codant pour une protéine eEF1A1. Cet ARNi est de préférence choisi parmi les ARN antisens et les ARN double brins (dsRNA), plus 25 préférentiellement un siRNA. Les ARN interférants selon l'invention sont conçus de préférence pour inhiber au moins 50%, 75%, 90% or 95% voire plus de 99% de l'expression d'une protéine eEF1A1 dans les cellules. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le siRNA comprend la séquence 30 suivante, capable d'inhiber l'expression d'un gène codant pour une protéine eEF1A1 : Séquence sens : 5' UGG UGA CAA CAU GCU GGA G 3' Séquence antisens) : 5' CUC CAG CAU GUU GUC ACC A 3' La présente invention concerne également un vecteur pour l'expression d'un ARN interférant défini ci-dessus et ci-après, lequel vecteur comprend une séquence codant pour ledit ARN interférant sous le contrôle d'éléments de régulations permettant l'expression dudit ARN interférant dans une cellule hôte. De tels vecteurs sont connus de l'homme du métier et disponibles, 35 comme par exemple les vecteurs Ambions pSilencerrM 5.1 Retro System (http://www.ambion.coin/catalog/CatNum.php?5782) ou BLOCK-iTTM Lentiviral RNAi Expression System commercialisés par Invitrogen (https://catalog.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=viewCatalog. viewProductDetails&productDe scription=5449&CMP=LEC-G C M S SEARCH&HQ S=block). L'invention concerne aussi un vecteur pour la délivrance d'un ARN interférant dans une cellule hôte, caractérisé en ce qu'il comprend un ARN interférant selon l'invention, défini ci-dessus et ci-après et des moyens permettant la délivrance dudit ARN interférant dans une cellule hôte. De tels moyens sont connus de l'homme du métier, comme par exemple les lipides lipofectamines (http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=4005) ou Miros (http://www.mirusbio.com/products/rnai/index.asp) L'invention concerne également un ARN interférant selon l'invention, un vecteur pour son expression ou un vecteur pour sa délivrance, tels que définis ci-dessus et ci-après, pour leur utilisation en thérapie. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'invention ou un ARN interférant selon l'invention ou un vecteur pour l'expression de l'ARN interférant selon l'invention ou un vecteur pour la délivrance d'un ARN interférant selon l'invention, tels que définis ci-dessus et ci-après, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les méthodes pour l'administration d'ARN interférants sont connues de l'homme du métier, les véhicules employés dépendant de la voie d'administration sélectionnée. Ainsi, l'injection IV d'un siRNA modifié chimiquement s'est révélée efficace pour l'inactivation de gènes in vivo (Soutschek J, Akinc A, Bramlage B, Charisse K, Constien R, Donoghue M, Elbashir S, Geick A, Hadwiger P, Harborth J, John M, Kesavan V, Lavine G, Pandey RK, Racie T, Rajeev KG, Rohl I, Toudjarska I, Wang G, Wuschko S, Bumcrot D, Koteliansky V, Limmer S, Manoharan M, Vornlocher HP. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 2004 ,432:173-8).

L'invention concerne également l'utilisation d'un anticorps selon l'invention ou un ARN interférant selon l'invention ou un vecteur pour l'expression de l'ARN interférant selon l'invention ou un vecteur pour la délivrance d'un ARN interférant selon l'invention, tels que définis ci-dessus et ci-après, pour le traitement des cancers, plus particulièrement des glioblastomes, ou pour la préparation d'un médicament destiné au traitement desdites maladies.

L'homme du métier saura sélectionner les dosages appropriés en fonction du patient et de l'état de l'avancement de la maladie à traiter. Cette connaissance de l'état du patient et de l'état d'avancement de la maladie pourra avantageusement être obtenue au moyen de la méthode de diagnostic selon l'invention. Il est entendu que, selon l'invention, l'utilisation peut se faire en combinaison avec d'autres moyens thérapeutiques appropriés pour le traitement du cancer, comme par exemple d'autres médicaments, molécules cytotoxiques, anticorps ou ligands susceptibles d'être employées en oncologie, mais également des moyens de traitement par rayons, en particulier rayonnnements ionisants ou encore par chirurgie.

Dans ce cas, les anticorps ou ARN interférants selon l'invention seront employés en combinaison avec le ou les autres moyens de manière simultanée, ensemble ou séparéments, ou décalée dans le temps. Dans le cas d'un traitement décalé, les anticorps ou ARN interférants selon l'invention peuvent être employés préalablement à l'autre moyen thérapeutique ou encore après ce dernier. L'invention concerne aussi un variant de la protéine eEF1Al comprenant la séquence protéique de la SEQ ID NO 1 et une séquence d'acide nucléique codant pour ledit variant. Elle concerne également un vecteur d'expression d'un variant de la protéine eEF1A1 comprenant ladite séquence d'acide nucléique selon l'invention sous le contrôle d'éléments de régulation nécessaires à l'expression de ladite protéine dans un organisme hôte. Elle concerne aussi un organisme hôte comprenant ledit vecteur d'expression selon l'invention, et un procédé de préparation du variant de la protéine eEF1A1 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture de l'organisme hôte selon l'invention dans un milieu de culture approprié, puis de récupération du variant de la protéine eEFlA1 ainsi produit et, éventuellement, sa purification.

Les méthodes de clonage et d'expression d'une protéine dans un organisme hôte sont bien connues de l'homme du métier, les éléments de régulations constituant le vecteur étant choisis par ce dernier selon l'organisme hôte choisi, mais aussi selon les conditions de cultures et l'objectif de la production de ce variant de la protéine eEF1A1. L'un de ces objectifs peut être la préparation et la mise en oeuvre d'une méthode de screening d'inhibiteurs d'expression d'une protéine eEF1A1 telle que définie auparavant ou dans les exemples ou d'inhibiteurs de l'activité d'une protéine eEF1Al, la méthode consistant à mettre en contact au moins un composé candidat inhibiteur avec un moyen de screening approprié pour permettre de mettre en évidence l'activité dudit composé au regard de l'expression de eEF1Al ou de son activité, l'existence ou l'absence d'une inhibition.

De tels moyens de screening sont bien connus de l'homme du métier, comme par exemple un organsisme hôte exprimant un gène rapporteur sous le contrôle du promoteur de la protéine eEF1Al ou bien un organisme hôte exprimant la protéine eEF1Al, dont le niveau d'expression ou la transcription est contrôlée par des méthodes appropriées, ou encore un organisme hôte exprimant la protéine eEF1Al ou un milieu réactionnel approprié contenant de la protéine eEF1A1, permettant de contrôler l'activité de cette dernière sous l'effet du ou des composés candidats. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, plusieurs composés candidats sont testés, ensembles ou séparément, lesdits composés pouvant constituer une librairie de composés à tester. De manière avantageuse, lesdits composés sont des molécules chimiques dites petites molécules . .35 Les exemples de réalisation ci-dessous permettent de mieux illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée.

Liste des exemples 1. Mise en évidence de caractéristiques immunoréactives discriminantes dans les liquides biologiques des populations de patients atteints de tumeurs versus des individus sains 2. Caractérisation par séquençage et spectrométrie de masse de l'antigène responsable des immunoréactions discriminantes 3. Identité de la protéine antigénique 4. Analyse par Western blot des réactions antigènes-anticorps et validation de l'intérêt clinique 5. Impact des anticorps sur la viabilité des cellules tumorales in vitro 6. Blocage de la prolifération des cellules tumorales in vitro par les siRNA.

Description des Figures Figure 1 : Western-blot réalisé avec un liquide kystique testé pour mettre en évidence des réactions vis-à-vis de protéines d'origine tumorale. Trois échantillons différents ont été utilisés pour générer après électrophorèse les empreintes de protéines pour la réaction d'immuno-détection. Piste M : extrait protéique des membranes des cellules de glioblastome Piste C : fraction cytoplasmique des cellules de glioblastome Piste T : extrait total de cellules de glioblastome. Figure 2 : Séquence de l'ADNc du clone 1G5 (en A) et de la protéine exprimée (en B).

Figure 3 : Alignement de la séquence protéique exprimée par le clone 1 G5 avec la séquence de l'extrémité C ter de la protéine isoforme 4 de eEF1A1. Figure 4 : Mesure de l'intensité des immunoréactions détectées dans les sérums de différents groupes d'individus vis-à-vis de la protéine antigénique codée par le clone 1G5. Les groupes d'individus sont composés de : groupe 1 : individus normaux contrôles ; groupe 2 : patients atteints de gliomes répondant positivement à la chimiothérapie ; groupe 3 : patients atteints de gliomes ne répondant pas à la chimiothérapie Les histogrammes d'immunoréactivité correspondent aux signaux enregistrés dans les western-blots (exprimés en unités arbitraires, UA) avec les antigènes suivants : A : protéine totale exprimée par le clone 1G5 (correspondant au domaine du variant de l'isoforme 4 de eEF1A1 décrit dans l'exemple 3 figure 3) ; B : produit de fragmentation de 12kDa du domaine du variant de l'isoforme 4 de eEF1Al décrit dans l'exemple 3. Figure 5 : Mesure de cytotoxicité des immunoglobulines purifiées de liquides kystiques ou sérums 35 sur des cellules de tumeurs en culture. Figure 6 : Séquences du siRNA testé in vitro.

Exemple 1 : Mise en évidence de caractéristiques immunoréactives discriminantes dans les liquides biologiques des populations de patients atteints de tumeurs versus des individus sains Dans cet exemple, des liquides kystiques prélevés dans les tumeurs solides du SNC de divers patients ont été analysés afin de déceler si ces liquides contiennent des anticorps capables de reconnaître des protéines exprimées par les tumeurs. Pour ce faire, la réactivité des liquides kystiques vis-à-vis d'extraits protéiques de tumeurs a été testée par western-blot. Le western-blot présenté à la figure 1 montre plusieurs bandes colorées mettant en évidence de ce fait de nombreuses réactivités, d'intensité modeste ou très intense, vis-à-vis de protéines tumorales diverses. On note par exemple de fortes réactions vis-à-vis de protéines de masses moléculaires estimées à environ 36, 41 et 53 kDa. Compte tenu des fractions protéiques utilisées dans ce western-blot, on peut conclure que les antigènes tumoraux, contre lesquels sont dirigés les anticorps présents dans les liquides kystiques, sont localisés soit dans les membranes des cellules tumorales soit dans leur cytoplasme. Après incubation des empreintes du western-blot avec le liquide kystique, les anticorps qui l5 ont interagi avec les protéines-antigéniques sont détectés par les méthodes classiques utilisant des anticorps secondaires couplés à la peroxydase. La mise en évidence de ces immunoréactions et des anticorps dirigés contre des protéines tumorales a été poursuivie selon la stratégie décrite ci-après. L'analyse a consisté à révéler la présence d'anticorps, dans les liquides kystiques et également dans les sérums des patients, 20 responsables des réponses immunitaires envers diverses protéines humaines. Des tests d'immunoréactions des sérums et liquides kystiques contre une banque de clones bactériens d'expression exprimant diverses protéines du répertoire humain ont permis d'isoler un clone dénommé selon nomenclature de la banque de clones propre aux inventeurs : clone 1G5. Les liquides biologiques testés (sérums d'individus sains) montrent une réactivité très forte envers le 25 clone. A l'inverse, les liquides kystiques de tumeurs et sérums de patients atteints de tumeurs montrent une réactivité beaucoup plus faible. Cette expérience met donc en évidence l'existence d'anticorps dirigés contre une protéine humaine particulière dans les liquides biologiques des individus sains ou des patients atteints de tumeurs et le fait que les taux de ces anticorps sont différents selon les groupesd'individus testés. :30 La mesure de ces taux d'anticorps présente donc l'intérêt diagnostique de permettre de discriminer aisément les individus atteints de tumeurs des individus parfaitement sains.

Exemple 2 : Caractérisation par séquençage et spectrométrie de masse de l'antigène responsable des immunoréactions discriminantes :35 La protéine qui est exprimée par le clone 1G5 a été identifiée. Cette identification a été réalisée de deux façons différentes et complémentaires. Tout d'abord, la caractérisation a reposé sur l'analyse de la séquence de l'ADNc cloné dans le vecteur d'expression du clone ; enfin, le polypeptide humain exprimé par ce clones a été purifié et analysé après protéolyse par la trypsine grâce à une approche nanoLC- MS/MS (nanochromatographie liquide couplée à une analyse par spectrométrie de masse en tandem) (suivant protocole utilisé par Bourges et al, 2004). La première approche a consisté à extraire le plasmide à partir du clone bactérien issu du stock de la banque et mis en culture. L'extraction a été réalisée en utilisant les méthodes classiques de purification de plasmides bactériens (à savoir, de manière sommaire, par lyse alcaline et précipitation de l'ADN plasmidique). Les plasmides purifiés ont ensuite été séquencés par la technique enzymatique de terminaison de chaîne avec didésoxynucléotides fluorescents. La séquence a été décryptée par migration capillaire sur un séquenceur ABI 3700. Les séquences ont 1.0 été réalisées dans les directions sens et antisens et validées par plusieurs runs. L'utilisation de logiciels tel qu'Autoassembler (Applied Biosystems) a permis de générer la séquence consensus et intégrale du fragment d'ADNc cloné dans le plasmide. La séquence a été étudiée en détail afin de reconnaître les régions de cette séquence qui codent la protéine humaine exprimée (séquence dite "codante"). 15 La séquence d'ADNc codante pour le clone 1G5 est montrée à la figure 2. La figure 2 montre aussi la séquence de la protéine humaine exprimée par le clone telle que prédite à partir de la séquence de l'ADNc cloné dans le vecteur d'expression. La séquence du plasmide située en amont de l'ADNc et comportant le codon d'initiation de synthèse du fragment protéique codé par l'ADNc n'est pas représentée. Le codon stop de traduction est représenté en gras et souligné. 20 La séquence de la protéine exprimée par le plasmide d'expression 1G5 est représentée (en B). Le code conventionnel à une lettre des acides aminés est utilisé. La purification de la protéine humaine exprimée par le clone a été réalisée. Les expériences ont été conduites en se basant sur des protocoles standards de purification et manipulation des protéines. Ainsi, le clone bactérien 1G5 a été mis en culture individuellement, puis les cellules 25 bactériennes ont été récoltées et lysées en présence de sels de guanidinium. Les protéines humaines ont été purifiées en faisant appel à la chromatographie d'affinité exploitant les interactions des séquences poly-histidine avec des colonnes de résines chargées de métaux immobilisés. En effet, du fait de la construction plasmidique, les protéines humaines sont exprimées dans les clones sous forme de chimères qui intègrent à leur extrémité N terminale une petite séquence comportant six 30 résidus consécutifs d'histidines. Ce motif permet la rétention quasi-sélective des protéines humaines exprimées dans les clones sur les résines chélatrices de Nickel. Après élution à pH acide, 1.es protéines ont été soumises à une électrophorèse en gel de polyacrylamide. Puis la bande protéique majeure est découpée et traitée par la trypsine. Les peptides obtenus sont séparés par chromatographie en phase inverse couplée à une analyse par spectrométrie de masse. Cette analyse :35 permet d'obtenir des informations sur la séquence primaire des peptides trypsiques générés. Elle permet ainsi de valider sans ambiguïté que les protéines codées par les ADNc clonés dans les vecteurs d'expression sont synthétisées par les clones et constituent les antigènes détectés par immunoréaction.

Le clone 1 G5 exprime bien la protéine dont la séquence est représentée à la figure 2.

Exemple 3 : Identité de la protéine antigénique Une analyse in silico consistant à comparer la séquence de l'ADNc du clone 1G5 et de la protéine correspondante qu'il exprime par rapport à des banques de séquences de références d'acides nucléiques (séquences de clones d'ADNc et séquence du génome humain) et de protéines humaines a été réalisée. Cette analyse a permis de préciser l'identité de la protéine qui constitue l'un des antigènes spécifiques responsables des immunoréactions manifestées dans l'exemple 1. Les informations suivantes ont donc été obtenues : Le clone 1G5 exprime la protéine eEF1A1 (elle inclut en plus dans sa partie N ter 8 acides aminés supplémentaires) La séquence de la protéine exprimée par le clone 1 G5 est comparée avec la séquence de référence de la protéine eEF1Al dans la figure 3. Les identités de séquence sont symbolisées par des étoiles.

Exemple 4 : Analyse par western-blot des réactions antigènes-anticorps et validation de l'intérêt clinique Des tests d'immuno-détection ont été entrepris pour valider deux paramètres importants : d'une part vérifier la spécificité de la réactivité des anticorps présents dans les sérums vis-à-vis des protéines humaines antigéniques purifiées ou leurs fragments ; d'autre part, évaluer la pertinence biologique des anticorps comme indicateurs d'intérêt diagnostique en oncologie.

Ces tests ont été réalisés en utilisant la méthode du western-blot. Pour ce faire, le clone bactérien 1 G5 a été mis en culture, et la protéines humaine exprimée a été purifiée sur résine chélatrice de Nickel comme indiqué dans l'exemple précédent. La protéine purifiée a été soumise à migration électrophorétique en gel de polyacrylamide. Après électrotransfert sur membranes de PVDF, l'antigène est détecté par imprégnation des membranes avec des sérums variés obtenus à partir de prélèvements sanguins effectués sur de nombreux individus. La cohorte d'individus constituée pour l'analyse était composée de 50 individus sains ; de 20 individus atteints de tumeurs gliales ne répondant pas à la chimiothérapie (traitement par le Temodal , ou témozolomide de Schering Plough) ; et de 14 individus présentant des tumeurs gliales caractérisées par une sensibilité objectivée à cette chimiothérapie (sur la base de la régression de la taille de la tumeur observée à l'imagerie à trois mois d'intervalle). L'analyse des western-blots a permis de tirer les conclusions qui suivent.

Pour le clone 1G5, les sérums réagissent contre deux régions du western-blot, une région correspondant à un antigène de taille apparente de 50 kDa et une correspondant à une taille de 12 kDa. L'analyse par digestion enzymatique des zones du gel d'électrophorèse équivalentes suivie de caractérisation par nanoLC-MS/MS montre que la zone de 50 kDa correspond à la protéine eEF1A1 exprimée par le clone bactérien 1G5 et la zone de 12 kDa à un peptide de fragmentation généré au cours de la purification de la protéine. Ce fragment englobe la partie N terminale de l'antigène produit par le clone 1 G5. Les intensités des réactions d'immunodétection obtenues sur les western-blots ont été quantifiées. L'analyse des données obtenues de manière individuelle avec les sérums des 84 individus de la cohorte a permis de révéler que la réponse vis-à-vis du peptide de 12 kDa est importante dans les sérums des individus sains et que cette réponse est presque aussi intense avec les sérums des patients présentant des tumeurs gliales caractérisées par une sensibilité à la chimiothérapie. Par contre, la réactivité des sérums des patients atteints de tumeurs gliales ne répondant pas à la chimiothérapie est considérablement réduite. Cet exemple montre clairement que la détection des anticorps sériques dirigés contre la protéine eEF1A1 a une valeur diagnostique et pronostique pour la prise en charge clinique de patients atteints de tumeurs gliales. En effet, la présence ou l'absence d'anticorps sériques dirigés contre le variant de la protéine eEF1A1 (ou ses fragments) permet de manière pronostique de défmir si la tumeur est susceptible d'être résistante à la chimiothérapie. Les résultats présentés ici montrent que des épitopes particuliers présents dans la protéine décrite (eEF1Al) permettent une évaluation des variations de taux d'anticorps dans les liquides biologiques d'un individu; évaluation ayant un intérêt clinique majeur. Tout autre composant biologique ou artificiel, naturel ou chimérique qui comporte les épitopes reconnus par les anticorps qui sont détectés dans le procédé décrit et ont un intérêt clinique peuvent être utilisés de manière avantageuse pour réaliser des dosages dans l'esprit du procédé décrit dans ce brevet. La figure 4 montre l'analyse par western-blot des protéines antigéniques produites par le clone 1G5. Les protéines et peptides résultant de fragmentations spontanées ont été soumis à migration électrophorétique en gel de polyacrylamide. Les immunoréactions ont été révélées de manière classique selon l'approche western-blot après imprégnation des blots avec des mélanges de sérums provenant de divers groupes d'individus. Les groupes d'individus sont composés de : groupe 1 : individus normaux contrôles ; groupe 2 : patients atteints de gliomes répondant positivement à la chimiothérapie ; groupe 3 : patients atteints de gliomes ne répondant pas à la chimiothérapie Les histogrammes d'immunoréactivité correspondent aux signaux enregistrés dans les western-blots avec les antigènes suivants : A: protéine totale exprimée par le clone 1G5 (correspondant à la séquence de eEF1A1 décrite dans l'exemple 3 figure 3) ; :35 B : produit de fragmentation de 12kDa de eEF1Al décrit dans l'exemple 3 figure 3.

Exemple 5 : Impact des anticorps sur la viabilité des cellules tumorales in vitro Afin de confirmer l'utilisation prévisible en thérapeutique des anticorps dirigés contre les antigènes tumoraux identifiés, l'impact cytotoxique des immunoglobulines extraites des liquides biologiques sur les cellules tumorales en culture a été évalué.

L'expérimentation a consisté à préparer des échantillons d'immunoglobulines purifiées, extraites des sérums d'individus sains et des liquides kystiques d'individus atteints d'une tumeur gliale. Les immunoglobulines sont purifiées par chromatographie sur colonnes "Hitrap protein-G" distribuées par Amersham (General Electric). Les conditions d'utilisation sont strictement conformes à celles décrites par le fournisseur. Les immunoglobulines purifiées sont resuspendues à un titre de 1 mg/ml. Des cellules de tumeurs en culture in vitro sont mises en contact avec les immunoglobulines purifiées à une concentration finale de 1 microgramme d'immunoglobulines par ml dans un milieu ne contenant pas de sérum de veau foetal. L'incubation est prolongée pendant 7 jours. A l'issue de cette période d'incubation, la viabilité des cellules est mesurée à l'aide d'un test classique de viabilité cellulaire. Les taux de survie sont calculés par rapport à des témoins correspondant aux cultures cellulaires mise en incubation avec les tampons de préparation et de dilution des immunoglobulines mais dépourvus d'immunoglobulines (tampon contrôle). Les immunoglobulines ont été préparées à partir de liquides kystiques prélevés sur des tumeurs de type : oligodendrogliomes ou méningiomes ou astrocytome de grade III. Les types cellulaires étaient représentés par des glioblastomes primaires prélevés sur différents patients (2 glioblastomes différents), d'une lignée de neuroblastome IMR32, d'une lignée de carcinome de la vessie EJ. Comme le montre la figure 5, les immunoglobulines purifiées des sérums d'individus sains ne montrent que très peu de cytotoxicité vis-à-vis des différents types cellulaires. Par contre, les immunoglobulines purifiées des liquides kystiques des différentes origines réduisent de manière très significative la survie des cellules de tumeurs gliales. Le taux de survie est compris entre 15 et 40% selon les extraits utilisés. Les cellules des tumeurs de type glioblastomes sont les plus sensibles ; les cellules de carcinome de vessie sont plus modestement affectées (65 à 75 % de survie) ; la viabilité des cellules de neuroblastome n'est pas modifiée de manière sensible. Ce dernier élément prouve qu'à la concentration de 1 microgramme d'immunoglobulines par ml de milieu, les immunoglobulines purifiées des liquides kystiques ne manifestent pas de toxicité non spécifique vis-àvis de cellules tumorales en culture. L'exemple permet de conclure que les immunoglobulines qui sont présentes dans les liquides kystiques et qui réagissent avec des antigènes tumoraux ont une capacité cytotoxique évidente vis-à-vis de cellules tumorales. Ces anticorps se distinguent très nettement des immunoglobulines présentent dans les sérums d'individus sains qui ne montrent pas, en ce qui les concerne, d'activité antitumorale marquée. La capacité cytotoxique des immunoglobulines purifiées des liquides kystiques se manifeste non seulement vis-à-vis des cellules de tumeurs du SNC mais aussi, quoi que plus modestement, vis-à-vis de cellules cancéreuses de la vessie, comme indiqué ici. La généralisation de l'utilisation de ces anticorps dans des approches thérapeutiques semblent donc envisageable pour le traitement des tumeurs des SNC et de certaines formes d'autres cancers affectant des organes autres que le SNC. La figure 5 montre la mesure de cytotoxicité des immunoglobulines purifiées de liquides kystiques ou sérums sur des cellules de tumeurs en culture. Les histogrammes représentent les taux de survie (exprimés en valeurs arbitraires) des cellules tumorales en culture après 7 jours d'incubation en présence de : 1) tampon contrôle ; 2) immunoglobulines de sérum d'individus sains ; 3) immunoglobulines d'un liquide kystique de tumeur oligodendrogliale ; 4) immunoglobulines d'un liquide kystique de tumeur astocytaire de grade III. Les cellules en culture sont : en A) des glioblastomes ; en B) des neuroblastomes. Les concentrations d'immunoglobulines au contact des cellules sont établies à 1 microgramme d'immunoglobulines par ml de milieu dans tous les essais.

Exemple 6 : Blocage de la prolifération des cellules tumorales in vitro par les siRNA La séquence du siRNA permettant de perturber l'expression des protéines eEF1Al a été choisie en fonction de la séquence ADNc du clone 1 G5 (cf figure 2). Brièvement, deux séquences sont sélectionnées pour la création d'un siRNA, à savoir : la séquence sens qui présente une longueur de 19 bases homologue à une partie de la séquence de l'ARN messager codant la protéine ; et une séquence parfaitement complémentaire de la séquence "sens" sélectionnée. Les deux séquences ont une longueur de 19 bases. Les séquences sens et antisens sont montrées à la figure 6. Les fragments d'ARN correspondant aux séquences sens et aux séquences complémentaires ont été synthétisés par voie chimique. Des ARN double-brin ont ensuite été créés in vitro par hybridation entre les ARN correspondant aux séquences sens et les fragments correspondant aux séquences complémentaires. Ces fragments d'ARN double-brin ont été utilisés pour transfection de cellules tumorales en culture. L'agent transfectant étant ici l'oligofectamine. Des contrôles appropriés ont été également réalisés, en particulier : transfection des cellules selon un protocole rigoureusement identique mais n'incluant pas les siRNA. Les cellules utilisées étaient des cellules de glioblastomes (lignée U373 présentant une forte prolifération in vitro).

Les cellules de glioblastomes U373 en culture ont été transfectées par les siRNA dont les séquences sont présentées à la figure 6. Après 5 jours d'entretien en milieu de croissance, les cellules sont comptées et le taux de prolifération, calculé par rapport à l'ensemencement initial du :milieu, est mesuré. Par rapport à un développement normal des cellules dans les conditions de contrôle (taux de prolifération statué à 100%), le siRNA double-brin dirigé contre eEF1Al ralentit :35 de manière significative la prolifération des cellules de glioblastomes. En effet, en présence du siRNA dirigé contre eEF1A1, la prolifération des cellules n'est plus que de 41% par rapport au contrôle.

Références bibliographiques - Beghini A, Magnani I, Roversi G, Piepoli T, Di Terlizzi S, Moroni RF, Polio B, Fuhrman Conti AM, Cowell JK, Finocchiaro G, Larizza L. Oncogene. 2003, 22, 2581-91. - Blomberg K, Hurskainen P, Hemmila I. Clin Chem. 1999, 45, 855-61. - Booth JC, Hannington G, Bakir TM, Stem H, Kangro H, Griffiths PD, Heath RB. J Clin Pathol. 1982, 35, 1345-8. Bourges I, Ramus C, Mousson de Camaret B, Beugnot R, Remacle C, Cardol P, Hofhaus G, Issartel JP. Biochem. J. 2004, 383, 491-9. - Bruner JM, Inouye L, Fuller GN, Langford LA. Cancer. 1997, 79, 796-803. - Burnette WN., Anal Biochem. 1981, 112, 195-203. Cairncross JG, Ueki K, Zlatescu MC, Lisle DK, Finkelstein DM, Hammond RR, Silver JS, Stark PC, Macdonald DR, Ino Y, Ramsay DA, Louis DN. J Natl Cancer Inst. 1998, 90, 1473-9. - Chatel M, Brucher J-M. dans Neuro-oncologie , Editeur J. Hildebrand, Doin 2001 ; p 25-34 - Coons SW, Johnson PC, Scheithauer BW, Yates M, Pearl DK. Cancer. 1997, 79, 1381-93. - Ditzel HJ, Masaki Y, Nielsen H, Farnaes L, Burton DR. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000, 97, 9234-9. Daumas-Duport C, Figarella-Branger D., dans Classification histopronostiques des tumeurs cérébrales gliales et leurs impacts en thérapeutique Editions espaces 34, 2002 ; p 11-48. - Ejiri SI. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002, 66, 1-21. - Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Nature. 2001, 411, 494-8. -Ellington AD, Szostak JW. Nature 1990, 346, 818-22. Engvall E, Perlmann P. Immunochemistry 1971, 8, 871-874. Engvall E, Jonsson K, Perlmann P. Biochim Biophys Acta. 1971, 251, 427-34. - Engvall E, Perlmann P. J Immunol. 1972, 109, 129-35. - Enomoto K, Aono Y, Mitsugi T, Takahashi K, Suzuki R, Preaudat M, Mathis G, Kominami G, Takemoto H. J Biomol Screen. 2000, 5, 263-8. - Fagerstam LG, Frostell A, Karlsson R, Kullman M, Larsson A, Malmgvist M, Butt H. J Mol Recognit. 1990, 3, 208-14. - Gao C, Mao S, Lo CH, Wirsching P, Lerner RA, Janda KD. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999, 96, 6025-30. Grant AG, Flomen RM, Tizard ML, Grant DA. Int J Cancer. 1992, 50, 740-5. - Hechemy K, Stevens RW, Gaafar HA., Appl Microbiol. 1974, 28, 306-11. - Hulett HR, Bonner WA, Barrett J, Herzenberg LA. Science. 1969, 166, 747-9.

Karagiarmis TC, El-Osta A. Cancer Gene Ther. 2005 May 13 - Khalyfa A, Carlson BM, Carlson JA, Wang E. Dev Dyn. 1999, 216, 267-73. Kato T, Satoh S, Okabe H, Kitahara O, Ono K, Kihara C, Tanaka T, Tsunoda T, Yamaoka Y, Nakamura Y, Furukawa Y. Neoplasia. 2001, 3, 4-9. - Kiernan JA. Histological and histochemical methods. Theory and practise. Third edition. Oxford : Butterworth-Heinemann 1999. - Knappik A, Ge L, Honegger A, Pack P, Fischer M, Wellnhofer G, Hoess A, Wolle J, Pluckthun A, Virnekas B. J Mol Biol 2000, 296, 57-86.

Kusnezow W, Hoheisel JD. J Mol Recognit. 2003, 16, 165-76. - Laemmli UK. Nature. 1970, 227, 680-5. Lee JM. Reprod. Biol. Endocrinol. 2003, 1, 69. -Mansilla F, Hansen LL, Jakobsen H, Kjeldgaard NO, Clark BF, Knudsen CR. Biochim Biophys Acta. 2005, 1727, 116-24. - Mathis G. Clin Chem. 1995, 41, 1391-7. Merchant M, Weinberger SR. Electrophoresis. 2000, 21, 1164-77. -Mittler MA, Walters BC, Stopa EG. J Neurosurg. 1996, 85, 1091-4. -Ohkouchi K, Mizutani H, Tanaka M, Takahashi M, Nakashima K, Shimizu M. Int Immunol 1999, 11, 1635-40.

Parks DR, Herzenberg LA. Methods Enzymol. 1984, 108, 197-241. - Peluso P, Wilson DS, Do D, Tran H, Venkatasubbaiah M, Quincy D, Heidecker B, Poindexter K, Tolani N, Phelan M, Witte K, Jung LS, Wagner P, Nock S. Anal Biochem. 2003, 312, 113-24. - Shen R, Su ZZ., Olsson CA, Fisher PB. Proc Natl Acad Sci U S A 1995, 92, 6778-82. 20 - Singer JM, Plotz CM, Pader E, Elster SK. Am J Clin Pathol. 1957, 28, 611-7. - Szabo A, Stolz L, Granzow R. Curr Opin Struct Biol. 1995, 5, 699-705. Szollosi J, Damjanovich S, Matyus L. Cytometry. 1998, 34, 159-79. - Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979, 76, 4350-4. Tuerk C, Gold L. Science 1990, 249, 505-10. 25 - Ueda H, Kubota K, Wang Y, Tsumoto K, Mahoney W, Kumagai I, Nagamune T. Biotechniques. 1999, 27, 73 8-42. - Vikinge TP, Askendal A, Liedberg B, Lindahl T, Tengvall P. Biosens Bioelectron. 1998, 13,

- 30 - - 1257-62. Weinberger SR, Morris TS, Pawlak M. Pharmacogenomics 2000, 1, 395-416. Xu Y, Piston DW, Johnson CH. Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96, 151-6. Yalow RS, Berson SA. J Clin Invest. 1960, 39, 1157-75.

Claims (19)

REVENDICATIONS

1. Procédé susceptible d'être employé pour détecter la présence ou l'absence d'une tumeur chez un mammifère, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détecter et/ou quantifier 5 sur un échantillon biologique préalablement prélevé sur ledit mammifère : - la présence d'une protéine eEF1Al, et/ou - la présence d'anticorps dirigés contre une protéine eEF1A1 ou un fragment comprenant au moins un épitope de cette protéine.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon biologique 10 préalablement prélevé est choisi parmi un échantillon de sérum sanguin, de lymphe, de liquide kystique, de liquide céphalo-rachidien (LCR), d'homogénats tissulaires, de préférence un échantillon de sérum sanguin.

3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la détection et la quantification d'au moins un autre marqueur biologique caractéristique de la 15 présence et/ou de l'invasivité d'une tumeur.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la présence de la protéine eEF1Al est détectée et/ou quantifiée aux moyens d'anticorps dirigés contre la protéine eEF1Al ou au moins un épitope de cette protéine.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisée en ce que les anticorps sont des 20 anticorps polyclonaux ou des anticorps monoclonaux.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la présence d'anticorps dirigés contre une protéine eEF1Al ou un fragment comprenant au moins un épitope de cette protéine est détectée et/ou quantifiée au moyen d'un antigène comprenant au moins un épitope d'une protéine eEF1Al. 25

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de comparaison des résultats obtenus à l'étape de détection et/ou de quantification avec une valeur de référence caractéristique de la présence d'une tumeur et/ou avec une valeur de référence caractéristique de l'absence de tumeur.

8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la protéine 30 eEF1Al comprend la séquence protéique représentée sur la SEQ ID NO 1.

9. Kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens permettant de détecter et/ou quantifier sur un échantillon biologique préalablement prélevé : la présence d'une protéine eEF1A1, et/ou 35 la présence d'anticorps dirigés contre une protéine eEF1A1 ou un fragment comprenant au moins un épitope de cette protéine.

10. Anticorps dirigés contre une protéine eEF 1 Al ou un fragment comprenant au moins un épitope de cette protéine, caractérisés en ce qu'ils se lient de manière spécifique à une protéine eEFIA1 ou à au moins un épitope de cette protéine.

11. Procédé pour inhiber la croissance de cellules tumorales in vitro, caractérisé en ce 5 que l'on inhibe l'activité de la protéine eEFIA1 au moyen d'un anticorps ou d'un ARN interférant qui inhibe l'expression d'un gène codant pour une protéine eEF1Al.

12. ARN interférant caractérisé en ce qu'il inhibe in vitro et/ou in vivo l'expression d'un gène codant pour une protéine eEF1AI.

13. ARN interférant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi 10 les ARN antisens et les ARN double brins (dsRNA).

14. ARN interférant selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'ARN double brin est un siRNA.

15. ARN interférant selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence suivante, capable d'inhiber l'expression d'un gène codant pour un variant spécifique de la 15 protéine eEF 1A 1 : Séquence sens : 5' UGG UGA CAA CAU GCU GGA G 3' Séquence antisens : 5' CUC CAG CAU GUU GUC ACC A 3'

16. Vecteur pour l'expression d'un ARN interférant selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour ledit ARN interférant sous le contrôle d'éléments de régulations permettant l'expression dudit ARN interférant dans une cellule hôte. 20

17. Vecteur pour la délivrance d'un ARN interférant dans une cellule hôte, caractérisé en ce qu'il comprend un ARN interférant selon l'une des revendications 12 à 15 et des moyens permettant la délivrance dudit ARN interférant dans une cellule hôte.

18. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps selon la revendication 10 ou un ARN interférant selon l'une des revendications 12 à 15 ou un 25 vecteur pour l'expression de l'ARN interférant selon la revendication 16 ou un vecteur pour la délivrance d'un ARN interférant selon la revendication 17 dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 30 l'une des revendications 12 à 15, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers. 22. Utilisation selon la revendication 21 pour le traitement des glioblastomes.

19. ARN interférant selon l'une des revendications 12 à 15, pour son utilisation en thérapie. Anticorps selon la revendication 10 pour son utilisation en thérapie.20. 21. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 10 ou d'un ARN interférant selon 35