FR2867565A1 - To identify contaminants and genetically modified matter, in agricultural foodstuffs, a solution of the proteins is electrophoresed and analyzed by mass spectrometry to give individual peptide mass fingerprints - Google Patents
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Abstract
Description
L'invention a pour objet un procédé d'identification de contaminantsThe subject of the invention is a method for identifying contaminants
biologiques naturels ou génétiquement modifiés susceptibles d'être présents dans des matières premières alimentaires par extraction et mise en solution de l'ensemble des protéines présentes dans l'échantillon, séparation desdites protéines de la solution natural or genetically modified biology likely to be present in food raw materials by extraction and dissolution of all the proteins present in the sample, separation of said proteins from the solution
par électrophorèse bidimensionnelle, localisation desdits contaminants, digestion par une enzyme protéolytique, et détermination de la masse moléculaire des peptides obtenus par spectrométrie de masse. L'invention a également pour objet un procédé d'établissement d'une banque de données constituée d'un ensemble d'empreintes de masses peptidiques. by two-dimensional electrophoresis, localization of said contaminants, digestion with a proteolytic enzyme, and determination of the molecular mass of the peptides obtained by mass spectrometry. The invention also relates to a method of establishing a database consisting of a set of peptide mass fingerprints.
La demande sociétale est très forte en matière de sécurité alimentaire. Il est réclamé aux agro-industriels, d'une part, et à l'État, de l'autre, de garantir la mise sur le marché de produits alimentaires exempts de risques pour le consommateur. The societal demand is very strong in terms of food security. Agribusinesses on the one hand, and the State on the other hand, are asked to guarantee the placing on the market of food products that are safe for the consumer.
Ces risques sont de deux ordres, toxicologique et biologique. Le premier peut résulter de la présence dans l'aliment (ou dans les matières premières qui ont servi à sa fabrication) d'organismes vivants producteurs de toxines. Le second est directement lié à la présence d'organismes ou de molécules issues de ces derniers, réputés néfastes à la santé du consommateur. These risks are twofold, toxicological and biological. The first may result from the presence in the food (or in the raw materials used in its manufacture) of living organisms producing toxins. The second is directly related to the presence of organisms or molecules from these, deemed harmful to the health of the consumer.
La contamination des matières premières d'origine biologique par un microorganisme implique la présence de protéines exogènes codées par des gènes étrangers; il peut en être de même si le génome a été modifié par insertion d'un gène étranger, ce qui est le cas des organismes génétiquement modifiés (OGM). The contamination of raw materials of biological origin by a microorganism implies the presence of exogenous proteins encoded by foreign genes; it may be the same if the genome has been modified by insertion of a foreign gene, which is the case of genetically modified organisms (GMOs).
Dans tous les cas, la contamination se traduit par une modification de la nature et de l'abondance d'une partie des protéines exprimées (c'est à dire du protéome) de cet organisme. Cette modification du protéome est révélée par la présence d'une ou plusieurs protéines codées par les gènes de l'organisme contaminant ou par les gènes insérés dans le ou les tissus où ils s'expriment. In all cases, the contamination results in a change in the nature and abundance of some of the proteins expressed (ie the proteome) of this organism. This modification of the proteome is revealed by the presence of one or more proteins coded by the genes of the contaminating organism or by the genes inserted into the tissue or tissues in which they are expressed.
L'approche protéomique qui vise à identifier et à quantifier l'ensemble des protéines présentes dans un matériau biologique, ou analyse protéomique différentielle et empreinte de masse peptidique (APDEMP), est une méthode innovante de révélation et d'identification de contaminants biologiques dans les matières premières et les produits agro-alimentaires. The proteomic approach, which aims to identify and quantify all the proteins present in a biological material, or differential proteomic analysis and peptide mass fingerprinting (APDEMP), is an innovative method for the identification and identification of biological contaminants in biological materials. raw materials and agri-food products.
Cette méthode de portée générale ne repose sur aucun présupposé quant à l'origine et la nature des contaminants, contrairement aux techniques immunochimiques ou celles fondées sur l'emploi de sondes d'oligonucléotides qui impliquent de disposer d'anticorps ou de sondes conçus et obtenus pour identifier individuellement chacun des contaminants potentiels, préalablement attendus. This general method does not presuppose the origin and nature of contaminants, unlike immunochemical techniques or those based on the use of oligonucleotide probes that involve having antibodies or probes designed and obtained. to individually identify each of the potential contaminants, previously expected.
Elle permet notamment de mettre en évidence la présence d'organismes génétiquement modifiés (OGM). It makes it possible to highlight the presence of genetically modified organisms (GMOs).
Il convient de souligner que, même si les protéines ont été dégradées (protéolyse) au cours des processus de transformation et de conservation, la méthode APDEMP permet de révéler la présence d'une protéine étrangère à travers la mise en évidence de ses fragments. It should be emphasized that, even if the proteins have been degraded (proteolysis) during the transformation and preservation processes, the APDEMP method makes it possible to reveal the presence of a foreign protein by revealing its fragments.
Ainsi, selon un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé d'identification d'au moins un contaminant biologique susceptible d'être présent dans une matière première agro-alimentaire comprenant les étapes consistant à : a) Extraire et mettre en solution l'ensemble des protéines présentes dans la matière première agro-alimentaire à tester, b) Séparer l'ensemble des protéines présentes dans la solution obtenue à l'étape a), c) Caractériser les protéines séparées selon un profil et comparer ce profil avec le profil d'un échantillon témoin en vue de localiser, le cas échéant, le contaminant biologique, d) Récupérer ledit contaminant biologique et le cliver au moyen d'une ou plusieurs enzymes protéolytiques, e) Déterminer l'empreinte de masse peptidique du contaminant biologique, ladite empreinte correspondant à la masse moléculaire des peptides obtenus à l'étape d) par spectrométrie de masse MALDI-TOF (ionisation/désorption par tir laser assisté par matrice et mesure par temps de vol) ou par spectrométrie de masse en tandem dite MS/MS, de type quadrupôle-quadrupôle, quadrupôle-temps de vol (ou Q-TOF pour quadrupole- time-of-flying ), ou temps de vol temps de vol (TOFTOF). Thus, according to a first aspect, the subject of the invention is a method of identifying at least one biological contaminant likely to be present in an agro-food raw material comprising the steps of: a) Extracting and dissolving all the proteins present in the agro-food raw material to be tested, b) Separate all the proteins present in the solution obtained in step a), c) Characterize the proteins separated according to a profile and compare this profile with the profile of a control sample to locate, where appropriate, the biological contaminant, d) recover the biological contaminant and cleave it with one or more proteolytic enzymes, e) Determine the contaminant peptide mass footprint biological, said fingerprint corresponding to the molecular mass of the peptides obtained in step d) by MALDI-TOF mass spectrometry (laser assisted ionization / desorption) by matrix and time-of-flight measurement) or by MS / MS tandem mass spectrometry, of the quadrupole-quadrupole, quadrupole-flight-time (or Q-TOF for quadrupole-time-of-flying) type, or time of flight. flight time of flight (TOFTOF).
f) Comparer cette empreinte à celle obtenue, expérimentalement ou in silico dans les bases de données de séquences, pour une protéine connue et identifier, le cas échéant, le contaminant biologique comme étant identique ou similaire à celui d'une protéine connue lorsque son empreinte est identique ou similaire à celle de ladite protéine connue. f) Compare this fingerprint to that obtained, experimentally or in silico in the sequence databases, for a known protein and identify, where appropriate, the biological contaminant as being identical or similar to that of a known protein when its fingerprint is identical or similar to that of said known protein.
Dans la présente demande, l'expression méthode d < analyse protéomique différentielle et d'empreinte de masse peptidique ou méthode APDEMP sera également utilisée pour désigner le procédé d'identification d'au moins un contaminant biologique selon l'invention. In the present application, the expression differential proteomic analysis and peptide mass imprint or APDEMP method will also be used to designate the method for identifying at least one biological contaminant according to the invention.
Les expressions contaminant biologique ou protéine exogène sont utilisées de manière indifférente dans la présente demande pour désigner un peptide, un polypeptide ou encore une protéine, susceptible d'être présent dans une matière première agro-alimentaire. 15 The terms biological contaminant or exogenous protein are used indifferently in the present application to designate a peptide, a polypeptide or a protein, which may be present in an agro-food raw material. 15
Le contaminant biologique susceptible d'être présent dans une matière première agro-alimentaire que l'on cherche à identifier selon le procédé de l'invention peut être de tout type. The biological contaminant likely to be present in an agro-food raw material that is to be identified according to the method of the invention may be of any type.
Ce peut être une toxine ou toute autre protéine produite par ou présente à la surface d'un organisme vivant présent de manière non souhaitée dans l'aliment (ou dans les matières premières qui ont servi à sa fabrication). It may be a toxin or any other protein produced by or present on the surface of a living organism undesirably present in the food (or in the raw materials used in its manufacture).
On peut citer comme exemple de contaminant biologique susceptible d'être présent dans une matière première agro-alimentaire les protéines issues d'organismes génétiquement modifiés (OGM) tels que des plantes génétiquement modifiées: dans la mesure où une protéine transgénique est exprimée dans le tissu biologique constituant tout ou partie de la matière première agro-alimentaire, sa présence peut être révélée, voire quantifiée, par la méthode APDEMP. Examples of biological contaminants that may be present in an agro-food raw material include proteins derived from genetically modified organisms (GMOs) such as genetically modified plants: insofar as a transgenic protein is expressed in the tissue biological component constituting all or part of the agro-food raw material, its presence can be revealed, even quantified, by the APDEMP method.
On peut également citer les protéines naturelles de l'organisme génétiquement modifié (OGM) sur- et/ou sous-exprimés sous l'effet de la transgénèse. Dans ce cas, le procédé d'identification du contaminant biologique, en l'occurrence l'OGM, se fait de manière indirecte. En effet, la modification génétique n'a pas toujours comme objectif de produire une protéine en quantité, elle permet aussi de conférer des propriétés nouvelles à l'organisme transformé qui sont fondées sur des modifications de son métabolisme, notamment pour résister aux stress environnementaux d'ordre climatique ou pathologique. Mention may also be made of the natural proteins of the genetically modified organism (GMO) that are over- and / or under-expressed by transgenesis. In this case, the method of identification of the biological contaminant, in this case the GMO, is done indirectly. In fact, the genetic modification does not always have the objective of producing a protein in quantity, it also makes it possible to confer new properties on the transformed organism which are based on modifications of its metabolism, in particular to resist the environmental stresses of climatic or pathological order.
Il est par exemple possible de faire acquérir à une plante une résistance nouvelle à des insectes, des nématodes ou des pathogènes (champignons, virus, bactéries). Les nouvelles voies métaboliques mises alors en jeu, qui modifient les réponses physiologiques de l'organisme, se traduisent par une diminution ou une augmentation du taux de certaines protéines naturelles. La méthode d'analyse protéomique différentielle et d'empreinte de masse peptidique peut alors éventuellement permettre de quantifier et de visualiser les effets de la transgenèse sur la sur- et/ou sous-expression du génome codant les protéines naturelles de l'organisme génétiquement modifié. For example, it is possible to have a plant acquire new resistance to insects, nematodes or pathogens (fungi, viruses, bacteria). The new metabolic pathways put into play, which modify the physiological responses of the body, result in a decrease or increase in the rate of certain natural proteins. The differential proteomic analysis and peptide mass fingerprinting method can then be used to quantify and visualize the effects of transgenesis on the over- and / or under-expression of the genome encoding the natural proteins of the genetically modified organism. .
On peut encore citer comme exemple de contaminant biologique susceptible d'être identifié de manière indirecte par le procédé d'identification selon l'invention, une protéine naturelle sur- et/ou sous-exprimée, ladite sur- et/ou sous-expression étant révélatrice non pas d'une transgénèse, mais d'une altération métabolique dérivée de la présence d'un agent (phyto)pathogène dans la matière première agro-alimentaire. Another example of a biological contaminant that can be indirectly identified by the identification method according to the invention is a natural protein that is over- and / or under-expressed, said over- and / or under-expression being revealing not a transgenesis, but a metabolic alteration derived from the presence of a pathogenic agent (phyto) in the agro-food raw material.
Si la contamination biologique s'est produite sur l'organisme vivant (parasitisme, pathogénie), son métabolisme est détourné vers les voies de défense. Il y a alors expression de gènes jusqu'alors silencieux, qui vont donner naissance à des protéines nouvelles. C'est notamment le cas des protéines de pathogénicité des végétaux (protéines PR) qui sont abondamment synthétisées, quel que soit le type d'agression à laquelle la plante est soumise (bactérienne, mycologique, virale). If the biological contamination has occurred on the living organism (parasitism, pathogenesis), its metabolism is diverted towards the ways of defense. There is then expression of previously silent genes, which will give rise to new proteins. This is particularly the case of plant pathogenicity proteins (PR proteins) that are abundantly synthesized, regardless of the type of attack to which the plant is subjected (bacterial, mycological, viral).
Dans ces conditions, le procédé d'identification d'au moins un contaminant biologique selon l'invention permet de corroborer la présence de protéines exogènes, et, en plus, de préciser si la contamination a eu lieu avant ou après récolte, élément de traçabilité important. Under these conditions, the method for identifying at least one biological contaminant according to the invention makes it possible to corroborate the presence of exogenous proteins, and, in addition, to specify whether the contamination occurred before or after harvesting, a traceability element. important.
On entend désigner par l'expression matière première agro-alimentaire dans la présente demande tout produit comestible destiné à l'alimentation humaine ou animale. Ce produit peut être en début ou en cours d'élaboration, ou peut être un aliment ou l'un des composants d'un aliment. By the term "agri-food raw material" is meant in the present application any edible product intended for human or animal consumption. This product may be in the beginning or under development, or may be a food or one of the components of a food.
Ainsi, selon un mode préféré de réalisation, le procédé d'identification d'au moins un contaminant biologique selon l'invention permet de suivre la composition de la matière première agro-alimentaire tout au long de sa chaîne de transformation. Thus, according to a preferred embodiment, the method for identifying at least one biological contaminant according to the invention makes it possible to follow the composition of the agro-food raw material throughout its transformation chain.
En effet, l'empreinte de masse peptidique est représentative de la qualité d'un produit agro-alimentaire et en garantit la traçabilité. Outre la détection d'éventuelles protéines incriminables, elle assure une stabilité dans la composition du produit. La traçabilité lot à lot peut ainsi être assurée par l'analyse et le rapprochement d'images d'analyses protéomiques électrophorétiques (ou chromatographiques). En cas d'anomalie, il est possible de repérer et d'identifier la ou les protéines inhabituelles. Ceci permet de suivre l'évolution du produit lot par lot et assure une traçabilité de la matière première (par exemple: farines animales, farines végétales, viandes...). In fact, the peptide mass footprint is representative of the quality of an agro-food product and guarantees its traceability. In addition to detecting any incriminating proteins, it provides stability in the composition of the product. Lot-to-batch traceability can thus be ensured by the analysis and comparison of images of electrophoretic (or chromatographic) proteomic analyzes. In case of anomaly, it is possible to identify and identify the unusual protein (s). This makes it possible to follow the evolution of the product batch by batch and ensures a traceability of the raw material (for example: animal meal, vegetable meal, meat ...).
La méthode d'extraction et de mise en solution réalisée à l'étape a) du procédé d'identification selon l'invention est une technique bien connue de l'homme du métier, qui saura la mettre en oeuvre de manière appropriée. The extraction and dissolution method carried out in step a) of the identification method according to the invention is a technique well known to those skilled in the art, which will know how to implement it appropriately.
Dans le procédé d'identification selon l'invention, l'étape b) de séparation des protéines présentes dans la solution peut être réalisée selon toute méthode appropriée par ailleurs bien connue de l'homme de l'art. Notamment, on pourra se référer à l'ouvrage Current Protocols in Molecular Biology , Ausubel et al., publié par J. Wiley & Sons, NY (1992) . In the identification method according to the invention, step b) of separation of the proteins present in the solution can be carried out according to any suitable method otherwise well known to those skilled in the art. In particular, reference may be made to Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Published by J. Wiley & Sons, NY (1992).
Selon un autre mode de réalisation préférée, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape b) de séparation des protéines en solution est effectuée par électrophorèse bi-dimensionnelle ou par chromatographie liquide haute performance (HPLC) ou capillaire, notamment multi-dimensionnelle. According to another preferred embodiment, the identification method according to the invention is characterized in that the step b) of separation of the proteins in solution is carried out by two-dimensional electrophoresis or by high performance liquid chromatography (HPLC) or capillary, especially multi-dimensional.
Ainsi, on obtiendra un profil après l'étape b) de séparation des protéines, tel qu'un profil électrophorétique ou un profil chromatographique. Thus, a profile will be obtained after the protein separation step b), such as an electrophoretic profile or a chromatographic profile.
De manière préférée, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que, lorsque l'étape b) de séparation des protéines en solution est effectuée par électrophorèse bi-dimensionnelle, le contaminant biologique caractérisé à l'étape c) est récupéré à l'étape d) par excision du spot protéique obtenu sur le profil électrophorétique. In a preferred manner, the identification process according to the invention is characterized in that, when the step b) of separation of the proteins in solution is carried out by two-dimensional electrophoresis, the biological contaminant characterized in step c) is recovered in step d) by excision of the protein spot obtained on the electrophoretic profile.
De préférence, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape f) de comparaison est réalisée par rapport à un ensemble de protéines connues répertoriées dans des banques de données spécifiques de chaque type de matière première agro-alimentaire, notamment d'une matière première agro-alimentaire susceptible de contenir un ou plusieurs organismes génétiquement modifiés. Preferably, the identification method according to the invention is characterized in that the comparison step f) is performed with respect to a set of known proteins listed in specific databanks of each type of agro-food raw material. , including an agro-food raw material that may contain one or more genetically modified organisms.
Par exemple, le procédé d'identification selon l'invention vise à détecter un contaminant sélectionné dans le groupe suivant: - Toxine cryl Ab [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki] ; adresse dans Swiss-Prot:P06578. For example, the identification method according to the invention aims to detect a contaminant selected from the following group: Cr-Ab toxin [Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki]; address in Swiss-Prot: P06578.
- Toxine crylAC [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki; adresse dans Swiss-Prot] :P05068. - CrylAC toxin [gene of Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki; address in Swiss-Prot]: P05068.
- Toxine crylF [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Aizawai] ; adresse dans Swiss-Prot: Q03746. CrylF toxin [Bacillus thuringiensis ssp. Aizawai]; address in Swiss-Prot: Q03746.
- Toxine cry3Bb1 [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Kumamotoensis] ; adresse dans Swiss-Prot: Q06117. Cry3Bb1 toxin [Bacillus thuringiensis ssp. Kumamotoensis]; address in Swiss-Prot: Q06117.
- Toxine cry9C [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Tolworthi] ; adresse dans Swiss-Prot: Q45733. Cry9C toxin [Bacillus thuringiensis ssp. Tolworthi]; address in Swiss-Prot: Q45733.
- Adénine méthylase [gène d'Escherichia coli] ; adresse dans Swiss-Prot: P21311. Adenine methylase [Escherichia coli gene]; address in Swiss-Prot: P21311.
- Ribonucléase Barnase [gène de Bacillus amyloliquefaciens] ; adresse dans Swiss-Prot: P00648. - Barnase ribonuclease [Bacillus amyloliquefaciens gene]; address in Swiss-Prot: P00648.
- Phosphinothricine acétyltransférase (PAT) [gène de Streptomyces viridochromogene] ; adresse dans Swiss-Prot: Q57146. Phosphinothricin acetyltransferase (PAT) [Streptomyces viridochromogene gene]; address in Swiss-Prot: Q57146.
- Phosphinothricine acétyltransférase (PAT) [gène de Streptomyces hygroscopicus] ; adresse dans Swiss-Prot: P16426. - Phosphinothricin acetyltransferase (PAT) [Streptomyces hygroscopicus gene]; address in Swiss-Prot: P16426.
- 5-énolpyruvyle shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) [gène d'Agrobacterium tumefaciens souche CP4] ; adresse dans Swiss-Prot: Q9R4E4. - 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) [Agrobacterium tumefaciens strain strain CP4]; address in Swiss-Prot: Q9R4E4.
Ce groupe est extensible aux protéines introduites dans de nouveaux OGM dont la culture sera légalement autorisée. This group is extensible to proteins introduced into new GMOs whose cultivation will be legally authorized.
Selon encore un autre mode de réalisation, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que l'empreinte de masse peptidique de la protéine connue est obtenue après clivage protéolytique in silico de ladite protéine connue. According to yet another embodiment, the identification method according to the invention is characterized in that the peptide mass fingerprint of the known protein is obtained after proteolytic cleavage in silico of said known protein.
L' expression empreinte de masse peptidique de chaque spot correspond à un ensemble de masses moléculaires de peptides résultant d'une digestion protéolytique à l'aide d'une ou plusieurs protéases telles que par exemple la trypsine. The expression peptide mass fingerprint of each spot corresponds to a set of molecular masses of peptides resulting from proteolytic digestion using one or more proteases such as, for example, trypsin.
De préférence, dans le procédé d'identification selon l'invention, lorsque la matière première à tester est une farine végétale, l'étape a) d'extraction des protéines présentes dans la farine végétale comprend la délipidation de ladite farine. Preferably, in the identification method according to the invention, when the raw material to be tested is a vegetable meal, step a) of extracting the proteins present in the vegetable meal comprises the delipidation of said flour.
Selon encore un autre mode de réalisation préféré, le procédé d'identification d'au moins un contaminant biologique selon l'invention permet la mise au point d'anticorps nouveaux pour faire de la recherche systématique de contaminants par immunochimie. According to yet another preferred embodiment, the method for identifying at least one biological contaminant according to the invention makes it possible to develop new antibodies to carry out routine investigations of contaminants by immunochemistry.
Les techniques d'immunochimie sont bien connues de l'homme de l'art, et sont notamment décrites dans Current Protocols in Molecular Biology , Ausubel et al., publié par J. Wiley & Sons, NY (1992). Immunochemistry techniques are well known to those skilled in the art, and are especially described in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Published by J. Wiley & Sons, NY (1992).
Selon un deuxième aspect, l'invention a pour objet l'utilisation du procédé d'identification selon l'invention pour caractériser la présence d'un contaminant biologique dans une matière première agro-alimentaire. According to a second aspect, the subject of the invention is the use of the identification method according to the invention for characterizing the presence of a biological contaminant in an agro-food raw material.
De préférence, l'utilisation du procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que ledit contaminant est une protéine issue d'un organisme génétiquement modifié. Preferably, the use of the identification method according to the invention is characterized in that said contaminant is a protein derived from a genetically modified organism.
Selon encore un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé d'établissement d'une banque de données constituée d'un ensemble d'empreintes de masse peptidique correspondant à une matière première agro-alimentaire, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Extraire et mettre en solution l'ensemble des protéines présentes dans la matière première agro-alimentaire à tester, b) Séparer l'ensemble des protéines présentes dans la solution obtenue à l'étape a), c) Caractériser les protéines séparées selon un profil, d) Récupérer chaque protéine séparée et cliver chacune de ces protéines au moyen d'une ou plusieurs enzymes protéolytiques, e) Déterminer l'empreinte de masse peptidique de chaque protéine, ladite empreinte correspondant à la masse moléculaire des peptides obtenus à l'étape d) par spectrométrie de masse MALDI-TOF (ionisation/désorption par tir laser assisté par matrice et mesure par temps de vol) ou par spectrométrie de masse en tandem dite MS/MS, de type quadrupôle-quadrupôle, quadrupôle-temps de vol (ou Q-TOF pour quadrupoletime-of-flying ), ou temps de vol temps de vol (TOF- TOF). According to yet another aspect, the subject of the invention is a method for establishing a database consisting of a set of peptide mass fingerprints corresponding to an agro-food raw material, characterized in that it comprises the following steps: a) extracting and dissolving all the proteins present in the agro-food raw material to be tested, b) separating all the proteins present in the solution obtained in step a), c) characterizing the proteins separated according to a profile, d) recovering each separated protein and cleaving each of these proteins by means of one or more proteolytic enzymes, e) Determining the peptide mass footprint of each protein, said fingerprint corresponding to the molecular weight of the proteins. peptides obtained in step d) by MALDI-TOF mass spectrometry (matrix assisted laser ionization / desorption and time-of-flight measurement) or by spectrometry of MS / MS tandem mass, quadrupole-quadrupole type, quadrupole-flight time (or Q-TOF for quadruple-of-flying), or flight time flight time (TOF-TOF).
f) Répertorier chaque empreinte correspondant à chaque protéine dans une 30 banque de données, g) Optionnellement, réitérer les étapes précédentes en vue de compléter la banque de données. f) List each fingerprint corresponding to each protein in a database, g) Optionally, repeat the previous steps to complete the database.
Les étapes mises en oeuvre dans ce procédé d'établissement d'une banque de données correspondent à celles du procédé d'identification selon l'invention. The steps implemented in this method of establishing a database correspond to those of the identification method according to the invention.
De préférence, le procédé d'établissement d'une banque de données selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape b) de séparation des protéines en solution est effectuée par électrophorèse bi-dimensionnelle ou par chromatographie liquide haute performance (HPLC) ou capillaire, notamment multi-dimensionnelle. Preferably, the method for establishing a data bank according to the invention is characterized in that step b) of separation of the proteins in solution is carried out by two-dimensional electrophoresis or by high performance liquid chromatography (HPLC) or capillary, especially multi-dimensional.
De manière encore préférée, le procédé d'établissement d'une banque de données selon l'invention est caractérisé en ce que, lorsque l'étape b) de séparation des protéines en solution est effectuée par électrophorèse bi-dimensionnelle, les protéines séparées caractérisées à l'étape c) sont récupérées à l'étape d) par excision du spot protéique obtenu sur le profil électrophorétique. More preferably, the method for establishing a database according to the invention is characterized in that, when the step b) of separation of the proteins in solution is carried out by two-dimensional electrophoresis, the separated proteins characterized in step c) are recovered in step d) by excision of the protein spot obtained on the electrophoretic profile.
Selon un autre mode de réalisation le procédé d'établissement d'une banque de données selon l'invention est caractérisé en ce que le clivage protéolytique de l'étape d) est réalisé in silico pour au moins l'un des spots du profil électrophorétique. According to another embodiment, the method for establishing a data bank according to the invention is characterized in that the proteolytic cleavage of step d) is carried out in silico for at least one of the spots of the electrophoretic profile. .
De préférence, dans le procédé d'établissement d'une banque de données selon l'invention, lorsque la matière première à tester est une farine végétale, l'étape a) d'extraction des protéines présentes dans la farine végétale comprend la délipidation de ladite farine. Preferably, in the method of establishing a database according to the invention, when the raw material to be tested is a vegetable meal, step a) of extracting the proteins present in the vegetable meal comprises the delipidation of said flour.
De manière encore préférée, le procédé d'établissement d'une banque de données selon la présente invention est caractérisé en ce que, lorsque la matière première agro-alimentaire est susceptible de contenir un organisme génétiquement modifié, la banque de données est complétée par les empreintes de masse peptidique de protéines issues d'organismes génétiquement modifiés. More preferably, the method of establishing a database according to the present invention is characterized in that, when the agro-food raw material is capable of containing a genetically modified organism, the database is completed by the peptide mass fingerprints of proteins from genetically modified organisms.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation de la banque de données établie selon le procédé d'établissement d'une banque de données selon l'invention pour identifier au moins un contaminant biologique susceptible d'être présent dans une matière première agroalimentaire. According to another aspect, the subject of the invention is the use of the data bank established according to the method of establishing a database according to the invention for identifying at least one biological contaminant likely to be present in a agro-food raw material.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinées à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. The legends of the figures and examples which follow are intended to illustrate the invention without in any way limiting its scope.
LEGENDES DES FIGURESLEGENDS OF FIGURES
Figure 1: Vue schématique d'une électrophorèse bidimensionnelle comparative révélant des protéines contaminantes; Figure 2: Electrophorèse bidimensionnelle des protéines hydrosolubles des lots 1 et 2; Figure 3: Analyse du spot D83-02; Figure 4: Analyse du spot D86-02; Figure 5: Analyse du spot D86-04; Figure 6: Electrophorèse bidimensionnelle des protéines hydrosolubles du lot 2; duplication expérimentale (les spots d'intérêt sont encerclés) ; Figure 7: Analyse du spot D63-02; Figure 8: Electrophorèse bidimensionnelle des protéines hydrosolubles des lots 3 et 4 en gel à 9 % d'acrylamide (les spots encerclés indiquent les protéines OGM) ; Figure 9: Analyse du spot 98-06; Figure 10:Analyse du spot 81-04. Figure 1: Schematic view of comparative two-dimensional electrophoresis revealing contaminating proteins; Figure 2: Two-dimensional electrophoresis of the water-soluble proteins of lots 1 and 2; Figure 3: Spot analysis D83-02; Figure 4: Spot analysis D86-02; Figure 5: Spot analysis D86-04; Figure 6: Two-dimensional electrophoresis of the water-soluble proteins of Lot 2; experimental duplication (the spots of interest are circled); Figure 7: Spot analysis D63-02; Figure 8: Two-dimensional electrophoresis of the water-soluble proteins of lots 3 and 4 in 9% acrylamide gel (circled spots indicate GMO proteins); Figure 9: Spot analysis 98-06; Figure 10: Spot analysis 81-04.
EXEMPLESEXAMPLES
La comparaison de deux lots de farine de maïs de même variété, mais ayant subi des conditions de conservation différentes illustre une application de la méthode APDEMP à la révélation de parasites biologiques. La comparaison de deux lots de farine de maïs, de même variété originelle mais dont l'un est une variété génétiquement modifiée, montre comment la méthode APDEMP peut révéler un OGM. The comparison of two batches of corn flour of the same variety, but with different storage conditions, illustrates an application of the APDEMP method to the detection of biological parasites. The comparison of two batches of corn flour, of the same original variety but one of which is a genetically modified variety, shows how the APDEMP method can reveal a GMO.
EXEMPLE 1 - MATERIELS ET METHODES 1.1 Origine des lots de farine de maïs Pour la première expérience, il s'agit de farines de maïs de même variété ayant été conservées de manières différentes. EXAMPLE 1 - MATERIALS AND METHODS 1.1 Origin of batches of maize flour For the first experiment, it is maize meal of the same variety having been preserved in different ways.
La deuxième expérience a été réalisée avec des farines de maïs de l'Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM) de la Commission Européenne (Joint Research Center, Geel Belgique) : référence IRMM 413-0 (lot témoin contenant moins de 0,02% d'OGM) et référence IRMM 413-5 (lot OGM contenant 5% d'OGM). Le maïs génétiquement modifié est la variété MON 810 (Origine: Monsanto) dans lequel a été introduit le gène de la protéine Cryl Ab issu du génome de la bactérie Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki HD-1. La modification génétique confère au maïs une résistance aux attaques de pyrale. The second experiment was conducted with maize flours from the European Commission's Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM) (Joint Research Center, Geel Belgium): reference IRMM 413-0 (control lot containing less than 0.02 % GMO) and reference IRMM 413-5 (GMO batch containing 5% GMO). The genetically modified maize is the variety MON 810 (Origin: Monsanto) in which the Cryl Ab gene gene from the genome of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1. Genetic modification gives corn resistance to corn borer attack.
1.2 Extraction des protéines Après délipidation des farines par agitation dans de l'acétone puis de l'éther éthylique, les protéines ont été extraites par agitation dans de l'eau pure. Après centrifugation, le surnageant a été concentré et dialysé. Un dosage des protéines a été effectué par une méthode utilisant le Bleu de Coomassie. 1.2 Protein extraction After defatting the flours by stirring in acetone and then ethyl ether, the proteins were extracted by stirring in pure water. After centrifugation, the supernatant was concentrated and dialyzed. A protein assay was performed by a method using Coomassie Blue.
La première étape d'extraction des protéines est cruciale pour les farines végétales. Elle nécessite d'abord une délipidation des farines par agitation dans de l'acétone puis de l'éther éthylique. The first step of protein extraction is crucial for vegetable flours. It first requires delipidation of the flours by stirring in acetone and then ethyl ether.
Par exemple, la farine (quelques grammes), préalablement lyophilisée, est suspendue dans 10% (p/v) d'acétone pure pour analyse et soumise à agitation à 4 C pendant 60 minutes au moyen d'un agitateur magnétique. Après sédimentation pendant 10 minutes, l'acétone est séparée du culot qui est dilué dans 10% (p/v) du diéthyléther pur pour analyse. Après agitation et sédimentation dans les mêmes conditions que précédemment, le culot est récupéré et séché sous vide pendant 90 minutes. Les protéines du culot sont extraites par agitation orbitale dans de l'eau pure dans un rapport de 10% (p/v) pendant 90 minutes à température ambiante. Après sédimentation, le surnageant est récupéré et soumis à une centrifugation (3 minutes à 16 000 x g), puis le second surnageant est concentré 5 fois par dialyse (membrane de cut-off de 8 000) contre du poly éthylène glycol 20 000. Une seconde dialyse contre de l'eau pure est effectuée pendant 2 heures en changeant 3 fois l'eau (rapport volumétrique de 1/2 500). For example, the flour (a few grams), previously lyophilized, is suspended in 10% (w / v) pure acetone for analysis and stirred at 4 C for 60 minutes using a magnetic stirrer. After sedimentation for 10 minutes, the acetone is separated from the pellet which is diluted in 10% (w / v) pure diethyl ether for analysis. After stirring and sedimentation under the same conditions as above, the pellet is recovered and dried under vacuum for 90 minutes. The pellet proteins are extracted by orbital shaking in pure water at a ratio of 10% (w / v) for 90 minutes at room temperature. After sedimentation, the supernatant is recovered and subjected to centrifugation (3 minutes at 16,000 xg), then the second supernatant is concentrated 5 times by dialysis (cut-off membrane of 8,000) against polyethylene glycol 20,000. second dialysis against pure water is performed for 2 hours by changing 3 times the water (volumetric ratio of 1/2 500).
Avant le dépôt sur le strip d'électrofocalisation, les protéines sont dosées par une méthode sensible (Bradford modifié) utilisant le Bleu de Coomassie comme colorant, selon le protocole Pierce, en utilisant la sérum albumine humaine comme étalon. Prior to deposition on the electrofocusing strip, the proteins are assayed by a sensitive method (modified Bradford) using Coomassie Blue as a stain, according to the Pierce protocol, using human serum albumin as a standard.
1.3 Séparation électrophorétique - Electrophorèse bidimensionnelle Après extraction et mise en solution de tout ou partie des protéines, la révélation des protéines se fait par électrophorèse bidimensionnelle qui permet la séparation des protéines les unes des autres et leur repérage dans un système cartésien (point isoélectrique en abscisse et masse molaire apparente en ordonnée). Après coloration (bleu de coomassie colloïdal, nitrate d'argent ammoniacal, SYPRO RubyTM ou autre...), chaque protéine est visualisée sous forme d'un spot, répéré très précisément après digitalisation de l'image et normalisation. Grâce à la coloration relative des spots protéiques, on obtient ainsi des informations quantitatives sur l'abondance des protéines observées. Une alternative à l'électrophorèse bidimensionnelle est la chromatographie liquide haute performance, éventuellement multidimensionnelle, qui peut être directement couplée à la spectrométrie de masse (cf. paragraphe 1.4). 1.3 Electrophoretic separation - Two-dimensional electrophoresis After extraction and dissolution of all or part of the proteins, the protein is revealed by two-dimensional electrophoresis which allows the separation of the proteins from each other and their identification in a Cartesian system (isoelectric point on the abscissa and apparent molar mass on the ordinate). After staining (Colloidal Coomassie Blue, Ammoniacal Silver Nitrate, SYPRO RubyTM or other ...), each protein is visualized in the form of a spot, which is highly accurate after digitization of the image and normalization. Thanks to the relative staining of the protein spots, we obtain quantitative information on the abundance of proteins observed. An alternative to two-dimensional electrophoresis is high performance liquid chromatography, possibly multidimensional, which can be directly coupled to mass spectrometry (see section 1.4).
Première dimension sur bandes de gradient de pH: Un volume variable d'échantillon (afin d'obtenir la même quantité de protéines) a été déposé lors de la réhydratation du strip (bande de gradient de pH) dans une solution contenant de l'urée 9 M, du détergent CHAPS 4 %, des ampholytes 0.6 % et du DTT 20 mM afin d'obtenir un volume final de 550 l; la première dimension a lieu à 20 C et se décompose en plusieurs étapes afin d'obtenir au minimum 80 000 Volts.Heures. First dimension on pH gradient strips: A variable sample volume (in order to obtain the same amount of protein) was deposited during the rehydration of the strip (pH gradient band) in a solution containing urea 9 M, CHAPS 4% detergent, 0.6% ampholytes and 20 mM DTT to obtain a final volume of 550 l; the first dimension takes place at 20 C and is broken down into several stages in order to obtain at least 80 000 Volts.Hours.
Différentes bandes ont été utilisés selon les expériences: longueur de 17 ou 24 cm et gamme de points isoélectrique de pH allant de 3 à 6, de 5 à 8 et de 3 à 10. Avant transfert pour la deuxième dimension, les strips sont équilibrés en deux étapes: réduction par le DTT (130 mM, 15 mn) et alkylation des groupes sulfhydryles par l'iodoacétamide (135 mM, 20 mn). Different bands were used according to the experiments: length of 17 or 24 cm and range of isoelectric points of pH ranging from 3 to 6, from 5 to 8 and from 3 to 10. Before transfer for the second dimension, the strips are balanced in two steps: reduction with DTT (130 mM, 15 min) and alkylation of sulfhydryl groups with iodoacetamide (135 mM, 20 min).
Deuxième dimension sur gel d'acrylamide: La deuxième dimension a été effectuée à 20 C sur des gels de polyacrylamide. Différents pourcentages d'acrylamide ont été utilisés selon les expériences: 9, 12 ou 16 %. La migration a été effectuée à voltage constant (200 V à 10 C). Des marqueurs de masse molaire ont servi à étalonner les gels. Second dimension on acrylamide gel: The second dimension was carried out at 20 C on polyacrylamide gels. Different percentages of acrylamide were used according to the experiments: 9, 12 or 16%. The migration was carried out at constant voltage (200 V at 10 C). Molecular weight markers were used to calibrate the gels.
Coloration: Bleu de Coomassie colloïdal Numérisation des images: Les images des gels ont été acquises numériquement et une analyse des spots a été effectuée à l'aide du logiciel Melanie 4 (Genebio) pour la détection des spots et le rapprochement des images des lots à comparer. Coloration: Colloidal Coomassie Blue Digitization of the images: The images of the gels were acquired numerically and a spot analysis was carried out using the software Melanie 4 (Genebio) for the detection of the spots and the reconciliation of the images of the batches to compare.
1.4 Excision et digestion des spots différentiels; analyse par spectrométrie de masse Chaque spot révélé comme étant propre à l'échantillon par rapport au témoin (cf Figure 1) est alors excisé et soumis à l'action d'une enzyme protéolytique qui va cliver la protéine en fragments, nommés peptides. La masse moléculaire exacte (précision meilleure que 50 ppm) de ces fragments est déterminée simultanément par spectrométrie de masse MALDI-TOF (ionisation/désorption par tir laser assisté par matrice et mesure par temps de vol), et, si nécessaire (cas des génomes encore très mal connus, notamment), des informations partielles de la séquence des peptides peuvent être obtenues par fragmentation (spectrométie de masse en tandem dite MS/MS, de type quadrupôle-quadrupôle, quadrupôle-temps de vol ou Q-Tof, voire temps de vol-temps de vol ou Tof-Tof). Cette technique permet d'obtenir l'empreinte de masse peptidique de chaque spot, c'est à dire un ensemble de masses moléculaires de peptides résultant d'une digestion protéolytique (ou chimique). 1.4 Excision and digestion of differential spots; mass spectrometry analysis Each spot revealed to be specific to the sample relative to the control (cf. FIG. 1) is then excised and subjected to the action of a proteolytic enzyme which will cleave the protein into fragments, called peptides. The exact molecular mass (better than 50 ppm accuracy) of these fragments is determined simultaneously by MALDI-TOF mass spectrometry (matrix assisted laser ionization / desorption and time of flight measurement), and, if necessary (genome case). still very poorly known, in particular), partial information of the sequence of the peptides can be obtained by fragmentation (MS / MS tandem mass spectrometry, of the quadrupole-quadrupole type, quadrupole-flight time or Q-Tof, or even time flight-time flight or Tof-Tof). This technique makes it possible to obtain the peptide mass footprint of each spot, ie a set of molecular masses of peptides resulting from a proteolytic (or chemical) digestion.
L'identification de la protéine est réalisée par comparaison de l'empreinte de masse peptidique mesurée avec celles issues de peptides virtuels obtenus par la digestion théorique des protéines des bases de données de séquences. Cette digestion virtuelle est réalisée in silico, en utilisant les propriétés de clivage de l'enzyme protéolytique ou de l'agent chimique utilisé. La démarche consiste à utiliser, dans un premier temps, des banques de données spécifiques de l'organisme constituant la matière première du produit agro-alimentaire à tester. The identification of the protein is carried out by comparing the measured peptide mass fingerprint with those obtained from virtual peptides obtained by the theoretical digestion of the proteins of the sequence databases. This virtual digestion is performed in silico, using the cleavage properties of the proteolytic enzyme or the chemical agent used. The approach consists in using, initially, databases specific to the organism constituting the raw material of the food product to be tested.
En cas de test révélant une protéine inconnue, donc exogène, il convient d'élargir progressivement la recherche aux banques d'autres organismes. In the case of a test revealing an unknown protein, therefore exogenous, it is necessary to gradually extend the research to the banks of other organisms.
Dans le cas d'une recherche d'OGM, l'originalité du procédé repose sur la constitution d'une banque bio-informatique de séquences protéiques dans laquelle seront recherchées les protéines analysées. Cette banque résulte de la fusion de la banque de protéines de l'organisme étudié à laquelle sont fusionnées les séquences des transgènes légalement autorisés (voir par exemple la conception de la banque Maïs + OGM au paragraphe 1.5) . La création de cette banque est décisive pour une analyse pertinente de l'échantillon. Cette identification indique non seulement la nature de la protéine (ou le code de l'EST), mais aussi et surtout son origine biologique, donc son statut soit de protéine intrinsèque (codée par le génome d'une des matières premières entrant dans la composition du produit analysé), soit de protéine exogène, révélant dans ce cas une contamination biologique ou un transgène. Dans certains cas, on peut, en complément de protéines étrangères, identifier une ou plusieurs protéines de l'organisme d'origine dont la sur- ou sous-expression est induite par la présence de l'organisme contaminant (cas des pathogènes, notamment). In the case of GMO research, the originality of the process is based on the constitution of a bioinformatic library of protein sequences in which the proteins analyzed will be sought. This bank results from the fusion of the protein library of the studied organism to which are fused the sequences of the legally authorized transgenes (see for example the design of the bank Corn + GMO in section 1.5). The creation of this bank is decisive for a relevant analysis of the sample. This identification indicates not only the nature of the protein (or the code of the EST), but also and especially its biological origin, therefore its status as intrinsic protein (coded by the genome of one of the raw materials used in the composition of the analyzed product), or exogenous protein, revealing in this case a biological contamination or a transgene. In some cases, one can, in addition to foreign proteins, identify one or more proteins of the organism of origin whose over- or under-expression is induced by the presence of the contaminating organism (case of the pathogens, in particular) .
Dans le cas le plus général dans lequel existe un échantillon témoin, l'analyse par empreinte de masse peptidique ne porte que sur les spotsprotéiques particuliers à l'échantillon testé. Cependant la méthode permet, en l'absence de témoin, de révéler et d'identifier des contaminants en caractérisant systématiquement chacun des spots pour en déterminer l'origine biologique. Ce peut être aussi un préalable pour valider le témoin et générer une carte protéique bidimensionnelle de référence. In the most general case in which a control sample exists, the analysis by peptide mass fingerprint relates only to the specific protein spots specific to the sample tested. However, the method allows, in the absence of a control, to reveal and identify contaminants by systematically characterizing each of the spots to determine its biological origin. It can also be a prerequisite for validating the control and generating a two-dimensional reference protein map.
La méthode APDEMP, associée à la constitution de bases de données pertinentes, permet de révéler la nature étrangère d'une protéine trouvée en mélange avec celles d'un produit biologique d'intérêt agro-alimentaire. Elle permet aussi d'indiquer sa provenance biologique, révélant l'organisme d'origine, voire de mettre en évidence un transgène, dans le cas des OGM. Dans ce cas elle repose notamment sur la conception de bases de données intégrant les séquences protéiques des transgènes autorisés. Elle peut s'appliquer aussi bien aux organismes entiers, aux tissus biologiques, aux cellules, d'origine animale, végétale ou microbienne, qu'à certains produits transformés (par exemple, les farines), pour autant que les protéines n'aient pas subi de traitements physico- chimiques trop dénaturants (cuisson à haute température...). The APDEMP method, associated with the constitution of relevant databases, makes it possible to reveal the foreign nature of a protein found in mixture with that of a biological product of agri-food interest. It also makes it possible to indicate its biological origin, revealing the organism of origin, even to highlight a transgene, in the case of GMOs. In this case, it relies in particular on the design of databases integrating the protein sequences of authorized transgenes. It can be applied to whole organisms, biological tissues, cells, of animal, plant or microbial origin, as well as to certain processed products (for example, flours), provided that the proteins do not undergone physicochemical treatments which are too denaturing (high temperature cooking ...).
Dans l'exemple de réalisation, l'excision de spots a été réalisée manuellement. Les peptides issus de la trypsinolyse réalisée à 37 C en milieu alcalin ont été analysés après mélange avec la matrice (acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique) à l'aide d'un spectromètre de masse MALDI-TOF (Applied Biosystems, Voyager DE super STR) équipé d'un laser a azote (337 nm, fréquence de tir de 20Hz). Le spectre de masse a été acquis en mode réflectron (mode positif) avec un délai d'extraction de 130 ns. Une calibration interne a été obtenue à l'aide des masses des peptides d'autolyse de la trypsine. La gamme de masses analysée s'étend de 500 Da à 5000 Da. In the exemplary embodiment, the excision of spots was performed manually. The peptides resulting from trypsinolysis carried out at 37 ° C. in an alkaline medium were analyzed after mixing with the matrix (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) using a MALDI-TOF mass spectrometer (Applied Biosystems, Voyager DE). super STR) equipped with a nitrogen laser (337 nm, firing frequency of 20 Hz). The mass spectrum was acquired in reflectron mode (positive mode) with an extraction time of 130 ns. Internal calibration was obtained using the masses of trypsin autolysis peptides. The mass range analyzed ranges from 500 Da to 5000 Da.
1.5 Conception et exploitation des bases de données Les interrogations en bases de données ont été réalisées par le logiciel PROFOUND avec une exigence de précision de 50 ppm. Avec la calibration interne obtenue grâce aux peptides trypsiques, les résultats sont acquis avec une précision inférieure a 20 ppm. Le minimum de peptides requis pour une identification en bases de données est fixé à 4 peptides. 1.5 Design and operation of databases The database queries were carried out by the PROFOUND software with a precision requirement of 50 ppm. With the internal calibration obtained with the trypsic peptides, the results are acquired with a precision of less than 20 ppm. The minimum of peptides required for database identification is set at 4 peptides.
Bases de données utilisées: Banques de données généralistes (Swiss-Prot, TrEMBL...) et banque de données d'EST (expressed sequenced tag) de Maïs auquelles nous avons adjoint une banque conçue spécialement pour révéler les OGM (Banque Maïs + OGM ). Databases used: General-purpose databases (Swiss-Prot, TrEMBL ...) and the EST (express sequenced tag) database of Maïs to which we have added a bank specifically designed to reveal GMOs (Maize + GMO bank) ).
Conception de la banque Maïs + OGM : Cette banque a été créée à partir d'une banque de protéines de maïs connues (environ 5000 entrées), à laquelle les protéines codées par les gènes autorisés pour produire les OGM de maïs commercialisés en juillet 2003 ont été ajoutés. Design of the bank Corn + GMO: This bank was created from a bank of known maize proteins (about 5000 entries), to which the proteins encoded by the genes authorized to produce the GMO maize marketed in July 2003 have been added.
Liste des gènes étrangers introduits: - Toxine cryl Ab [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki] ; adresse dans Swiss-Prot:P06578. List of introduced foreign genes: - Cryl Ab toxin [Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki]; address in Swiss-Prot: P06578.
- Toxine cryl AC [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki; adresse dans Swiss-Prot] :P05068. - Cryl AC toxin [gene of Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki; address in Swiss-Prot]: P05068.
- Toxine crylF [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Aizawai] ; adresse dans Swiss-Prot: Q03746. CrylF toxin [Bacillus thuringiensis ssp. Aizawai]; address in Swiss-Prot: Q03746.
- Toxine cry3Bb1 [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Kumamotoensis] ; adresse dans Swiss-Prot: Q06117. Cry3Bb1 toxin [Bacillus thuringiensis ssp. Kumamotoensis]; address in Swiss-Prot: Q06117.
- Toxine cry9C [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Tolworthi] ; adresse dans Swiss-Prot: Q45733. Cry9C toxin [Bacillus thuringiensis ssp. Tolworthi]; address in Swiss-Prot: Q45733.
- Adénine méthylase [gène d'Escherichia coin; adresse dans Swiss-Prot: P21311. Adenine methylase [Escherichia corner gene; address in Swiss-Prot: P21311.
- Ribonucléase Barnase [gène de Bacillus amyloliquefaciens] ; adresse dans Swiss-Prot: P00648. - Barnase ribonuclease [Bacillus amyloliquefaciens gene]; address in Swiss-Prot: P00648.
- Phosphinothricine acétyltransférase (PAT) [gène de Streptomyces viridochromogene] ; adresse dans Swiss-Prot: Q57146. Phosphinothricin acetyltransferase (PAT) [Streptomyces viridochromogene gene]; address in Swiss-Prot: Q57146.
- Phosphinothricine acétyltransférase (PAT) [gène de Streptomyces hygroscopicus] ; adresse dans Swiss-Prot: P16426. - Phosphinothricin acetyltransferase (PAT) [Streptomyces hygroscopicus gene]; address in Swiss-Prot: P16426.
- 5-énolpyruvyle shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) [gène d'Agrobacterium tumefaciens souche CP4] ; adresse dans Swiss-Prot: Q9R4E4. - 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) [Agrobacterium tumefaciens strain strain CP4]; address in Swiss-Prot: Q9R4E4.
EXEMPLE 2 - RESULTATS 2.1 Mise en évidence de contaminants biologiques Comparaison des électrophorèses des lots 1 et 2 L'observation des gels révèle un certain nombre de spots protéiques caractéristiques de chacun des lots (encerclés sur la figure 2), spots qui ont été découpés, hydrolysés à la trypsine et soumis à une analyse de masse MALDI-TOF (figure 2). EXAMPLE 2 - RESULTS 2.1 Demonstration of biological contaminants Comparison of the electrophoreses of batches 1 and 2 The observation of the gels reveals a certain number of protein spots characteristic of each of the batches (circled in FIG. 2), spots which have been cut out, hydrolyzed with trypsin and subjected to a MALDI-TOF mass analysis (FIG. 2).
Particularité du lot 1 L'électrophorèse montre, par rapport au lot 2, quatre spots protéiques particuliers. Leur analyse par empreinte de masse peptidique révèle la présence d'une protéine chaperon provenant du parasite Ustilago maydis, identifié avec une grande certitude (96% de séquence homologue) (figure 3). Particularity of the batch 1 The electrophoresis shows, compared to the lot 2, four particular protein spots. Their analysis by peptide mass fingerprint reveals the presence of a chaperone protein from the parasite Ustilago maydis, identified with great certainty (96% homologous sequence) (Figure 3).
Particularités du lot 2 Le spot D86-02 met en évidence une protéine, la HC-toxine réductase, révélant une infection par un champignon du genre Helminthosporium (alternativement Cochliobolus) responsable de Phelminthosporiose du Maïs (figure 4). Ce genre sécrète en effet un peptide cyclique toxique spécifique qui induit chez son hôte une réaction de défense se traduisant par l'expression d'une peptidase spécifique, la HC-toxine réductase, qui détoxique la toxine HC en réduisant un groupe carboné. Special features of lot 2 Spot D86-02 shows a protein, HC-toxin reductase, revealing an infection with a fungus of the genus Helminthosporium (alternatively Cochliobolus) responsible for corn blight (Figure 4). This genus secretes a specific toxic cyclic peptide which induces in its host a defense reaction resulting in the expression of a specific peptidase, HC-toxin reductase, which detoxifies the HC toxin by reducing a carbon group.
Cette infection est corroborée par l'expression simultanée d'une protéine spécifique de la réaction d'hypersensibilité du maïs (réaction de défense des végétaux, analogue à la réaction inflammatoire des tissus animaux), protéine observée dans le spot D86-04 (figure 5). This infection is corroborated by the simultaneous expression of a protein specific for the corn hypersensitivity reaction (plant defense reaction, analogous to the inflammatory reaction of animal tissues), a protein observed in spot D86-04 (FIG. ).
Reproductibilité La répétition de la recherche de contaminant dans le lot 2, en refaisant entièrement l'expérience ex nihilo, a permis de retrouver les mêmes protéines (Figure 6). Les spots D63-01 et D63-05 mettent à nouveau en évidence la HC-toxine réductase, alors que le spot D63-05 révèle une autre protéine de défense, caractéristique de la réaction d'hypersensibilité, appartenant à la famille des protéines PR (pathogenesis related proteins) (figure 7). Reproducibility The repetition of the search for contaminant in batch 2, by completely redoing the experiment ex nihilo, made it possible to find the same proteins (Figure 6). The spots D63-01 and D63-05 show again the HC-toxin reductase, whereas the spot D63-05 reveals another defense protein, characteristic of the hypersensitivity reaction, belonging to the PR protein family ( pathogenesis related proteins) (Figure 7).
2.2 Mise en évidence de protéines révélatrices d'OGM Cette analyse porte sur la comparaison de farines de maïs fournies par l'IRMM (Institute for Reference Materials and Measurements, European Commission, Joint Resaerch Center). Le lot 3 est un témoin contenant moins de 0,02% d'OGM, le lot 4 est une farine contenant 5% d'OGM Monsanto 810. 2.2 Demonstration of GMO-revealing proteins This analysis deals with the comparison of maize meal provided by the IRMM (European Commission, Joint Resaerch Center). Lot 3 is a control containing less than 0.02% GMO, lot 4 is a flour containing 5% GMO Monsanto 810.
Comparaison des électrophorèses des lots 3 et 4 Les spots 98-03, 98-04, 98-06 et 98-11 sont présents uniquement dans le lot 4 qui concerne une farine contenant 5% de la variété de maïs OGM Monsanto 810 (figure 8). Comparison of the electrophoreses of lots 3 and 4 The spots 98-03, 98-04, 98-06 and 98-11 are present only in batch 4 which concerns a flour containing 5% of the variety of GM corn Monsanto 810 (figure 8 ).
Révélation et identification des transgènes Après analyse par spectrométrie de masse des peptides trypsiques, le spot 98-06 s'avère être une protéine transgénique: c'est la toxine Cry de Bacillus thuringiensis répertoriée par les obtenteurs de l'OGM considéré (figure 9) . Les spots 98-03, 98-04 et 98-11 correspondent à des fragments protéolytiques de cette même protéine. Revelation and identification of transgenes After analysis by mass spectrometry of trypsic peptides, the 98-06 spot turns out to be a transgenic protein: it is the Cry toxin of Bacillus thuringiensis listed by the breeders of the GMO considered (FIG. 9). . The spots 98-03, 98-04 and 98-11 correspond to proteolytic fragments of this same protein.
Reproductibilité Une électrophorèse des mêmes lots avec une concentration d'acrylamide à 12% (non figurée) montre que le lot 4 contient un spot (8104) dont l'analyse par spectrométrie de masse des peptides trypsiques révèle aussi une protéine transgénique de type toxine Cry de Bacillus thuringiensis (figure 10). Reproducibility Electrophoresis of the same lots with a concentration of 12% acrylamide (not shown) shows that batch 4 contains a spot (8104) whose mass spectrometry analysis of tryptic peptides also reveals a transgenic protein of Cry toxin type. Bacillus thuringiensis (Figure 10).
EXEMPLE 2 - CONCLUSIONS Ces exemples montrent que la méthode d'Analyse Protéomique Différentielle et d'Empreinte de Masse Peptidique permet de révéler une contamination de lots de maïs soit par la présence de protéines exogènes (cas de la chaperone d' Ustilago maydis), soit de protéines du maïs spécifiquement exprimées dans le cas d'une attaque parasitaire ou microbienne (HC toxin reductase) en complément de protéines de défense ubiquitaires (protéines d'hypersensibilité et de pathogénie). EXAMPLE 2 - CONCLUSIONS These examples show that the method of Differential Proteomic Analysis and Peptide Mass Footprint makes it possible to reveal a contamination of maize batches either by the presence of exogenous proteins (case of the Ustilago maydis chaperone) or of maize proteins specifically expressed in the case of a parasitic or microbial attack (HC toxin reductase) in addition to ubiquitous defense proteins (hypersensitivity and pathogenesis proteins).
Par ailleurs, le second exemple indique que, notamment lorsque l'on utilise une base de donnée spécialement conçue pour révéler des séquences de protéines transgéniques, la méthode APDEMP révèle la présence d'une contamination par un OGM. On the other hand, the second example indicates that, especially when using a database specially designed to reveal transgenic protein sequences, the APDEMP method reveals the presence of contamination by a GMO.
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