FR2872911A1 - Procede de localisation d'une espece chimique ou biologique sur un substrat, microsysteme d'analyse et biopuce - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à un procédé de localisation d'une espèce chimique ou biologique sur un substrat, à un substrat texturé (1) ainsi qu'à un microsystème d'analyse et à une biopuce. Le procédé comprend les étapes suivantes : fournir un substrat (S) ; déposer sur au moins une surface du substrat une couche d'un matériau de formule (α) SiOxCy:H où 0,7 ≤ x ≤ 1,3 et 1,5 ≤ y ≤ 2 ; décomposer par traitement ultraviolet au moins une zone localisée de la couche de matériau de formule (α) déposée en un matériau de formule (β) SiOx1Cy1:H où 1,7 ≤ x1 ≤ 2,5 et 0,1 ≤ y1 ≤ 0,4 ; et mettre en contact lesdites zones localisées du matériau de formule (β) avec une solution de l'espèce chimique ou biologique.
Description
PROCEDE DE LOCALISATION D'UNE ESPECE CHIMIQUE OU
BIOLOGIQUE SUR UN SUBSTRAT, MICROSYSTEME D'ANALYSE ET
BIOPUCE
DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention se rapporte à un procédé de localisation d'une espèce chimique ou biologique sur un substrat, à un substrat texturé susceptible d'être obtenu à partir de ce procédé, ainsi qu'à un microsystème d'analyse et à une biopuce susceptibles d'être obtenus à partir de ce procédé.
La présente invention trouve notamment des applications dans la fabrication de substrats servant de supports pour des tests en chimie ou en biologie, en particulier où des surfaces de substrats sont structurés localement pour obtenir des zones ( spots en anglais) où des éléments chimiques ou biologiques peuvent adhérer et/ou se développer en vue de leur analyse et/ou détection.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE Les procédés connus de localisation d'espèces chimiques sur un substrat ne sont ni simples, ni de très grande sélectivité : le problème principal est que les cellules, les molécules et les liquides adhèrent un peu partout.
Le micromatriçage ( micropatterning en anglais) d'espèces biologiques, c'est-à-dire le contrôle de la fixation et de la non fixation de cellules ou molécules chimiques ou biologiques sur des zones précises d'une surface est généralement obtenu suivant deux techniques différentes qui sont la photolithographie et l'impression.
La technique du micropatterning par photolithographie a déjà été largement décrite, comme par exemple dans le document [1] EP-A-1 260 863, Micropatterning of plasma polymerised polymer , Winther-Jensen Bjoern; Bouaidat Salim; Jonsmann Jacques. Elle consiste à former des cavités dans un matériau organique ou inorganique en utilisant les technologies employées dans l'industrie de la microélectronique. Cependant, cette technologie comporte plusieurs inconvénients. En particulier, la photolithographie exige l'utilisation de solvants et de bases qui sont incompatibles avec beaucoup de molécules biologiques. Les équipements nécessaires à la mise en oeuvre de cette technologie sont en outre complexes et relativement chers pour les applications biologiques.
L'impression ( printing en anglais) par micro contact ( micro stamping en anglais) est une autre technique qui a été employée pour réaliser le micropatterning d'espèces biologiques sur les surfaces de substrats. En utilisant cette technique, des substrats inorganiques tels que le verre et le silicium ont été micro-matricés en déposant des encres sur leur surface. Dans cette technique, des protéines ont été appliquées sur une surface en réseau dense à partir d'un tampon fabriqué en poly(diméthylsiloxane) pré-enduit. D'autres procédés utilisent la modification localisée de la polarité de la surface en appliquant un tampon spécifique, c'est-à-dire micromatricé, et enduit de produit pouvant modifier localement la polarité du substrat. Le document [2] US n 20030104614, Micropatterning surfaces of polymeric substrate , Schmalenberg Kristine (US) ; Buettner Helen M. (US) ; Uhrich Kathryn décrit une telle technique.
Malheureusement, dans le premier cas, les molécules biochimiques actives sont en contact avec des constituants étrangers pouvant les contaminer et modifier leur comportement. Dans le second cas, la modification localisée de la polarité doit être localisée juste avant la dépose des molécules biochimiques. Cette technique est en outre potentiellement sensible au nettoyage. Ces deux techniques sont en outre basées sur le dépôt d'un film destiné à augmenter la fixation des molécules biologiques dans certaines zones ou d'un film bloquant la fixation des molécules biologiques dans des zones complémentaires, et dans tous les cas le film n'est pas continu sur le substrat ce qui fragilise la tenue mécanique du dépôt (vieillissement et tenue au nettoyage). Le dépôt de ce ou de ces films requiert de plus du matériel et des appareillages, ce qui prolonge la durée de fabrication du substrat et augmente le coût de sa fabrication.
Il existe donc, dans le domaine de la fabrication de substrats servant de supports pour des tests en chimie ou en biologie un réel besoin de nouveaux procédés de fabrication qui apportent une solution aux inconvénients précités, et qui permettent en outre de travailler à des échelles qui sont toujours plus réduites au fur et à mesure des perfectionnements apportés aux microsystèmes d'analyse et biopuces.
Exposé de l'invention La présente invention fournit précisément un nouveau procédé de fabrication de substrats textures pouvant servir de supports pour des tests en chimie ou en biologie qui apporte notamment une solution aux inconvénients précités de l'art antérieur, facile à mettre en oeuvre, rapide et présentant un coût réduit.
Le procédé de l'invention est un procédé de localisation d'une espèce chimique ou biologique sur un substrat comprenant les étapes suivantes: (a) fournir un substrat; (b) déposer sur au moins une surface du substrat une couche d'un matériau de formule (a) SiOxCy: H où 0,7 S x _< 1,3 et 1,5 <- y <- 2; (c) modifié par traitement ultraviolet ou plasma au moins une zone localisée de la couche de 20 matériau de formule (a) déposée à l'étape (b) en un matériau de formule (5) SiOx1Cy1:H où 1,7 <- xl <- 2,5 et 0,1 <- yl <- 0,4; et (d) mettre en contact lesdites zones localisées du matériau de formule (5) avec une solution 25 de l'espèce chimique ou biologique.
La présente invention se rapporte également à un substrat texturé comprenant: un matériau de formule (a) SiOxCy:H où 0,7 -< x 5 1,3 et 1,5 _< y <- 2; et - un matériau de formule (5) SiOxiCy1:H où 1,7 <- xl -< 2,5 et 0,1 < yl < 0,4.
Ce substrat peut comporter en outre, notamment lors de son utilisation, mais aussi pour sa commercialisation, une espèce chimique ou biologique liée au matériau de formule (R).
L'invention concerne le matriçage, ou texturation, de surfaces de substrats, et en particulier le micromatriçage d'espèces chimiques ou biologiques sur des surfaces de substrats.
Le substrat est en fait le support sur lequel la couche de matériau (a) est déposée à l'étape (b) du procédé. Il peut s'agir de tout matériau solide connu de l'homme du métier, tel que par exemple les matériaux supports utilisés pour la fabrication des microsystèmes d'analyse et des biopuces. Il peut s'agir d'un substrat organique ou inorganique. Il peut être constitué par exemple d'un matériau choisi dans le groupe comprenant du verre, de la silice, du polycarbonate, du polyméthylméthacrylate (PMMA) , du polystyrène, du copolymère cyclooléfine (COC), et du polystyrène acrylonitrile (SAN).
Le substrat peut être plan ou non, c'est-à-dire.
- comporter des microstructurations (canaux, des cavités, des niveaux différents, etc.) réalisant un microsystème (fluidique, mécanique, optique tels que des microsystèmes électromécaniques (MEMS) ou des microsystèmes optoélectromécaniques (MOEMS)) ; - comporter des fonctions électriques, par exemple par dépôt métallique pour des électrodes; électroniques (circuiterie CMOS (CMOS pour complementary metal oxyde semi conductor )), optiques (dépôt de couches minces adaptées pour réaliser des miroirs, des zones anti- réfléchissantes, des guides d'ondes, etc.).
Avant l'étape (b) du procédé de l'invention, le substrat peut être nettoyé afin d'améliorer l'adhérence de la couche de matériau (a) à sa surface. Ce nettoyage peut être par exemple un nettoyage chimique, éventuellement suivi d'un traitement thermique. Les techniques de nettoyage en particulier celles utilisées pour la préparation de supports de biopuce, connues de l'homme du métier sont utilisables. Pour ce nettoyage, on peut utiliser tout solvant approprié pour dépoussiérer et/ou dégraisser la surface du substrat, de préférence sans l'abîmer. On peut citer par exemple comme solvant de nettoyage le trichloréthylène, l'acétone, l'alcool éthylique, l'eau désionisée, des solutions acides ou basiques, etc. Le nettoyage peut consister à baigner le substrat dans un ou plusieurs de ces solvants successivement. Le nettoyage est alors généralement suivi d'un séchage. Le nettoyage peut également consister tout simplement à débarrasser le substrat de ses poussières par un jet d'air comprimé.
L'étape (b) consistant à déposer sur au moins une surface du substrat une couche d'un matériau de formule (a) peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier pour déposer ce type de matériau sur une surface. Il peut s'agir par exemple d'un dépôt chimique en phase vapeur assisté par plasma (dépôt PECVD) d'un polysiloxane (ou organosilane). Le polysiloxane est un précurseur du matériau (a) qui se transforme en ledit matériau (a) lors de son dépôt sur la surface du substrat.
Le polysiloxane peut être choisi par exemple parmi l'hexaméthyldisiloxane (HMDSO) et l'octaméthylcyclotétrasiloxane (OMCTS), le tétraméthylcyclotétrasiloxane (TMCTS).
L'utilisation de la technologie de dépôt chimique en phase vapeur plasma (PECVD ou PACVD) permet d'obtenir des épaisseurs de dépôt très fines qui peuvent être inférieures à 50 nanomètres, et même aller jusqu'à 5-10 nm, ce qui garantit une excellente adhésion du dépôt sur tout type de substrat. Une technique PECVD ou PACVD utilisable pour mettre en oeuvre la présente invention est décrite par exemple dans le document [3] Svend S. Eskildsen et al., Plasma CVD: Process capabilities and economic aspects , Surface and Coatings Technology, 116-119 (1999) 18-24. Ce matériau de formule (a) présente la particularité d'être amorphe.
Selon l'invention, la couche de matériau de formule (a) peut être déposée sur ladite surface du substrat à une épaisseur de 5 nm à 5 pm. En fait, on comprend aisément que l'épaisseur minimale est une épaisseur qui permet avantageusement de couvrir la, au moins une, surface du substrat, sans laisser de trous. L'épaisseur maximale n'est pas limitée, il est toutefois superflu d'utiliser des quantités trop importantes de matériau pour mettre en oeuvre la présente invention.
L'étape (c) de modification est réalisée par traitement localisé. Par localisé(e) , on entend dans la présente défini(e) . Dans cette étape, une zone définie, en épaisseur et en surface, de la couche de matériau de formule (a) est transformée en matériau de formule 03). La taille de la surface du matériau transformé est déterminée essentiellement par la surface du matériau exposée au rayonnement ultraviolet ou au plasma.
Le traitement ultraviolet ou le traitement plasma peut être tout traitement connu de l'homme du métier qui induit la transformation du matériau de formule (a) en matériau de formule 03). Le traitement est avantageusement réalisé par traitement de type irradiation lumineuse (par exemple UVO: ultraviolet-ozone - l'ozone est créé par les UV) ou par traitement de type plasma (par exemple plasma d'hélium, d'argon, corona, atmosphérique, SF6/02, CH3O2r etc.). Lorsque le traitement est une irradiation lumineuse, la longueur d'onde est généralement inférieure à 300 nm (seuil à partir duquel l'oxygène moléculaire peut être transformé en ozone) en particulier égale à 184,9 nm et 253,7 nm. Les ultraviolets peuvent être générés par tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple par une lampe à faible pression de vapeur de mercure pour le traitement en présence d'ozone. Le traitement ultraviolet peut être réalisé avantageusement en présence d'oxygène.
La durée de ce traitement est déterminée notamment par les conditions opératoires utilisées et par l'épaisseur de décomposition souhaitée. Pour des couches de matériaux (a) telles que celles précitées, une durée de traitement de 1 à 20 minutes suffit généralement.
La localisation en surface des zones où le matériau (a) est transformé peut être obtenue par exemple en positionnant un masque absorbant autour de ladite, au moins une, zone au cours du traitement. I1 peut s'agir d'un masque de type mécanique, par exemple sous forme de cache, ou simplement optique dans le cas d'un rayonnement ultraviolet, utilisé là où le matériau (a) ne doit pas être modifié. Ce masque possède par exemple une ou des ouverture(s) localisant la ou les zones de matériau (a) qui sera (seront) modifiée(s). On obtient ainsi avantageusement des zones localisées de matériau (R) sans utiliser de technique de photolithographie ou de micro- contact. Le masque peut être constitué d'un matériau choisi parmi un matériau métallique (inox, acier, etc.), du carbone, etc. Le procédé de l'invention consiste donc à déposer un matériau amorphe de type SiOXCy:H sur une surface d'un substrat, dont la composition 0,7 < x < 1,3 et 1,5 < y < 2 (ou le domaine de composition) est déterminée afin que, notamment, des espèces chimiques ou biologiques, par exemple des cellules vivantes, ne puissent pas adhérer à sa surface. Ce matériau est ensuite modifié localement pour obtenir un matériau de SiOXiCy1:H tel que 1,7 < xi < 2,5 et 0,1 < yl< 0,4 permettant l'adhésion des espèces chimiques et/ou biologiques. Cette nouvelle composition permet par exemple un développement normal de cellules vivantes et est utilisable pour les applications d'analyse biochimiques.
L'invention a ainsi pour objet de permettre la localisation d'espèces chimiques ou biologiques en favorisant leur adhésion sur des zones spécifiques de la surface d'un substrat. La localisation est en outre facilitée par une modification de l'énergie de surface, le matériau passant d'un caractère hydrophobe (matériau (a)) à hydrophile (matériau ((3)).
Selon l'invention, le matériau ((3) peut en outre être fonctionnalisé en vue de la fixation sur celui-ci d'une espèce chimique ou biologique. Aussi, la présente invention se rapporte également à un substrat selon l'invention, dans lequel le matériau de formule (f3) est ainsi fonctionnalisé. La fonctionnalisation est réalisée par tout moyen chimique connu de l'homme du métier en vue de pouvoir fixer des molécules sur une surface à base de silice. Il peut s'agir par exemple d'une fonctionnalisation destinée à former des groupes silanols, par exemple en vue de la fixation d'acides nucléiques. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier.
Selon l'invention, l'étape (d) peut être réalisée par exemple par immersion du substrat obtenu à l'étape (c) dans ladite solution de l'espèce chimique ou biologique, ou par dépôt sous forme de goutte de ladite solution de l'espèce biologique sur ladite zone localisée de matériau ((3) obtenue à l'étape(c). L'immersion est de préférence faite pendant une durée suffisante pour permettre l'adhésion des espèces chimiques ou biologiques, par exemple des cellules. Le dépôt sous forme de goutte peut être réalisé par exemple par les techniques connues de l'homme du métier pour disposer des gouttes d'une solution sur la surface d'un substrat, par exemple par micropipettage ou au moyen d'un appareil de type jet d'encre ( jet printing en anglais). La solution peut être toute solution appropriée pour contenir ladite espèce chimique. De préférence, elle n'est pas corrosive pour le substrat de la présente invention, en particulier pour les matériau (a) et (R). Il peut s'agir par exemple d'une solution aqueuse, par exemple aussi d'un liquide physiologique, d'une solution tampon, d'un tampon biologique, etc. Cette étape (d) peut être réalisée sans fonctionnalisation, directement sur le substrat de la présente invention. Elle peut aussi être réalisée après fonctionalisation.
Selon l'invention, lorsque l'espèce est biologique, elle peut être choisie par exemple dans le groupe constitué d'une cellule eucaryote, d'une cellule procaryote, d'une protéine, d'une glycoprotéine, d'une enzyme, d'un antigène, d'un anticorps, d'ADN, d'ARN, d'une hormone, d'un tissu vivant, d'un réseau protéique ou glycoprotéique.
Selon l'invention, lorsque l'espèce est chimique, il peut s'agir d'un polymère, par exemple organique.
Les inventeurs de la présente ont en effet remarqué de manière inattendue que les zones de matériau (R) sont très favorables à l'adhérence et à la croissance de cellules et les zones de matériau (a) 30 très défavorables à leur croissance. La présente invention permet donc de localiser l'adhésion de cellules vivantes.
L'ensemble des technologies de photolithographie et de gravure utilisé actuellement ne permet pas d'obtenir un tel comportement. En outre, sur les substrats obtenus par les techniques de l'art antérieur, les cellules adhèrent et se développent souvent indifféremment hors des zones définies par ces techniques. Ce n'est pas le cas dans la présente invention.
Le micromatriçage d'espèces biologiques sur une surface trouve un certain nombre d'applications comme par exemple les stratégies combinatoires de criblages, les détecteurs analytiques multiples et la possibilité de moduler les interactions cellule-substrat en dirigeant dans l'espace la croissance de cellules.
Le matriçage obtenu par le procédé de la présente invention est stable dans le temps et n'est pas sensible aux différents nettoyages chimiques. En outre, la technique utilisée dans la présente invention est peu sensible au vieillissement du substrat.
Le procédé de la présente invention permet avantageusement de traiter des plans non horizontaux et donc des substrats structurés par des microcanaux fluidiques par exemple.
La localisation de zones hydrophiles matérialisées par les zones localisées de matériau (0) permet de conférer en plus au substrat des propriétés fluidiques: elle permet une localisation de gouttes de liquide de culture dans les zones adhérentes aux molécules biologiques, remplissage ou définition de capillaires.
Le dépôt de molécules chimiques ou biologiques est aisé car les zones non adhérentes (matériau de 5 formule (a)) sont hydrophobes et celles adhérentes (matériau de formule ((3)) sont hydrophiles. Les solutions de l'espèce chimique ou biologique déposées sont donc très précisément localisées.
Il n'y a pas de lithographie ou de dépôt de composés de structuration de la surface, tels que des résines. Le film est continu et conforme à d'éventuelles structurations du substrat. Les propriétés d'adhérence peuvent ainsi être conférées à des surfaces non horizontales.
Le procédé de la présente invention peut s'appliquer sur de grandes surfaces, ce qui permet la fabrication collective de dispositifs. Le procédé de l'invention est en outre économiquement très rentable puisqu'il est très simple à réaliser.
Un autre avantage de la présente invention est que le matériau SiOxCy:H est transparent en fluorescence X. On peut donc par fluorescence X, par exemple au-dessous d'une lame de verre en tant que substrat, visualiser les cellules marquées ou pas.
La présente invention peut être utilisée par exemple pour la fabrication d'une biopuce ou d'un microsystème d'analyse chimique ou biochimique. La présente invention se rapporte donc également à un microsystème d'analyse chimique ou biochimique, ou à 30 une biopuce, comprenant un substrat selon l'invention.
En effet, une fois que les espèces chimiques ou 20 25 biologiques sont liées à la surface du substrat suivant la présente invention, elles peuvent être analysées suivant les procédés connus de l'homme du métier pour l'analyse et/ou la détection de molécules ou cellules à la surface d'un substrat, notamment dans le domaine des biopuces.
D'autres caractéristiques apparaîtront encore à la lecture des exemples qui suivent, donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
Brève description des figures
- Figure 1: représentation schématique d'un substrat texturés obtenu suivant le procédé de la 15 présente invention.
- Figure 2 représentation graphique du nombre de cellules en fonction du temps d'incubation pour trois échantillons différents, comprenant tous les trois une couche de matériau de formule (a) (précurseur OMCTS), et, chacun, différentes durées de modifications de zones localisées en matériau de formule (J3) par traitement ultraviolet + ozone (UVO). Sur cette figure, N = nombre de cellules comptées par ml (voir ≈E ci-dessous) .
Figure 3: représentation graphique de la comparaison du nombre de cellules après 96 heures de culture pour OMCTS/OMCTS UVO 10 minutes et polycarbonate/polycarbonate + UVO 10 minutes.
- Figure 4 ^ photographie montrant 30 l'adhérence localisée de cellules vivantes sur un substrat texturé selon l'invention.
EXEMPLES
A- préparation du substrat Le support qui a été utilisé pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention est une lame de verre.
La lame est débarrassée de ses poussières par un jet d'air comprimé.
B- dépôt d'une couche de matériau de formule (a) La lame est introduite dans un équipement PECVD pour réaliser un dépôt de SiO0.7Co.o5H0.25.
Les conditions de dépôt sont les suivantes: plasma à couplage capacitif OMCTSO (Aldrich, 98%) /He (99.999%). Puissance RF: 50 watt (0,1 watt/cm2, générateur de puissance advanced energy RF10S), pression: 0,2 mBar, débit OMCTS = 2,82x10-4 mole/min, He: 500 standard cm3, distance inter électrodes: 30 mm, température: ambiante.
Une couche de SiOo.7Co.o5Ho.25 de 50 nm a été déposée.
C- Modification de matériau de formule (a) en matériau de formule (a) par traitement ultraviolet + ozone Trois échantillons identiques sont traités de manières différentes. Les trois échantillons comprennent à leur surface une couche de matériau de formule (a) (précurseur OMCTS) déposée suivant le procédé décrit dans le paragraphe B. La modification localisée du matériau de formule (a) en matériau de formule ((3) a été réalisée 30 par traitement ultraviolet (UVO) (modification photochimique).
Dans cet exemple la modification localisée est réalisée par un appareil de nettoyage par UV-Ozone (UVO 5 Cleaner) modèle 342-220 fabriqué par Jelight Compagny (2 Mason, Irvine, CA92618 U.S.A.).
L'appareil fonctionne à l'air ambiant, c'est-à-dire à pression atmosphérique et température ambiante. Une lampe à faible pression de vapeur de mercure, en forme de grille, émettant un rayonnement ultraviolet large, entre autres des bandes dans l'UV profond à 184.9 nm et à 253.7 nm a été utilisée. La lampe a une puissance de 28 pW/cm2 à 6 mm.
La température augmente de quelques dizaines de degrés durant le traitement (jusqu'à 50-70 environ) pour une durée d'exposition élevée (supérieure à 20 min) mais n'altère pas, a priori, le processus. La lampe de l'appareil est mise à préchauffer 10 minutes pour obtenir une émission UV optimale.
Le substrat est placé dans un emplacement porte échantillons de l'appareil, à une distance de 5 mm à 1 cm environ de la lampe à mercure (comme conseillé dans le manuel de l'appareil).
Dans les différents essais réalisés, l'exposition est supérieure à 1 minute et peut durer plusieurs dizaines de minutes selon les conditions: si la surface est directement exposée aux UV, à travers un masque mécanique par exemple, l'exposition est de l'ordre de 1 à 10 minutes; en revanche, à travers un masque optique en quartz, par exemple de 2 mm d'épaisseur, qui absorbe une bonne quantité d'UV profonds: environ 50% de perte à 184.9 nm et 20% de perte à 253.7 nm, il faut une exposition de 30 minutes à 2 heures pour obtenir un effet équivalent (le problème est lié à la mauvaise transmittance du quartz dans l'UV profond).
La localisation de la zone irradiée est réalisée en utilisant un masque mécanique en acier. Le masque mécanique est maintenu plaqué sur la lame par un pincement sur les cotés, laissant accessible le motif (trous) aux UV.
Des durées de traitement de modification différentes, d'un échantillon à l'autre, ont été réalisées.
- échantillon 1: OMCTS + UVO 3 minutes - échantillon 2: OMCTS + UVO 5 minutes - échantillon 3: OMCTS + UVO 10 minutes Un échantillon témoin est également réalisé : OMCTS sans traitement de modification.
La figure 1 annexée est une représentation schématique d'un substrat texturé (1) obtenu suivant le procédé de la présente invention. Sur cette figure, la référence (S) indique le support de silicium, (a) indique le matériau de formule (a) (OMCTS), et (0) indique les zones où le matériau de formule (0) a été 25 formé par modification photochimique du matériau de type (a).
D- décomposition de matériau de formule (a) en matériau de formule (0) par traitement plasma He Un traitement par un plasma He permet d'obtenir des résultats équivalents voire légèrement meilleurs.
Dans ce cas le protocole est le suivant, à la place du protocole du paragraphe C ci-dessus: le masque mécanique est maintenu plaqué sur le substrat par un pincement sur les cotés, laissant accessible le motif (trous) au plasma. Le substrat est introduit dans l'équipement PECVD décrit précédemment puis est directement exposé au plasma.
Le traitement au plasma Hélium dure 1 minute, les conditions sont RF 200W, 0,2 mbar, 500 sccm He. 10 E- Mise en contact du matériau de formule 0) avec une espèce biologique Des cellules ovariennes de hamster (CHO) vivantes ont été mises en solution aqueuse à raison de 7x103 cellules/ml.
Les substrats des différents échantillons obtenus suivant les protocoles des paragraphes C et D ont été immergés dans la solution.
Les substrats texturés ainsi recouverts de gouttes de solution de cellules vivantes ont alors été incubés pendant 0, 24, 48, 72 et 96 heures à 37 C.
Le nombre de cellules adhérentes sur les zones précitées a été compté par comptage manuel soit directement sous le microscope, soit sur des clichés obtenus au microscope aux durées d'incubation 0, 24, 48, 72 et 96 heures, après lavage des échantillons par tampon physiologique.
La figure 2 annexée montre les résultats des mesures pour les différents échantillons ayant subi un 30 traitement de décomposition de 3, 5 et 10 minutes.
On remarque sur cette figure que la différence du nombre de cellules entre la zone de composition SiOXCyHZ et la zone de composition SiOX1CyiHZi est très importante (facteur 10) après 96 heures d'incubation.
Ces résultats montrent clairement la différence d'adhérence de cellules sur un substrat grâce au procédé de la présente invention.
Un étalement optimal des cellules (31}lm +/-17}lm) est obtenu avec 3 à 5 minutes de traitement UVO avec un masque mécanique. Avec un traitement plus long, les cellules s'étalent beaucoup moins. L'adhésion cellulaire est très sensible à la présence de charges et de liaisons hydrogène. Dans le cas des substrats OMCTS traités à l'UVO, le comportement optimal observé est obtenu pour des traitements de 3 à 7 minutes, c'est à dire lorsque la proportion de liaisons hydrogène est élevée parmi les interactions polaires. En dessous, les interactions polaires sont trop faibles pour faciliter l'adhésion.
Au-dessus de cette durée, le nombre de charges devient très important. Ces charges, a priori négatives, auront tendance à induire une répulsion électrostatique des cellules (chargées négativement à leur surface) qui s'oppose fortement à l'adhésion induite par les liaisons hydrogène.
La figure 4 est une photographie montrant l'adhérence localisée des cellules dans des zones de 480 pm de diamètre après 72 heures de culture et un simple lavage des cellules non adhérentes au tampon salin.
F- Comparatif La figure 3 annexée compare des résultats de comptage de cellules adhérentes sur la surface de quatre substrats différents: - unesurface obtenue à partir d'un support en polycarbonate traité suivant les protocoles décrits dans les paragraphes (B) et (E) (pas de traitement de modification) ci-dessus (OMTCS) ( AA pour art antérieur) ; - une surface obtenue à partir d'un support en polycarbonate traité suivant le procédé de l'invention décrit dans les paragraphes (B) à (E) ci-dessus (traitement de décomposition de 10 minutes) (OMTCS + UVO 10 minutes) (matériaux a et (3) ; - une surface de polycarbonate (PC) non traitée par le procédé de l'invention.
une surface de polycarbonate soumise uniquement au traitement de décomposition de 10 minutes (pas de couche de matériau (a))(PC+ UVO 10 minutes).
Le protocole du paragraphe D a été appliqué pour le dépôt de cellules vivantes CHO. Le comptage des cellules a été effectué après 96 heures d'incubation.
Le nombre de cellules avant et après traitement UV + ozone ne permet pas d'obtenir une différence de croissance de cellules très importante sur les surfaces en polycarbonate (résultats AA sur la figure 3) qui n'ont pas été traitées suivant le procédé de la présente invention.
En revanche, sur la surface traitée par le 30 procédé de l'invention, une nette différence d'adhérence apparaît entre les zones localisées traitées photochimiquement (matériau de formule (a)) et les zones non traitées (matériau de formule (R)).
Des résultats similaires sont obtenus avec un support en copolymère cyclooléfine (COC) ou en polystyrène acrylonitrile (SAN).
Sur les substrats traités plasma Hélium, les cellules se multiplient aussi vite mais s'étalent beaucoup plus que sur les substrats traités UVO. Les cellules ont un étalement chiffrable par leur diamètre moyen de 42 pm +/-15 pm sur les substrats traités plasma Hélium, contre 31 pm +/-17 pm sur un substrat traité UVO 3 minutes, et 20 pm +/-3 pm sur un substrat OMTCS sans traitement.
Claims (2)
- 22 REVENDICATIONS1. Substrat comprenant: - un matériau de formule (a) SiOXCY:H où 0,7 s x s 1,3 et 1,5 s y s 2; et un matériau de formule ((3) SiOx1Cyl:H où 1,7 s x1 s 2,5 et 0,1 s y1 s 0,4.2. Substrat selon la revendication 1, ledit 10 substrat comprenant en outre une espèce chimique ou biologique liée au matériau de formule ((3).3. Substrat selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le substrat est un substrat organique ou 15 inorganique.4. Substrat selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le substrat est constitué d'un matériau choisi dans le groupe comprenant du verre, de la silice, du polycarbonate, du polyméthylméthacrylate, , du polystyrène, du copolymère cyclooléfine, et du polystyrène acrylonitrile.5. Substrat selon la revendication 2, dans 25 lequel l'espèce étant biologique, elle est choisie dans le groupe constitué d'une cellule eucaryote, d'une cellule procaryote, d'une protéine, d'une glycoprotéines, d'une enzyme, d'un antigène, d'un anticorps, d'ADN, d'ARN, d'une hormone, d'un tissu 30 vivant, d'un réseau protéique ou glycoprotéique.É 2872911 23 6. Substrat selon la revendication 1 ou 2, dans lequel au moins une des surfaces du substrat comprend à la fois le matériau de formule (a) et le matériau de formule (13).7. Substrat selon la revendication 6, dans lequel ladite, au moins une, surface du substrat est une surface structurée et/ou une surface comportant des fonctions électriques.8. Substrat selon la revendication 1 ou 6, dans lequel le matériau de formule ([3) est fonctionnalisé pour la fixation sur celui-ci d'une espèce chimique ou biologique.9. Microsystème d'analyse chimique ou biochimique comprenant un substrat selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.10. Biopuce comprenant un substrat selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.11. Procédé de localisation d'une espèce chimique ou biologique sur un substrat comprenant les 25 étapes suivantes: (a) fournir un substrat; (b) déposer sur au moins une surface du substrat une couche d'un matériau de formule (a) SiO,Cy:H où 0,7 s x s 1,3 et 1,5 s y s 2; (c) modifier par traitement ultraviolet ou plasma au moins une zone localisée de la couche de matériau de formule (a) déposée à l'étape (b) en un matériau de formule (R) SiOXiCy1:H où 1,7 s xl s 2,5 et 0,1 s yl s 0,4; et (d) mettre en contact lesdites zones localisées du matériau de formule (a) avec une solution de l'espèce chimique ou biologique.12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel le substrat est un substrat organique ou 10 inorganique.13. Procédé selon la revendication 11, dans lequel le substrat est constitué d'un matériau choisi dans le groupe comprenant du verre, de la silice, du polycarbonate, du polyméthylméthacrylate, du polystyrène, du copolymère cyclooléfine, et du polystyrène acrylonitrile.14. Procédé selon la revendication 11, dans lequel la couche de matériau de formule (a) est déposée sur ladite surface du substrat par dépôt chimique en phase vapeur assisté par plasma d'un polysiloxane.15. Procédé selon la revendication 13, dans lequel le polysiloxane est l'hexaméthyldisiloxane ou l' octaméthylcyclotétrasiloxane, le tétraméthylcyclotétrasiloxane.16. Procédé selon la revendication 14, dans 30 lequel la couche de matériau de formule (a) est déposée 2872911 25 sur ladite surface du substrat à une épaisseur de 5 nm à 5 pm.17. Procédé selon la revendication 11, dans lequel la zone localisée est définie en positionnant un masque absorbant autour de ladite, au moins une, zone au cours du traitement photochimique.18. Procédé selon la revendication 11, dans 10 lequel le traitement ultraviolet est réalisé en présence d'oxygène.19. Procédé selon la revendication 11, dans lequel l'étape (d) est réalisée par immersion du substrat obtenu à l'étape (c) dans ladite solution de l'espèce biologique.20. Procédé selon la revendication 11, dans lequel l'étape (d) est réalisée par dépôt sous forme de goutte de ladite solution de l'espèce biologique sur ladite zone localisée de matériau ([3) obtenue à l' étape (c) . 21. Procédé selon la revendication 11, dans lequel l'espèce étant biologique, elle est choisie dans le groupe constitué d'une cellule eucaryote, d'une cellule procaryote, d'une protéine, d'une glycoprotéines, d'une enzyme, d'un antigène, d'un anticorps, d'ADN, d'ARN, d'une hormone, d'un tissu vivant, d'un réseau protéique ou glycoprotéique.
- 2872911 26 22. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 21 pour la fabrication d'une biopuce ou d'un microsystème d'analyse chimique ou biochimique.
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