FR2888117A1 - Oil-in-water adjuvant emulsion, useful in immunogenic composition, comprises squalene, aqueous solvent, polyoxyethylene alkyl ether hydrophilic nonionic surfactant, and hydrophobic nonionic surfactant - Google Patents
Oil-in-water adjuvant emulsion, useful in immunogenic composition, comprises squalene, aqueous solvent, polyoxyethylene alkyl ether hydrophilic nonionic surfactant, and hydrophobic nonionic surfactant Download PDFInfo
- Publication number
- FR2888117A1 FR2888117A1 FR0507240A FR0507240A FR2888117A1 FR 2888117 A1 FR2888117 A1 FR 2888117A1 FR 0507240 A FR0507240 A FR 0507240A FR 0507240 A FR0507240 A FR 0507240A FR 2888117 A1 FR2888117 A1 FR 2888117A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- vaccine
- composition according
- emulsion
- oil
- vaccine composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
- A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
La présente invention est relative au domaine des vaccins; plusThe present invention relates to the field of vaccines; more
particulièrement, l'invention est relative au domaine des vaccins comprenant un adjuvant. particularly, the invention relates to the field of vaccines comprising an adjuvant.
Il existe dans l'art antérieur de nombreux vaccins qui contiennent un ou plusieurs adjuvants. Le brevet US 6 299 884 décrit notamment une formulation adjuvante comprenant une émulsion huile dans eau, dont la taille des gouttelettes d'huile est comprise entre 100 et 1000 nm. Cette émulsion est obtenue au moyen d'un homogénéiseur haute pression (microfluidiseur), au cours d'un procédé de fabrication mettant en oeuvre de hautes énergies mécaniques afin d'obtenir des forces de cisaillement suffisamment importantes pour réduire la taille des gouttes d'huile. Selon cet enseignement, si la valeur minimale de la fourchette des tailles des gouttes obtenues est de 100 nm, la valeur moyenne est nettement plus élevée et se situe au mieux vers 170 nm, plus généralement vers 500nm. There are many vaccines in the prior art that contain one or more adjuvants. US Pat. No. 6,299,884 describes in particular an adjuvant formulation comprising an oil-in-water emulsion, the size of the oil droplets of which is between 100 and 1000 nm. This emulsion is obtained by means of a high pressure homogenizer (microfluidizer), during a manufacturing process using high mechanical energies in order to obtain shear forces large enough to reduce the size of oil drops. . According to this teaching, if the minimum value of the range of the drops obtained is 100 nm, the average value is much higher and is best at 170 nm, more generally around 500 nm.
Il est souhaitable de pouvoir disposer d'une formulation alternative à celle proposée dans ce brevet, et surtout qui puisse être obtenue par un procédé plus simple (ne nécessitant pas une technologie de cisaillement particulière), et de basse énergie tout en étant reproductible et parfaitement fiable; en outre, la formulation adjuvante doit permettre d'adjuver efficacement les vaccins, en permettant notamment d'augmenter la réponse immunitaire obtenue ou de diminuer la dose d'antigène présente, tout en ne présentant pas de signe de toxicité qui nuirait à son administration en toute sécurité. It is desirable to have an alternative formulation to that proposed in this patent, and especially that can be obtained by a simpler process (not requiring a particular shearing technology), and low energy while being reproducible and perfectly reliable; in addition, the adjuvant formulation must allow the vaccines to be effectively adjuvanted, in particular by making it possible to increase the immune response obtained or to reduce the dose of antigen present, while not exhibiting any sign of toxicity which would be detrimental to its administration. all security.
Pour atteindre ce but, la présente invention a pour objet une composition vaccinale comprenant au moins un antigène vaccinal et une émulsion huile dans eau comprenant au moins: - du squalène, un émulsifiant non-ionique comprenant des groupements oxyde d'éthylène, à l'exception des copolymères de polyoxyéthylène et de polyoxypropylène, - un émulsifiant non ionique hydrophobe, caractérisée en ce que l'émulsion est thermoréversible et en ce que 90% de la population 30 volumique des gouttes d'huile a une taille inférieure à 200 nm. To achieve this object, the subject of the present invention is a vaccine composition comprising at least one vaccine antigen and an oil-in-water emulsion comprising at least: squalene, a nonionic emulsifier comprising ethylene oxide groups, except for polyoxyethylene and polyoxypropylene copolymers; a hydrophobic nonionic emulsifier, characterized in that the emulsion is thermoreversible and in that 90% of the volume population of the oil drops is less than 200 nm in size.
Selon l'invention, une telle émulsion est obtenue par un procédé d'inversion de phase par variation de température, ce qui procure un très gros avantage d'un point de vue industriel. Un tel procédé présente toutes les garanties de sécurité et de rentabilité nécessaires à l'industrie pharmaceutique. En outre, grâce à ce procédé, il est possible d'obtenir une émulsion monodisperse dont la taille des gouttelettes d'huile est très faible, ce qui rend l'émulsion ainsi obtenue particulièrement stable et facilement filtrable au moyen de filtres stérilisants dont le seuil de coupure est de 200 nm. According to the invention, such an emulsion is obtained by a phase inversion method by temperature variation, which provides a very large advantage from an industrial point of view. Such a process has all the guarantees of safety and profitability necessary for the pharmaceutical industry. In addition, thanks to this process, it is possible to obtain a monodisperse emulsion whose oil droplet size is very small, which makes the emulsion thus obtained particularly stable and easily filterable by means of sterilizing filters whose threshold cutoff is 200 nm.
Selon une caractéristique particulière, 90% de la population volumique des gouttes d'huile a une taille inférieure à 160 nm, et même à 150 nm. En outre, grâce au procédé de préparation utilisé, la dispersion des gouttelettes en terme de taille est très faible; en effet, lorsqu'on réalise la courbe de distribution des tailles de gouttes obtenues, on remarque que l'on a une distribution gaussienne très resserrée; si la valeur de d90 est généralement inférieure à 150 nm, la valeur de d50 est elle inférieure à 100 et même 90nm. According to a particular characteristic, 90% of the density population of the drops of oil has a size less than 160 nm, and even at 150 nm. In addition, thanks to the preparation method used, the dispersion of the droplets in terms of size is very small; indeed, when one realizes the curve of distribution of the sizes of drops obtained, one notices that one has a very tight Gaussian distribution; if the value of d90 is generally less than 150 nm, the value of d50 is less than 100 and even 90 nm.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'émulsion selon l'invention comprend en outre un alditol; ceci permet d'obtenir une inversion de phase à une température inférieure à celle qui serait nécessaire pour la même composition ne présentant pas d'alditol, ce qui permet de réduire les coûts de production ainsi que les risques de dénaturation thermique des constituants de l'émulsion. According to a particular embodiment of the invention, the emulsion according to the invention further comprises an alditol; this makes it possible to obtain a phase inversion at a temperature lower than that which would be necessary for the same composition not having alditol, which makes it possible to reduce the production costs as well as the risks of thermal denaturation of the constituents of the emulsion.
Selon un mode particulièrement avantageux, le tensioactif non-ionique hydrophobe de l'invention est un tensioactif à base d'ester de sorbitanne ou d'ester de mannide. De tels tensioactifs présentent l'avantage de pouvoir être utilisés en toute sécurité dans les solutions injectables. According to a particularly advantageous embodiment, the hydrophobic nonionic surfactant of the invention is a surfactant based on sorbitan ester or mannide ester. Such surfactants have the advantage that they can be used safely in injectable solutions.
Selon un mode particulier de l'invention, l'émulsion comprend en outre un alkylpolyglucoside et un agent cryoprotecteur tel qu'un sucre, en particulier du dodécylmaltoside et du saccharose.. According to one particular embodiment of the invention, the emulsion further comprises an alkylpolyglucoside and a cryoprotective agent such as a sugar, in particular dodecylmaltoside and sucrose.
Ainsi, il est possible d'obtenir une émulsion lyophilisable, qui, après lyophilisation et reconstitution, retrouve ses propriétés, notamment granulométriques, c'est-à-dire que l'émulsion lyophilisée puis reconstituée est toujours monodisperse et est constituée de gouttelettes d'huile dont 90% de la population volumique a une taille inférieure à 200nm. Ceci est particulièrement important pour le domaine des vaccins qui doivent parfois pour des raisons de stabilité (soit de certains antigènes, soit de certains adjuvants) être conservés sous forme lyophilisée. Thus, it is possible to obtain a freeze-dried emulsion which, after lyophilization and reconstitution, regains its properties, in particular granulometric properties, that is to say that the lyophilized and then reconstituted emulsion is always monodisperse and consists of droplets of oil in which 90% of the population density is less than 200nm. This is particularly important for the field of vaccines which sometimes have to be stored in freeze-dried form for reasons of stability (either of certain antigens or of certain adjuvants).
L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une composition vaccinale comprenant au moins un antigène vaccinal et une émulsion huile dans eau, caractérisé en ce que l'émulsion est obtenue par un procédé d'inversation de phase par variation de la température. The invention also relates to a method for preparing a vaccine composition comprising at least one vaccine antigen and an oil-in-water emulsion, characterized in that the emulsion is obtained by a phase inversion method by variation of the temperature.
Grâce à un tel procédé, très avantageux d'un point de vue industriel, on obtient une émulsion monodisperse dont la taille des gouttelettes d'huile est très faible, ce qui rend 5 l'émulsion ainsi obtenue particulièrement stable et facilement filtrable au moyen de filtres stérilisants. Thanks to such a process, which is very advantageous from an industrial point of view, a monodisperse emulsion is obtained, the size of the oil droplets of which is very small, which makes the emulsion thus obtained particularly stable and easily filterable by means of sterilizing filters.
De nombreux autres avantages de la présente invention apparaîtront au cours de la description qui va suivre. Many other advantages of the present invention will become apparent from the following description.
Par composition vaccinale au sens de la présente invention, on entend une composition susceptible d'être administrée à l'homme ou à l'animal afin d'induire une réponse du système immunitaire; cette réponse du système immunitaire pouvant se traduire par une production d'anticorps ou par une activation de certaines cellules, notamment les cellules présentatrices d'antigènes ( par exemple les cellules dendritiques), les lymphocytes T, les lymphocytes B. La composition vaccinale peut être une composition à visée prophylactique ou à visée thérapeutique, ou encore les deux. Cette activation cellulaire peut être mise en évidence par la présence de marqueurs d'activation à la surface des cellules ou par la libération de cytokines. La composition vaccinale selon l'invention peut être administrée par toutes les voies habituellement utilisées ou préconisées pour les vaccins: voie parentérale, voie muqueuse, et se présenter sous diverses formes notamment liquide ou lyophilisée. Elle peut être administrée au moyen d'une seringue ou au moyen d'un injecteur sans aiguille pour injection intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique, ou au moyen d'un spray nasal. For the purposes of the present invention, the term "vaccine composition" is intended to mean a composition that can be administered to humans or animals in order to induce an immune system response; this response of the immune system may result in antibody production or activation of certain cells, including antigen presenting cells (eg dendritic cells), T cells, B cells. The vaccine composition may be a prophylactic or therapeutic composition, or both. This cellular activation can be demonstrated by the presence of activation markers on the cell surface or by the release of cytokines. The vaccine composition according to the invention may be administered by any of the routes usually used or recommended for vaccines: parenteral route, mucosal route, and be in various forms, in particular liquid or freeze-dried form. It can be administered by means of a syringe or by means of a needleless injector for intramuscular, subcutaneous or intradermal injection, or by means of a nasal spray.
Par antigène au sens de la présente invention, on entend tout antigène susceptible d'être utilisé dans un vaccin, qu'il s'agisse d'un germe entier ou d'un antigène sous-unitaire, peu important sa nature; l'antigène peut en effet être un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un polysaccharide, un glycolipide, un lipopeptide...etc La formulation selon l'invention est particulièrement adaptée aux antigènes viraux; on a en effet obtenu de particulièrement bons résultats avec des antigènes du cytomegalovirus humain, du virus de l'immunodeficience humaine, et de la grippe. For the purposes of the present invention, the term "antigen" is intended to mean any antigen that may be used in a vaccine, whether it be a whole seed or a subunit antigen, which is of little importance; the antigen may indeed be a peptide, a protein, a glycoprotein, a polysaccharide, a glycolipid, a lipopeptide, etc. The formulation according to the invention is particularly suitable for viral antigens; particularly good results have been obtained with antigens of human cytomegalovirus, human immunodeficiency virus, and influenza.
En ce qui concerne les antigènes du virus de la grippe, il est possible d'utiliser des antigènes provenant d'une seule souche virale, ou d'un mélange de différentes souches. Il est possible d'utiliser des antigènes issus de virus cultivés de façon traditionnelle sur oeufs, ou sur cellules. Grâce à l'invention, on a remarqué qu'on pouvait, que ce soit pour une seule souche ou pour un mélange de souches, obtenir une réponse satisfaisante du système immunitaire tout en réduisant très fortement la quantité d'antigènes présente dans la dose vaccinale. Ceci peut être d'un intérêt particulièrement grand dans le cas de la préparation d'un vaccin contre une pandémie de grippe, où il faut pouvoir produire dans un délai très court, des quantités très importantes de doses vaccinales. With respect to influenza virus antigens, it is possible to use antigens from a single viral strain, or a mixture of different strains. It is possible to use antigens derived from viruses traditionally grown on eggs, or on cells. Thanks to the invention, it has been observed that it is possible, whether for a single strain or for a mixture of strains, to obtain a satisfactory response of the immune system while at the same time greatly reducing the quantity of antigens present in the vaccine dose. . This may be particularly important in the case of the preparation of a vaccine against an influenza pandemic, where it is necessary to produce in a very short time, very large amounts of vaccine doses.
Selon l'invention, l'émulsion huile dans eau comprend du squalène qui est une huile provenant à l'origine du foie de requin; c'est une huile dont la formule chimique brute est C30HSO, comprenant 6 double-liaisons, cette huile est métabolisable et présente des qualités permettant son utilisation dans un produit pharmaceutique injectable. Il existe également du squalène d'origine végétale extrait de l'huile d'olive. On a notamment obtenu de bons résultats en utilisant le squalène fourni par la société Fluka qui est d'origine animale. Les quantités de squalène utilisées pour la préparation d'une émulsion concentrée sont avantageusement comprises entre 5 et 45 % ; cette émulsion concentrée est ensuite diluée pour préparer des doses vaccinales dans lesquelles la quantité de squalène est comprise entre 0,5 et 5%. . Selon l'invention, l'émulsion comprend un émulsifiant hydrophile non ionique comportant des groupements oxydes d'éthylène, à l'exception des copolymères de polyoxyéthène et de polyoxyéthylène qui ne conviennent pas. Un émulsifiant qui convient peut notamment être un tensioactif constitué par un éther de polyoxyéthylèneglycols et d'alcools gras encore appelés alkyl- éthers polyoxyéthylénés ou macrogols ethers. De façon non exhaustive, on peut citer comme émulsifiants appartenant à cette catégorie ceux qui sont connus sous la dénomination BRIJ et qui sont commercialisés par la Société ICI America's Inc., ou encore certains des produits connus sous la dénomination d' EumulginTM commercialisés par la Société Cognis. On a ainsi obtenu de bons résultats avec le produit BRIJ 56. Un composé particulièrement adapté et préféré en raison de son origine semisynthétique est le polyoxyéthylène (12) éther cétostéarylique, fourni par la Société COGNIS sous la dénomination d' EumulginTM B1. According to the invention, the oil-in-water emulsion comprises squalene which is an oil originally derived from shark liver; it is an oil whose chemical formula is C30HSO, comprising 6 double bonds, this oil is metabolizable and has qualities allowing its use in an injectable pharmaceutical product. There is also vegetable squalene extracted from olive oil. In particular, good results have been obtained using squalene supplied by Fluka, which is of animal origin. The amounts of squalene used for the preparation of a concentrated emulsion are advantageously between 5 and 45%; this concentrated emulsion is then diluted to prepare vaccine doses in which the amount of squalene is between 0.5 and 5%. . According to the invention, the emulsion comprises a nonionic hydrophilic emulsifier comprising ethylene oxide groups, with the exception of polyoxyethylene and polyoxyethylene copolymers which are unsuitable. A suitable emulsifier may especially be a surfactant consisting of an ether of polyoxyethylene glycols and fatty alcohols also called polyoxyethylenated alkyl ethers or macrogols ethers. Non-exhaustively, mention may be made as emulsifiers belonging to this category, which are known under the name BRIJ and which are marketed by ICI America's Inc., or some of the products known under the name EumulginTM marketed by the Company. Cognis. Thus, good results have been obtained with the product BRIJ 56. A compound that is particularly suitable and preferred because of its semisynthetic origin is the polyoxyethylene (12) cetostearyl ether, supplied by the company COGNIS under the name Eumulgin ™ B1.
Selon l'invention, la composition vaccinale comprend également un tensioactif non- ionique hydrophobe; il doit s'agir d'un tensioactif pouvant être utilisé dans l'industrie pharmaceutique; parmi les tensioactifs convenant à cet égard, on peut citer les tensioactifs à base d'ester de sorbitanne ou d'ester de mannide; les tensioactifs à base d'ester de sorbitanne sont obtenus par réaction d'un acide gras et de mélange d'esters partiels de sorbitol et ses mono et di-anhydres; il peut s'agir d'un mono, d'un di ou d'un tri-ester, ou même d'un mélange; ce sont des tensioactifs hydrophobes dont la balance hydrophilie-lipophilie (HLB) est inférieure à 9. Il s'agit notamment des tensioactifs commercialisés par la Société ICI America's Inc. sous la dénomination de SPAN , ou par la Société Cognis sous la dénomination de DehymulsTM, ou par la Société ICI sous la dénomination de ARLACELTM; comme exemples de tensioactifs convenant particulièrement bien, on peut citer le monooléate de sorbitanne, commercialisé sous la dénomination de Dehymuls SMO TM ou de SPAN 80. Parmi les tensioactifs à base d'ester de mannide, on peut citer le mannide monooléate commercialisé par la Société SIGMA, ou par la Société SEPPIC sous la dénomination de Montanide 80TM Les quantités de squalène et de chacun des tensioactifs utilisés sont avantageusement choisies de manière à obtenir un mélange dont le diagramme de phases comporte une phase de courbure moyenne nulle (type microémulsion ou phase lamellaire) pour laquelle les tensions interfaciales sont extrêmement basses. According to the invention, the vaccine composition also comprises a hydrophobic nonionic surfactant; it must be a surfactant that can be used in the pharmaceutical industry; suitable surfactants include sorbitan ester or mannide ester surfactants; the sorbitan ester surfactants are obtained by reaction of a fatty acid and a mixture of partial esters of sorbitol and its mono and di-anhydrous; it can be a mono, a di or a tri-ester, or even a mixture; they are hydrophobic surfactants whose hydrophilic-lipophilic balance (HLB) is less than 9. These include surfactants marketed by the company ICI America's Inc. under the name of SPAN, or by Cognis under the name of DehymulsTM , or by the company ICI under the name of ARLACELTM; Examples of surfactants that are particularly suitable are sorbitan monooleate, sold under the name Dehymuls SMO TM or SPAN 80. Among the surfactants based on mannide esters, mention may be made of the mannide monooleate marketed by the Company. SIGMA, or by the company SEPPIC under the name Montanide 80 ™ The quantities of squalene and each of the surfactants used are advantageously chosen so as to obtain a mixture whose phase diagram comprises a phase of zero mean curvature (microemulsion type or lamellar phase ) for which the interfacial tensions are extremely low.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la composition vaccinale comprend, en outre, un alditol tel que notamment le glycérol, l'érythritol, le xylitol, le sorbitol ou le mannitol. On a notamment obtenu de bons résultats avec le mannitol commercialisé par la Société ROQUETTE Frères. Les quantités d'alditol utilisées lors du processus de préparation, peuvent varier entre 1 et 10 %, lorsque l'on souhaite préparer une émulsion qui sera conservée à l'état liquide. Cependant, dans le cas d'une émulsion destinée à être lyophilisée, les quantités d'alditol seront augmentées, et pouffant être de l'ordre de 20%. According to a particular embodiment of the invention, the vaccine composition further comprises an alditol such as in particular glycerol, erythritol, xylitol, sorbitol or mannitol. In particular, we obtained good results with the mannitol marketed by the company ROQUETTE Frères. The amounts of alditol used during the preparation process can vary between 1 and 10%, when it is desired to prepare an emulsion which will be preserved in the liquid state. However, in the case of an emulsion intended to be lyophilized, the amounts of alditol will be increased, and being about 20%.
Selon une caractéristique de l'invention, la composition vaccinale comprend en outre un cryoprotecteur qui permet la lyophilisation de l'émulsion obtenue; parmi les cryoprotecteurs, les sucres sont particulièrement préférés, et notamment le saccharose. En outre, l'émulsion selon l'invention peut comprendre un alkyl polyglycoside qui est un tensioactif à tête sucre; il peut notamment s'agir de décyl-D galactoside uronate de sodium, ou selon un mode préféré de dodécyl (3 maltoside disponible auprès de la Société Fluka. According to one characteristic of the invention, the vaccine composition further comprises a cryoprotectant which allows freeze-drying of the emulsion obtained; among the cryoprotectants, sugars are particularly preferred, and in particular sucrose. In addition, the emulsion according to the invention may comprise an alkyl polyglycoside which is a surfactant with a sugar head; it may especially be sodium decyl-D-galactoside uronate, or according to a preferred mode of dodecyl (3 maltoside available from the company Fluka.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la phase aqueuse de l'émulsion est constituée par un tampon, tel que les solutions de Dulbecco tamponnées au Phosphate (D-PBS, sans calcium ni magnésium). According to a particular embodiment of the invention, the aqueous phase of the emulsion is constituted by a buffer, such as phosphate-buffered Dulbecco's solutions (D-PBS, without calcium or magnesium).
Grâce au procédé de préparation de la composition vaccinale selon l'invention par une inversion de phase obtenue en faisant varier la température, on obtient très facilement, de façon très reproductible, une émulsion directe huile dans eau dont la taille des gouttelettes d'huile est très homogène; la valeur de d90 (en volume) est inférieure à 200 nm, et en général proche de 150 nm, en même temps que la valeur de d50 est inférieure à 80 nm. On peut ainsi, après qu'elle ait été diluée, effectuer une filtration stérilisante de l'émulsion obtenue. Thanks to the process for preparing the vaccine composition according to the invention by a phase inversion obtained by varying the temperature, very easily, in a very reproducible manner, a direct oil-in-water emulsion is obtained whose size of the oil droplets is very homogeneous; the value of d90 (by volume) is less than 200 nm, and generally close to 150 nm, at the same time as the value of d50 is less than 80 nm. It is thus possible, after it has been diluted, to carry out a sterilizing filtration of the emulsion obtained.
De telles émulsions dont la taille des gouttes est homogène et très petite, sont stables dans le temps. Ainsi, on a pu remarquer qu'une émulsion préparée selon l'invention et stockée à 4 C, conservait après 2 ans, un profil monodisperse, avec une valeur de d50 de 90 nm et une valeur de d90 de 116, ce qui prouve la très grande stabilité de l'émulsion. Such emulsions whose drop size is homogeneous and very small, are stable over time. Thus, it has been noted that an emulsion prepared according to the invention and stored at 4 C, retained after 2 years, a monodisperse profile, with a d50 value of 90 nm and a d90 value of 116, which proves the very high stability of the emulsion.
La mesure de la taille des gouttes peut se faire par différents moyens, et notamment par des granulomètres à diffraction LASER, tels que les appareils Beckman Coulter de la gamme LS (notamment le LS230). Le principe de mesure de ces appareils est basé sur l'analyse de l'intensité de la lumière diffusée par les particules en fonction de l'angle (détecteurs de grands, moyens et petits angles) lorsque l'échantillon est éclairé par un faisceau LASER. Cette analyse se fait au moyen de modèles mathématiques choisis selon la taille et la nature du matériau utilisé. Dans le cas de mesure de taille de particules submicroniques, il faut appliquer un modèle optique particulier (théorie de Mie) prenant en compte les indices de réfraction de l'échantillon (ici 1,495 pour le squalène) et de son milieu (ici 1,332 pour l'eau) ; il faut également être capable de détecter les faibles intensités émises par les particules très fines, ce qui nécessite une cellule supplémentaire de détection pour la mesure aux grands angles de la diffusion différentielle des intensités polarisées ( système PIDS chez Coulter qui permet une mesure dès 40 nm). Aux fins de description del' invention, les paramètres de d50 et d90 mentionnés dans la présente demande de brevet, sont des valeurs volumiques; la valeur de d50 signifie la valeur de 50% de la population volumique des gouttes. Measuring the size of the drops can be done by various means, and especially by LASER diffraction granulometers, such as Beckman Coulter LS range (including the LS230). The measurement principle of these devices is based on the analysis of the intensity of the light scattered by the particles according to the angle (detectors of large, medium and small angles) when the sample is illuminated by a beam LASER . This analysis is done using mathematical models chosen according to the size and nature of the material used. In the case of submicron particle size measurement, a special optical model (Mie theory) must be applied, taking into account the refractive indices of the sample (here 1.495 for squalene) and its medium (here 1.332 for the sample). water); it is also necessary to be able to detect the low intensities emitted by the very fine particles, which requires an additional detection cell for the measurement at large angles of the differential diffusion of the polarized intensities (PIDS system at Coulter which allows a measurement from 40 nm ). For the purpose of describing the invention, the parameters of d50 and d90 mentioned in the present patent application are volume values; the value of d50 means the value of 50% of the population density of the drops.
Le procédé selon l'invention est mis en oeuvre de la manière suivante: on prépare une émulsion grossière huile/eau concentrée par incorporation de la phase aqueuse (solution tamponnée de polyol comprenant le tensioactif non-ionique à groupements polyoxyéthylène) dans la phase huileuse (squalène, et tensioactif à base d'ester de sorbitanne). On obtient alors une émulsion huile dans eau non calibrée, qui manifeste rapidement son instabilité. Cette émulsion est chauffée jusqu'à obtention d'une inversion de phase, c'est-à-dire l'obtention d'une émulsion eau dans huile. La transition ou inversion de phase peut être suivie par conductimétrie. La température à laquelle se produit le changement de courbure traduisant le passage d'un type d'émulsion à un autre est la température d'inversion de phase. Une fois cette température d'inversion de phase atteinte, et donc en présence d'une émulsion eau dans huile, on arrête le chauffage et on refroidit le mélange. L'émulsion eau/huile va alors à nouveau s'inverser pour donner lieu à nouveau à une émulsion huile dans eau, dont la taille des gouttelettes d'huile est cette fois très homogène et petite; l'émulsion obtenue est alors très stable. Cette émulsion concentrée peut alors être diluée par une solution comprenant l'antigène vaccinal, et être stockée à +4 C. Cette émulsion est thermoréversible, ce qui signifie que si elle est portée à une température supérieure à la température d'inversion de phase, elle va devenir une émulsion eau dans l'huile. The process according to the invention is carried out as follows: a concentrated oil / water emulsion is prepared by incorporating the aqueous phase (buffered polyol solution comprising the nonionic surfactant containing polyoxyethylene groups) into the oily phase ( squalene, and sorbitan ester surfactant). An oil-in-water emulsion is then obtained without calibration, which rapidly manifests its instability. This emulsion is heated until a phase inversion is obtained, that is to say obtaining a water-in-oil emulsion. The transition or phase inversion can be followed by conductimetry. The temperature at which the change in curvature resulting from the transition from one type of emulsion to another occurs is the phase inversion temperature. Once this phase inversion temperature is reached, and therefore in the presence of a water-in-oil emulsion, the heating is stopped and the mixture is cooled. The water / oil emulsion will then again be reversed to give rise again to an oil-in-water emulsion, the size of the oil droplets is this time very homogeneous and small; the emulsion obtained is then very stable. This concentrated emulsion can then be diluted with a solution comprising the vaccine antigen, and stored at +4 C. This emulsion is thermoreversible, which means that if it is brought to a temperature above the phase inversion temperature, it will become a water-in-oil emulsion.
De façon avantageuse selon l'invention, la formulation de l'émulsion est choisie pour avoir une température d'inversion de phase qui soit comprise entre 45 et 80 C, et plus particulièrement entre 50 et 65 C. Ainsi, on évite de chauffer à des températures trop élevées qui risqueraient d'induire des dégradations chimiques des constituants ou une évaporation de la phase aqueuse, et on évite également de provoquer une nouvelle inversion de phase lors d'un stockage ultérieur, soit durant la phase de préparation de la composition vaccinale, c'est-à-dire avant d'être incorporée à la solution antigénique, soit ultérieurement lors du stockage de la composition vaccinale avant son utilisation. Un tel procédé peut être mis en oeuvre de différentes façons. En effet, il est possible, ainsi que cela vient d'être décrit de mélanger d'un côté le squalène avec le tensioactif à base d'ester de sorbitanne et d'un autre côté la solution tamponnée de polyol avec le tensioactif à groupements oxydes d'éthylène; d'homogénéiser chacun des mélanges, et de les réunir ensuite afin d'obtenir l'émulsion brute qui sera alors chauffée puis refroidie. Alternativement, les mélanges préparés séparément peuvent être chauffés à une température légèrement supérieure à la température d'inversion de phase, avant d'être rassemblés pour donner une émulsion inverse eau dans huile qui sera refroidie jusqu'à obtention de l'émulsion submicronique huile/eau. Advantageously according to the invention, the formulation of the emulsion is chosen to have a phase inversion temperature which is between 45 and 80 ° C., and more particularly between 50 ° and 65 ° C. Thus, it is avoided to heat too high temperatures which might induce chemical degradation of the constituents or evaporation of the aqueous phase, and it is also avoided to cause a new phase inversion during subsequent storage, ie during the preparation phase of the vaccine composition that is, before being incorporated into the antigenic solution, or later upon storage of the vaccine composition prior to use. Such a method can be implemented in different ways. Indeed, it is possible, as has just been described, to mix on one side squalene with the surfactant based on sorbitan ester and on the other hand the buffered solution of polyol with the surfactant containing oxides ethylene; homogenize each of the mixtures, and then combine them to obtain the crude emulsion which will then be heated and cooled. Alternatively, the separately prepared mixtures can be heated to a temperature slightly above the phase inversion temperature, before being combined to give a water-in-oil inverse emulsion which will be cooled until the submicron emulsion oil is obtained. water.
Ces opérations peuvent être réalisées dans des réservoirs séparés pour une préparation en lots. These operations can be performed in separate tanks for batch preparation.
Il est également possible d'utiliser un procédé en ligne. It is also possible to use an online process.
Le procédé de fabrication de l'émulsion en ligne consiste en un mélange à chaud des deux phases aqueuse et huileuse préalablement préparées séparément, au travers d'un mélangeur statique thermostaté suivi d'un refroidissement en ligne au travers d'un échangeur thermique réfrigéré connecté en sortie du mélangeur statique, puis de la récupération finale de l'émulsion selon l'invention dans un récipient approprié (flacon ou réacteur). On a utilisé un mélangeur statique constitué d'une succession d'éléments de mélange composés de lames croisées et inclinées par rapport à l'axe du tube dans lequel ils sont introduits. L'énergie nécessaire au mélange est fournie par les pompes qui véhiculent les fluides et le mélange est réalisé sans pièce mobile, au travers des éléments de mélange par la séparation, le déplacement et la réunion successive des constituants du mélange. The process for producing the in-line emulsion consists of a hot mixing of the two aqueous and oily phases previously prepared separately, through a static thermostatic mixer followed by in-line cooling through a connected refrigerated heat exchanger. at the outlet of the static mixer, then the final recovery of the emulsion according to the invention in a suitable container (flask or reactor). A static mixer was used consisting of a succession of mixing elements composed of crossed blades and inclined with respect to the axis of the tube in which they are introduced. The energy required for the mixing is supplied by the pumps which convey the fluids and the mixture is produced without moving parts, through the mixing elements by the separation, the displacement and the successive meeting of the constituents of the mixture.
Le procédé de fabrication en ligne est mis en oeuvre selon la manière suivante: on prépare séparément la phase aqueuse (solution tamponnée comprenant le tensioactif non-ionique à groupements polyoxyéthylène) et la phase huileuse (squalène, et tensioactif non ionique hydrophobe) dans deux flacons ou réacteurs. Les deux phases sont chauffées sous agitation à une température légèrement supérieure à la température d'inversion de phase. Les deux phases sont alors introduites dans un mélangeur statique thermostaté au moyen de 2 pompes, dont les débits sont régulés de manière à obtenir la composition de l'émulsion selon l'invention. L'émulsion inverse eau dans l'huile est obtenue durant le passage des deux phases dans le mélangeur statique. L'émulsion inverse est ensuite refroidie par passage en ligne au travers d'un échangeur thermique réfrigéré connecté en sortie du mélangeur statique. L'émulsion eau dans huile va alors s'inverser au travers de l'échangeur thermique réfrigéré pour donner lieu à une émulsion huile dans eau, qui sera réceptionnée dans un flacon ou réacteur et dont les caractéristiques sont identiques à celles de l'émulsion obtenue par un procédé en batch. The in-line manufacturing process is carried out as follows: the aqueous phase (buffered solution comprising the nonionic surfactant containing polyoxyethylene groups) and the oily phase (squalene and hydrophobic nonionic surfactant) are prepared separately in two flasks or reactors. The two phases are heated with stirring at a temperature slightly above the phase inversion temperature. The two phases are then introduced into a static thermostatic mixer by means of 2 pumps, the flow rates of which are regulated so as to obtain the composition of the emulsion according to the invention. The water-in-oil inverse emulsion is obtained during the passage of the two phases in the static mixer. The inverse emulsion is then cooled by passage in line through a refrigerated heat exchanger connected to the output of the static mixer. The water-in-oil emulsion will then be reversed through the refrigerated heat exchanger to give rise to an oil-in-water emulsion, which will be received in a flask or reactor and whose characteristics are identical to those of the emulsion obtained. by a batch process.
Les exemples qui suivent illustrent différents modes de réalisation de l'invention. The following examples illustrate various embodiments of the invention.
Exemple 1: Préparation d'une émulsion concentrée de squalène. Example 1: Preparation of a concentrated emulsion of squalene
On mélange dans un bécher 3,71g d'EumulginTM B1 et 33,9g d'une solution de mannitol à 10% en tampon PBS, que l'on homogénéise sous agitation à environ 30 C. Dans un autre récipient, on mélange 2,89g de DehymulsTM SMO et 19,5g de squalène que l'on agite magnétiquement. 3.31 g of Eumulgin ™ B1 and 33.9 g of a 10% solution of mannitol in PBS buffer are mixed in a beaker, which is homogenized with stirring at approximately 30 ° C. In another container, 2 is mixed. 89g of DehymulsTM SMO and 19.5g of squalene which is stirred magnetically.
Lorsque des phases homogènes sont obtenues dans chacun des récipients, on incorpore la phase aqueuse à la phase huileuse qui est maintenue sous agitation à 30 C. Lorsque l'incorporation est terminée, on chauffe l'émulsion brute obtenue jusqu'à ce que la température atteigne 58-60 C, tout en maintenant l'agitation. When homogeneous phases are obtained in each of the containers, the aqueous phase is incorporated in the oily phase which is stirred at 30 ° C. When the incorporation is complete, the crude emulsion obtained is heated until the temperature is reached. reaches 58-60 C, while maintaining agitation.
On cesse ensuite le chauffage mais on maintient l'agitation jusqu'à ce que la température atteigne la température ambiante. The heating is then stopped but stirring is maintained until the temperature reaches room temperature.
On a alors une émulsion huile dans eau, dont la taille des gouttelettes d'huile est centrée autour de 80 nm, et dont la composition en masse est la suivante: - 32,5 % de squalène, 6,18 % de polyoxyéthylène (12) cétostéaryétherl, 4,82 % de monooléate de sorbitanne, - 6 % de mannitol Exemple 2: Composition vaccinale contre le SIDA. We then have an oil-in-water emulsion, the size of the oil droplets of which is centered around 80 nm, and whose mass composition is as follows: 32.5% of squalene, 6.18% of polyoxyethylene (12%) cetostearyl ether, 4.82% sorbitan monooleate, 6% mannitol. Example 2: Vaccine composition against AIDS.
On prépare des compositions vaccinales comprenant comme antigène une protéine TAT III B détoxifiée. La protéine TAT a été détoxifiée par une réaction d'alkylation en milieu alcalin par utilisation d'iodoacétamide dans les conditions suivantes: nombre de micromoles d'iodoacétamide = 200 X nombre de micromoles de TAT + nombre de micromoles de DTT. Cette protéine détoxifiée et son procédé de préparation sont décrits en détails dans la demande WO99/33346 où elle est identifiée sous le terme de TAT carboxyméthylée. Vaccine compositions comprising as antigen a detoxified TAT III B protein are prepared. The TAT protein was detoxified by an alkaline alkylation reaction using iodoacetamide under the following conditions: number of micromoles of iodoacetamide = 200 X number of micromoles of TAT + number of micromoles of DTT. This detoxified protein and its method of preparation are described in detail in the application WO99 / 33346 where it is identified by the term carboxymethyl TAT.
Cet antigène TAT recombinante est conservé en solution, en présence de tampon TRIS 50mM, pH 7,5 à -70 C. This recombinant TAT antigen is stored in solution in the presence of 50 mM TRIS buffer, pH 7.5 at -70 ° C.
Les compositions vaccinales à administrer sont préparées à partir de solutions concentrées, afin d'obtenir des doses d'immunisation de 200111 ayant les compositions quantitatives suivantes: pour la composition ayant uniquement l'antigène: 20 g de TAT en tampon 30 TRIS 50mM, NaCl 100 mM à pH 7,5. The vaccine compositions to be administered are prepared from concentrated solutions, in order to obtain immunization doses of 200111 having the following quantitative compositions: for the antigen-only composition: 20 g TAT in 50mM TRIS buffer, NaCl 100 mM pH 7.5.
pour la composition selon l'invention: É 20 g de TAT, É 5 mg de squalène 10- É 0,75 mg de Dehymuls SMO, É 0,94 mg d' Eumulgin B1, É 0,91 mg de mannitol. for the composition according to the invention: E 20 g of TAT, E 5 mg of squalene 10- 0.75 mg of Dehymuls SMO, E 0.94 mg of Eumulgin B1, and 0.91 mg of mannitol.
On dispose de 2 groupes de 6 souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines, à qui l'on injecte une des compositions préparées par voie sous-cutanée, à raison d'une dose de 20O 1 par souris; les injections sont réalisées à JO et à J21. There are 2 groups of 6 BALB / c female mice, 8 weeks old, injected with one of the compositions prepared subcutaneously, at a dose of 20O 1 per mouse; the injections are performed at OJ and D21.
On prélève des échantillons sanguins au sinus retro-orbital à J14 pour l'appréciation de la réponse primaire et à J34 pour la réponse secondaire. La détermination du taux d'IgGl et d'IgG2a spécifiques est effectuée grâce à des tests ELISA standardisés. Blood samples are taken from the retro-orbital sinus at day 14 for the assessment of the primary response and at day 34 for the secondary response. The determination of specific IgG1 and IgG2a levels is performed by standardized ELISA tests.
Les souris sont sacrifiées à J37; on prélève leur rate et on isole les splénocytes. The mice are sacrificed at J37; their spleen is removed and the splenocytes isolated.
Les résultats obtenus en ce qui concerne les réponses humorales sont récapitulés dans le tableau ci-dessous, où les taux d'IgG sont exprimés en unités arbitraires ELISA (loglO). The results obtained with respect to the humoral responses are summarized in the table below, where the IgG levels are expressed in arbitrary ELISA units (log10).
Pour chaque groupe de souris, la valeur indiquée dans le tableau est le titre géométrique 15 moyen des valeurs obtenues pour chacune des souris. For each group of mice, the value indicated in the table is the average geometric title of the values obtained for each of the mice.
Composition IgGl IgG2a IgGl IgG2a Rapport vaccinale à J14 à J14 à J34 à J34 IgGl/IgG2a à J34 Tat 2,6 1,2 4,4 3,0 25 Tat+ PIT 3,5 2,5 5,7 5,0 5 Les résultats obtenus montrent que l'émulsion selon l'invention permet d'accroître globalement la réponse humorale et tend en outre à favoriser la réponse T helper de type 20 1 car la réponse IgG2a est plus augmentée que la réponse IgGl. Composition IgG1 IgG2a IgG1 IgG2a Immunization report at day 14 to day 14 at day 34 at day 34 IgG1 / IgG2a at day 34 Tat 2.6 1.2 4.4 3.0 Tat + PIT 3.5 2.5 5.7 5.0 5 The results obtained show that the emulsion according to the invention makes it possible to increase the overall humoral response and also tends to favor the T helper type 1 response because the IgG2a response is increased more than the IgG1 response.
En ce qui concerne la réponse cellulaire, on a pu mettre en évidence, par dosage ELISPOT après restimulation avec de la protéine TAT recombinante des splénocytes prélevés, une nette augmentation du nombre de cellules produisant l'interféron y lorsque les splénocytes proviennent de souris immunisées avec une préparation selon l'invention ( 486 spots par 106 cellules contre 39 par 106 pour la préparation contenant l'antigène seul) . De même, le dosage des cytokines dans les surnageants de culture a montré la plus grande sécrétion à la fois d'interféron y ( 5028 pg/ml contre 1940 pg/ml) et d'Interleukine 5 ( 5365 pg/ml contre 2394 pg/ml). Il- As regards the cellular response, it was possible to demonstrate, by ELISPOT assay after restimulation with recombinant TAT protein of the splenocytes removed, a clear increase in the number of cells producing interferon γ when the splenocytes come from mice immunized with a preparation according to the invention (486 spots per 106 cells against 39 by 106 for the preparation containing the antigen alone). Similarly, the cytokine assay in culture supernatants showed the highest secretion of both interferon γ (5028 μg / ml vs 1940 μg / ml) and Interleukin 5 (5365 μg / ml against 2394 μg / ml). ml). He-
Exemple 3: Préparation d'une composition vaccinale contre les infections à cytomegalovirus humain. Example 3 Preparation of a vaccine composition against human cytomegalovirus infections.
On prépare des compositions vaccinales comprenant à titre d'antigène vaccinal une protéine recombinante dérivée d'une glycoprotéine d'enveloppe de la souche Towne du Cytomegalovirus (CMV) dénommée gB dont les séquences nucléotidique et protéique sont décrites dans le brevet USP 5,834,307. Cette protéine recombinante est produite par une lignée CHO recombinante transfectée par un plasmide dénommé pPRgB27clv4 qui contient un gène modifié de la gB. En effet, pour faciliter la production de cette protéine recombinante par la lignée CHO le gène de la gB a été modifié au préalable en supprimant la partie du gène qui code pour la région transmembranaire de la protéine gB correspondant à la séquence d'acides aminés comprise entre la Valine 677 et l'Arginine 752 et en introduisant 3 mutations ponctuelles de sorte que le site de clivage existant dans la gB native a été supprimée. En définitive la protéine recombinante produite par la lignée CHO recombinante correspond à une protéine gB tronquée dépourvue de site de clivage et de région transmembranaire dénommée gBdTM. Vaccine compositions comprising, as vaccine antigen, recombinant protein derived from an envelope glycoprotein of the Cytomegalovirus Towne strain (CMV) designated gB, the nucleotide and protein sequences of which are described in USP Patent 5,834,307, are prepared. This recombinant protein is produced by a recombinant CHO line transfected with a plasmid called pPRgB27clv4 which contains a modified gB gene. Indeed, to facilitate the production of this recombinant protein by the CHO line, the gB gene has been modified beforehand by deleting the part of the gene which encodes the transmembrane region of the gB protein corresponding to the amino acid sequence included. between Valine 677 and Arginine 752 and introducing 3 point mutations so that the existing cleavage site in the native gB was deleted. Ultimately, the recombinant protein produced by the recombinant CHO line corresponds to a truncated gB protein lacking a cleavage site and a transmembrane region called gBdTM.
La construction du plasmide pPRgB27clv4 et la production de la protéine gB tronquée (gBdTM) par la lignée CHO recombinante sont décrites dans US 6,100,064. La purification de la protéine gB tronquée est réalisée sur colonne chromatographique d'immunoaffinité en utilisant l'anticorps monoclonal 15D8 décrit par Rasmussen L et al. ( J. Virol. (1985) 55: 274280). The construction of the plasmid pPRgB27clv4 and the production of the truncated gBdTM protein by the recombinant CHO line are described in US 6,100,064. Purification of the truncated gB protein is performed on an immunoaffinity chromatographic column using the 15D8 monoclonal antibody described by Rasmussen L et al. J. Virol (1985) 55: 274280).
A partir d'une composition stock à 0.975 mg/ml d'antigène gB ainsi obtenu et maintenu en tampon phosphate, de l'émulsion selon l'invention concentrée telle que décrite à l'exemple 1, et d'une émulsion de l'art antérieur obtenue par microfluidisation, on prépare des doses de compositions immunisantes de 50 1 ayant les compositions suivantes: 2 gg de gB en tampon citrate à pH 6, (groupe appelé gB seule) 2 g de gB; 1, 075mg de squalène; 0,133 mg de Montane VG 85 et 0,125 mg de TweenTM80 en tampon citrate à pH 6, (groupe appelé avec émulsion de l'art antérieur ) - 2 g de gB; 1,25 mg de squalène; 0,185 mg de Dehymuls SMO; 0,235 mg d'Eumulgin B1 et 0,230 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4. (groupe appelé avec émulsion de l'invention ) On dispose de 3 groupes de 10 souris Outbred OF1 femelles, âgées de 8 semaines que l'on immunise 2 fois, à JO et à J21 par voie sous-cutanée, par une des compositions indiquées ci-dessus ( chaque groupe de souris reçoit les 2 fois la même composition) On prélève à J20 et J34 au sinus retro-orbital des échantillons sanguins qui sont utilisés pour déterminer les concentrations en anticorps de type IgGI et IgG2a spécifiques de l'antigène gB. From a stock composition at 0.975 mg / ml of gB antigen thus obtained and maintained in phosphate buffer, the emulsion according to the invention concentrated as described in Example 1, and an emulsion of the Prior art obtained by microfluidization, doses of 50 I immunizing compositions having the following compositions were prepared: 2 g g citrate buffer pH 6, (called gB group only) 2 g gB; 1. 075 mg of squalene; 0.133 mg of Montane VG 85 and 0.125 mg of TweenTM80 in citrate buffer at pH 6 (called group with emulsion of the prior art) - 2 g of gB; 1.25 mg of squalene; 0.185 mg of Dehymuls SMO; 0.235 mg of Eumulgin B1 and 0.230 mg of mannitol in PBS buffer at pH 7.4. (called group with emulsion of the invention) There are 3 groups of 10 female Outbred OF1 mice, aged 8 weeks which are immunized twice, at 0 and J21 by the subcutaneous route, with one of the indicated compositions. above (each group of mice receives the same 2 times the same composition) Samples are taken at J20 and J34 from the retro-orbital sinus which are used to determine the concentrations of IgGI and IgG2a antibodies specific for the antigen gB .
Les dosages sont réalisés grâce à des tests ELISA; les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau ci-dessous, et sont exprimés en loglo des titres ELISA. Les valeurs indiquées sont les valeurs moyennes obtenues pour chaque groupe de souris. Assays are performed using ELISA tests; the results obtained are collated in the table below, and are expressed in loglo of the ELISA titers. The values given are the average values obtained for each group of mice.
J20 J34 Ratio à J34 Nature des Groupes IgGI IgG2a IgGI IgG2a IgGl/IgG2a gB seule 2,474 2,094 3,801 2,941 137 gB + émulsion de l'art antérieur 4, 0632,980 5,493 4,185 143 gB + émulsion selon l'invention 4,615 3,914 5, 615 4,854 14 Ces résultats montrent l'efficacité de l'émulsion selon l'invention qui permet une plus grande induction d'anticorps à la fois ceux de type IgGI et IgG2a, avec en outre, par rapport à l'émulsion selon l'art antérieur l'obtention du résultat recherché dans le cadre d'un vaccin contre le cytomégalovirus humain, qui est d'orienter la réponse immunitaire vers une réponse TH1 (dont un indicateur est le taux d' IgG2a) , tout en maintenant la réponse de type TH2 (dont un indicateur est le taux d' IgGI) à un niveau suffisant. J20 J34 Ratio at J34 Nature of IgGI IgG2a IgGI IgG2a IgG1 / IgG2a gB groups alone 2,474 2,094 3,801 2,941 137 gB + emulsion of the prior art 4,632,980 5,493 4,185 143 gB + emulsion according to the invention 4,615 3,914 5, 615 4,854 14 These results show the effectiveness of the emulsion according to the invention which allows a greater induction of antibodies both IgGI and IgG2a type, with, in addition, compared to the emulsion according to the prior art obtaining the desired result in the context of a vaccine against human cytomegalovirus, which is to direct the immune response towards a TH1 response (one indicator of which is the IgG2a level), while maintaining the TH2-type response (one indicator is the IgGI level) at a sufficient level.
Exemple 4: Composition vaccinale contre la grippe. Example 4: Vaccine composition against influenza.
On dispose d'antigènes de virus grippal obtenus selon le procédé décrit aux exemples de la demande WO9605294, à l'exception du fait que la souche virale utilisée est la souche A/New Caledonia H1N 1. Influenza virus antigens obtained according to the method described in the examples of the application WO9605294 are available, except that the viral strain used is the A / New Caledonia H1N1 strain.
- 13 - A partir de cette préparation d'antigènes, de l'émulsion concentrée obtenue à l'exemple 1, et d'une suspension d'aluminium fournie par REHEIS sous la dénomination A1O0H Rehydra, on prépare des doses d'immunisation de 500 qui ont la composition indiquée ci-après, où les quantités d'antigènes de la grippe sont exprimés en poids d'hémagglutinine HA. From this antigen preparation, the concentrated emulsion obtained in Example 1, and an aluminum suspension provided by REHEIS under the name A1O0H Rehydra, immunization doses of 500 are prepared. which have the composition indicated below, where the amounts of influenza antigens are expressed by weight of haemagglutinin HA.
soit l g de HA en tampon PBS, soit 5 g de HA en tampon PBS, soit 1 g de HA et 60 g d'hydroxyde d'aluminium, soit 1 g de HA; 1,25 mg de squalène; 0,185 mg de DehymulsTM SMO; 0,235 mg 10 d' EumulginTM B; 0,21 mg de mannitol; le tout en tampon PBS. either 1 g of HA in PBS buffer, or 5 g of HA in PBS buffer, or 1 g of HA and 60 g of aluminum hydroxide, or 1 g of HA; 1.25 mg of squalene; 0.185 mg of DehymulsTM SMO; 0.235 mg of Eumulgin ™ B; 0.21 mg of mannitol; all in PBS buffer.
On dispose de 8 groupes de 5 souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines, à qui on administre à JO les compositions préparées selon la répartition suivante: un groupe reçoit la composition ayant 1 g de HA par voie souscutanée, un groupe reçoit la même composition ayant 11.tg de HA par voie intra-dermique, un groupe reçoit la composition ayant 5 g de HA par voie sous-cutanée, un groupe reçoit la même composition ayant 5 g de HA par voie intra-dermique, un groupe reçoit la composition ayant 11.ig de HA et 60 g d'aluminium par voie sous-cutanée, un groupe reçoit la même composition ayant 1 g de HA et 60 g d'aluminium par voie intra-dermique, un groupe reçoit la composition ayant 1 de HA et l'émulsion selon l'invention par voie sous-cutanée, un groupe reçoit la composition ayant 11.tg de HA et l'émulsion selon l'invention 25 par voie intra-dermique. There are 8 groups of 5 BALB / c female mice, 8 weeks old, to which the compositions prepared according to the following distribution are administered at 0: one group receives the composition having 1 g of HA subcutaneously, one group receives the same composition having 11.tg of HA by intradermal route, a group receives the composition having 5 g of HA subcutaneously, a group receives the same composition having 5 g of HA intradermally, a group receives the composition having 11 μg of HA and 60 g of aluminum subcutaneously, one group receiving the same composition having 1 g of HA and 60 g of aluminum intradermally, a group receiving the composition having 1 of HA and the emulsion according to the invention subcutaneously, a group receives the composition having 11.tg HA and the emulsion according to the invention 25 intradermally.
On prélève sur chacune des souris des échantillons sanguins à J7, J14, J27, J41, J56, J77 et J105. Blood samples were taken from each of the mice at D7, D14, D27, D41, D56, D77 and D105.
Les sérums des souris immunisées sont testés d'une part par la technique ELISA afin 30 d'évaluer leur teneur en anticorps totaux induits contre la souche grippale A/H1N1 du vaccin trivalent. Les titres anticorps sont exprimés en unités ELISA arbitraires en valeur loglO, avec un seuil de détection à 1,3 loglO. The sera of the immunized mice are tested on the one hand by the ELISA technique in order to evaluate their total antibody content induced against the trivalent vaccine influenza A / H1N1 strain. The antibody titers are expressed in arbitrary ELISA units in log10 value, with a detection threshold at 1.3 log10.
Ces sérums sont testés d'autre part par la technique IHA (inhibition d'hémaglutination) pour déterminer leur teneur en anticorps fonctionnels contre la souche grippale A/H1N1. Les titres anticorps sont exprimés en inverse de dilution en valeur arithmétique, avec un seuil de détection à 5. These sera are further tested by the IHA (haemagglutination inhibition) technique to determine their functional antibody content against influenza A / H1N1 strain. The antibody titers are expressed in inverse dilution in arithmetic value, with a detection threshold of 5.
Les résultats obtenus sont repris dans les tableaux ci-après, dans lesquels les valeurs indiquées représentent la moyenne des titres des souris de chaque groupe. The results obtained are given in the tables below, in which the values indicated represent the average of the titles of the mice of each group.
Titres ELISA: Groupe de Voie J14 J28 J41 J56 J105 souris d'immunisation HA 1 g sous-cutanée 2,838 3,288 3,556 3,581 3,535 HA 5 g sous-cutanée 3, 203 3,642 3,836 3,732 3,844 ELISA Titers: Pathway group J14 J28 J41 J56 J105 immunization mice HA 1 g subcutaneous 2,838 3,288 3,556 3,581 3,535 HA 5 g subcutaneous 3, 203 3,642 3,836 3,732 3,844
JJ
HA 1 g + sous-cutanée 2,860 3,363 ^ 3,843 3,951 3,982 A1O0H HA 1 g + souscutanée 4,043 4,511 4,753 4,723 4,681 émulsion HA 1 g intradermique 2,174 2,814 3,143 3,075 2,735 HA 5 g intradermique 1 2,839 3,297 3,496 3,549 3, 479 HA 1 g + intradermique 2,654 3,004 3,137 3,020 2,724 A1O0H HA 1 g + intradermique 4,134 4,692 4,895 4,911 4,823 émulsion Titres IHA: Groupe de Voie J14 J28 J41 J56 J105 souris d'immunisation HA 1 g sous-cutanée 5 6 5 40 23 HA 5 g sous-cutanée 5 9 20 HA 1 g + sous-cutanée 5 15 23 121 160 A1OOH HA 1 g + sous-cutanée 6 160 368 422 485 émulsion HA 1 g intradermique 5 5 5 23 8 FIA 5 g intradermique 5 8 10 HA 1 g + intradermique 5 5 5 26 7 A1O0H HA 1 g + intradermique 7 557 1640 1557 1844 émulsion Ces résultats montrent l'intérêt de la présente invention; en effet, l'hydroxyde d'aluminium qui est un adjuvant bien connu et largement utilisé dans l'art antérieur ne permet pas d'augmenter l'immunogénicité des antigènes de la grippe avec la même rapidité et la même force que la formulation selon l'invention; on constate aussi que la composition selon l'invention est particulièrement efficace, que ce soit par voie sous-cutanée, ou par voie intradermique. HA 1 g + subcutaneous 2,860 3,363 ^ 3,843 3,951 3,982 A1O0H HA 1 g + subcutaneous 4,043 4,511 4,753 4,723 4,681 emulsion HA 1 g intradermal 2,174 2,814 3,143 3,075 2,735 HA 5 g intradermal 1 2,839 3,297 3,496 3,549 3, 479 HA 1 g + intradermal 2,654 3,004 3,137 3,020 2,724 A1O0H HA 1 g + intradermal 4,134 4,692 4,895 4,911 4,823 emulsion IHA titres: Pathway group J14 J28 J41 J56 J105 immunization mice HA 1 g subcutaneous 5 6 5 40 23 HA 5 g subcutaneous HA 1 g + subcutaneously 5 1 1 2 1 1 1 + subcutaneous 6,100 368 422 485 intradermal HA 1 g emulsion 5 5 23 8 FIA 5 g intradermal 5 8 10 HA 1 g + intradermal These results show the interest of the present invention; indeed, aluminum hydroxide which is a well-known adjuvant and widely used in the prior art does not make it possible to increase the immunogenicity of influenza antigens with the same speed and strength as the formulation according to US Pat. 'invention; it is also found that the composition according to the invention is particularly effective, either subcutaneously or intradermally.
Exemple 5: Composition vaccinale contre la grippe. Example 5: Influenza vaccine composition.
On veut évaluer chez des souris, l'intérêt de la présente invention pour diminuer la quantité d'antigène vaccinal lorsque qu'il s'agit d'un vaccin contre la grippe contenant comme antigènes 3 souches de virus grippal, et qui serait administré par voie intradermique. It is desired to evaluate in mice, the interest of the present invention to reduce the amount of vaccine antigen when it is an influenza vaccine containing as antigens 3 strains of influenza virus, and which would be administered by intradermal route.
A cette fin, on dilue l'émulsion concentrée de l'exemple 1 par du tampon PBS afin d'obtenir une émulsion à 5% de squalène, que l'on va encore diluer pour moitié par une composition comprenant les antigènes. For this purpose, the concentrated emulsion of Example 1 is diluted with PBS buffer in order to obtain a 5% squalene emulsion, which will be half diluted by a composition comprising the antigens.
- 16 - On dispose en effet d'une composition comprenant du virus grippal provenant de 3 souches virales différentes obtenues de la manière décrite dans la demande de brevet WO9605294, les 3 souches étant ici la souche A/New Caledonia (H1N1), la souche A/Wyoming (H3N2), la souche B/Jiangsu. Une telle composition vaccinale trivalente est une composition classique pour un vaccin contre la grippe et correspond au vaccin commercialisé dans l'hémisphère Nord lors de la campagne grippe 2004. Les quantités d'antigènes de chacune des souches virales sont appréciées par leur quantité d'hémagglutinines HA. There is indeed a composition comprising influenza virus from 3 different viral strains obtained in the manner described in the patent application WO9605294, the 3 strains being here the strain A / New Caledonia (H1N1), the strain A / Wyoming (H3N2), strain B / Jiangsu. Such a trivalent vaccine composition is a conventional composition for an influenza vaccine and corresponds to the vaccine marketed in the Northern Hemisphere during the 2004 influenza campaign. The amounts of antigen of each of the viral strains are assessed by their quantity of hemagglutinins. HA.
Les doses d'immunisation préparées, de volume 501.tl, ont les compositions indiquées ci-10 après: 0,33 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS à pH 7,4; 1,31 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS à pH 7,4; 5,25 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS à pH 7,4; 10,5 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS à pH 7,4; 21 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS à pH 7,4; 0,33 g de HA de chacune des souches virales; 1,25 mg de squalène; 0,185 mg de DehymulsTM SMO; 0,235 mg d'EumulginTM B1 et 0,230 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4; 1,31 g de HA de chacune des souches virales; 1,25 mg de squalène; 0,185 mg 20 de DehymulsTM SMO; 0,235 mg d'EumulginTM B1 et 0,230 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4; 5,25 g de HA de chacune des souches virales; 1,25 mg de squalène; 0,185 mg de DehymulsTM SMO; 0,235 mg d'EumulginTM B1 et 0, 230 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4. The prepared immunization doses, of volume 501.tl, have the compositions indicated below: 0.33 g of HA of each of the viral strains in PBS buffer at pH 7.4; 1.31 g of HA of each of the viral strains in PBS buffer at pH 7.4; 5.25 g HA of each of the viral strains in PBS buffer at pH 7.4; 10.5 g of HA of each of the viral strains in PBS buffer at pH 7.4; 21 g of HA of each of the viral strains in PBS buffer at pH 7.4; 0.33 g HA of each of the viral strains; 1.25 mg of squalene; 0.185 mg of DehymulsTM SMO; 0.235 mg of EumulginTM B1 and 0.230 mg of mannitol in PBS buffer at pH 7.4; 1.31 g HA of each of the viral strains; 1.25 mg of squalene; 0.185 mg of DehymulsTM SMO; 0.235 mg of EumulginTM B1 and 0.230 mg of mannitol in PBS buffer at pH 7.4; 5.25 g HA of each of the viral strains; 1.25 mg of squalene; 0.185 mg of DehymulsTM SMO; 0.235 mg of Eumulgin ™ B1 and 0, 230 mg of mannitol in PBS buffer at pH 7.4.
On dispose de 8 groupes de 10 souris BALB/c femelles âgées de 6 à 8 semaines à qui on administre par voie intradermique (face interne de l'oreille) une des compositions préparées, à raison d'une composition par groupe. There are 8 groups of 10 BALB / c female mice aged 6 to 8 weeks administered intradermally (inner side of the ear) one of the compositions prepared, one composition per group.
3 semaines après l'immunisation, on prélève des échantillons sanguins et on dose par ELISA pour chacun des groupes, les IgG induites contre chacune des souches virales; on effectue en outre, pour chacun des groupes, un test d'inhibition de l'hémagglutinine contre chaque souche virale. 3 weeks after immunization, blood samples are taken and ELISA for each of the groups, IgG induced against each of the viral strains; in addition, for each of the groups, a hemagglutinin inhibition test is carried out against each viral strain.
Les résultats obtenus, sont représentés dans le tableau ci-dessous sous forme de moyennes pour chacun des groupes; les résultats ELISA sont exprimés en loglo d'unités arbitraires, et les résultats IHA sont les titres moyens arithmétiques des inverses de dilution. The results obtained are shown in the table below as averages for each of the groups; the ELISA results are expressed in loglo of arbitrary units, and the IHA results are the arithmetic mean titers of the dilution inverses.
Nature H 1N 1 H3N2 B CompositionNature H 1N 1 H3N2 B Composition
ELISA IHA ELISA IHA ELISA IHAIHA ELISA ELISA IHA ELISA IHA
0,33 g HA _ 3,51 35 4,38 243 4,28 25 1,31 g HA 3,96 65 4,74 640 4,35 32 5,25 g HA 4,16 92 5,05 970 4,62 53 10,5 g HA 4,38 197 5,18 1810 4,71 130 21 g HA 4,63 - 260 5,37 2389 4,98 184 0,33 g HA 4,27 226 5,20 2389 4, 91 149 +émulsion 1,31 g HA 4,46 279 5,37 3880 4,95 171 + émulsion 5,25 g HA 4,68 394 5,58 5487 5,12 22 +émulsion Ces résultats permettent de mettre en évidence l'intérêt particulier de l'invention pour réduire la quantité d'antigènes; en effet, grâce à l'émulsion selon l'invention, on peut pour une même réponse immunitaire induite, abaisser de façon très importante la quantité d'antigènes présente dans la dose d'immunisation. 0.33 g HA 3.51 4.38 243 4.28 25 1.31 g HA 3.96 65 4.74 640 4.35 32 5.25 g HA 4.16 92 5.05 970 4 62 53 10.5 g HA 4.38 197 5.18 1810 4.71 130 21 g HA 4.63 - 260 5.37 2389 4.98 184 0.33 g HA 4.27 226 5.20 2389 4, 91 149 + emulsion 1.31 g HA 4.46 279 5.37 3880 4.95 171 + emulsion 5.25 g HA 4.68 394 5.58 5487 5.12 22 + emulsion These results make it possible to highlight particular interest of the invention for reducing the amount of antigens; in fact, thanks to the emulsion according to the invention, it is possible for the same immune response to be induced to reduce very significantly the quantity of antigens present in the immunization dose.
Exemple 6: Composition vaccinale contre la grippe trivalente chez des individus non naïfs. Example 6: Vaccine composition against trivalent influenza in non-naive individuals.
On veut tester l'efficacité de l'émulsion de l'invention dans le cas d'un vaccin contre la grippe qui serait administré à des personnes dont l'organisme a déjà été au contact d'antigènes du virus de la grippe, ainsi que cela est fréquemment le cas, soit parce que les personnes ont déjà été en contact avec le virus de la grippe, soit parce qu'elles ont déjà été précédemment vaccinées avec un vaccin anti-grippal. It is desired to test the effectiveness of the emulsion of the invention in the case of an influenza vaccine that would be administered to persons whose bodies have already been in contact with antigens of the influenza virus, as well as this is often the case either because people have already been in contact with the influenza virus or because they have been previously vaccinated with an influenza vaccine.
Selon les informations publiées par C.W. Potter dans Vaccine, 2003, 21:940-5, il est possible d'utiliser comme modèle animal pour faire ce test, des souris BALB/c préalablement immunisées par voie intramusculaire par un vaccin trivalent. On prépare donc des doses d'immunisation de 50 l comprenant soit uniquement du tampon PBS, soit du vaccin trivalent de la campagne 2004, c'est-à-dire un vaccin comprenant la souche A/New Caledonia (H 1N1), la souche A/Wyoming (H3N2),et la souche B/Jiangsu, à raison de 5 g de HA de chacune des souches, en tampon PBS à pH 7,4. According to information published by C. W. Potter in Vaccine, 2003, 21: 940-5, it is possible to use BALB / c mice previously immunized intramuscularly with a trivalent vaccine as an animal model for this test. Thus, 50 l immunization doses comprising either PBS buffer or the 2004 campaign trivalent vaccine, that is, a vaccine comprising the strain A / New Caledonia (H 1N1), the strain, are prepared. A / Wyoming (H3N2), and the B / Jiangsu strain, at a rate of 5 g of HA of each of the strains, in PBS buffer at pH 7.4.
On dispose de 6 groupes de 7 souris BALB/c; on immunise 3 groupes avec les doses 10 comprenant uniquement du tampon, et 3 autres avec le vaccin trivalent, par voie intramusculaire. There are 6 groups of 7 BALB / c mice; 3 groups are immunized with the doses comprising only buffer, and 3 others with the trivalent vaccine, intramuscularly.
On prépare en outre, à partir de l'émulsion concentrée de l'exemple 1, et d'une composition vaccinale comprenant les 3 souches virales de la campagne 2004 mentionnée ci-dessus des doses d'immunisation de 30 l ayant les compositions 15 suivantes: tampon PBS seul, - 0,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS - 0,3 g de HA de chacune des souches virales; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de 20 DehymulsTM SMO; 0,143 mg d'EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4. In addition, from the concentrated emulsion of Example 1, and a vaccine composition comprising the 3 viral strains of the 2004 campaign mentioned above, 30 l immunization doses with the following compositions are prepared. PBS buffer alone, 0.3 g HA of each of the virus strains in PBS buffer, 0.3 g HA of each of the viral strains; 0.75 mg squalene; 0.11 mg of DehymulsTM SMO; 0.143 mg of EumulginTM B1 and 0.138 mg of mannitol in PBS buffer at pH 7.4.
Chacune des compositions ainsi préparée est utilisée pour immuniser à J34 par voie intradermique (dans la face interne de l'oreille) à la fois un groupe de souris ayant reçu au préalable uniquement du tampon PBS, et un groupe de souris ayant reçu une dose de vaccin trivalent. Each of the compositions thus prepared is used to immunize at J34 intradermally (in the inner side of the ear) both a group of mice that previously received only PBS buffer, and a group of mice that received a dose of trivalent vaccine.
On prélève à J56 un échantillon sanguin de chacune des souris, et on effectue un dosage des anticorps produits contre la souche H1N1 (A/New Caledonia) grâce à un test 30 d'inhibition de l'hémagglutinine. A sample of blood from each of the mice is taken at day 56, and the antibodies produced against the H1N1 strain (A / New Caledonia) are assayed by means of a hemagglutinin inhibition test.
Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-après et représentent les valeurs moyennes obtenues pour chaque groupe de souris ayant suivi le même protocole d'immunisation. The results obtained are summarized in the table below and represent the average values obtained for each group of mice having followed the same immunization protocol.
Identification Nature de la dose Nature de la dose Titre IHA vis-à-vis Groupe de souris pour le priming im pour le boost id de la souche H1N1 A PBS PBS 5 B PBS Vaccin trivalent à 59 0,3 g HA/souche C PBS Vaccin trivalent à 320 0,3 g HA/souche + émulsion D Vaccin trivalent à PBS 145 gg HA/souche E Vaccin trivalent à Vaccin trivalent à 476 gg HA/souche 0,3 g HA/souche F Vaccin trivalent à Vaccin trivalent à 861 g HA/souche 0,3 g HA/souche + émulsion Ces résultats montrent tout l'intérêt de l'invention même chez des individus non naïfs vis-à-vis de l'antigène administré. En effet, contrairement aux observations de C.W. Potter lors de l'utilisation de ce modèle qui, lui, n'avait pu montrer qu'un faible effet adjuvant des Iscoms lorsqu'ils étaient utilisés pour immuniser des souris pré-infectées ou pré-vaccinées par des antigènes de la grippe, ici on voit que l'émulsion selon l'invention permet d'augmenter de façon significative la réponse induite, que les souris immunisées soient des souris naïves, ou des souris ayant déjà été immunisées par du vaccin grippe. Identification Nature of the dose Type of dose Title IHA vis-à-vis Group of mice for priming im for the boost id of the H1N1 strain A PBS PBS 5 B PBS Trivalent vaccine at 59 0.3 g HA / strain C PBS Trivalent vaccine at 320 0.3 g HA / strain + emulsion D trivalent PBS vaccine 145 gg HA / strain E Trivalent vaccine with trivalent vaccine at 476 gg HA / strain 0.3 g HA / strain F Trivalent vaccine with trivalent 861 vaccine HA / strain 0.3 g HA / strain + emulsion These results show the whole point of the invention even in non-naive individuals vis-à-vis the administered antigen. Indeed, contrary to the observations of CW Potter during the use of this model which, he had been able to show a weak adjuvant effect of Iscoms when they were used to immunize pre-infected or pre-vaccinated mice by influenza antigens, here we see that the emulsion according to the invention makes it possible to significantly increase the induced response, that the immunized mice are naive mice, or mice that have already been immunized with influenza vaccine.
Exemple 7: Composition vaccinale trivalente contre la grippe comprenant de faibles 15 doses d'antigènes On prépare à partir de l'émulsion concentrée de l'exemple 1, et d'une composition vaccinale comprenant les 3 souches virales de la campagne 2004 (la souche A/New 2888117 - 20 - Caledonia (H1N1), la souche A/Wyoming (H3N2),et la souche B/Jiangsu) des doses d'immunisation de 30 l ayant les compositions suivantes: 0,111g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 0,4 g de FIA de chacune des souches virales en tampon PBS, 1,6 g de FIA de chacune des souches virales en tampon PBS, 6,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 0,1 gg de HA; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de DehymulsTM SMO; 0,143 mg d'EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4, 0,4 g de HA; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de DehymulsTM SMO; 0,143 mg d'EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4 On dispose de 6 groupes de 8 souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines, à qui on administre à JO par voie intradermique (face interne de l'oreille) une dose de 30 l d'une des compositions indiquées ci-dessus (1 composition par groupe). Example 7: Influenza trivalent vaccine composition comprising low doses of antigens Prepared from the concentrated emulsion of Example 1, and a vaccine composition comprising the 3 viral strains of the 2004 campaign (strain A / New Caledonia (H1N1) strain, A / Wyoming strain (H3N2), and B / Jiangsu strain), 30 l immunization doses having the following compositions: 0.11 g HA of each of the viral strains in PBS buffer, 0.4 g of FIA of each of the viral strains in PBS buffer, 1.6 g of FIA of each of the viral strains in PBS buffer, 6.3 g of HA of each of the viral strains in PBS buffer, 0 1 g of HA; 0.75 mg squalene; 0.11 mg of DehymulsTM SMO; 0.143 mg of Eumulgin ™ B1 and 0.138 mg of mannitol in PBS buffer pH 7.4, 0.4 g of HA; 0.75 mg squalene; 0.11 mg of DehymulsTM SMO; 0.143 mg of EumulginTM B1 and 0.138 mg of mannitol in PBS buffer at pH 7.4 There are 6 groups of 8 female BALB / c mice aged 8 weeks, administered intradermally by OJ (internal side of ear) a dose of 30 l of one of the compositions indicated above (1 composition per group).
Dans chaque groupe, on administre à nouveau par voie intradermique à la moitié des souris à J29, une 2nde dose ayant la même nature que la lère dose administrée. On prélève des échantillons sanguins à J22 et à J43 afin de déterminer les quantités d'anticorps induits. In each group, half of the mice on D29 were again administered intradermally, a second dose having the same nature as the first dose administered. Blood samples were taken on D22 and D43 to determine the amounts of antibody induced.
Les dosages d'anticorps sont effectués par ELISA pour les anticorps induits à J22 et à J43, vis-à-vis de l'ensemble des souches administrées: H1N1, H3N2 et B, et par IHA vis-à-vis de la souche H1N1 uniquement à la fois à J22, et à J43. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-après, où les titres exprimés sont les moyennes obtenues pour chaque groupe de souris. En ce qui concerne les résultats à J43, les moyennes ont été réalisées séparément à l'intérieur d'un même groupe, pour les souris ayant reçu 2 doses de vaccin et celles n'en ayant reçu qu'une. -21 - The antibody assays are carried out by ELISA for the antibodies induced at J22 and at J43, with respect to all the strains administered: H1N1, H3N2 and B, and by IHA with respect to the H1N1 strain. only on both J22 and J43. The results obtained are summarized in the table below, where the titles expressed are the averages obtained for each group of mice. Regarding the results at D43, the averages were performed separately within the same group, for mice that received 2 doses of vaccine and those that received only one. -21 -
Composition Titre ELISA Titre Titre ELISA Titre IHA Titre IHA vaccinale H1N1 à J22 ELISA B à J22 H1N1 à J22 H1N1 à J43 H3N2 à J22 Souris Souris Boostées non boostées 0,1 tg HA 3,467 4,131 4,063 57 95 80 0,4 g HA 3, 816 4,527 4,313 73 226 80 1,6 g HA 4,069 4,831 4,750 147 1280 135 6,3 g HA 4,534 5,298 4,947 320 1522 320 0,1 g HA 4,200 5,015 4,807 207 2153 538 + émulsion - 0,4 g HA 4,612 5,482 5,001 453 2560 640 + émulsion Composition Titre ELISA Titre ELISA Titre ELISA vaccinale HINI à J43 H3N2 à J43 B à J43 Souris Souris non Souris Souris non Souris Souris non Boostées boostées Boostées boostées Boostées boostées 0,1 tg HA 3,833 3, 425 4,782 4,174 4,479 3,911 0,4 tg HA 4,385 3,599 5,250 4,354 5,053 4,079 1,6 g HA 4,906 3,876 5,526 4,779 5,458 4,487 6,3 gg HA 5,287 4,176 6,073 5,033 5,678 4,773 0,1.tg HA 5,210 4,523 5,990 5,264 5,723 4,943 + émulsion 0,4 g HA 5,394 4,790 6,171 5,640 5,962 5,144 + émulsion Ces résultats montrent que grâce à l'émulsion selon l'invention, même avec de faibles doses d'antigènes, on obtient des réponses humorales très importantes. Ainsi, les résultats obtenus avec uniquement 0,4 tg de HA de chacune des souches virales, on obtient de bien meilleures réponses en utilisant l'émulsion selon l'invention qu'en - 22 - utilisant une dose de 6,3 g de HA seule. En outre, on remarque que même chez les individus n'ayant pas reçu de dose de rappel, le système immunitaire continue à induire des anticorps alors que cela n'est pas le cas pour les individus ayant reçu les antigènes vaccinaux non adjuvés. Composition Title ELISA Title Title ELISA Title IHA Title IHA Vaccine H1N1 to J22 ELISA B to J22 H1N1 to J22 H1N1 to J43 H3N2 to J22 Mouse Mice Boosted unboosted 0.1 tg HA 3,467 4,131 4,063 57 95 80 0,4 g HA 3, 816 4,527 4,313 73,226 80 1,6 g HA 4,069 4,831 4,750 147 1280 135 6.3 g HA 4,534 5,298 4,947 320 1522 320 0,1 g HA 4,200 5,015 4,807 207 2153 538 + emulsion - 0.4 g HA 4,612 5,482 5,001 453 2560 640 + emulsion Composition Title ELISA Title ELISA Title Immunization ELISA HINI at J43 H3N2 at J43 B at J43 Mice Mice no Mice Mice no Mice Boosted non boosted mice Boosted boosted Boosted boosted 0.1 tg HA 3,833 3, 425 4,782 4,174 4,479 3,911 0.4 tg HA 4,385 3,599 5,250 4,354 5,053 4,079 1,6 g HA 4,906 3,876 5,526 4,779 5,458 4,487 6.3 gg HA 5,287 4,176 6,073 5,033 5,678 4,773 0.1.tg HA 5,210 4,523 5,990 5,264 5,723 4,943 + emulsion 0.4 HA 5,394 4,790 6,171 5,640 5,962 5,144 + emulsion These results show that thanks to the emulsion according to the invention, even with low doses of antigens, very large humoral responses are obtained. Thus, the results obtained with only 0.4 tg of HA of each of the viral strains, much better responses are obtained using the emulsion according to the invention than by using a dose of 6.3 g of HA alone. In addition, it is noted that even in individuals who have not received a booster dose, the immune system continues to induce antibodies while this is not the case for individuals who received the non-adjuvanted vaccine antigens.
Exemple 8: Composition vaccinale contre la grippe trivalente On prépare à partir de l'émulsion concentrée de l'exemple 1, et d'une composition vaccinale comprenant les 3 souches virales de la campagne 2004 (la souche A/New Caledonia (H 1N 1), la souche A/Wyoming (H3N2),et la souche B/Jiangsu) des doses d'immunisation de 30 l ayant les compositions suivantes: 0,1.tg de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 0,4 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 1,6 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 6,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 0,1 g de HA; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de DehymulsTM SMO; 0,143 mg d' EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4, 0,4 g de HA; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de DehymulsTM SMO; 0,143 mg d'EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4. Example 8: Vaccine composition against trivalent influenza is prepared from the concentrated emulsion of Example 1, and a vaccine composition comprising the 3 strains of viral 2004 campaign (strain A / New Caledonia (H 1N 1 ), the A / Wyoming strain (H3N2), and the B / Jiangsu strain) of 30 l immunization doses having the following compositions: 0.1.tg of HA of each of the viral strains in PBS buffer, 0.4 g of HA of each of the viral strains in PBS buffer, 1.6 g of HA of each of the viral strains in PBS buffer, 6.3 g of HA of each of the viral strains in PBS buffer, 0.1 g of HA; 0.75 mg squalene; 0.11 mg of DehymulsTM SMO; 0.143 mg of Eumulgin ™ B1 and 0.138 mg of mannitol in PBS buffer pH 7.4, 0.4 g of HA; 0.75 mg squalene; 0.11 mg of DehymulsTM SMO; 0.143 mg of EumulginTM B1 and 0.138 mg of mannitol in PBS buffer at pH 7.4.
On dispose de 6 groupes de 8 souris C57BL/6J femelles âgées de 8 semaines, à qui on administre à JO par voie intradermique (face interne de l'oreille) une dose de 30 l d'une des compositions indiquées ci-dessus (1 composition par groupe). There are 6 groups of 8 female C57BL / 6J mice, aged 8 weeks, administered intradermally (inner side of the ear) by JO 30 l of one of the compositions indicated above (1 composition by group).
On prélève des échantillons sanguins à J23 afin de déterminer les quantités d'anticorps induits. Blood samples are taken on D23 to determine the amounts of antibody induced.
Les dosages d'anticorps sont effectués par ELISA et par IHA pour les anticorps induits vis-à-vis de l'ensemble des souches administrées: H1N1, H3N2 et B. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-après, où les titres exprimés sont 30 les moyennes obtenues pour chaque groupe de souris. The antibody assays are carried out by ELISA and by IHA for the antibodies induced vis-à-vis all the strains administered: H1N1, H3N2 and B. The results obtained are summarized in the table below, where the titers expressed are the averages obtained for each group of mice.
- 23 - Composition ELISA ELISA ELISA IHA IHA IHA H1N1 H3N2 B H1N1 H3N2 B 0,1 g HA 2,924 3,506 3,920 26 174 95 0,4 g HA 3,673 4,227 4,431 135 269 147 1,6 g HA 3,948 4,593 4,786 160 381 190 6,3 g HA 4,446 5,106 5,190 587 1174 453 0,1 g HA 4,456 5,192 5,064 349 1974 320 + émulsion 0,4 g HA 4,659 5,337 5,174 761 2348 494 + émulsion A nouveau, les résultats obtenus montrent tout l'intérêt de l'émulsion selon l'invention grâce à laquelle il est possible de réduire très fortement les quantités d'antigènes présents. En effet, on peut globalement considérer qu'avec uniquement 0,11ag de HA adjuvé par l'émulsion selon l'invention, on obtient d'aussi bons résultats qu'avec une quantité de 6,3.tg de HA. - 23 - Composition ELISA ELISA ELISA IHA IHA IHA H1N1 H3N2 B H1N1 H3N2 B 0.1 g HA 2.924 3.506 3.920 26 174 95 0.4 g HA 3.673 4.227 4.431 135 269 147 1.6 g HA 3.948 4.593 4.786 160 381 190 6 , 3 g HA 4,446 5,106 5,190 587 1174 453 0.1 g HA 4,456 5,192 5,064 349 1974 320 + emulsion 0.4 g HA 4,659 5,337 5,174 761 2348 494 + emulsion Again, the results obtained show all the interest of the emulsion according to the invention by which it is possible to very strongly reduce the amounts of antigens present. Indeed, it can be generally considered that with only 0.11 g of HA adjuvanted by the emulsion according to the invention, we obtain as good results as with a quantity of 6.3.tg of HA.
Exemple 9: Composition vaccinale trivalente contre la grippe comprenant une émulsion 10 selon l'invention ou selon l'art antérieur. Example 9: Trivalent vaccine composition against influenza comprising an emulsion 10 according to the invention or according to the prior art.
On prépare à partir de l'émulsion concentrée de l'exemple 1, et d'une composition vaccinale comprenant les 3 souches virales de la campagne 2004 ( la souche A/New Caledonia (H1N1), la souche A/Wyoming (H3N2),et la souche B/Jiangsu) des doses d'immunisation de 30 l ayant les compositions suivantes: 0,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 6,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 0,3 g de HA; 0,21 mg de squalène; 0,031 mg de DehymulsTM SMO; 0,040 mg 20 d'EumulginTM B1 et 0,039 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4 (émulsion à 0,7%), - 24 - 0,3 g de HA; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de DehymulsTM SMO; 0,143 mg d'EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4 (émulsion à 2,5%) 0,3 g de HA; 0,645 mg de squalène; 0,075mg de TweenTM 80; 0,075mg de 5 SpanTM 85 (émulsion selon l'art antérieur obtenue par microfluidisation). Is prepared from the concentrated emulsion of Example 1, and a vaccine composition comprising the 3 viral strains of the 2004 campaign (strain A / New Caledonia (H1N1), strain A / Wyoming (H3N2), and strain B / Jiangsu) 30 l immunization doses having the following compositions: 0.3 g HA of each of the viral strains in PBS buffer, 6.3 g HA of each of the viral strains in PBS buffer, 0.3 g HA; 0.21 mg squalene; 0.031 mg DehymulsTM SMO; 0.040 mg of Eumulgin ™ B1 and 0.039 mg of mannitol in PBS buffer pH 7.4 (0.7% emulsion), 0.3 g HA; 0.75 mg squalene; 0.11 mg of DehymulsTM SMO; 0.143 mg of Eumulgin ™ B1 and 0.138 mg of mannitol in PBS buffer at pH 7.4 (2.5% emulsion) 0.3 g of HA; 0.645 mg of squalene; 0.075mg TweenTM 80; 0.075 mg of SpanTM 85 (emulsion according to the prior art obtained by microfluidization).
On dispose de 5 groupes de 8 souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines, à qui on administre à JO par voie intradermique (face interne de l'oreille) une dose de 30 l d'une des compositions indiquées ci-dessus (1 composition par groupe). There are 5 groups of 8 female BALB / c mice, 8 weeks old, administered intradermally (inner side of the ear) by JO 30 l of one of the compositions indicated above (1 composition by group).
Pour évaluer la quantité d'anticorps induits, on effectue des prélèvements sanguins à J21 sur lesquels on détermine par IHA (inhibition de 1'hémagglutination) l'activité contre la souche A/H1N1, la souche A/H3N2, la souche B. Les résultats obtenus pour chaque groupe de souris sont représentés dans le tableau ci-après. In order to evaluate the quantity of antibodies induced, blood samples are taken on day 21, on which IHA (inhibition of haemagglutination) is determined by the activity against the A / H1N1 strain, the A / H3N2 strain and the B strain. The results obtained for each group of mice are shown in the table below.
Composition testée IHA contre IHA contre IHA contre H1N1 H3N2 B 0,3 g HA 26 174 8 6,3 g HA 247 905 73 0,3 g HA + émulsion invention à 95 640 37 0,7 % 0,3 g HA + émulsion invention à 269 1974 73 2,5 % 0,3 g HA + 135 987 57 émulsion art antérieur Ces résultats montrent qu'avec une émulsion obtenue selon l'invention grâce à un procédé de préparation très simple d'inversion de phase au moyen d'un changement de température, on obtient un adjuvant qui est aussi bon, et même légèrement meilleur que l'émulsion de l'art antérieur obtenue en utilisant des taux de cisaillement très importants. Composition tested IHA against IHA against IHA against H1N1 H3N2 B 0.3 g HA 26 174 8 6.3 g HA 247 905 73 0.3 g HA + emulsion invention at 95 640 37 0.7% 0.3 g HA + emulsion invention to 269 1974 73 2.5% 0.3 g HA + 135 987 57 emulsion prior art These results show that with an emulsion obtained according to the invention thanks to a very simple process of preparation of phase inversion by means of At a temperature change, an adjuvant is obtained which is as good and even slightly better than the emulsion of the prior art obtained using very high shear rates.
- 25 - Exemple 10: Composition vaccinale trivalente contre la grippe comprenant une émulsion selon l'invention à différentes concentrations On prépare à partir de l'émulsion concentrée de l'exemple 1, et d'une composition vaccinale comprenant les 3 souches virales de la campagne 2004 (la souche A/New Caledonia (H1N1), la souche A/Wyoming (H3N2),et la souche B/Jiangsu) des doses d'immunisation de 30 l ayant les compositions suivantes: 0,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 6,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 0, 3 g de HA de chacune des souches virales; 0,12 mg de squalène; 0,018 mg de DehymulsTM SMO; 0,023 mg d'EumulginTM B1 et 0,022 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4 (émulsion à 0,4%), 0,3 g de HA de chacune des souches virales; 0,299 mg de squalène; 0,044 mg de DehymulsTM SMO; 0,057 mg d'EumulginTM B1 et 0,055 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4 (émulsion à 1%) 0,3 g de HA de chacune des souches virales; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de DehymulsTM SMO; 0,143 mg d'EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en 20 tampon PBS à pH 7,4 (émulsion à 2,5%) On dispose de 5 groupes de 8 souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines, à qui on administre à JO par voie intradermique (face interne de l'oreille) une dose de 30 l d'une des compositions indiquées ci-dessus (1 composition par groupe). EXAMPLE 10 Trivalent Influenza Vaccine Composition Comprising an Emulsion According to the Invention at Different Concentrations One prepares from the concentrated emulsion of Example 1, and from a vaccine composition comprising the 3 viral strains of the invention. 2004 campaign (strain A / New Caledonia (H1N1), strain A / Wyoming (H3N2), and strain B / Jiangsu) of 30 l immunization doses having the following compositions: 0.3 g of HA each viral strains in PBS buffer, 6.3 g of HA of each of the viral strains in PBS buffer, 0.3 g of HA of each of the viral strains; 0.12 mg of squalene; 0.018 mg DehymulsTM SMO; 0.023 mg of EumulginTM B1 and 0.022 mg of mannitol in PBS buffer at pH 7.4 (0.4% emulsion), 0.3 g of HA of each of the viral strains; 0.299 mg of squalene; 0.044 mg DehymulsTM SMO; 0.057 mg of EumulginTM B1 and 0.055 mg of mannitol in PBS buffer at pH 7.4 (1% emulsion) 0.3 g of HA of each of the viral strains; 0.75 mg squalene; 0.11 mg of DehymulsTM SMO; 0.143 mg of Eumulgin ™ B1 and 0.138 mg of mannitol in PBS buffer pH 7.4 (2.5% emulsion). There are 5 groups of 8 female BALB / c mice, 8 weeks old, administered JO intradermally (inner side of the ear) a dose of 30 l of one of the compositions indicated above (1 composition per group).
Pour évaluer la quantité d'anticorps induits, on effectue des prélèvements sanguins à J21 sur lesquels on détermine par ELISA les anticorps anti-H1N1, les anticorps anti-H3N2 et les anticorps anti-B. To evaluate the amount of antibody induced, blood samples are taken at D21 on which the anti-H1N1 antibodies, the anti-H3N2 antibodies and the anti-B antibodies are determined by ELISA.
Les résultats obtenus sont indiqués en loglo d'unités arbitraires dans le tableau ci-après, qui indique pour chaque groupe de souris la moyenne des résultats obtenus sur chacune des souris. The results obtained are indicated in loglo of arbitrary units in the table below, which indicates for each group of mice the average of the results obtained on each of the mice.
Composition testée Anti-HiN1 Anti-H3N2 Anti-B 0,3 g HA 3,864 4,594 4,406 6,3 g HA 4,478 5,041 5,053 0,3 g HA + 4,053 4,827 4,545 émulsion invention 0,4% 0,3 g HA + 4,312 5,074 4,733 émulsion invention à 1% 0,3 g HA + 4,425 5,200 4,840 émulsion invention à 2,5% Ces résultats confirment à nouveau que, quelle que soit la souche évaluée, l'émulsion selon l'invention permet avec une dose très faible d'antigènes, d'avoir une réponse du système immunitaire très importante. Tested Composition Anti-HiN1 Anti-H3N2 Anti-B 0.3 g HA 3.864 4.594 4.406 6.3 g HA 4.478 5.041 5.053 0.3 g HA + 4.053 4.827 4.545 emulsion invention 0.4% 0.3 g HA + 4.3212 5.074 4,733 emulsion invention at 1% 0.3 g HA + 4,425 5,200 4,840 emulsion invention at 2,5% These results confirm again that, whatever the strain evaluated, the emulsion according to the invention allows with a very low dose of antigens, to have a very important immune system response.
Exemple 11: Préparation d'une composition lyophilisable On procède comme à l'exemple 1, mais en utilisant de l'eau au lieu du tampon; l'émulsion obtenue est ensuite diluée avec une solution aqueuse comprenant du mannitol, du saccharose et du dodécylmaltoside, afin d'obtenir une émulsion dont la composition finale est la suivante: 5% de squalène, 0, 95% de polyoxyéthylène cétostéaryl éther, 0,75% de monooléate de sorbitanne 3% de mannitol, 2% de dodécylmaltoside, 6% de saccharose Cette émulsion a été lyophilisée et conservée 3 mois à 4 C; puis après reconstitution, on a constaté que ses propriétés étaient conservées, notamment ses qualités d'émulsion monodisperse, avec une valeur de d90 égale à celle mesurée avant lyophilisation. EXAMPLE 11 Preparation of a freeze-dried composition The procedure is as in Example 1, but using water instead of the buffer; the emulsion obtained is then diluted with an aqueous solution comprising mannitol, sucrose and dodecylmaltoside, in order to obtain an emulsion whose final composition is as follows: 5% squalene, 0.95% polyoxyethylene cetostearyl ether, 0 , 75% sorbitan monooleate 3% mannitol, 2% dodecylmaltoside, 6% sucrose This emulsion was lyophilized and stored for 3 months at 4 ° C .; then after reconstitution, it was found that its properties were preserved, especially its monodisperse emulsion qualities, with a value of d90 equal to that measured before lyophilization.
Cette émulsion peut-être diluée au %2 avec une solution comprenant des antigènes vaccinaux afin de donner une composition vaccinale selon l'invention. This emulsion can be diluted in% 2 with a solution comprising vaccine antigens to give a vaccine composition according to the invention.
Claims (27)
Priority Applications (36)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0507240A FR2888117B1 (en) | 2005-07-07 | 2005-07-07 | VACCINE COMPOSITION COMPRISING A THERMOREVERSIBLE EMULSION |
ARP060102917A AR054822A1 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-06 | ADMISSION IMMUNE EMULSION |
DK09152313.4T DK2080522T3 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immunoadjuvant emulsion |
PT09152313T PT2080522E (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno-adjuvant emulsion |
DE602006005671T DE602006005671D1 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immunadjuvansemulsion |
EP09152313A EP2080522B1 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno-adjuvant emulsion |
AT06778810T ATE424845T1 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | THERMOREVERSIBLE IMMUNADJUVANT EMULSION |
EP06778810A EP1904099B1 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno- adjuvant emulsion |
CN2006800248369A CN101217977B (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno-adjuvant emulsion |
DK06778810T DK1904099T3 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immunoadjuvant emulsion |
ES06778810T ES2322102T3 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | IMMUNE EMULSION-THERMAL-REVERSIBLE ADJUSTER. |
SI200631423T SI2080522T1 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno-adjuvant emulsion |
SG201004919-5A SG163584A1 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno-adjuvant emulsion |
ZA200800824A ZA200800824B (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Themoreversible immuno-adjuvant emulsion |
US11/483,358 US8703095B2 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Immuno-adjuvant emulsion |
NZ564173A NZ564173A (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immunological adjuvant emulsion |
AU2006268466A AU2006268466B2 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno-adjuvant emulsion |
ES09152313T ES2390104T3 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immunoadjuvant emulsion |
AP2007004280A AP2361A (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Immunological adjuvant emulsion. |
BRPI0614053-0A BRPI0614053A2 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | adjuvant oil-in-water emulsion, use of said emulsion, process for preparing an immunogenic composition comprising at least one vaccine antigen and an oil-in-water emulsion, and immunogenic composition |
PT06778810T PT1904099E (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno- adjuvant emulsion |
PL06778810T PL1904099T3 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno- adjuvant emulsion |
PL09152313T PL2080522T3 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno-adjuvant emulsion |
EA200800271A EA012376B1 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Immuno-adjuvant emulsion |
PCT/FR2006/001635 WO2007006939A2 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno-adjuvant emulsion |
SI200630298T SI1904099T1 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno- adjuvant emulsion |
CA2613732A CA2613732C (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno-adjuvant emulsion |
JP2008519966A JP5300475B2 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immune adjuvant emulsion |
MX2007016412A MX2007016412A (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno-adjuvant emulsion. |
KR1020087002704A KR101328638B1 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-07 | Thermoreversible immuno-adjuvant emulsion |
IL187967A IL187967A0 (en) | 2005-07-07 | 2007-12-06 | Thermoreversible immuno-adjuvant emulsion |
TNP2008000001A TNSN08001A1 (en) | 2005-07-07 | 2008-01-04 | THERMOREVERSIBLE IMMUNO-ADJUVANT EMULSION |
NO20080585A NO336369B1 (en) | 2005-07-07 | 2008-01-31 | Oil-in-water adjuvant emulsion, use and method of preparation thereof, as well as immunogenic composition and method of preparation thereof. |
CY20091100455T CY1108994T1 (en) | 2005-07-07 | 2009-04-27 | THERMOSTABLE IMMUNE TREATMENT MILK |
CY20121100915T CY1113414T1 (en) | 2005-07-07 | 2012-10-03 | THERMOSTABLE IMMUNE TREATMENT MILK |
US14/193,097 US20140178478A1 (en) | 2005-07-07 | 2014-02-28 | Immuno-Adjuvant Emulsion |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0507240A FR2888117B1 (en) | 2005-07-07 | 2005-07-07 | VACCINE COMPOSITION COMPRISING A THERMOREVERSIBLE EMULSION |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR2888117A1 true FR2888117A1 (en) | 2007-01-12 |
FR2888117B1 FR2888117B1 (en) | 2009-10-09 |
Family
ID=35871259
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR0507240A Expired - Fee Related FR2888117B1 (en) | 2005-07-07 | 2005-07-07 | VACCINE COMPOSITION COMPRISING A THERMOREVERSIBLE EMULSION |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
AP (1) | AP2361A (en) |
FR (1) | FR2888117B1 (en) |
ZA (1) | ZA200800824B (en) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6299884B1 (en) * | 1989-05-25 | 2001-10-09 | Chiron Corporation | Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion |
US20030022852A1 (en) * | 2000-03-10 | 2003-01-30 | Nest Gary Van | Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof |
US20030060559A1 (en) * | 2001-03-21 | 2003-03-27 | Madash, Llc | Thermally reversible water in oil in water emulsions |
US6544518B1 (en) * | 1999-04-19 | 2003-04-08 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccines |
US6787523B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
-
2005
- 2005-07-07 FR FR0507240A patent/FR2888117B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-07-07 AP AP2007004280A patent/AP2361A/en active
- 2006-07-07 ZA ZA200800824A patent/ZA200800824B/en unknown
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6299884B1 (en) * | 1989-05-25 | 2001-10-09 | Chiron Corporation | Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion |
US6787523B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US6544518B1 (en) * | 1999-04-19 | 2003-04-08 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccines |
US20030022852A1 (en) * | 2000-03-10 | 2003-01-30 | Nest Gary Van | Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof |
US20030060559A1 (en) * | 2001-03-21 | 2003-03-27 | Madash, Llc | Thermally reversible water in oil in water emulsions |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AP2361A (en) | 2012-02-06 |
AP2007004280A0 (en) | 2007-12-31 |
FR2888117B1 (en) | 2009-10-09 |
ZA200800824B (en) | 2009-12-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1904099B1 (en) | Thermoreversible immuno- adjuvant emulsion | |
EP1976560B1 (en) | Thermoreversible oil-in-water emulsion | |
US8703095B2 (en) | Immuno-adjuvant emulsion | |
JP2018008968A (en) | Human respiratory syncytial virus vaccine | |
WO1994016681A1 (en) | Recombinant living subunit vaccine composition and process for its preparation | |
US20240050561A1 (en) | Solanesol vaccine adjuvants and methods of preparing same | |
BE1024160B9 (en) | IMMUNOGENIC FORMULATION | |
FR2888117A1 (en) | Oil-in-water adjuvant emulsion, useful in immunogenic composition, comprises squalene, aqueous solvent, polyoxyethylene alkyl ether hydrophilic nonionic surfactant, and hydrophobic nonionic surfactant | |
EP2531215B1 (en) | Use of a specific mineral oil for the production of a novel adjuvant | |
Makidon | Oil-in-water nanoemulsions as mucosal vaccine adjuvants: characterization, mechanism, formulation, and development of a nanoemulsion-based Burkholderia cenocepacia vaccine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 11 |
|
ST | Notification of lapse |
Effective date: 20170331 |