FR2890660A1 - Acceleration of induction of in vitro somatic mutations, useful in in vitro tests of hypermutagenicity, comprises expression of complementary DNA expressing a modified version of activation induced cytidine deaminase gene in the cells - Google Patents
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Abstract
Description
PROCÉDÉ POUR L'ACCÉLÉRATION DES MUTATIONS SOMATIQUESMETHOD FOR ACCELERATING SOMATIC MUTATIONS
ET SON APPLICATION EN PROTÉOMIQUE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne la biologie, et plus spécialement le domaine de l'adaptation par mutation dirigée, spécifique au monde vivant. Elle concerne plus particulièrement l'accélération de l'induction de mutations somatiques in vitro, et les applications que les perfectionnements d'une telle technique rendent désormais possibles. FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to biology, and more particularly to the field of adaptation by directed mutation, specific to the living world. It relates more particularly to the acceleration of the induction of somatic mutations in vitro, and the applications that the improvements of such a technique now make possible.
Dans une forme de réalisation particulière, l'invention concerne l'induction des mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. In a particular embodiment, the invention relates to the induction of mutations on Burkitt BL2 lymphoma.
Sous un autre aspect, l'invention concerne l'induction de mutations sur des cellules immortalisées productrices d'anticorps, à savoir des 15 hybridomes de souris ou des hybridomes humains ou des lignées B humaines immortalisées par le virus Epstein-Barr (EBV). In another aspect, the invention relates to the induction of mutations on antibody-producing immortalized cells, namely mouse hybridomas or human hybridomas or human B lines immortalized by Epstein-Barr virus (EBV).
ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION Pour simplifier, il est fait référence dans la suite au lymphome de 20 Burkitt BL2. Il faut cependant souligner que cela vise seulement à faciliter l'exposé de la technique concernée et du concept inventif revendiqué, sans pour autant limiter l'invention à cet égard. BACKGROUND OF THE INVENTION For simplicity, reference is hereinafter made to Burkitt BL2 lymphoma. It must be emphasized, however, that this is only intended to facilitate the presentation of the technique concerned and the claimed inventive concept, without limiting the invention in this respect.
La lignée cellulaire du lymphome de Burkitt de type I BL2, présente les caractéristiques des cellules B centroblastiques. Cette lignée cellulaire est la plus proche contrepartie immortalisée des centroblastes des centres germinatifs. Son origine de centre germinatif a été confirmée par la présence de mutations somatiques dans les gènes VH d'immunoglobuline des lymphomes de Burkitt. The type I BL2 Burkitt lymphoma cell line exhibits the characteristics of centroblastic B cells. This cell line is the closest immortalized counterpart of centroblasts of germinal centers. Its germinal center origin was confirmed by the presence of somatic mutations in the immunoglobulin VH genes of Burkitt's lymphomas.
L'homogénéité et la stabilité des cellules BL2 dans des cultures appropriées a été soulignée (Denépoux S. et al., Immunity, vol. 6, 35-46, 1997). Il a été proposé, en conformité avec le phénotype de centroblaste, de considérer que la BL2 résulte de la transformation d'un centroblaste de centre germinatif qui a subi plusieurs phases de mutations somatiques. The homogeneity and stability of BL2 cells in appropriate cultures has been emphasized (Denépoux S. et al., Immunity, vol 6, 35-46, 1997). It has been proposed, in accordance with the centroblast phenotype, to consider that BL2 results from the transformation of a germinal center centroblast which has undergone several phases of somatic mutations.
On estime par ailleurs que les cellules B subissent une hypermutation au stade du centroblaste (Pascual V. et al., j. Exp. Med. 180, 329-339 (1994) . It is further believed that B cells undergo hypermutation at the centroblast stage (Pascual V. et al., J. Med Exp 180, 329-339 (1994).
Le phénomène d'hypermutation des immunoglobulines a lieu dans les centres germinatifs, après stimulation d'une cellule B par un antigène Tdépendant. The hypermutation phenomenon of immunoglobulins takes place in the germinal centers, after stimulation of a B cell by a T-dependent antigen.
En particulier, Denépoux S. et al., (op. cité) ont établi que les cellules de lymphome, notamment les cellules BL2, peuvent enclencher un processus d'hypermutation après agrégation de leur récepteur de surface et co-culture avec une cellule T-auxiliaire ou amplificatrice, après une semaine de culture. Il a été conclu dans cet article que c'est par des activations répétées des cellules BL2 que l'on peut augmenter la fréquence de mutation. Egalement ces auteurs ont souligné que les mutations induites in vitro sur la BL2 n'affectent pas la région constante de 1'IgM et ne font pas apparaître une sélection dirigée par un antigène. In particular, Denépoux S. et al., (Cited above) have established that lymphoma cells, in particular BL2 cells, can initiate a process of hypermutation after aggregation of their surface receptor and co-culture with a T cell. -aliliary or amplifying, after a week of culture. It has been concluded in this article that it is by repeated BL2 cell activations that the mutation frequency can be increased. These authors also pointed out that mutations induced in vitro on BL2 do not affect the constant region of IgM and do not show antigen-directed selection.
Egalement, Yélamos J. et al., Nature, vol. 376, pp. 225-229 (1995) ont relaté des expériences tendant à montrer que le fragment de gène V de 15 l'immunoglobuline n'est pas indispensable pour une hypermutation et que la construction de substrats de mutation artificiels pourrait s'en trouver simplifiée. Also, Yelamos J. et al., Nature, vol. 376, pp. 225-229 (1995) have reported experiments that show that the immunoglobulin V gene fragment is not essential for hypermutation and that the construction of artificial mutation substrates could be simplified.
La lignée BL2, dérivée d'un lymphome de Burkitt, peut ainsi être utilisée comme outil de mutagenèse ciblée pour altérer un gène d'intérêt. The BL2 line, derived from a Burkitt lymphoma, can thus be used as a targeted mutagenesis tool for altering a gene of interest.
Malgré ces développements de la technique antérieure, on ne disposait pas de moyens efficaces pour étudier ces phénomènes et pour en retirer des résultats pratiques, en particulier à des fins de diagnostic et/ou de suivi, ainsi que de traitement des processus tumoraux, dans des conditions de praticité et de rapidité satisfaisantes. Despite these developments of the prior art, there were no effective means to study these phenomena and to obtain practical results, particularly for diagnostic and / or monitoring purposes, as well as treatment of tumor processes, in particular conditions of practicality and rapidity satisfactory.
Il y avait donc un besoin pour des moyens permettant de réaliser des tests d'hypermutation somatique rapides et fiables. Il existait plus particulièrement un besoin pour des moyens permettant de disposer d'un modèle d'induction de mutations somatiques, applicable aux gènes V, mais également aux autres gènes susceptibles d'être impliqués dans un processus tumoral, notamment chez les humains, comme par exemple les gènes Bd-6 et Fas Ligand (FasL). There was therefore a need for means for performing rapid and reliable somatic hypermutation tests. In particular, there was a need for means making it possible to have a model for the induction of somatic mutations, applicable to the V genes, but also to other genes that may be involved in a tumor process, particularly in humans, such as for example the Bd-6 and Fas Ligand (FasL) genes.
La présente demanderesse a précédemment montré que la mutation des gènes d'immunoglobulines peut être induite par des signaux qui imitent le déclenchement des processus d'hypermutation des gènes d'immunoglobulines: stimulation par un anticorps anti-IgM, plus co-culture avec des cellules T auxiliaires, ou stimulation avec des anticorps anti-CD19 et anti-CD21 plus les anticorps anti-IgM biotinylés, qui peuvent ensuite être agrégés à l'aide de billes magnétiques couplées à la streptavidine. The present Applicant has previously shown that the mutation of immunoglobulin genes can be induced by signals that mimic the triggering of hypermutation processes of immunoglobulin genes: stimulation by an anti-IgM antibody, plus co-culture with cells. T helper, or stimulation with anti-CD19 and anti-CD21 antibodies plus biotinylated anti-IgM antibodies, which can then be aggregated with magnetic beads coupled to streptavidin.
Les présents inventeurs ont également montré antérieurement qu'il était possible d'effectuer la recombinaison homologue dans cette lignée, alors que la mise en oeuvre de cette technique est habituellement restreinte aux lignées de type ES ("embryonic stem cells") ou à la lignée issue d'un lymphome aviaire, la DT40. The present inventors have also previously shown that it is possible to perform homologous recombination in this line, whereas the implementation of this technique is usually restricted to ES ("embryonic stem cells") lines or to the line from an avian lymphoma, DT40.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION On a maintenant trouvé un procédé pour l'induction de mutations somatiques dans lequel on accélère les dites mutations, notamment dans la lignée BL2, dérivée d'un lymphome de Burkitt, en exprimant des ADNc exprimant eux-mêmes des versions modifiées du gène AID (l'abréviation AID désigne la "activation-induced cytidine déaminase" ou cytidine déaminase induite par activation). On a pour ce faire mis au point des ADNc AID-modifiés, spécialement adaptés, qui font également partie de la présente invention. SUMMARY OF THE INVENTION We have now found a method for the induction of somatic mutations in which these mutations are accelerated, in particular in the BL2 line, derived from Burkitt's lymphoma, by expressing cDNAs expressing themselves versions. modified AID gene (abbreviation AID refers to activation-induced cytidine deaminase or activation-induced cytidine deaminase). To this end, specially adapted AID-modified cDNAs have been developed that are also part of the present invention.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Fig. 1 représente la séquence codante nucléotidique naturelle de l'AID humaine et le peptide codé par ladite séquence. Fig. 1 represents the natural nucleotide coding sequence of human AID and the peptide encoded by said sequence.
Fig. 2 est une représentation des proportions respectives de séquences VH de la lignée BL2 présentant un nombre donné de mutations, 25 respectivement dans des cellules transfectées avec 1'AID sauvage et dans des cellules transfectées avec l'AID mutant (SEQ ID NO.1 selon la présente invention). Fig. 2 is a representation of the respective proportions of VH sequences of the BL2 line having a given number of mutations, respectively in cells transfected with wild-type AID and in cells transfected with the mutant AID (SEQ ID NO. present invention).
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Le gène AID (voir Fig. 1) est responsable de l'initiation du processus d'hypermutation par déamination des cytidines du gène V des immunoglobulines en uraciles, ce qui conduit à une réparation ou une réplication erronée de ces bases anormales dans l'ADN. The AID gene (see Fig. 1) is responsible for initiating the process of hypermutation by deamination of cytidines of the immunoglobulin V gene into uracils, leading to erroneous repair or replication of these abnormal bases in DNA. .
L'AID est une protéine essentiellement cytoplasmique, qui doit être 35 ciblée dans le noyau d'une cellule pour y exercer son activité de déamination. Or, l'AID circule en permanence entre noyau et cytoplasme (voir, par exemple, S. Ito et al., PNAS, 17 février, 2004, vol. 101, No. 7, pp. 1975-1980), et sa localisation cytoplasmique résulte d'un export actif du noyau, effectué par la protéine CRM1 (voir, par exemple, K.M. McBride et al., J. Exp. Med., vol. 199, No. 9, 3 mai 2004, pp. 1235-1244). Celle-ci reconnaît un site consensus, présent dans la protéine AID. AID is an essentially cytoplasmic protein, which must be targeted into the nucleus of a cell to exert its deaminating activity therein. However, AID constantly circulates between nucleus and cytoplasm (see, for example, S. Ito et al., PNAS, February 17, 2004, vol 101, No. 7, pp. 1975-1980), and its location. Cytoplasmic results from an active export of the nucleus, carried out by the CRM1 protein (see, for example, KM McBride et al., J. Exp.Med., vol 199, No. 9, May 3, 2004, pp. 1235- 1244). This recognizes a consensus site, present in the protein AID.
On a alors maintenant trouvé que l'on peut interrompre cet export et obtenir une localisation essentiellement nucléaire de la protéine AID en effectuant une mutagenèse de trois acides aminés hydrophobes de ce site consensus de la protéine AID, à savoir 1eu189, phe193 et 1eu196, en alanine. It has now now been found that this export can be interrupted and an essentially nuclear location of the AID protein can be obtained by performing a mutagenesis of three hydrophobic amino acids of this consensus site of the AID protein, namely 1eu189, phe193 and 1eu196, in alanine.
On a ainsi trouvé expérimentalement que la mutagenèse observée au locus des immunoglobulines est augmentée de 5 à 10 fois, de façon constitutive, par rapport au taux de mutation que l'on obtiendrait toutes choses égales par ailleurs avec les techniques connues rappelées plus haut. It has thus been found experimentally that the mutagenesis observed at the immunoglobulin locus is increased 5 to 10 times, constitutively, with respect to the rate of mutation that would be obtained all things being equal with the known techniques mentioned above.
La séquence codante nucléotidique de l'AID humaine portant la mutation indiquée ci-dessus sur les positions appropriées est représentée, avec le peptide codé par ladite séquence, par la séquence SEQ ID NO.1, comportant les mutations des trois acides aminés 1eu189, phe193 et 1eu196 en alanine sur la séquence de l'AID. The nucleotide coding sequence of the human AID carrying the mutation indicated above at the appropriate positions is represented, with the peptide encoded by said sequence, by the sequence SEQ ID NO.1, comprising the mutations of the three amino acids 1eu189, phe193. and 1eu196 in alanine on the sequence of AID.
Cette mutagenèse, s'effectue selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. This mutagenesis is carried out according to methods well known to those skilled in the art.
L'effet procuré p4ar le procédé selon l'invention est attesté par les résultats d'expériences (effectuées de manière traditionnelle, conforme à la pratique connue de l'homme du métier) résumés dans les schémas des Figs 25 2A-B annexées. The effect provided by the process according to the invention is attested by the results of experiments (carried out in a conventional manner, in accordance with the practice known to those skilled in the art) summarized in the diagrams of the appended Figs. 2A-B.
On a ainsi trouvé que les cellules de lymphome, notamment les cellules BL2, peuvent enclencher un processus d'hypermutation nettement accéléré sur leurs gènes d'immunoglobulines, contrairement aux données de la technique antérieure, selon lesquelles un processus comparable était long et fastidieux à mettre en oeuvre, ou nécessitant d'autres techniques pour atteindre une mutation quelque peu accélérée. Au surplus, le procédé selon l'invention procure une remarquable distribution du nombre des mutations obtenues (voir Fig. 2B). It has thus been found that lymphoma cells, in particular BL2 cells, can initiate a clearly accelerated hypermutation process on their immunoglobulin genes, contrary to the prior art data, according to which a comparable process was long and tedious to put into effect. implemented, or requiring other techniques to achieve a somewhat accelerated change. In addition, the method according to the invention provides a remarkable distribution of the number of mutations obtained (see Fig. 2B).
La fréquence de mutation (pour 100 paires de bases) s'est avérée être 35 de 0,22 % pour des cellules transfectées avec le gène d'AID mutant selon l'invention avec seulement les 3 acides aminés 189, 193 et 196 remplacés par l'alanine (soit SEQ ID NO.1), contre seulement 0,05 % pour des cellules transfectées avec l'AID humaine sauvage selon la séquence représentée sur la Fig. 1. The mutation frequency (per 100 base pairs) was found to be 0.22% for cells transfected with the mutant AID gene according to the invention with only the 3 amino acids 189, 193 and 196 replaced by alanine (ie SEQ ID NO.1), against only 0.05% for cells transfected with wild-type human AID according to the sequence shown in FIG. 1.
Plus précisément, on a maintenant trouvé de manière inattendue que, avec pour modèle la cellule BL2, on peut réaliser in vitro dans des conditions de rapidité et d'efficacité très exceptionnelles, l'induction de mutations somatiques dans des cellules appropriées en transfectant les cellules à faire muter avec au moins un gène AID mutant tel que décrit plus haut et 10 représenté par SEQ ID NO.1, avec dans le listage des séquences SEQ ID NO.2 représentant le peptide codé par ladite séquence. More specifically, it has now surprisingly been found that, with the BL2 cell as a model, the induction of somatic mutations in appropriate cells by transfecting cells can be performed in vitro under very exceptional conditions of rapidity and efficiency. to mutate with at least one mutant AID gene as described above and represented by SEQ ID NO.1, with in the list of sequences SEQ ID NO.2 representing the peptide encoded by said sequence.
L'invention a ainsi pour premier objet un procédé pour l'accélération de l'induction de mutations somatiques in vitro ou ex vivo, comportant (1) l'adjonction aux cellules à faire muter, dans des conditions de culture et dans un milieu appropriés aux dites cellules, d' un ADNc exprimant une version modifiée du gène AID, dans lequel on a remplacé les trois acides aminés hydrophobes 1eu189, phe193 et 1eu196 par mutation en alanine dans chaque cas. The invention thus firstly relates to a method for accelerating the induction of somatic mutations in vitro or ex vivo, comprising (1) the addition to the cells to be mutated, under appropriate culture conditions and in a medium. to said cells, a cDNA expressing a modified version of the AID gene, in which the three hydrophobic amino acids 1eu189, phe193 and 1eu196 have been replaced by alanine mutations in each case.
Selon une caractéristique, l'induction de mutations somatiques selon 20 l'invention est mise en oeuvre sur une durée d'au moins 7 jours, et plus préférablement sur une durée d'environ 8 jours. According to one characteristic, the induction of somatic mutations according to the invention is carried out over a period of at least 7 days, and more preferably over a period of about 8 days.
Selon une caractéristique avantageuse, le procédé selon l'invention ne comporte pas la mise en oeuvre de co-cultures avec des cellules d'un autre type cellulaire, notamment avec une cellule T. Selon une caractéristique particulière, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre pour l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. According to an advantageous characteristic, the method according to the invention does not involve the implementation of co-cultures with cells of another cell type, in particular with a T cell. According to one particular characteristic, the method according to the invention is implemented for the induction of mutations on Burkitt BL2 lymphoma.
L'invention a également pour objet l'utilisation de ce procédé d'induction de mutations somatiques pour la réalisation de tests in vitro d'hypermutagénicité au niveau protéique et/ou génique. Les modalités pratiques les plus appropriées pour l'utilisation du procédé d'accélération des mutations somatiques conformément à l'invention sont parfaitement connues de l'homme du métier, qui dispose à cet égard de moyens de routine et/ou d'essais pour l'ajustement des paramètres, en cas de besoin. The subject of the invention is also the use of this method of inducing somatic mutations for carrying out in vitro tests for hypermutagenicity at the protein and / or gene level. The most appropriate practical modalities for the use of the method of acceleration of somatic mutations according to the invention are well known to those skilled in the art, who has in this respect routine means and / or tests for the adjustment of the parameters, if necessary.
Sous un premier aspect de l'invention, cette utilisation est appliquée aux lymphomes B, en particulier aux lymphomes B humains, plus particulièrement pour l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. According to a first aspect of the invention, this use is applied to B lymphomas, in particular to human B lymphomas, more particularly for the induction of mutations on Burkitt BL2 lymphoma.
Sous un autre aspect de l'invention, cette utilisation est appliquée à d'autres cellules immortalisées productrices d'anticorps, à savoir les hybridomes de souris ou les lignées B humaines immortalisées par le virus de l'Epstein-Barr (EBV). In another aspect of the invention, this use is applied to other immortalized antibody-producing cells, i.e., mouse hybridomas or human B lines immortalized by Epstein-Barr virus (EBV).
L'invention a ainsi également pour objet l'utilisation du procédé selon l'invention pour l'induction de mutations somatiques sur les gènes d'immunoglobulines de cellules immortalisées productrices d'anticorps, notamment celles choisies parmi les hybridomes de souris, les hybridomes humains et les lignées B humaines immortalisées par le virus Epstein-Barr. On utilise pour ce faire des techniques similaires à celles préconisées pour les lymphomes de Burkitt. The invention thus also relates to the use of the method according to the invention for the induction of somatic mutations on immunoglobulin genes of immortalized antibody-producing cells, in particular those chosen from mouse hybridomas, human hybridomas and human B lines immortalized by the Epstein-Barr virus. To do this, techniques similar to those recommended for Burkitt's lymphomas are used.
Pour l'induction de mutations somatiques in vitro notamment sur la cellule BL2 conformément à l'invention, on procède en pratique par transfection de cellules, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. For the induction of somatic mutations in vitro, in particular on the BL2 cell according to the invention, the procedure is in practice by transfection of cells, according to techniques well known to those skilled in the art.
L'invention a également pour objet un kit pour l'induction de mutations somatiques, caractérisé en ce qu'il comporte un système inducteur de mutations somatiques adcélérées tel que défini plus haut. The invention also relates to a kit for the induction of somatic mutations, characterized in that it comprises an inducer system of somatic mutations adcelerated as defined above.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de ce kit pour l'identification qualitative et/ou quantitative de composants du mutasome, 25 notamment par l'analyse des protéines. Another object of the invention is the use of this kit for the qualitative and / or quantitative identification of mutasome components, in particular by the analysis of proteins.
Dans une forme de réalisation, l'utilisation du kit selon l'invention comporte l'identification des modifications post-traductionnelles induites, en particulier par identification, isolement et analyse d'un composant du mutasome, notamment d'un composant protéinique, qui apparaît pendant ladite induction. In one embodiment, the use of the kit according to the invention comprises the identification of the induced post-translational modifications, in particular by identification, isolation and analysis of a component of the mutasome, in particular of a protein component, which appears during said induction.
Selon une caractéristique de mise en oeuvre préférée, cette utilisation comporte la fourniture d'au moins un gène, notamment un gène codant pour une protéine d'intérêt, sur lequel on souhaite induire des mutations, tandis que ledit gène est inclus dans une cassette contenant le promoteur et l'activateur ("enhancer" des gènes codant pour la chaîne lourde ou légère des IgG, et que ledit gène est transfecté dans des cellules de lymphome, notamment de lymphome de Burkitt BL2. According to a preferred implementation characteristic, this use comprises the provision of at least one gene, in particular a gene coding for a protein of interest, on which it is desired to induce mutations, whereas said gene is included in a cassette containing the promoter and activator ("enhancer" of the genes encoding the IgG heavy or light chain, and that said gene is transfected into lymphoma cells, in particular Burkitt BL2 lymphoma cells.
Selon une forme de réalisation avantageuse, pour faire muter une séquence quelconque, on encadre la séquence à faire muter par le promoteur et l'activateur des Ig, de préférence dans une cassette de mutation. According to an advantageous embodiment, to mutate any sequence, the sequence to be mutated by the promoter and the Ig activator is preferably framed, preferably in a mutation cassette.
L'homme du métier est ainsi apte à concevoir, sur la base des indications ci-dessus et de ses connaissances propres, sans sortir du cadre de la présente invention, des systèmes de test analogues ou équivalents et des utilisations concrètes différentes, apparentées ou non à celles qui sont décrites ici. Those skilled in the art are thus able to conceive, on the basis of the above indications and of their own knowledge, without departing from the scope of the present invention, analogous or equivalent test systems and different practical uses, related or otherwise to those described here.
TABLEAU EXPLICITANT LA SÉQUENCE SEQ ID NO.: 1: 1/1 31/1.1 atg.gac 41c. etc t*tg atg aac pgg agg aa.g ttt ctt tac caa ttc aaa aat gtc cgc tgg,M 'D S L L _M N R R K F L Y Q F K N V R W 61/21 91/31 gct aaÉg ggt cgg. E5t gag. ïcc tac ctg tgc tac sgÉta gtg aag agg cgt'gac agt get aca A K G.R 1 2 H 1 ' Y L 'C Y FJ V K R R. D S A T 121/41 15 /51 tec ttt tca tg.g.q ttt ggt:tat ctt agé aat aag a,aç ggc tgc cap gtg gaâ ttg ctc S F S L E.F G Y L T N G C S V E L L 181/61 211/71 ttc ôta cgc.ta,e atcÉt<ag gac tgg gâc cta gaç cct ggc cgc tgc tac cgc gtc acc tgg F L R Y I S $ ? T D Z, D P G R C Y R V T W 241/81 271/91 ttc acc toc tg.g agç ccc te tac gac tgt gcc cga cat gtg gcc gac ttt ctg cga-ggg F T S W $: D Ç Y D Ée AÉ R H V A D- F L R G 501/10.1. - 331/111. TABLE EXPLAINING THE SEQUENCE SEQ ID NO .: 1: 1/1 31 / 1.1 atg.gac 41c. etc. ttgtg ttg aac pgg agg aa.g ttt ctt tac caa ttc aaa aat gtc cgc tgg, M 'D S L L _M N R R K F L Y Q F K N V R W 61/21 91/31 gct aaegg ggt cgg. E5t gag. tac tac c c c agg AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK AK a, a ggc tgc cap gtg gaâ ttg ctc SFSL EF GYLTNGCSVELL 181/61 211/71 ttc ota cgc.ta, e atcEt <ag gac tgg gcc cta gac cct ggc cgc tgc tac cgc gtc acc tgg FLRYIS $? T D Z, D P G R C Y R V T W 241/81 271/91 t acc acc acc acc acc W W W G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G 501 / 10.1. - 331/111.
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