FR2865825A1

FR2865825A1 - Determining if a product, especially food, is in a condition to be used or consumed comprises using an indicator providing a signal that changes after a storage period depending on the product's storage conditions

Info

Publication number: FR2865825A1
Application number: FR0450200A
Authority: FR
Inventors: Renaud Vaillant
Original assignee: Cryolog SA
Current assignee: Cryolog SA
Priority date: 2004-02-03
Filing date: 2004-02-03
Publication date: 2005-08-05

Abstract

Determining if a product is in a condition to be used or consumed comprises using an indicator providing a signal that first indicates that the product can be used or consumed and then, after a storage period depending on the product's storage conditions, indicates a change in the use or consumption status of the product. Determining if a product is in a condition to be used or consumed comprises using an indicator providing a signal that first indicates that the product can be used or consumed and then, after a storage period depending on the product's storage conditions, indicates a change in the use or consumption status of the product. The indicator provides information enabling the product to be used during a longer period of time if the storage conditions are better than standard or recommended conditions or during a shorter period of time if the storage conditions are worse than standard or recommended conditions. An independent claim is also included for a device for determining if a product is in a condition to be used or consumed, comprising an indicator as above.

Description

Dispositif destiné à contrôler la fraîcheur d'un produitDevice for controlling the freshness of a product

La présente invention concerne un dispositif destiné à contrôler la fraîcheur d'un produit. Le dispositif est caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une étiquette comprenant des bactéries destinées à provoquer une opacification de l'étiquette en cas de franchissement d'un seuil déterminé de température de conservation du produit. L'étiquette est notamment destinée à être apposée sur un code barres associé au produit. Le dispositif est en outre caractérisé en ce que: - l'étiquette est paramétrée en fonction d'une date limite de consommation du produit sur lequel elle est apposée, - l'étiquette subit une opacification lors de la survenance de la date limite de consommation et/ou antérieurement à la date limite de consommation dans le cas où la température du produit a excédé un seuil déterminé pendant une durée déterminée. The present invention relates to a device for controlling the freshness of a product. The device is characterized in that it implements a label comprising bacteria intended to cause an opacification of the label in case of crossing a determined threshold of storage temperature of the product. The label is intended in particular to be affixed to a barcode associated with the product. The device is further characterized in that: - the label is set according to a consumption limit date of the product on which it is affixed, - the label undergoes opacification at the occurrence of the use-by date. and / or prior to the use-by date in the case where the temperature of the product has exceeded a determined threshold for a specified period.

Ainsi, l'opacification de l'étiquette rend illisible le code barres du produit. Thus, the opacification of the label renders illegible the barcode of the product.

STABILITE DE LA SOUCHE 503M10 A 20 C DANS DES MILIEUX DE CULTURE AVEC DIFFERENTS HUMECTANTS (NON HYDROLYSES) DATE: 12 août 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: La croissance de la souche 503M10 est testée à 20 C dans différents milieux de culture contenant différents humectants. STABILITY OF THE 503M10 STRAIN AT 20 C IN CULTURE MEDIA WITH DIFFERENT HUMECTANTS (NON HYDROLYSIS) DATE: August 12, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIMENT: The growth of strain 503M10 is tested at 20 C in different culture media containing different humectants .

Les milieux de culture utilisés: Tryptone- NaCI Caséine Glycérol Aga rose Saccharose Sorbito pH sel (%) (g/1) (%) (%) (%) (%) 1 X 0,85 50 0,5 6,2 2.. X 0,1 50 0,5 6,2 3 X 0,85 50 4 0,5 6,2 4 X 0,85 50 15 0,5 6,2 X 0,85 50 0,5 4 6,2 6 X 0,85 50 0,5 15 6,2 Page 1 sur 83 7 X 0,85 50 0,5 25 6,2 8 X 0,85 50 0,5 4 6,2 9 X 0,85 0,5 7,5 6,2 X 0,85 0,5 10 6,2 11 X 0,85 0,5 6,2 OBJECTIFS: Déterminer un milieu de stabilité pour la souche 503 M10 à 20 C. Culture media used: Tryptone-NaCl Casein Glycerol Pink Aga Sucrose Sorbito pH Salt (%) (g / 1) (%) (%) (%) (%) 1 X 0.85 50 0.5 6.2 2 .. X 0.1 50 0.5 6.2 3 X 0.85 50 4 0.5 6.2 4 X 0.85 50 15 0.5 6.2 X 0.85 50 0.5 4 6, 2 6 X 0.85 50 0.5 15 6.2 Page 1 of 83 7 X 0.85 50 0.5 25 6.2 8 X 0.85 50 0.5 4 6.2 9 X 0.85 0 , 7.5 7.5 6.2 X 0.85 0.5 10 6.2 11 X 0.85 0.5 6.2 OBJECTIVES: To determine a stability medium for strain 503 M10 at 20C.

Page 2 sur 83 RÉSULTATS: Evolution de la croissance de la souche 503M10 à 20 C dans les milieux 1 et2 Croissance de la souche 503M10 sur le milieu 8 9.00 9.00 8.00 m 7.00 e 6.00 8.00 7.00 6.00 t Milieu 1 5.00 c 5.00 - --a-Milieu 2 i o -1 4.00 RESULTS: Evolution of the growth of strain 503M10 at 20 C in media 1 and 2 Growth of strain 503M10 on medium 8 9.00 9.00 8.00 m 7.00 e 6.00 8.00 7.00 6.00 t Medium 1 5.00 c 5.00 - - a-Medium 2 io -1 4.00

---

J 4.00 3.00 3.00 2.00 2.00 0 2 4 6 Temps(jours) Temps(jours) 1-.- Milieu 81 Milieu 3 --a- Milieu 4 Croissance de la souche 503M10 dans le milieu 3 et 4 à 20 C 9.00 8.00 a, 7.00 6.00 - âà 5.00 - 0 4.00 r 3.00 2.00 1 Croissance de la souche 503M10 dans les milieux 5, 6 et 7 à 20 CCroissance de la souche 503M10 sur le milieu 11 à 20 C Croissance de la souche 503M10 dans le milieu 9 et 10 à 20 C Milieu 9 -a- Milieu 10 0 2 4 6 Temps(jours) 9.00 8.00 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 2 4 6 Temps(jours) 9.00 9.00 8.00 8.00 7.00 m 7.00 -± Milieu 6 6.00 -a- Milieu 6 6.00 o 5.00 Milieu 7 âe" ô 5.00 J -1 4.00 4.00 v. J 4.00 3.00 3.00 2.00 2.00 0 2 4 6 Time (days) Time (days) 1 -.- Medium 81 Medium 3 --a- Medium 4 Growth of strain 503M10 in medium 3 and 4 at 20 C 9.00 8.00 a, 7.00 6.00 - à 5.00 - 0 4.00 r 3.00 2.00 1 Growth of strain 503M10 in media 5, 6 and 7 to 20 Growth of strain 503M10 on medium 11 to 20 C Growth of strain 503M10 in medium 9 and 10 at 20 C Middle 9 -a- Middle 10 0 2 4 6 Time (days) 9.00 8.00 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 2 4 6 Time (days) 9.00 9.00 8.00 8.00 7.00 m 7.00 - ± Middle 6 6.00 -a- Middle 6 6.00 o 5.00 Middle 7 o'clock 5.00 J -1 4.00 4.00 c.

3.00 3.00 2.00 2.00 -,- - Milieu 1 1 0 2 4 6 0 2 4 Temps(jours) Temps(jours) NOMBRE D'ESSAIS: boites par condition ont été réalisées, soit 110 essais. 3.00 3.00 2.00 2.00 -, - - Medium 1 1 0 2 4 6 0 2 4 Time (days) Time (days) NUMBER OF TESTS: boxes per condition were performed, ie 110 trials.

CONCLUSION: La souche 503M10 croît dans les différents milieux expérimentés. La présence des différents humectants ne permet pas de réduire sa croissance. CONCLUSION: The strain 503M10 grows in the different environments experimented. The presence of different humectants does not reduce its growth.

Ces milieux ne nous permettent pas d'atteindre notre objectif. These environments do not allow us to reach our goal.

Page 3 sur 83 ETALONNAGE AW TRYPTONE + GLYCEROL DATE: 12 août 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Mesure de l'Aw de différentes solutions de TS (0.85 % nacl) OBJECTIFS: Obtenir une courbe d'étalonnage d'Aw en milieu liquide RESULTATS: Milieux AW TS 0.85% NaCl Aw Traceo + glycerol AwSupérieure, Température IAWlnférieure iTempérature Awfinale, Température' 0_.990 23.7 0.996 _ ___3 6 0.987 Page 3 of 83 CALIBRATION AW TRYPTONE + GLYCEROL DATE: August 12th, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIMENT: Measurement of the Aw of different solutions of TS (0.85% nacl) OBJECTIVES: To obtain a curve of calibration of Aw in liquid medium RESULTS : Media AW TS 0.85% NaCl Aw Traceo + glycerol AwSuperior, Temperature IAWlnferior Awfinal temperature, Temperature '0_.990 23.7 0.996 _ ___3 6 0.987

____

0.990 0.989 23.4 0.994 23.8 0.990 _ ____ 0.991 23.3 0.993 23.9 0.990 0.990 23.3 0.99 23.8 0.990 i 0.987 23.6 0.991 0.990 23 2 0.99 __ _ 23.8 1 0.990 0.984 23.3 0,987 0.990 0.975 _.._23.3__ 0.986 23 6 0.990 [ 0.972 23.3 0. 9 8 5;2 3. 7 0.990 0.963 23.4 0.981 23.7 _j 0.990._0.949 23.8 0 978 23 7 0.990 1 _0.934 _ _23.8 0.969 Il 23.7 0.990_ 23.7 0.966..239 Page 4 sur 83 NOMBRE D'ESSAIS: 13 CONCLUSION: Obtention de la courbe d'étalonnage de I'Aw en milieu liquide. 0.990 0.989 23.4 0.994 23.8 0.990 _ ____ 0.991 23.3 0.993 23.9 0.990 0.990 23.3 0.99 23.8 0.990 i 0.987 23.6 0.991 0.990 23 2 0.99 __ _ 23.8 1 0.990 0.984 23.3 0.987 0.990 0.975 23.3 0.986 23 6 0.990 [0.972 23.3 0 9 8 5; 2 3. 7 0.990 0.963 23.4 0.981 23.7 _j 0.990._0.949 23.8 0 978 23 7 0.990 1 _0.934 _ _23.8 0.969 Il 23.7 0.990_ 23.7 0.966..239 Page 4 of 83 NUMBER OF TESTS: 13 CONCLUSION: Obtaining the calibration curve of the Aw in a liquid medium.

Evolution de l'AW finale en fonction de l'Aw supérieure et inférieure 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Essais 1.020 1.000 0.980 0.960 Q 0.940 - 0.920 0.900 - 0.880 - .-AwSupérieure e-- AWlnférieure Awfinale Page 5 sur 83 DETERMINATION DE LA DLC DE LA SOUCHE 503M10 Evolution of the final AW as a function of the upper and lower aw 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Tests 1.020 1.000 0.980 0.960 Q 0.940 - 0.920 0.900 - 0.880 -. -Superior e-- AWlnferior Awfinale Page 5 of 83 DETERMINATION OF THE DLC OF THE STRAIN 503M10

SUR LE MILIEU TRACEO DOUBLE COUCHEON THE MIDDLE TRACEO DOUBLE LAYER

DATE: 14 août 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Quatre scénarios de croissance sont envisagés: Le milieu supérieur est le tryptone sel ( 0. 85% de Nacl) + 50 g/I de caséine Le milieu inférieur est le milieu TRACEO double concentration avec ou sans glycérol. DATE: August 14, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIENCE: Four growth scenarios are considered: The upper medium is tryptone salt (0.85% Nacl) + 50 g / I casein The lower medium is TRACEO double concentration medium with or without glycerol.

Scénarios; Glycérol (%) I Température 0 113 4 C et 2/3 8 C 3 15 jours 15 et 20 1/3 4 C et 2/3 8 C 4 21 jours 25et20 1134 Cet2/38 C OBJECTIFS: Déterminer la DLC de la souche 503M10 dans le milieu TRACEO RESULTATS: / Croissance de la souche 503M10 lors du scénario à 8 C - SCENARIO 1 Milieu double couche Milieu TRACEO DC sans glycérol+ caséine 50g/I Milieu inférieur Milieu TS 0.85% Nacl + caséine 50g/l Milieu supérieur 14-août 19h00 0 1 0.0 6.5 + 1 18 août I 10h00 I 87 I 3.6 6.38 I 19-août 9h00 120 5.0 1 5.69 i I + 20-août 9h30 I 144 1 5.63 + 21-août 9h00 167.5 7.0 4.87 + 22-août 17h00 I 199.5 8.3 4.91 Date Heure I Temps pH Précipitation Lecture (heures) (jours) code-barre Page 6 sur 83 Croissance de la souche 503MI0 lors du scénario à 8 C - SCENARIO 2 Milieu double couche Milieu TRACEO DC sans glycérol+ caséine 50g/l Milieu inférieur Milieu TS 0.85% Nacl sans caséine DLC attendue: 7 jours 0% glycérol Milieu supérieur 1 Date Heure Temps Dénombrement _ II (heures) (jours) (ufc/boite) 21-août 16h15 0 0.0 1.0E+04 4.0 16.38 1 22 août 17hOO 24.75 1 1.0 2.2E+04 ^ 25-août r 9h00 88.75 3.7 2.4E+05 5.4 6 34 26-août 11hOO 114.75 4.8 5E+07 7.2 6.15 27-août 9hOO 136.75 5.7 2.8E+08 8.45 5.9 _ [ + 7-août 15h00 142.75 44-6.12 - + 28-août 9ti 00 [160.75 6.7 9.30E+07 7.97 5.6 r - 1 + 28-août 13h30 165.25 6.9 + 5.62 1 + 28-août 116h3O 168.25 7.0 5.58 _ + 28-août 18hOO 169.75 7.1 5.49 _ + 29-août 9hOO 184.75 7.7 3.1E+09 9.49 5.12 - + 01-sept 9h00 256.75 r 10.7 4.71 1 + - (ufc/boite) L g pH Précipitation code-barre Lecture + 4.3 6.27 Il _ + Milieu TRACEO DC avec glycérol(2%)+ caséine 50g/l Milieu inférieur Milieu TS 0.85% Nacl sans caséine 2 % glycérol DLC attendue: 7 jours Milieu supérieur Data Heure Temp s Dénombrement (ufc/boite) pH Précipitation Lecture (ufc/boite) Log code barre 1 (heures) 1(jours) 21-août 16h15 24.75 0.0 1.2E+04 4.1- 1 6.4 + 0 1.0 22-août 17hOO 2.5E+04 4.4 6.25 + T 1 25-août 1 9h00 88.75 3.7 3.5E+05 5.5 - + 6 29 1 26 août 1 1 hOO 114.75 4.8 8.3E+06 6.9 6 16 1 - + 27-août 9hOO 136.75 5.7 1.8E+08 8.26 6.04 + 28 août, 9h00 160.75 6.7 7.1E+08 8.85 1 5.67 - + 13h30, 165.25 6.9 1.0E+09 9.00 5.63 i - + 28août 28-août 16h30 168.25 7.0 1 5.45 _ + 28août 18h00 169.75 7.1 15.29-1 _ + 29-août 9h00 184.75 7.7 2.6E+09 9.41 5 1 + 9hOO 256.75 10.7 [47 1 + 01-sept 24-août: passage à 8 C soit 66,5 heures (2.8 jours) à 4 C Page 7 sur 83 V Croissance de la souche 503M10 lors du scénario à 8 C - SCENARIO 3 Milieu double couche Milieu TRACEO DC avec glycérol(15%)+ caséine 50gl1 Milieu inférieur Milieu TS 0.85% Nacl + caséine 50gll Milieu supérieur DLC attendue: 15 jours Milieu TRACEO DC avec glycérol(20%)+ caséine 50gl1 Milieu inférieur Milieu TS 0.85% Nacl + caséine 50gl1 Milieu supérieur DLC attendue: 15 jours Temps Dénombrement Lecture Date Heure heures pH Précipitation (ufc/boîte) code-barre () i _(jours 14-août, 19h00 0 0.0 i' 9.6E+03 6.5 _ + , 18-août 10hOO, 87 1 3 6 9.20E+03 6.471 _ + 19-août 15h00 116 4.8 6.4 _ + 1 19-août, 19h00 i 120 5.0 Passage a 8 C 20-ao9t 9h3O 1 134.5 5.6 6A7-1 + 21-a00t 9h00 158 1 6.6 1 1 6.321 _ + 22-août117h00 190 1 7.9 1 6.41 1 - + 25-août 9h00 254 10.6 1 6.37 _ i + 26-août 11 hOO, 280 11.7 1 27 août 9hOO i 302 1 12.6 6.041 _ + I 28-août 9h00 326 13.6 6.26, + Petites colonies 29-aoûtl 9h00 350 14.6 1. 6.36 _ 01-sept 9hOO 422 17.6 6.251 _ 1 + 02 set 9hO0 446 18.6 5.851 _ + 02-sept 19h00 456 19.0 1 5.61 _ + j _ ] 03-sept 19hOO 480 20.0 5.23 19-août: passage a 8 C soit 120 heures (5 jours) à 4 C. Lecture 1 code- barre 1 19 août 15h00 19-août 19h00 1 120 20-août 9h30] 134.5 21-août l 9h00 158 6.6 6.39 _ 1 + ] if l 7.9 I 6.37 _ + l + 1 Heure Temps Dénombrement 1 pH Précipitation (Heure 1 (heures) (jours) 1 14 août 19hOO 0 0.0 1 1 0E+04 6 54 18-août 1 10h001 87 3.6 1.20E+04 1 6.42 Date 116 4.8 1 6.45 5.0.1 5.6:16.46 - ^^^^ 2ô il 17h00 25-août 9h00 l 254 10.6 5.53 _ [ 26-août 11 hOO l 280 11.7 1 l 5.34 27 -août 9h00 0 12.6 28-août] 9h00 326 13.6 il Passage à 8 C + + scenarios; Glycerol (%) I Temperature 0 113 4 C and 2/3 8 C 3 15 days 15 and 20 1/3 4 C and 2/3 8 C 4 21 days 25 and 20 1134 Cet2 / 38 C OBJECTIVES: To determine the DLC of the strain 503M10 in the medium TRACEO RESULTS: / Growth of the 503M10 strain in the 8 C scenario - SCENARIO 1 Double layer medium TRACEO DC medium without glycerol + casein 50g / I Lower medium Medium TS 0.85% Nacl + casein 50g / l Upper medium 14- August 19:00 0 1 0.0 6.5 + 1 18 August I 10.00 I 87 I 3.6 6.38 I 19-Aug 9.00 120 5.0 1 5.69 i I + 20-Aug 9.30 I 144 1 5.63 + 21-Aug 9.00 167.5 7.0 4.87 + 22-Aug 17.00 I 199.5 8.3 4.91 Date Time I Time pH Precipitation Reading (hours) (days) barcode Page 6 of 83 Growth of strain 503MI0 in the 8 C scenario - SCENARIO 2 Double layer medium TRACEO DC medium without glycerol + casein 50g / l Lower medium Medium TS 0.85% Nacl casein free DLC expected: 7 days 0% glycerol Upper medium 1 Date Time Time Enumeration _ II (hours) (days) (ufc / box) 21-Aug 16h15 0 0.0 1.0E + 04 4.0 16.38 1 22 Aug 17h00 24.75 1 1.0 2.2E + 04 ^ 25-Aug r 9.00 88.75 3.7 2.4E + 05 5.4 6 34 26-Aug 11h00 114.75 4.8 5E +07 7.2 6.15 27-Aug 9h00 136.75 5.7 2.8E + 08 8.45 5.9 _ [+ 7-Aug 15.00 142.75 44-6.12 - + 28-Aug 9ti 00 [160.75 6.7 9.30E + 07 7.97 5.6 r - 1 + 28-Aug 13h30 165.25 6.9 + 5.62 1 + 28-août 116h3O 168.25 7.0 5.58 _ + 28-août 18hOO 169.75 7.1 5.49 _ + 29-août 9hOO 184.75 7.7 3.1E + 09 9.49 5.12 - + 01-sept 9h00 256.75 r 10.7 4.71 1 + - (ufc / box) L g pH Precipitation barcode Reading + 4.3 6.27 Il _ + Medium TRACEO DC with glycerol (2%) + casein 50g / l Lower medium Medium TS 0.85% Nacl without casein 2% glycerol DLC expected: 7 days Upper medium Data Time Temp s Enumeration (cfu / box) pH Precipitation Reading (cfu / box) Barcode 1 (hours) 1 (days) 21-Aug. 16:15 24.75 0.0 1.2E + 04 4.1- 1 6.4 + 0 1.0 22- August 17hOO 2.5E + 04 4.4 6.25 + T 1 25-Aug 1 9.00 88.75 3.7 3.5E + 05 5.5 - + 6 29 1 26 Aug 1 1 hOO 114.75 4.8 8.3E + 06 6.9 6 16 1 - + 27-Aug 9h00 136.75 5.7 1.8E + 08 8.26 6.04 + 28 August, 9.00 160.75 6.7 7.1E + 08 8.85 1 5.67 - + 13.30, 165.25 6.9 1.0E + 09 9.00 5.63 i - + 28August 28-Augur 16:30 168.25 7.0 1 5.45 _ + 28Aug 18.00 169.75 7.1 15.29-1 _ + 29-Aug 9.00 184.75 7.7 2.6E + 09 9.41 5 1 + 9hOO 256.75 10.7 [47 1 + 01-Sep 24- August: change to 8 C, ie 66.5 hours (2.8 days) at 4 C Page 7 of 83 V Growth of strain 503M10 in the 8 C scenario - SCENARIO 3 Double layer medium TRACEO DC medium with glycerol (15%) + casein 50gl1 Lower medium Medium TS 0.85% Nacl + casein 50gll Upper medium DLC expected: 15 days Medium TRACEO DC with glycerol (20%) + casein 50gl1 Lower medium Medium TS 0.85% Nacl + casein 50gl1 Upper medium DLC expected: 15 days Time Enumeration Reading Date Time hours pH Precipitation (ufc / box) barcode () i _ (days 14-August, 19:00 0 0.0 i '9.6E + 03 6.5 _ +, 18-Aug 10h00, 87 1 3 6 9.20E + 03 6.471 _ + 19-Aug 15h00 116 4.8 6.4 _ + 1 19-août, 19h00 i 120 5.0 Change to 8 C 20-ao9t 9h3O 1 134.5 5.6 6A7-1 + 21-a00t 9h00 158 1 6.6 1 1 6.321 _ + 22-août117h00 190 1 7.9 1 6.41 1 - + 25-Aug 9h00 254 10.6 1 6.37 _ i + 26-août 11 hOO, 280 11.7 1 27 august 9h00 i 302 1 12.6 6.041 _ + I 28-août 9h00 326 13.6 6.26, + Small colonies 29-august 9h00 350 14.6 1. 6.36 _ 01-sept 9h00 422 17.6 6.251 _ 1 + 02 set 9h00 446 18.6 5.851 _ + 02-sept 19h00 456 19.0 1 5.61 _ + j _] 03-sept 19hOO 480 20.0 5.23 19-Aug: change to 8 C 120 hours (5 days) at 4 C. Reading 1 barcode 1 19 August 15h00 19-August 19h00 1 120 20-août 9h30] 134.5 21-août l 9h00 158 6.6 6.39 _ 1 +] if l 7.9 I 6.37 _ + l + 1 Hour Time Enumeration 1 pH Precipitation (Time 1 (hours) (days) 1 14 Aug. 19h00 0 0.0 1 1 0E + 04 6 54 18-Aug 1 10h001 87 3.6 1.20E + 04 1 6.42 Date 116 4.8 1 6.45 5.0.1 5.6: 16.46 - ^^^^ 2o il 17h00 25-août 9h00 l 254 10.6 5.53 _ [26-august 11 hOO l 280 11.7 1 l 5.34 27 -Aug 9.00 0 12.6 28-Aug] 9:00 326 13.6 Change to 8 C + +

AAT

Page 8 sur 83 Croissance de la souche 503M10 lors du scénario à 8 C SCENARIO 4 Milieu double couche Milieu TRACEO DC avec glycérol(20%)+ caséine 50g/I Milieu inférieur Milieu TS 0.85% Nacl + caséine 50g11 Milieu supérieur DLC attendue: 21 jours - + 8 C + + + - I + Milieu TRACEO DC avec glycérol(25%)+ caséine 50g/I Milieu inférieur Milieu TS 0. 85% Nacl + caséine 50g/l Milieu supérieur DLC attendue: 21 jours Temps Dénombrement Lecture Heure -- ufc/boîte pH Précipitation 1(heures) 1(jours) ( ) code-barre 14-août 119h00 0 0.0 8.5E+03 16.51 1 - + 4 C_ 18 août 10h00; 87 1 3.6 1 8.9E+03 6 44 19 août 15h00 1 116 4.8 20-août 10h00 135 5.6 16.48 1- + I 21-août 1 9h00 1 158 6.6 6.41 1 1 + 1968h changement de T 122-août 1 + 1 7h0â 190 7.9 16.44 25-août 1 9h00 254 10.6 + 26-août 11 h00 1 280 11.7 ( 6.32 1 + 27-août; 9h00 I 302 ' 12.6 28 août h00 F 326 13.6 29-août 19h00 1 350 1- 14.6 101-sept ' 9h00 [ 422 1 17.6 02-sept '' 9h00 446 1 18.6 03-sept 19h00; 480 1 20.0 05-sept 91145 1 518.75 121.6 08-sept 9H15 1590. 25 124.6 15-sept'', 114.00 1 764 1 31.8 I 21-août: passage à 8 C soit 168 heures (7 jours) à 4 C 114-août 19h00 118 août 10h00 119-août 15h00 20-août 10h00 I 135 I 5.6 f21 août, 9h00 158 6.6 + 22-août 17h00 190 7.9 ^ 6 36_; - + [2-août 9h00 I 254 1 10.6 1 16.36! 126-août ' 11 h00 1 280 11.7 6.231 127-août; 9h00 1 302 1 12.6 16.21 1 128-août 9h00 326 11 13.6 6.28 L 29-août 9h00 1 350 1 14.6 '1 16.33 1,101-sept 9h00 422 17.6 _I_ 15.97 102-sept 9h00 I.446 1 18.6 1 6.02 102-sept 19h00 456 [ 19.0 1 15.31 I _ + Date Heure 1 Temps I (heures) 1 (jours) 1 0 1.0.0 1 9.3E+03 16.47.1 _. 87 3.6 ( ..9.6E+03_. 6.47 + .. 1 116 4.8 6.32 - 1 + I 6.48 1 _ + 11 Dénombrement (ufc/boîte) pH Précipitation Lecture code-barre' 4 C Date 16.32;1 6.3 1 16.32 r-- - [626', 1 626 ( I- + 6261 + + 6.251 + Page 9 sur 83 NOMBRE D'ESSAIS: boites ont été réalisées pour chaque scénario, soit au total 80 essais. Page 8 of 83 Growth of strain 503M10 in the 8 C scenario SCENARIO 4 Double layer medium TRACEO DC medium with glycerol (20%) + casein 50g / I Lower medium Medium TS 0.85% Nacl + casein 50g11 Upper medium DLC expected: 21 days - + 8 C + + + - I + TRACEO DC medium with glycerol (25%) + casein 50g / I Lower medium Medium TS 0. 85% Nacl + casein 50g / l Upper medium DLC expected: 21 days Time Enumeration Reading Time - ufc / pH box Precipitation 1 (hours) 1 (days) () barcode 14-august 119h00 0 0.0 8.5E + 03 16.51 1 - + 4 C_ 18 Aug 10h00; 87 1 3.6 1 8.9E + 03 6 44 19 Aug 15h00 1 116 4.8 20-Aug 10h00 135 5.6 16.48 1- + I 21-Aug 1 9h00 1 158 6.6 6.41 1 1 + 1968h change of T 122-Aug 1 + 1 7h0â 190 7.9 16.44 25-Aug 1 9.00 254 10.6 + 26-Aug 11.00 1 280 11.7 (6.32 1 + 27-Aug; 9.00 I 302 '12.6 Aug 28 h00 F 326 13.6 29-Aug 19.00 1 350 1- 14.6 101-Sep 9:00 am [422 1 17.6 02-sept '' 09:00 446 1 18.6 03-seven 19:00; 480 1 20.0 05-seven 91145 1 518.75 121.6 08-seven 9H15 1590. 25 124.6 15-seven '', 114.00 1 764 1 31.8 I 21-Aug: changeover to 8 C or 168 hours (7 days) to 4 C 114-Aug 19:00 118 Aug 10:00 119-Aug 15:00 20-Aug 10:00 I 135 I 5.6 f21 Aug, 9:00 158 6.6 + 22-Aug 17:00 190 7.9 ^ 6 36_; - + [2-Aug 9h00 I 254 1 10.6 1 16.36! 126-août '11 h00 1 280 11.7 6.231 127-août; 9h00 1 302 1 12.6 16.21 1 128-août 9h00 326 11 13.6 6.28 L 29- August 9:00 1 350 1 14.6 '1 16.33 1,101-Sep 9:00 422 17.6 _I_ 15.97 102-Sep 9:00 I.446 1 18.6 1 6.02 102-Sep 19:00 456 [19.0 1 15.31 I _ + Date Time 1 Tem ps I (hours) 1 (days) 1 0 1.0.0 1 9.3E + 03 16.47.1 _. 87 3.6 (..9.6E + 03_. 6.47 + .. 1 116 4.8 6.32 - 1 + I 6.48 1 _ + 11 Enumeration (cfu / box) pH Precipitation Reading barcode '4 C Date 16.32; 1 6.3 1 16.32 r - - [626 ', 1 626 (I- + 6261 + + 6.251 + Page 9 out of 83 NUMBER OF TESTS: boxes were made for each scenario, making a total of 80 tests.

CONCLUSION: Le milieu TRACEO précipite à 8 C en 7 jours. CONCLUSION: TRACEO medium precipitates at 8 C in 7 days.

Le glycérol permet d'augmenter la DLC de notre système. Glycerol can increase the DLC of our system.

Pour 15 % de glycérol, la DLC est comprise en 11,7 et 12,6 jours. For 15% glycerol, the DLC is in 11.7 and 12.6 days.

Pour 20 % de glycérol, la DLC est comprise en 19 et 20 jours. For 20% glycerol, the DLC is 19 to 20 days.

Pour 25 % de glycérol, nous n'obtenons pas de précipitation du milieu TRACEO . For 25% glycerol, we do not get precipitation of TRACEO medium.

Page 10 sur 83 DETERMINATION DE LA DLC DE LA SOUCHE 503M10 Page 10 of 83 DETERMINATION OF THE STRAIN DLC 503M10

REPETITIONREPETITION

DATE: 17 octobre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: La croissance de la souche 503M10 est testée sur le milieu TRACEO avec différentes conditions. DATE: October 17, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIENCE: The growth of strain 503M10 is tested on TRACEO medium with different conditions.

Le protocole est le suivant: Scénarios DLC attendue (jours) 1 7 jours (0 et 2% glycérol) 2 15jours(15et16.5%et18% glycérol) 3 répétitions sont réalisées pour ces 2 scénarios OBJECTIF: Valider les résultats de DLC réalisés précédemment (cryo49). The protocol is as follows: DLC scenarios expected (days) 1 7 days (0 and 2% glycerol) 2 15 days (15 and 16.5% and 18% glycerol) 3 repetitions are performed for these two scenarios OBJECTIVE: To validate the results of DLC previously carried out (cryo49).

RESULTATS: Page 11 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche 58 lors du scénariol 7jours Milieu double couche Milieu TRACEO DC sans glycérol+ caseine 50g/l Milieu TS 0.85% Nacl Température moyenne RM14 (4 C) : 3.57 C Température moyenne RE420 (8 C) : 8.03 C TO:denombrement: 8,9.10 3 ufc/boite Date Heure Temps pH moyen Précipitation Lecture code Opacificatior (heures) (jrs) barre 30-sept 18h00 0 0,0 6,27 - + - 01-oct 17h30 23,5 1,0 - + - 02-oct 18h00 48 2,0 - + - 03-sept 9h00 63 2,6 - + 03-oct 12h30 66,5 2,8 6,24 + - 06-oct 9h00 130 5,4 6,27 -1-1- +/+/+ -1-I_ 07-oct 9h00 154 6,4 6,12 -1-I- +/+/+ -1-/- 11h00 156 6,5 6,13 -I-I- +/+I+ -/-/- 14h00 159 6,6 6,08 -I-I- +1+/+ -/-/- 17h00 161 6,7 6,10 -/-/- +/+/+ -/-/- 18h00 164 6,8 6,08 -/-/- +/+/+ -/-/- 08-oct 9h00 178 7,4 5,86 -1-1+/+/+ -I-/- 11 h30 180,5 7,5 5,83 -/-/- +/+/+ -/-/- 15h00 184 7,7 5,73 -/-1- +/+/+ -I-I- 18h00 187 7,8 5,63 -1-1- +/+/+ -/-1- 09-oct 9h00 202 8,4 5,21 +1- bord +/+/+ Début 10h30 203,5 8,5 5,17 +/- bord +/+/+ 14h15 207,25 8,6 5,13 +1- bord +/+/+ 17h00 210 8,8 5,03 +± +1+1+ 18h00 212 8,8 5,03 +I+1+ -I-/- Fin Milieu TRACEO DC avec glycérol(2%)+ caseine 50g/l Milieu TS 0.85% Nacl TO:denombrement: 8,9.10 3 ufc/boite Date Heure Temps pH moyen Précipitation Lecture code Opacificatior (heures) (jrs) barre 30-sept 18h00 0 0,0 6,28 - + - 01-oct 17h30 23,5 1,0 - + - 02-oct 18h00 48 2,0 - + - 03-sept 9h00 63 2,6 - + - 03oct 12h30 66,E 2,8 6;24 - +.. _. RESULTS: Page 11 of 83 Table of growth results of strain 58 during the scenario 7days Double layer medium TRACEO DC medium without glycerol + casein 50g / l Medium TS 0.85% Nacl Average temperature RM14 (4 C): 3.57 C Average temperature RE420 ( 8 C): 8.03 C TO: enumeration: 8.9.10 3 cfu / box Date Time Time average pH Precipitation Reading code Opacificatior (hours) (dd) bar 30-sept 18h00 0 0,0 6,27 - + - 01-oct 17.30 23.5 1.0 - + - 02-Oct 18.00 48 2.0 - + - 03-Sep 9.00 63 2.6 - + 03-Oct 12.30 66.5 2.8 6.24 + - 06-Oct 09.00 130 5,4 6,27 -1-1- + / + / + -1-I_ 07-oct 9:00 154 6,4 6,12 -1-I- + / + / + -1 - / - 11:00 156 6 , 5 6,13 -II- + / + I + - / - / - 2:00 pm 159 6,6 6,08 -II- +1 + / + - / - / - 5:00 pm 161 6,7 6,10 - / - / - + / + / + - / - / - 18h00 164 6,8 6,08 - / - / - + / + / + - / - / - 08-oct 9:00 178 7,4 5,86 -1-1 + / + / + -I - / - 11.30 180.5 7.5 5.83 - / - / - + / + / + - / - / - 15.00 184 7.7 5.73 - / - 1- + / + / + -II- 18h00 187 7,8 5,63 -1-1- + / + / + - / - 1- 09-oct 9:00 202 8,4 5,21 + 1- edge + / + / + Start 10:30 am 203.5 8,5 5,17 + / - edge + / + / + 14h15 207.25 8.6 5,13 + 1- edge + / + / + 17h00 210 8.8 5.03 + ± + 1 + 1 + 18h00 212 8.8 5.03 + I + 1 + -I - / - End Medium TRACEO DC with glycerol (2%) + casein 50g / l Medium TS 0.85% Nacl TO: count: 8.9.10 3 cfu / box Date Time Time average pH Precipitation Reading code Opacificatior ( hours) (dd) bar 30-sept 18.00 0 0.0 6.28 - + - 01-oct 17.30 23.5 1.0 - + - 02-oct 18.00 48 2.0 - + - 03-Sep 9.00 63 2 , 6 - + - 03oct 12h30 66, E 2,8 6; 24 - + .. _.

06-oct 9h00 130 5,4 6,26 -/-/- +/+/+ -/-/- 07-oct 9h00 154 6,4 6,12 -/-/+/+/+ -/-/- 11 h00 156 6,5 6,13 -I-1- +/+/+ -/-/- 14h00 159 6,6 6,19 -1-I+/+I+ -1-1- 17h00 162 6,8 6,13 -I-1- +/+/+ -I-/- 18h00 163 6,8 6,12 -/-/+/+/+ -1-1- 08-oct 9h00 178 7,4 5,96 -/-/- +/+/+ -/-/- 11 h30 180,5 7,5 5,90 -I-l- +I+/+ -I-I- 15h00 184 7,7 5,86 -/-/- +/+/+ -/-/- 18h00 187 7,8 5,78 -/-/- +/+/+ -/-/- 09-oct 9h00 202 8,4 5,39 -/-/- +/+/+ -/-/- 10h30 203,5 8,5 5,39 -1-1- +/+I+ -I-/- 14h15 207,25 8,6 5,28 -I-1- +/+/+ -I-117h00 210 8,8 5,21 +/-bord +/+/+ Début 18h00 212 8,8 5,36 +/-bord +/+/+ 10-oct 9h00 226 9,4 5,00 +/-bord +/+/+ Léger 16h00 233 9,7 4,98 +/-bord +/+/+ Léger 17h00 234 9,8 4,93 +/+I+ -I-1- _ Fin Passage à 8 C te 3110103 à 12h30 iôit 66,5 h à4 C(2,8 jours) Milieu inférieur Milieu supérieur Milieu inférieur Milieu supérieur (Milieu double couche Milieu TRACEO DC sans glycérol+ caseine 50g/l Milieu TS 0.85% Nacl TO:denombrement: 9,0.103 ufc/boite Date Heure Temps pH moyen Précipitation Lecture code Opacificatio (heures) (jrs) barre 02-oct 12h00 0 0,0 6,26 - + - 03-oct 12h00 24 1,0 - + - 04-oct 12h00 48 2,0 - + - 0 - et 9h00 69. 2,9 + - 1 06-oct 9h00 93 3,9 6,31 -I-I- +/+/+ -1-1- 07-oct 9h00 117 4,9 6,31 -I-I+/+/+ -1-1- 08-oct 9h00 141 5,9 6,24 -I-I- +/+/+ -1-1- 09-oct 10h30 166,5 6,9 5,90 -/-/- +/+/+ -/-/- 17h00 173 7,2 5,75 -/-/- +/+/+ -/-/- 10-oct 9h00 189 7,9 5,43 -I-/- +/+/+ -/-/- 16h00 196 8,2 5,35 -I-I- +1+1+ -/-/11-oct 12h00 216 9,0 4,92 ±/±/± -1-1- ±1±/± 12-oct 9h00 213 8,9 4,79 +1+1+ -I-I- +/+/+ 13-oct 9h00 237 9,9 4,75 +1+1+ -1-1- +/+/+ Milieu inférieur Milieu supérieur Milieu TRACEO DC avec glycérol(2%)+ caseine 50g/1 Milieu TS 0. 85% Nacl Milieu inférieur Milieu supérieur TO:denombrement: 9.0.10 3 ufc/boite Date Heure Temps pH moyen Précipitation Lecture code Opacificatio (heures) (jrs) barre 02-oct 12h00 0 0,0 6,26 - + - 03-oct 12h00 24 1,0 - + - 04-oct 12h00 48 2,0 - + 05-oct 9h00 69 2,9 06-oct 9h00 93 3,9 6,31 -1-1- +/+/+ -/-/- 07-oct 9h00 117 4,9 6,29 -I-I- +/+/+ -/-/- 08-oct 9h00 141 5,9 6,26 -/-/- +/+/+ -N08-cet 17h00 150 6,3 5,77 -I-I- +/+/+ -/-/- 09-oct 10h30 165 6,9 10-oct 9h00 187,5 7,8 5,40 -/-/- +/+/+ -/-/- 16h00 194,5 8,1 5,36 -1-I- +/+/+ -1-1- 18h00 196,5 8,2 5,21 -/-/- +/+/+ -/-/- 11-oct 12h00 214,5 8,9 4,91 ±1+/+ -I-/- ±/+/+ 12-oct 9h00 235,5 9,8 4,70 +1+1+ -/-I- +/+/+ 13-oct 9h00 259,5 10,8 4,70 +1+1+ -/-/- +1+1+ 105110103 passage à 8 C à 9H soit 29j à 4 C Page 13 sur 83 Milieu TS 0. 85% Nacl Milieu supérieur TO:denombrement: 8,8.10 3 ufc/boite Date Heure Temps pH moyen Précipitation Lecture code Opacification (heures) (jrs) barre 07-oct 18h00 0 0,0 6,28 - + _ 08-oct 9h00 15 0,6 09-oct 9h00 39 1,6 10-oct 9h00 63 2,6 10-oct 12h30 66,5 2,8 6,35 < + -. 06-oct 9h00 130 5,4 6,26 - / - / - + / + / + - / - / - 07-oct 9:00 154 6,4 6,12 - / - / + / + / + - / - / - 11 h 00 156 6,5 6,13 -I-1- + / + / + - / - / - 14:00 159 6,6 6,19 -1-I + / + I + -1-1- 17:00 162 6.8 6,13 -I-1- + / + / + -I - / - 18:00 163 6,8 6,12 - / - / + / + / + -1-1- 08-oct 9:00 178 7.4 5, 96 - / - / - + / + / + - / - / - 11.30 180.5 7.5 5.90 -Il- + I + / + -II- 15.00 184 7.7 5.86 - / - / - + / + / + - / - / - 18:00 187 7,8 5,78 - / - / - + / + / + - / - / - 09-oct 9:00 202 8,4 5,39 - / - / - + / + / + - / - / - 10h30 203.5 8.5 5.39 -1-1- + / + I + -I - / - 14h15 207.25 8.6 5.28 -I-1- + / + / + -I-117.00 210 8.8 5.21 +/- edge + / + / + Start 18.00 212 8.8 5.36 +/- edge + / + / + 10-oct 9.00 226 9.4 5 , 00 +/- edge + / + / + Light 16h00 233 9.7 4.98 +/- edge + / + / + Light 17h00 234 9.8 4.93 + / + I + -I-1- _ End Passage at 8 C teens 3110103 at 12:30 hrs 66.5 hrs at 4 C (2.8 days) Lower medium Upper medium Lower medium Upper medium (Double layer medium TRACEO DC medium without glycerol + casein 50g / l Medium TS 0.85% Nacl TO: enumeration: 9.0.103 cfu / box Date Time Time Average pH Precipita Reading code Opacificatio (hours) (days) bar 02-oct 12h00 0 0,0 6,26 - + - 03-oct 12:00 24 1,0 - + - 04-oct 12:00 48 2,0 - + - 0 - and 9:00 69. 2,9 + - 1 06-Oct 9:00 93 3,9 6,31 -II- + / + / + -1-1- 07-Oct 9:00 117 4.9 6.31 -I-I + / + / + -1-1- 08-oct 9:00 141 5,9 6,24 -II- + / + / + -1-1- 09-oct 10:30 166,5 6,9 5,90 - / - / - + / + / + - / - / - 17:00 173 7,2 5,75 - / - / - + / + / + - / - / - 10-oct 9:00 189 7,9 5,43 -I - / - + / + / + - / - / - 16h00 196 8.2 5.35 -II- + 1 + 1 + - / - / 11-oct 12h00 216 9.0 4.92 ± / ± / ± -1-1 ± 1 ± / ± 12-oct 9:00 213 8,9 4,79 + 1 + 1 + -II- + / + / + 13-oct 9:00 237 9,9 4,75 + 1 + 1 + -1-1- + / + / + Lower medium Upper medium Medium TRACEO DC with glycerol (2%) + casein 50g / 1 Medium TS 0. 85% Nacl Lower medium Upper medium TO: enumeration: 9.0.10 3 cfu / box Date Time Time Average pH Precipitation Code reading Opacificatio (hours) (dd) bar 02-oct 12h00 0 0,0 6,26 - + - 03-oct 12h00 24 1,0 - + - 04-oct 12:00 48 2,0 - + 05-oct 9:00 69 2.9 06-oct 9.00 93 3.9 6.31 -1-1- + / + / + - / - / - 07-oct 9:00 117 4,9 6,29 -II- + / + / + - / - / - 08-oct 9:00 141 5,9 6,26 - / - / - + / + / + -N08-this 17:00 150 6, 3 5,77 -II- + / + / + - / - / - 09-oct 10:30 165 6,9 10-oct 9:00 187,5 7,8 5,40 - / - / - + / + / + - / - / - 16:00 194,5 8,1 5,36 -1-I- + / + / + -1-1- 18:00 196,5 8.2 5.21 - / - / - + / + / + - / - / - 11-oct 12h00 214.5 8.9 4.91 ± 1 + / + -I - / - ± / + / + 12-oct 9.00 235.5 9.8 4.70 + 1 + 1 + - / -I- + / + / + 13-oct 9h00 259.5 10.8 4.70 + 1 + 1 + - / - / - + 1 + 1 + 105110103 changeover to 8 C to 9H or 29j to 4 C Page 13 of 83 Medium TS 0. 85% Nacl Upper medium TO: enumeration: 8.8.10 3 cfu / box Date Time Time Average pH Precipitation Reading code Opacification (hours) (dd) bar 07-oct 18h00 0 0,0 6,28 - + _ 08-Oct 9:00 15 0.6 09-Oct 9.00 39 1.6 10-Oct 9.00 63 2.6 10-Oct 12.30 66.5 2.8 6.35 <+ -.

13-oct 16h30 142,5 5,9 6,28 -/-/- +/+/+ _1-/_ 14-oct 9h00 159 6,6 6,04 -1-1- +/+/+ 15-oct 14h00 188 7,8 5,31 +1+1+ _/+1+ +1+1+ 16h00 190 7,9 5,43 +/+/+ -/-/- +/+/+ 17h00 191 8,0 5,27 +1+1+ -/-/- +1+1+ Milieu TRACEO DC avec glycérol(2%)+ caseine 50g/l Milieu TS 0.85% Nacl TO:denombrement: 9,0.10 3 ufc/boite Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification (heures) (jrs) barre 07-oct 18h00 0 0,0 6,25 - + _ 08-oct 9h00 15 0,6 09-oct 9h00 39 1,6 10-oct 9h00 63 2,6 10-oct 12h30 66,5 2,8 6;43 13-oct 16h30 142,5 5,9 6,27 -I-/- +/+/+ 14-oct 9h00 159 6,6 6,05 -I-I- +/+/+ 15-oct 14h00 188 7,8 5,38 +1+1+ +/+/+ 16h00 190 7,9 5,43 +1+1+ -1-/+ +1+1+ 17h00 191 8,0 5,30 +1+1+ -/-/- +/+/+ (Passage à 8 C le 10110/03 à 12h30 soit 66,5 h à 4 C(2,8 jours Milieu inférieur Milieu supérieur Page 14 sur 83 scénario 2 Milieu TRACEO DC 15% glycérol+ caseine 50g/I Milieu TS 0.85% Nacl Milieu inférieur Milieu supérieur Tableau de résultats de croissance de la souche 58 lors du scénario2 15jours Milieu double couche To: Denombrment 8,7.10 3 ufc/boite Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification (heures) (jrs) barre 08-oct 12h00 0 0,0 6,23 - + - 13-oct 12h00 120 5,0 6,39 16-oct 17h00 197 8,2 6,34 - + 17-oct 11 h30 215,5 9,0 5,92 - + - 18h00 223 9,3 6,03 20-oct 9h00 285 11,9 5,02 +I+1+ -/-I- +1+/+ Passage etites cola Milieu TRACEO DC avec glycérol(16.5%)+ caseine 50g/I Milieu TS 0.85% NacI Milieu inférieur Milieu supérieur To: Denombrment 8,7.10 3 ufc/boite Date Heure Temps pH moyen Précipitation Lecture code Opacification (heures) (jrs) barre 08-oct 12h00 0 0,0 6,23 - + - 13-oct 12h0â 120 5 0 6,34 + _ - 16-oct 17h00 197 8,2 6,33 - + - 17-oct 11h30 215,5 9,0 6,1 - + - 18h00 223 9,3 6,34 - + 20-oct 9h00 285 11,9 5,04 ±I+/+ +1-1- ±1+/+ *** 11h00 287 12,0 5,09 +/+/+ -/-/_ +/+/+ ***Le 20 octobre à 9h00 une seule boite sur 9 restante: Précipitation +/- Opacification +/- Lecture code barre + La lecture dà 11 h est réalisée sur cette seule boite. 13-oct 16:30 142.5 5.9 6.28 - / - / - + / + / + _1 - / _ 14-oct 9.00 159 6.6 6.04 -1-1- + / + / + 15- Oct 14:00 188 7.8 5,31 + 1 + 1 + _ / + 1+ + 1 + 1 + 16:00 190 7,9 5,43 + / + / + - / - / - + / + / + 17:00 191 8 , 0 5,27 + 1 + 1 + - / - / - + 1 + 1 + TRACEO DC medium with glycerol (2%) + casein 50g / l Medium TS 0.85% Nacl TO: enumeration: 9,0.10 3 cfu / box Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification (hours) (days) bar 07-oct 18:00 0 0,0 6,25 - + _ 08-oct 9:00 15,06 09-oct 9:00 39 1,6 10-oct 9:00 63 2.6 10-Oct 12.30 66.5 2.8 6; 43 13-Oct 16.30 142.5 5.9 6.27 -I - / - + / + / + 14-Oct 9.00 159 6.6 6.05 -II- + / + / + 15-oct 14:00 188 7.8 5,38 + 1 + 1 + + / + / + 16:00 190 7,9 5,43 + 1 + 1 + -1 - / + +1+ 1+ 5:00 pm 191 8,0 5,30 + 1 + 1 + - / - / - + / + / + (Change to 8 C on 10110/03 at 12:30 or 66.5 h at 4 C (2.8 days) Medium lower Upper medium Page 14 of 83 scenario 2 Medium TRACEO DC 15% glycerol + casein 50g / I Medium TS 0.85% Nacl Lower medium Upper medium Table of growth results of strain 58 in scenario 2 15 days Medium double layer To: Denombrment 8,7.10 3 ufc / box Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification (hours) (days) bar 08-oct 12h00 0 0,0 6,23 - + - 13-oct 12:00 120 5, 0 6.39 16-oct 17.00 197 8.2 6.34 - + 17-oct 11.30 215.5 9.0 5.92 - + - 18.00 223 9.3 6.03 20-oct 9.00 285 11.9 5.02 + I + 1 + - / - I- +1 + / + Passage eta cola TRACEO DC medium with glycerol (16.5%) + casein 50g / I Medium TS 0.85% NacI Lower medium Upper medium To: Denombrment 8.7.10 3 cfu / box Date Time Time Average pH Precipitation Reading code Opacification (hours) (days) bar 08-oct 12h00 0 0,0 6,23 - + - 13-oct 12h0â 120 5 0 6,34 + _ - 16-oct 17:00 197 8.2 6.33 - + - 17-Oct 11.30 215.5 9.0 6.1 - + - 18.00 223 9.3 6.34 - + 20-oct 9.00 285 11.9 5.04 ± I + / + + 1-1- ± 1 + / + *** 11h00 287 12,0 5,09 + / + / + - / - / _ + / + / + *** On October 20 at 9:00 a single box on Remaining 9: Precipitation +/- Opacification +/- Reading bar code + The reading at 11 am is done on this single box.

scénario 2 Page 15 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche 58 lors du scénario2 15jours Milieu double couche Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification (heures) (jrs) barre 17-oct 18h00 0 0,0 6,15 -I-I- +/+/+ -/-/- 23-oct 18h00 144 6,0 -/-/- +/+/+ -/-/- 24-oct 16h30 166,5 6,9 6,13 -I-I- +/+/+ -I-I- 27-oct 16h00 238 9,9 5,66 -I-I+/+/+ -I-I- 28-oct 17h00 263 11,0 5,26 Début +/+/+ -I-I- 29-oct 14h00 284 11,8 5,03 +/+/+ -/-/- +/+/+ Milieu TRACEO DC 15% glycérol+ caseine 50g/l Milieu TS 0.85% Nacl sans caséine scénario 1 Milieu inférieur Milieu supérieur Milieu TRACEO DC avec glycérol(16.5%)+ caseine 50g11 Milieu TS 0.85% Nacl sans caséine Milieu inférieur Milieu supérieur scénario 1 Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification (heures) Ors) barre 17-oct 18h00 0 0,0 6,15 -I-I- +/+/+ -I-I- 23-oct 18h00 144 6,0 -I-I+/+/+ -I-I- 24-oct 16h30 166,5 6,9 6,20 -I-l- +I+/+ -I-I- 27-oct 16h00 238 9,9 5,99 -l-I- +/+/+ -I-I- 28-oct 17h00 263 11,0 5,70 -I-I- +/+/+ -I-/29-oct 14h00 284 11,8 5,29 Début +/+/+ Début 18h00 288 12,0 5,35 +/+/+ 30-oct 9h00 303 12,6 5,06 +++ --- +++ Page 16 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche 58 lors du scénario 2 15 jours Milieu TRACEO DC avec glycérol 18% + caséine 50g/l Milieu TS 0,85% NACL sans caséine Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification Heures Jours 22-nov 18h00 0 0,00 6,33 - + - 27-oct 18f00 120 500 633 + - 29-oct 14h00 164 6,83 6,39 - + - 03-nov 17h00 287 11,96 5,17 Début + Début 04-nov 9h00 303 12,63 5,04 + - + NOMBRE D'ESSAIS: boites sont réalisées pour chaque essais soit 120 essais sont effectués. scenario 2 Page 15 of 83 Table of growth results of strain 58 in scenario 2 15 days Double layer media Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification (hours) (days) bar 17-oct 18:00 0 0,0 6,15 -II - + / + / + - / - / - 23-oct 18:00 144 6,0 - / - / - + / + / + - / - / - 24-oct 16:30 166,5 6,9 6,13 -II- + / + / + -II- 27-oct 16h00 238 9,9 5,66 -I-I + / + / + -II- 28-oct 17:00 263 11,0 5,26 Start + / + / + -II- 29-oct 14h00 284 11,8 5,03 + / + / + - / - / - + / + / + Medium TRACEO DC 15% glycerol + casein 50g / l Medium TS 0.85% Nacl casein-free scenario 1 Lower medium Upper medium Medium TRACEO DC with glycerol (16.5%) + casein 50g11 Medium TS 0.85% Nacl without casein Lower medium Upper medium scenario 1 Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification (hours) Ors) bar 17-oct 18h00 0 0,0 6,15 - II- + / + / + -II- 23-oct 18h00 144 6,0 -I-I + / + / + -II- 24-oct 16:30 166,5 6,9 6,20 -Il- + I + / + - II- 27-Oct 16h00 238 9.9 5.99 -I- + / + / + -II- 28-Oct 17h00 263 11.0 5.70 -II- + / + / + -I- / 29-oct 14.00 284 11.8 5.29 Start + / + / + Start 18.00 288 12.0 5.35 + / + / + 30-oct 9h00 303 12.6 5.06 +++ --- +++ Page 16 of 83 Table of growth results of strain 58 in scenario 2 15 days Medium TRACEO DC with glycerol 18% + casein 50g / l Medium TS 0.85% NACL without casein Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification Hours Days 22-nov 18h00 0 0,00 6,33 - + - 27-oct 18f00 120 500 633 + - 29-oct 14h00 164 6, 83 6.39 - + - 03-nov 17.00 287 11.96 5.17 Start + Start 04-nov 9.00 303 12.63 5.04 + - + NUMBER OF TESTS: boxes are made for each test, ie 120 tests are carried out performed.

CONCLUSION: Les résultats obtenus sont cohérents par rapport à ceux obtenus précedemment. II reste à affiner nos lectures par d'autres répétitions. CONCLUSION: The results obtained are consistent with those obtained previously. It remains to refine our readings by other repetitions.

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DETERMINATION DU TAUX DE CROISSANCE OPTIMAL DE LA DETERMINING THE OPTIMUM GROWTH RATE OF

SOUCHE 503M10 DATE: 1 septembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Le taux de croissance optimal est déterminé en gélose sur le milieu TRACEO. Le protocole est le suivant: Aw opt PH opt T( C) T( C) T( C) 0.992 6.4 4 C 8 C 30 C La souche est inoculée à 10 ufclml. STRAIN 503M10 DATE: September 1st, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIENCE: The optimal growth rate is determined in agar on TRACEO medium. The protocol is the following: Aw opt PH opt T (C) T (C) T (C) 0.992 6.4 4 C 8 C 30 C The strain is inoculated at 10 μfclml.

OBJECTIF: Cette expérience permet de déterminer le taux de croissance optimale de la souche 503M10; Page 18 sur 83 RESULTATS: Calcul du popt de la souche 58 sur le milieu tracéo aux conditions optimales Aw=0.992 et pH=6.4 T 4 C Temps ufc/boite Log(ufc/boite) 0 1.10E+04 4.04 24.75 1.00E+04 4.00 88.75 8.70E+05 5.94 114.75 3.30E+06 6.52 121.25 5.50E+06 6.74 136.75 9.30E+07 7.97 160.75 1.00E+08 8.00 184.75 5.40E+09 9.73 0.0889(h"-"1)[ 0.0540; 0.1238] leg= 44.84]h)[ 0.86; 88.81] ( 1.870) log_1_0(X_m_a_x)= 27.59[-85448608.43;85448663.62] 1 2 3 log_1_0(X_o)= 4.02[ 3.23; 4.81] Page 19 sur 83 Calcul du pop' de la souche 58 sur le milieu tracéo aux conditions optimales Aw=0.992 et pH=6. 4 T 8 C Temps ufc/boite Log(ufc/boite) 0 1.10E+04 4.04 24.75 1.00E+04 4.00 88.75 1.50E+06 6.18 114.75 9.20E+07 7.96 120.75 1.80E+07 7.26 136.75 5.30E+08 8.72 160.75 7.70E+08 8.89 0 1 2 log_7_0(X_o)- 4.02( 3.05; 4.99] N m_e_xÉ 01198(h"-'l)[ 0.0066; 0.2329] lag- 46.91(h)[ -17.23; 11105]( 1.95()) log_1 0(X_m_a x)= 8.99[ 7.41; 10.56] R'-0.97829 3 4 tmmnm Page 20 sur 83 Calcul du popt de la souche 58 sur le milieu tracéo aux conditions optimales Aw=0.992 et pH=6.4 T 30 C Temps(heures) ufc/boite(a) Loq(ufc/boite)(a) 0 1.00E+03 3 2.5 1.00E+03 3 4.5 6.10E+03 3.79 5.5 9.10E+03 3.96 7 5.10E+04 4.71 9.30E+08 8.97 17.5 1.20E+09 9.08 21.5 9.80E+08 8.99 22 1.20E+09 9.08 3Q L 0 01 0.2 03 0.4 0.5 016 0.7 0.8 0.9 log_7 OV,o)É 3.04[ 2.82: 1271 'wmnslR 11..8_exÉ 11B760) - l)[ 19934: 1.3818) IegÉ 29005[ 2.15: 1651( 0.120) log_1 07<_m_e_.)- 908[ 889: 926] R.099991 NOMBRES D'ESSAIS: 3 essais ont été nécessaires pour déterminer le taux de croissance optimale de cette souche. OBJECTIVE: This experiment determines the optimal growth rate of strain 503M10; RESULTS: Calculation of the strain of the strain 58 on the traceo medium at optimal conditions Aw = 0.992 and pH = 6.4 T 4 C Time cfu / log box (cfu / box) 0 1.10E + 04 4.04 24.75 1.00E + 04 4.00 88.75 8.70E + 05 5.94 114.75 3.30E + 06 6.52 121.25 5.50E + 06 6.74 136.75 9.30E + 07 7.97 160.75 1.00E + 08 8.00 184.75 5.40E + 09 9.73 0.0889 (h "-" 1) [0.0540; 0.1238] leg = 44.84] h) [0.86; 88.81] (1.870) log_1_0 (X_m_a_x) = 27.59 [-85448608.43; 85448663.62] 1 2 3 log_1_0 (X_o) = 4.02 [3.23; 4.81] Page 19 of 83 Calculation of the pop of the strain 58 on the traceo medium at optimal conditions Aw = 0.992 and pH = 6. 4 T 8 C Time ufc / box Log (ufc / box) 0 1.10E + 04 4.04 24.75 1.00E + 04 4.00 88.75 1.50E + 06 6.18 114.75 9.20E + 07 7.96 120.75 1.80E + 07 7.26 136.75 5.30E + 08 8.72 160.75 7.70E + 08 8.89 0 1 2 log_7_0 (X_o) - 4.02 (3.05; 4.99) N m_e_xÉ 01198 (h "- 'l) [0.0066; 0.2329] lag-46.91 (h) [-17.23; 11105] (1.95 ( )) log_1 0 (X_m_a x) = 8.99 [7.41; 10.56] R'-0.97829 3 4 tmmnm Page 20 of 83 Calculation of the strain of strain 58 on the tracer medium at optimal conditions Aw = 0.992 and pH = 6.4 T 30 C Time (hours) ufc / box (a) Loq (ufc / box) (a) 0 1.00E + 03 3 2.5 1.00E + 03 3 4.5 6.10E + 03 3.79 5.5 9.10E + 03 3.96 7 5.10E + 04 4.71 9.30 E + 08 8.97 17.5 1.20E + 09 9.08 21.5 9.80E + 08 8.99 22 1.20E + 09 9.08 3Q L 0 01 0.2 03 0.4 0.5 016 0.7 0.8 0.9 log_7 OV, o) S 3.04 [2.82: 1271 'wmnslR 11 .. 8_exE 11B760) - 1) [19934: 1.3818] IegE 29005 [2.15: 1651 (0.120) log_1 07 <_m_e _.) - 908 [889: 926] R.099991 NUMBER OF TESTS: 3 tests were necessary to determine the rate optimal growth of this strain.

CONCLUSION: Les taux de croissance de la souche 503M10 sont: 0.088 h-1 à 4 C 0.1198 h-1 à 8 C 1.1876 h-1 à 30 C Page 21 sur 83 STABILITE DE LA SOUCHE 503M10 à 20 C DATE: 22 septembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: La croissance de la souche est testée dans 4 milieux différents. La composition est la suivante: Milieux Tryptone(%) Nacl (g/I) 1 0.2 8.5 2 0.5 8.5 3 0.0 8.5 4 0.1 8.5 OBJECTIF: Ces essais permettent de déterminer un milieu stable à 20 C pour la souche 503M 10. CONCLUSION: The growth rates of strain 503M10 are: 0.088 h-1 at 4 C 0.1198 h-1 at 8 C 1.1876 h-1 at 30 C Page 21 of 83 STABILITY OF STRAIN 503M10 at 20 C DATE: September 22, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIENCE: The growth of the strain is tested in 4 different environments. The composition is as follows: Tryptone Media (%) Nacl (g / I) 1 0.2 8.5 2 0.5 8.5 3 0.0 8.5 4 0.1 8.5 OBJECTIVE: These tests make it possible to determine a stable medium at 20 C for strain 503M10.

Page 22 sur 83 RESULTATS: 0.2g/l tryptone 0.5g/1 tryptone Date Heure Temps ufc/g log(ufc/g) ufc/g log(ufc/g) 09/09/03 17h00 1 7.50E+03 3.88 8.50E+03 3.93 11/09/03 9h00 41 5.70E+05 5.76 3.20E+05 5.51 15/09/0310h00 138 4.40E+05 5.64 4.40E+05 5.64 22/09/0318h00 314 1.90E+05 5.28 1.70E+05 5.23 24/09/0316h00 360 2.00E+03 3.30 2.60E+05 5.41 26/09/0310h00 402 3.20E+04 4.51 2.30E+04 4.36 Milieu 1 et 2 Page 23 sur 83 Milieu 3 et 4 sans tryptone 0,l g tryptone Date Heure Temps ufc/g log(ufc/g) ufclg log(ufc/g) 22/09/0218h00 0 1.60E+03 3.20 2.40E+03 3.38 24/09/0316h00 46 3.20E+04 4.51 6.90E+03 3.84 26/09/0310h00 88 5.20E+04 4.72 1.70E+04 4.23 30/09/0310H00 184 4.70E+04 4.67 2.90E+04 4.46 03/10/039h30 279.5 1.00E+05 5 3.40E+04 4.53 10/10/0317h00 375 7.60E+04 4.88 4.20E+04 4.62 NOMBRE D'ESSAIS: 4 essais ont été nécessaires pour l'obtention de ces résultats. RESULTS: 0.2g / l tryptone 0.5g / 1 tryptone Date Time Time ufc / g log (cfu / g) ufc / g log (cfu / g) 09/09/03 17:00 1 7.50E + 03 3.88 8.50 E + 03 3.93 11/09/03 9:00 41 5.70E + 05 5.76 3.20E + 05 5.51 15/09 / 0310h00 138 4.40E + 05 5.64 4.40E + 05 5.64 22/09 / 0318h00 314 1.90E + 05 5.28 1.70E +05 5.23 24/09 / 0316h00 360 2.00E + 03 3.30 2.60E + 05 5.41 26/09 / 0310h00 402 3.20E + 04 4.51 2.30E + 04 4.36 Medium 1 and 2 Page 23 of 83 Medium 3 and 4 without tryptone 0 , lg tryptone Date Time Time ufc / g log (ufc / g) ufclg log (ufc / g) 22/09 / 0218h00 0 1.60E + 03 3.20 2.40E + 03 3.38 24/09 / 0316h00 46 3.20E + 04 4.51 6.90 E + 03 3.84 26/09 / 0310h00 88 5.20E + 04 4.72 1.70E + 04 4.23 30/09 / 0310H00 184 4.70E + 04 4.67 2.90E + 04 4.46 03/10 / 039h30 279.5 1.00E + 05 5 3.40E + 04 4.53 10/10 / 0317h00 375 7.60E + 04 4.88 4.20E + 04 4.62 NUMBER OF TESTS: 4 tests were necessary to obtain these results.

CONCLUSION: Le milieu TS avec 0.1 g/l de tryptone semble être le milieu le plus approprié. En effet il est le plus table à 20 C. CONCLUSION: TS medium with 0.1 g / l tryptone seems to be the most suitable medium. Indeed it is the most table at 20 C.

Page 24 sur 83 DETERMINATION DU TAUX DE CROISSANCE DE LA SOUCHE 503M10 EN PRESENCE DE DIFFERENTS SUCRES: glucose, lactose, galactose et saccharose. Page 24 of 83 DETERMINATION OF THE GROWTH RATE OF THE 503M10 STRAIN IN THE PRESENCE OF DIFFERENT SUGARS: glucose, lactose, galactose and sucrose.

DATE: 17 septembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Des taux de croissance de la souche 503M10 vont être déterminés au Bioscreen en fonction des différents sucres présents dans le milieu TRACEO. DATE: September 17, 2003 CONDITIONS OF EXPERIENCE: Growth rates of strain 503M10 will be determined at Bioscreen according to the different sugars present in the TRACEO medium.

Les concentrations testées sont 10 et 20g/I. The concentrations tested are 10 and 20 g / l.

OBJECTIF: Augmenter ou ralentir la croissance de la souche 503M10 RESULTATS: Les taux de croissance sont consignés dans le tableau cidessous: 10g/I 20g1l Dextrose 0,61 0,517 0,597 0,493 Lactose 0,572 0,607 0,607 0,546 Galactose 0,56 0,522 0,572 0,588 Fructose 0,638 0,763 0,661 0,485 Saccharose 0,605 Taux de croissance en fonction des concentrations de sucres 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 1 0,4 0.3 0,2 0.1 0 D10g/1 ^ 10g/l ^ 20gn ^ 20g/1 oya ya Q4 aF sucres Page 25 sur 83 NOMBRE D'ESSAIS: 18 essais sont effectués. OBJECTIVE: To increase or slow the growth of strain 503M10 RESULTS: The growth rates are recorded in the table below: 10g / I 20g1l Dextrose 0.61 0.517 0.597 0.493 Lactose 0.572 0.607 0.606 0.546 Galactose 0.56 0.522 0.572 0.588 Fructose 0.638 0.763 0.661 0.485 Sucrose 0.605 Growth rate as a function of sugar concentrations 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 1 0.4 0.3 0.2 0.1 0 D10g / 1 ^ 10g / l ^ 20gn ^ 20g / 1 oya ya Q4 aF sugars Page 25 of 83 NUMBER OF TESTS: 18 tests are carried out.

CONCLUSION: Le taux de croissance de la souche 503M10 en présence de différents sucres varie peu. Le taux de croissance est peu sensible à la concentration en sucre du milieu. CONCLUSION: The growth rate of strain 503M10 in the presence of different sugars varies little. The growth rate is insensitive to the sugar concentration of the medium.

Page 26 sur 83 ETUDE DE L'ACTION INHIBITRICE DE 2 TYPES DE COLLES Page 26 of 83 STUDY OF THE INHIBITING ACTION OF 2 TYPES OF GLUES

FOURNIS PAR LA SOCIETE CRYOLOGSUPPLIED BY CRYOLOG COMPANY

DATE: 18 septembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Les 2 colles fournies par la société CRYOLOG sont: Resinated permanent PSA Non résinated permanent PSA La croissance de la souche est testée à 15 C dans le milieu TRACEO contenant 10% et 50% des 2 colles fournis. Cette croissance est comparée à un témoin contenant 10% et 50% d'eau distillée. DATE: September 18, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIENCE: The 2 adhesives provided by the company CRYOLOG are: Resinated permanent PSA Non resinated permanent PSA The growth of the strain is tested at 15 C in the medium TRACEO containing 10% and 50% of the 2 glues provided. This growth is compared to a control containing 10% and 50% distilled water.

OBJECTIF: Ces colles peuvent être utilisées dans le processus industriel. Il est important de tester leur inhibition sur la souche 503M10. OBJECTIVE: These glues can be used in the industrial process. It is important to test their inhibition on the 503M10 strain.

Page 27 sur 83 RESULTATS: T10% Log T50% 0110% C150% 0210% C250% Date heure Temps(heures) ufc/g ufc/g ufc/g ufc/g ufc/g ufc/g 16/10/2003 10h00 0 1,10E+04 4,04 7,90E+03 3,90 1,20E+04 4,08 1,00E+04 4, 00 9,60E+03 3,98 1,10E+04 4,04 12h15 2,25 2,10E+04 4,32 1,80E+04 4,26 1,50E+04 4,18 1,20E+04 4,08 1,70E+ 04 4,23 1,00E+04 4,00 13h45 3,75 3,30E+04 4,52 2,70E+04 4,43 2,20E+04 4,34 1,80E+04 4,26 2,30E+ 04 4,36 1,20E+04 4,08 15h45 5,75 6,60E+04 4,82 4,80E+04 4,68 1,90E+04 4,28 2,00E+04 4,30 3,60E+ 04 4,56 1,30E+04 4,11 17h30 7,5 1,10E+05 5,04 1,20E+05 5,08 4,70E+04 4,67 3,50E+04 4,54 5,00E+ 04 4,70 2,00E+04 4,30 17/10/2003 9h00 23 1,30E+07 7,11 1,30E+07 7,11 1,50E+06 6,18 9,60E+05 5, 98 7,70E+06 6,89 4,40E+05 5,64 12h00 26 3,60E+07 7,56 2,20E+07 7,34 3,00E+06 6,48 1,60E+06 6,20 7,00E+ 06 6,85 5,00E+05 5,70 14h00 28 5,10E+07 7,71 3,70E+07 7,57 4,70E+06 6,67 2,90E+06 6,46 2,00E+ 07 7,30 1,00E+06 6,00 Ni CO 0) CO Ni Page 28 sur 83 Témoin 10% Témoin 50% l.m 103.1_041251. 404 3%: .111 ti n 030116n'-}1 02560 071771 105.000 63.t_0x_.r.y.F 203140159485125331 5073719 1 pmax=0,3071 [0,2960 0,3183] Colle 1 10% b3.1_00{2o1. 334 312: 2481 0.45 r 022211 "-11 61215: 021351 b9rtW b4.1_0)G3_5345 X9W191A 61211.12000003a0:19180%62121111uwA(O 34 pmax=0,2227 [0,1719 0,2735] Colle 2 10% 104.1_0752* 397 361: 4225 0413311C11 02355: 031,71 43.5 _00!_, e.M 2234e 6613310153>77]600]0]p 9323 t33t01532336COXOe W1 pmax=0,2758 [0,2359 0,3157] Cl: Colle Résinated permanent PSA C2: Colle Non Résinated permanent PSA 341_1352* 394 319: 1131 0]qn".-11 02163. 070n 0030. RESULTS: T10% Log T50% 0110% C150% 0210% C250% Date Time Time (hours) ufc / g ufc / g ufc / g ufc / g ufc / g ufc / g 16/10/2003 10:00 0 1,10E + 04 4,04 7,90E + 03 3,90 1,20E + 04 4,08 1,00E + 04 4, 00 9,60E + 03 3,98 1,10E + 04 4,04 12h15 2 , 25 2,10E + 04 4,32 1,80E + 04 4,26 1,50E + 04 4,18 1,20E + 04 4,08 1,70E + 04 4,23 1,00E + 04 4,00 13:45 3,75 3,30E + 04 4,52 2,70E + 04 4,43 2,20E + 04 4,34 1,80E + 04 4,26 2,30E + 04 4,36 1,20E + 04 4,08 15h45 5.75 6.60E + 04 4.82 4.80E + 04 4.68 1.90E + 04 4.28 2.00E + 04 4.30 3.60E + 04 4.56 1.30E + 04 4, 11 17h30 7.5 1,10E + 05 5,04 1,20E + 05 5,08 4,70E + 04 4,67 3,50E + 04 4,54 5,00E + 04 4,70 2,00E + 04 4 , 30 17/10/2003 9:00 23 1,30E + 07 7,11 1,30E + 07 7,11 1,50E + 06 6,18 9,60E + 05 5, 98 7,70E + 06 6,89 4 , 40E + 05 5.64 12.00 26 3.60E + 07 7.56 2.20E + 07 7.34 3.00E + 06 6.48 1.60E + 06 6.20 7.00E + 06 6.85 5, 00E + 05 5.70 14.00 28 5.10E + 07 7.71 3.70E + 07 7.57 4.70E + 06 6.67 2.90E + 06 6.46 2.00E + 07 7.30 1.00E +06 6,00 Ni CO 0) CO Ni Page 28 of 83 Control 10% Control 50% lm 103.1_041251. 404 3%: ## EQU1 ## 203140159485125331 5073719 1 pmax = 0.3071 [0.2960 0.3183] Adhesive 1 10% b3.1_00 {2o1. 334 312: 2481 0.45 r 022211 "-11 61215: 021351 b9rtW b4.1_0) G3_5345 X9W191A 61211.12000003a0: 19180% 62121111uwA (O 34 pmax = 0.2227 [0.1719 0.2735] Adhesive 2 10% 104.1_0752 * 397 ## EQU1 ## Not Resinated Permanent PSA 341_1352 * 394 319: 1131 0] qn ".- 11 02163. 070n 0030.

b3.1_04C0.V35 3ne.23112578)E0731512771 pmax=0,3032[0,2760 0,3305] Colle 1 50% 64.1_045231. 194 374: 434 0.,.0_.É 03024,- 11 018,: 0211031 64.1_0X77 e a). S0[4.22907345505131420OOMC0100:2D0734551W21420p0000m0.001 pmax=0,2070 [0,1877 0,2263] 1.313.0 414.4_[35257 3331 450: 3.081 Y_^_9 4_ 0.17290,'t37 21351: 021011 0. W 1>Q1 001_, e.). 203.71.21111 98622111199,5.54] pmax=0,1728 [0,1354 0,2101] Page 29 sur 83 NOMBRE D'ESSAIS: 6 essais ont été nécessaires pour l'obtention de ces résultats. b3.1_04C0.V35 3ne.23112578) E0731512771 pmax = 0.3032 [0.2760 0.3305] Adhesive 1 50% 64.1_045231. 194 374: 434 0, 0. 03024, 11118, 641_0X77 and a). S0 [4.22907345505131420OOMC0100: 2D0734551W21420p0000m0.001 pmax = 0.2070 [0.1877 0.2263] 1.313.0 414.4_ [35257 3331 450: 3.081 Y_ ^ _ 9 4_ 0.17290, 't37 21351: 021011 0. W 1> Q1 001_ , e.). 203.71.21111 98622111199,5.54] pmax = 0,1728 [0,1354 0,2101] Page 29 of 83 NUMBER OF TESTS: 6 tests were necessary to obtain these results.

CONCLUSION: Le taux de croissance est plus faible dans les cas ou le milieu contient la colle à 10 et 50%. Cependant la différence n'est pas significative avec les témoins. CONCLUSION: The growth rate is lower in cases where the medium contains glue at 10 and 50%. However, the difference is not significant with the witnesses.

Page 30 sur 83 DETERMINATION DU PH CARDINAL DE LA SOUCHE 58. Page 30 of 83 DETERMINATION OF CARDINAL PH STRAIN 58.

DONNEES SUPPLEMENTAIRESADDITIONAL DATA

DATE: 18 septembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Des points supplémentaires de pH sont expérimentés pour augmenter la précision du pH cardinale de la souche 503M10. DATE: September 18, 2003 EXPERIMENTAL CONDITIONS: Additional pH points are being tested to increase the cardinal pH accuracy of strain 503M10.

OBJECTIF: Augmenter la précision des valeurs cardinales en pH de la souche 503M10. OBJECTIVE: To increase the precision of the cardinal pH values of strain 503M10.

RESULTATS: Ces résultats reprennent les résultats obtenus dans le dossier CRYO50 et ces dernières. RESULTS: These results show the results obtained in the CRYO50 file and the latter.

pH Nmax 5.72 0.685 6.6 0.764 7.3 0.821 7.85 0.744 5.56 0.297 6.4 0.635 6. 85 0.727 7.75 0.71 mu opt=0.78937 [0.62058 0.95815] pHmin=4.8572 [3.9902 5.7242] pHopt=7.1603 [6.3282 7.9923] R2=0.6672 Page 31 sur 83 NOMBRE D'ESSAIS: 8 essais ont été nécessaires à cette expérimentation. pH Nmax 5.72 0.685 6.6 0.764 7.3 0.821 7.85 0.744 5.56 0.297 6.4 0.635 6. 85 0.727 7.75 0.71 mu opt = 0.78937 [0.62058 0.95815] pHmin = 4.8572 [3.9902 5.7242] pHopt = 7.1603 [6.3282 7.9923] R2 = 0.6672 Page 31 of 83 NUMBER TEST: 8 tests were necessary for this experiment.

CONCLUSION: Le pH de la souche est déterminé à nouveau. Le pH minimum obtenu est 4.95 [3.99-5.72] et le pH optimal est de 7.1 [6.32-7.99]. CONCLUSION: The pH of the strain is determined again. The minimum pH obtained is 4.95 [3.99-5.72] and the optimum pH is 7.1 [6.32-7.99].

Page 32 sur 83 TRAITEMENT THERMIQUE DE LA SOUCHE 503M10 DATE: 30 septembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: La croissance de la souche 503M10 est testée à 30 C après traitement thermique à 60 C pendant 1, 3 et 5 minutes. EXPERIMENTAL CONDITIONS: The growth of the 503M10 strain is tested at 30 ° C. after heat treatment at 60 ° C. for 1, 3 and 5 minutes.

OBJECTIF: Pour les essais industriels, il est important de déterminer la température maximale que peut supporter la souche. OBJECTIVE: For industrial testing, it is important to determine the maximum temperature that the strain can withstand.

Page 33 sur 83 RESULTATS: Dénombrement avant traitement thermique Echantillon Témoin non traité Traitement 1 minute Traitement 3 minutes Traitement 5 minutes ufc/g log(ufc/g) ufc/g log(ufc/g) ufc/g log(ufc/g) ufc/g log(ufc/g) A 1,70E+04 4,23 1,30E+04 4,11 2,00E+ 01 1,30 <2,0E1 <1,3 B 1,30E+04 4,11 1,30E+04 4,11 6,00E+01 1,78 <2,0E1 <1, 3 C 1,30E+04 4,111,40E+04 4,15 <2,0E1 <1,3 <2,0E1 <1,3 I Suivi du dénombrement à 30 C de la souche traitée Date Heure 1 minute 3 minutes 5 minutes ufc/g log(ufc/g) ufc/g log(ufc/g) ufc/g log(ufc/g) 01/10/2003 9h00 3,70E+07 7,57 2,00E+07 7,30 <2,0E1 <1,3 01/10/2003 14h00 3,10E+08 8,49 3,70E+07 7,57 <2,0E2 <1,3 01/10/2003 18h00 3,90E+08 8,59 6,50E+07 7,81 <2,0E3 <1,3 NOMBRE D'ESSAIS: 3 essais ont été réalisés. RESULTS: Enumeration before heat treatment Sample Untreated control Treatment 1 minute Treatment 3 minutes Treatment 5 minutes ufc / g log (ufc / g) ufc / g log (ufc / g) ufc / g log (ufc / g) ufc / g log (ufc / g) A 1.70E + 04 4.23 1.30E + 04 4.11 2.00E + 01 1.30 <2.0E1 <1.3B 1.30E + 04 4.11 1.30E + 04 4.11 6.00E + 01 1.78 <2.0E1 <1, 3C 1.30E + 04 4.11.40E + 04 4.15 <2.0E1 <1.3 <2.0E1 <1.3 I Monitoring the count at 30 C of the treated strain Date Time 1 minute 3 minutes 5 minutes ufc / g log (ufc / g) ufc / g log (ufc / g) ufc / g log (ufc / g) 01/10/2003 9h00 3,70E + 07 7,57 2,00E + 07 7,30 <2,0E1 <1,3 01/10/2003 14h00 3,10E + 08 8,49 3,70E + 07 7 , 57 <2.0E2 <1.3 01/10/2003 18h00 3.90E + 08 8.59 6.50E + 07 7.81 <2.0E3 <1.3 NUMBER OF TESTS: 3 tests were carried out .

B CB C

Page 34 sur 83 CROISSANCE DE LA SOUCHE 503M10 DANS LE MILIEU CTSI ( CRESOL RED THALLIUM ACETATE SUCROSE INULIN AGAR) DATE: 16 octobre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: La croissance de la souche 503M10 dans le milieu TRACEO est comparée à celle dans le milieu CTSI pH=9.1 et pH=6.2. Page 34 of 83 GROWTH OF THE 503M10 STRAIN IN THE CTSI ENVIRONMENT (CRESOL RED THALLIUM ACETATE INULIN AGAR SUCROSE) DATE: October 16, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIMENT: The growth of the strain 503M10 in the TRACEO medium is compared with that in the medium CTSI pH = 9.1 and pH = 6.2.

La croissance est déterminée par dénombrements de la souche sur le milieu TRACEO Agar. Growth is determined by counts of the strain on TRACEO Agar medium.

OBJECTIFS: Cette expérience permet de déterminer la croissance de la souche 503M10 sur le milieu CTSI, milieu sélectif des Carnobacterium spp. * RESULTATS: Date Heure Temps(heures) TRACEO +glu CTSI 9.1 CTSI 6.2 ufc/ml log(ufc/mI) ufc/mI log(ufc/ml) ufc/mI log(ufc/ml) 16-oct 12h15 1.25 8.80E+03 3.94 1.00E+04 4.00 7.90E+03 3.90 13h45 2.75 3.00E+04 4.48 1.50E+04 4.18 1.00E+04 4.00 15h45 4.75 1.80E+05 5.26 2.40E+04 4.38 1.00E+04 4.00 17h30 6.5 2.30E+05 5.36 1.20E+04 4.08 4.90E+04 4.69 17-oct 9h00 22 2.50E+08 8.40 8.70E+06 6.94 9.00E+06 6.95 NOMBRE D'ESSAIS: 3 essais ont été réalisés pour cette expérience CONCLUSION: Le milieu TRACEO permet une meilleure croissance de la souche 503M10. De plus le milieu CTSI de part sa composition est trouble, alors que nous recherchons un milieu transparent. OBJECTIVES: This experiment makes it possible to determine the growth of strain 503M10 on CTSI medium, a selective medium of Carnobacterium spp. * RESULTS: Date Time Time (hours) TRACEO + glu CTSI 9.1 CTSI 6.2 ufc / ml log (ufc / mI) ufc / mI log (cfu / ml) ufc / mI log (cfu / ml) 16-oct 12h15 1.25 8.80E +03 3.94 1.00E + 04 4.00 7.90E + 03 3.90 13h45 2.75 3.00E + 04 4.48 1.50E + 04 4.18 1.00E + 04 4.00 15.45 4.75 1.80E + 05 5.26 2.40E + 04 4.38 1.00E + 04 4.00 5.30 pm 6.5 2.30 E + 05 5.36 1.20E + 04 4.08 4.90E + 04 4.69 17-oct 9.00 22 2.50E + 08 8.40 8.70E + 06 6.94 9.00E + 06 6.95 NUMBER OF TESTS: 3 tests were carried out for this experiment CONCLUSION: The TRACEO medium allows better growth of the 503M10 strain. In addition the CTSI medium by its composition is cloudy, while we are looking for a transparent medium.

Page 35 sur 83 CROISSANCE DE LA SOUCHE 503M10 DANS LE MILIEU TRACEO CONTENANT DES SUCRES DIFFERENTS: MALTOSE, MANNITOL, TREHALOSE. Page 35 of 83 GROWTH OF THE 503M10 STRAIN IN THE TRACEO ENVIRONMENT CONTAINING DIFFERENT SUGARS: MALTOSIS, MANNITOL, TREHALOSE.

DATE: 21 octobre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Le taux de croissance de la souche 503M10 dans le milieu TRACEO + glucose 2% est comparé à celui du milieu TRACEO + maltose, mannitol et tréhalose de même concentration à 25 C. DATE: October 21, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIMENT: The growth rate of strain 503M10 in TRACEO medium + glucose 2% is compared with that of medium TRACEO + maltose, mannitol and trehalose of the same concentration at 25 ° C.

Le pH final de croissance est déterminé. The final growth pH is determined.

OBJECTIFS: L'objectif est de trouver des sucres permettant une acidification ralentie de notre système. OBJECTIVES: The objective is to find sugars allowing a slow acidification of our system.

RESULTATS: Date heure temps Glucose Maltose Trehalose ufc/ml Log(ufc/ml) ufc/ml Log(ufc/ml) ufc/ml Log(ufcml) 21-oct 9h45 0 1.50E+04 4.18 1.70E+04 4.23 2.50E+04 4.40 11 h00 1.25 1.40E+04 4.15 1.90E+04 4.28 1.20E+04 4.08 13h30 2.75 4.50E+04 4.65 1.00E+05 5.00 8.00E+04 4.90 14h45 4 1.30E+05 5.11 4.40E+04 4.64 1.20E+05 5.08 16h00 6.25 2.20E+05 5.34 2.70E+05 5.43 1.80E+05 5.26 17h30 7.75 5.90E+05 5.77 5.50E+05 5.74 4.60E+05 5.66 22-oct 8h45 23 2.60E+08 8.41 2.00E+08 8.30 3.30E+08 8.52 pH final 4.23 4. 41 4.27 Date heure temps Mannitol ufc/ml Log(ufc/ml) 21-oct 10h00 0 1.60E+04 4.20 13h30 2.5 3.90E+04 4.59 14h45 3.75 1.40E+05 5.15 16h00 6 2.00E+05 5.30 17h30 7.5 4.60E+05 5.66 22-oct 8h45 22.75 2.40E+08 8.38 pH final 4.4 Page 36 sur 83 I Taux de croissance à 25 C Sucres Taux de croissance (h-1) Glucose 0.4312 Maltose 0.412 Mannitol 0.419 tréhalose 0.429 NOMBRE D'ESSAIS: 4 essais ont été réalisés pour cette expérience. CONCLUSION: Le taux de croissance varie peu en fonction du sucre utilisé. Le pH final varie également peu. RESULTS: Date time time Glucose Maltose Trehalose ufc / ml Log (cfu / ml) ufc / ml Log (cfu / ml) ufc / ml Log (ufcml) 21-oct 9h45 0 1.50E + 04 4.18 1.70E + 04 4.23 2.50E +04 4.40 11 h 00 1.25 1.40E + 04 4.15 1.90E + 04 4.28 1.20E + 04 4.08 13.30 2.75 4.50E + 04 4.65 1.00E + 05 5.00 8.00E + 04 4.90 14.45 4 1.30E + 05 5.11 4.40E + 04 4.64 1.20E + 05 5.08 16.00 6.25 2.20E + 05 5.34 2.70E + 05 5.43 1.80E + 05 5.26 17.30 7.75 5.90E + 05 5.77 5.50E + 05 5.74 4.60E + 05 5.66 22-oct 8h45 23 2.60E + 08 8.41 2.00 E + 08 8.30 3.30E + 08 8.52 Final pH 4.23 4. 41 4.27 Date time time Mannitol ufc / ml Log (cfu / ml) 21-oct 10h00 0 1.60E + 04 4.20 13h30 2.5 3.90E + 04 4.59 14h45 3.75 1.40E +05 5.15 16h00 6 2.00E + 05 5.30 5.30 pm 7.5 4.60E + 05 5.66 22-oct 8h45 22.75 2.40E + 08 8.38 Final pH 4.4 Page 36 of 83 I Growth rate at 25 C Sugars Growth rate (h-1) Glucose 0.4312 Maltose 0.412 Mannitol 0.419 trehalose 0.429 NUMBER OF TESTS: 4 trials were conducted for this experiment. CONCLUSION: The growth rate varies little according to the sugar used. The final pH also varies little.

Page 37 sur 83 CROISSANCE DE LA SOUCHE 503M10 SUR LE MILIEU TRACEO POUR UNE DLC DE 7 JOURS. MODIFICATION DU PH ET DE L'INOCULUM. Page 37 of 83 GROWTH OF THE 503M10 STRAIN ON THE TRACEO MEDIUM FOR A 7-DAY DLC. MODIFICATION OF PH AND INOCULUM.

DATE: 22 octobre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Milieu TRACEO: pH Inoculum de départ (ufc pour 5ml de la couche supérieure) 6.0 104 5.8 105 OBJECTIFS: Le but est de déterminer la DLC pour un pH plus faible et un inoculum plus fort. DATE: October 22, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIENCE: TRACEO Medium: pH Inoculum of starting (cfu for 5ml of the top layer) 6.0 104 5.8 105 OBJECTIVES: The aim is to determine the DLC for a lower pH and a stronger inoculum .

Page 38 sur 83 RESULTATS: Tableau de résultats de croissance de la souche 58 lors du scénario 7jours I Milieu double couche Milieu TRACEO DC 0% glycérol+ caseine 50g/I Milieu inférieur Milieu TS 0.85% Nacl Milieu supérieur pH= 5,8 inoculum=10e4 t Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification (heures) (jrs) barre 22-oct 18h00 0 0,0 5,9 - + - 25-oct 11 h00 65 2,7 - + - 27-oct 16h00 118 4,9 5,99 - + - 28-oct 17h00 143 6,0 5,98 - + - 29-oct 14h00 164 6,8 6 - + - 29-oct 18h00 168 7,0 5,93 - + - 30-oct 9h00 183 7,6 5,84 - + - 30-oct 18h00 192 8,0 5,73 - + 31-oct 9h00 207 8,6 5,54 - + - 31-oct 16h00 214 8,9 5,5 - + - 01-nov 14h00 236 9,8 + + - 03-nov 8h45 278,25 11,6 + - - l 1 1 Milieu TRACEO DC 0% glycérol+ caseine 50g/I L Milieu inférieur Milieu TS 0.85% Nacl Milieu supérieur pH= 5,8 inoculum=10e5 Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification (heures) (jrs) barre 22-oct 18h00 0 0,0 5,9 - + 25-oct 11 h00 65 2,7 - + - 27-oct 16h00 118 4,9 5,98 - + - 28-oct 17h00 143 6,0 5,99 - + - 29-oct 14h00 164 6,8 5,82 - + - 29-oct 18h00 168 7,0 5,7 - + - 30-oct 9h00 183 7,6 5,48 - + - 30-oct 18h00 192 8,0 5,25 - + 31-oct 9h00 207 8,6 5,2 Début + Début 31-oct 16h00 214 8,9 5,15 + 01-nov 14h00 236 9,8 + 03-nov 8h45 278,25 11,6 +++ - +++ Page 39 sur 83 Milieu double couche t 1 Milieu TRACEO DC 0% glycérol+ caseine 50g11 Milieu inférieur Milieu TS 0. 85% Nacl { (Milieu supérieur pH= 6,0 I inoculum=10e4 Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification (heures) (jrs) barre 22-oct 18h00 0 0,0 6 - + - 25-oct 11 h00 65 2,7 - + 27-oct 16h00 118 4,9 6,07 - + 28-oct 17h00 143 6,0 6,09 - + - 29-oct 14h00 164 6,8 5,88 - + - 29-oct 18h00 168 7,0 5,83 - + - 30-oct 9h00 183 7,6 5,56 - + - 30-oct 18h00 192 8,0 5,34 Début + Début 31-oct 9h00 207 8,6 5,19 Début + Début 31-oct 16h00 214 8,9 5,12 + - + 01-nov 14h00 236 9,8 + - + Milieu double couche I J Milieu TRACEO DC 0% glycérol+ caseine 50g/l Milieu inférieur Milieu TS 0.85% Nacl 1 Milieu supérieur pH= 6,0 inoculum=10e5 L Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification (heures) (jrs) barre 22-oct 18h00 0 0,0 6 - + - 25-oct 11 h00 65 2,7 - + - 27-oct 16h00 118 4,9 6,09 - + - 28-oct 17h00 143 6,0 5,89 - + - 29-oct 14h00 164 6,8 5,48 - + - 29-oct 18h00 168 7,0 5,4 - + 30-oct 9h00 183 7,6 5,14 - + - 30-oct 18h00 192 8,0 5,04 Début + (Limi) Début 31-oct 9h00 207 8,6 4,985 Début +(Lirai) Début 31-oct 16h00 214 8,9 5,01 + - + 01-déc 14h00 236 9,8 + - + I I 4 Page 40 sur 83 NOMBRE D'ESSAIS: 4 essais ont été réalisés pour cet étude. RESULTS: Table of growth results of strain 58 during the 7days scenario I Double-layer medium Medium TRACEO DC 0% glycerol + casein 50g / I Lower medium Medium TS 0.85% Nacl Upper medium pH = 5.8 inoculum = 10e4 t Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification (hours) (days) bar 22-oct 18h00 0 0.0 5.9 - + - 25-oct 11 h 00 65 2.7 - + - 27-oct 16h00 118 4.9 5.99 - + - 28-oct 17h00 143 6.0 5.98 - + - 29-oct 14h00 164 6.8 6 - + - 29-oct 18h00 168 7.0 5.93 - + - 30-oct 9h00 183 7.6 5.84 - + - 30-oct 18.00 192 8.0 5.73 - + 31-oct 9.00 207 8.6 5.54 - + - 31-oct 16.00 214 8.9 5.5 - + - 01-nov 14h00 236 9,8 + + - 03-nov 8h45 278,25 11,6 + - - 1 1 1 Medium TRACEO DC 0% glycerol + casein 50g / IL Lower medium Medium TS 0.85% Nacl Upper medium pH = 5 , 8 inoculum = 10e5 Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification (hours) (days) bar 22-oct 18:00 0 0,0 5,9 - + 25-oct 11:00 65 2,7 - + - 27-oct 16:00 118 4.9 5.98 - + - 28- Oct 17:00 143 6.0 5.99 - + - 29-Oct 14:00 164 6.8 5.82 - + - 29-Oct 18.00 168 7.0 5.7 - + - 30-oct 9.00 183 7.6 5, 48 - + - 30-oct 18h00 192 8.0 5.25 - + 31-oct 9.00 207 8.6 5.2 Start + Start 31-oct 16.00 214 8.9 5.15 + 01-nov 14.00 236 9, 8 + 03-nov 8h45 278,25 11,6 +++ - +++ Page 39 of 83 Medium double layer t 1 Medium TRACEO DC 0% glycerol + casein 50g11 Lower medium Medium TS 0. 85% Nacl {(Upper medium pH = 6.0 I inoculum = 10e4 Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification (hours) (days) bar 22-oct 18h00 0 0.0 6 - + - 25-oct 11 h 00 65 2.7 - + 27-oct 16h00 118 4.9 6.07 - + 28-oct 17.00 143 6.0 6.09 - + - 29-oct 14.00 164 6.8 5.88 - + - 29-oct 18.00 168 7.0 5.83 - + - 30-oct 9:00 183 7,6 5,56 - + - 30-oct 18:00 192 8,0 5,34 Start + Start 31-Oct 9:00 207 8,6 5,19 Start + Start 31-Oct 16:00 214 8, 9 5,12 + - + 01-nov 14h00 236 9,8 + - + Double layer medium IJ Medium TRACEO DC 0% glycerol + casein 50g / l Lower medium Medium TS 0.85% Nacl 1 Medium higher pH = 6.0 inoculum = 10e5 L Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification (hours) (days) bar 22-oct 18:00 0 0.0 6 - + - 25-oct 11 hrs 65 2.7 - + - 27 -oct 16:00 118 4.9 6.09 - + - 28-oct 17.00 143 6.0 5.89 - + - 29-oct 14.00 164 6.8 5.48 - + - 29-oct 18.00 168 7.0 5 , 4 - + 30-oct 9:00 183 7,6 5,14 - + - 30-oct 18:00 192 8,0 5,04 Start + (Limit) Start 31-Oct 9:00 207 8,6 4,985 Start + (Lirai) Start 31-Oct 16h00 214 8.9 5.01 + - + 01-dc 14h00 236 9.8 + - + II 4 Page 40 of 83 NUMBER OF TESTS: 4 trials were conducted for this study.

CONCLUSION: Pour un inoculum de 104 ufc/5m1 (de la couche supérieure), le temps de précipitation est plus long lorsque le pH de départ et 5.8 ([9.811.6]) que lorsque le pH de départ est 6.2 ( [7.8-9]). CONCLUSION: For an inoculum of 104 cfu / 5m1 (of the upper layer), the precipitation time is longer when the starting pH and 5.8 ([9.811.6]) than when the starting pH is 6.2 ([7.8- 9]).

L'augmentation de I'inoculum de 104 à 105 ufcl5 ml (de la couche supérieure) ne permet pas d'augmenter considérablement le temps de précipitation. Increasing the inoculum from 104 to 105 μl / cm2 (top layer) does not significantly increase the precipitation time.

D'autres inoculum plus élevés devront être testés. Other higher inoculums should be tested.

Page 41 sur 83Page 41 of 83

UTILISATION DU CHLORURE DE CALCIUM POUR AUGMENTER LA VITESSE USE OF CALCIUM CHLORIDE TO INCREASE SPEED

DE PRECIPITATION DE LA CASEINEPRECIPITATION OF CASEIN

DATE: 5 novembre 2004 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Des essais de précipitation en milieu liquide sont réalisés dans le milieu TRACEO en présence de chlorure de calcium à 4 concentrations différentes (0.01,0. 02M, 0.04M et 0.05M) comparativement au milieu TRACEO sans chlorure de calcium. De l'acide lactique est ajouté aux différentes solutions pour obtenir la précipitation. DATE: November 5, 2004 CONDITIONS OF THE EXPERIMENT: Precipitation tests in liquid medium are carried out in TRACEO medium in the presence of calcium chloride at 4 different concentrations (0.01.0 .02M, 0.04M and 0.05M) compared to the medium TRACEO without calcium chloride. Lactic acid is added to the different solutions to obtain the precipitation.

OBJECTIFS: L'objectif est de déterminer le rôle du chlorure de calcium dans la réaction de précipitation. OBJECTIVES: The objective is to determine the role of calcium chloride in the precipitation reaction.

RESULTATS: La réaction de précipitation pour les concentrations 0.04M et 0.05 M se produit instantanément lors du contact avec le milieu. RESULTS: The precipitation reaction for 0.04M and 0.05M concentrations occurs instantly on contact with the medium.

Pour les concentrations 0.01 M et 0.02M les résultats sont consignés dans le tableau ci-dessous. For the 0.01 M and 0.02M concentrations the results are shown in the table below.

Page 42 sur 83 Volume [acide Tracéo précipitation pH Tracéo précipitation pH Tracéo précipitation acide lactique] (g!1) pH=6. 2 CaCl2 0,01 M CaCl2 0,02M lactique (pl) 0 0 6,2 - 6,19 - 6,21 - 0,06 6,17 - 6,17 - 6,18 - 0,12 6,15 - 6,14 - 6,16 - 0,18 6,13 - 6,11 - 6,14 - 0,24 6,11 - 6,09 - 6,1 0,3 6,09 - 6,05 - 6,08 - 0,36 6,07 - 6,03 - 6,05 - 0,42 6,04 - 6 - 6,03 0,48 6,02 - 5,97 - 6 - 0,54 6 - 5,94 - 5,95 - 0,6 5,99 - 5,91 - 5,92 0,66 5,97 Petits flocons 5,88 - 5,89 - 0,72 5,94 - 5,86 Flocons 5,86 0,78 5,92 - 5,83 - 5,82 - 0,84 5,86 Gros flocons 5,8 - 5,8 - 0,9 5,81 5,78 - 5,75 - 0,96 5,78 - 5,75 - 5,72 - 1,02 5,76 - 5,72 - 5,68 - 1,08 5,73 - 5,69 - 5,64 - 1,14 5,66 - 5,66 - 5,6 - 1,2 5,64 - 5,63 - 5,56 - 210 1,26 5,62 - 5,6 - 5,53 - 220 1,32 5,57 - 5,57 - 5,47 - 230 1,38 5,56 5,54 - 5,43 - 240 1,44 5,54 - 5,51 - 5,39 - 250 1,5 5,51 - 5,49 - 5,34 260 1,56 5,49 - 5,47 - 5,32 - 270 1,62 5,46 - 5,44 - 5,3 - 280 1,68 5,43 5,41 Blanc 5,27 Petits flocons 290 1,74 5,4 - 5,37 5,23 300 1,8 5,38 5,35 5,21 Blanc 310 1,86 5,36 - 5,32 + gros flocons 5,17 320 1,92 5,34 5,3 5,15 Gros flocons 330 1,98 5,33 - 5,27 5,09 +++ 340 2,04 5,31 - 5,25 350 2,1 5,25 +++ 5,23 5,11 +++ Page 43 sur 83 NOMBRE D'ESSAIS: Pour cette expérimentation 5 essais ont été nécessaires. Volume [acid Traceo precipitation pH Traceo precipitation pH Traceo lactic acid precipitation] (g! 1) pH = 6. 2 CaCl2 0.01 M CaCl2 0.02M Lactic (pl) 0 0 6.2 - 6.19 - 6.21 - 0.06 6.17 - 6.17 - 6.18 - 0.12 6.15 - 6,14 - 6,16 - 0,18 6,13 - 6,11 - 6,14 - 0,24 6,11 - 6,09 - 6,1 0,3 6,09 - 6,05 - 6, 08 - 0.36 6.07 - 6.03 - 6.05 - 0.42 6.04 - 6 - 6.03 0.48 6.02 - 5.97 - 6 - 0.54 6 - 5.94 - 5.95 - 0.6 5.99 - 5.91 - 5.92 0.66 5.97 Small flakes 5.88 - 5.89 - 0.72 5.94 - 5.86 Flakes 5.86 0 , 78 5.92 - 5.83 - 5.82 - 0.84 5.86 Large flakes 5.8 - 5.8 - 0.9 5.81 5.78 - 5.75 - 0.96 5.78 - 5.75 - 5.72 - 1.02 5.76 - 5.72 - 5.68 - 1.08 5.73 - 5.69 - 5.64 - 1.14 5.66 - 5.66 - 5.6 - 1.2 5.64 - 5.63 - 5.56 - 210 1.26 5.62 - 5.6 - 5.53 - 220 1.32 5.57 - 5.57 - 5.47 - 230 1.38 5.56 5.54 - 5.43 - 240 1.44 5.54 - 5.51 - 5.39 - 250 1.5 5.51 - 5.49 - 5.34 260 1, 56 5,49 - 5,47 - 5,32 - 270 1,62 5,46 - 5,44 - 5,3 - 280 1,68 5,43 5,41 White 5,27 Small flakes 290 1,74 5 , 4 - 5,37 5,23 300 1,8 5,38 5,35 5,21 White 310 1,86 5,36 - 5,32 + large flakes 5,17 320 1,92 5,34 5.3 5.15 Large flakes 330 1.98 5.33 - 5.27 5.09 +++ 340 2,04 5,31 - 5,25 350 2,1 5,25 +++ 5,23 5,11 +++ Page 43 of 83 NUMBER OF TESTS: For this experiment 5 tests were necessary.

CONCLUSION: Pour une concentration de 0.02M en chlorure de Calcium, ces résultats nous montrent un léger écart d'acidification du milieu selon la présence ou non du chlorure de calcium D'autres essais devront être réalisés. CONCLUSION: For a concentration of 0.02M in calcium chloride, these results show us a slight difference in acidification of the medium depending on the presence or absence of calcium chloride. Other tests will have to be carried out.

pH du milieu tracéo avec ou sans chlorure de calcium o 2 Concentration en acide lactique gll 0 M chlorure de Calcium --- 0.020M chlorure de calcium Page 44 sur 83 pH of tracer medium with or without calcium chloride o 2 Concentration of lactic acid gll 0 M Calcium Chloride --- 0.020M Calcium Chloride Page 44 of 83

TRACABILITE DU MILIEU EN INDUSTRIE-UTILISATION DE LA TRACEABILITY IN THE INDUSTRY-USE OF THE

METHODE DEFT (FILTRATION SUR MEMBRANE) DATE: 5 novembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: La méthode DEFT est testée sur la souche 503M10 Trois échantillons de solution bactérienne sont filtrés par cette méthode comparativement à la méthode de dénombrement sur gélose TRACEO. DEFT METHOD (MEMBRANE FILTRATION) DATE: November 5, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIMENT: The DEFT method is tested on strain 503M10 Three samples of bacterial solution are filtered by this method compared to the TRACEO plate counting method.

Le protocole est le suivant:* Protocole méthode DEFT Filtration sur membrane 1. MILIEUX o Tampon pour méthyle orange ml d'acide citrique 0,1 M (1,05 g / 50 ml H2O) ml NaOH 0,1 M (0,6 g 1150 ml H2O) jusqu'à pH = 6,6 Stériliser le tampon par filtration o Solution stock méthyle orange 0,25 g / 10 ml de tampon à conserver au froid et à l'obscurité Solution fraîche Acridine (pour une semaine maxi) 0,025 % (0,5 ml solution stock dans 50 ml tampon) o Triton 0,1 % (filtré) o Isopropanol (filtré) Page 45 sur 83 2. PROTOCOLES - Installation de l'appareil de filtration - Stériliser avec de l'alcool, flamber Rincer le bol avec de l'eau stérile Déposer la membrane Nucléopore 0,6 pm 0,25 mm 0 face brillante vers le haut Filtrer 5 ml de Triton 0,1 % Filtrer l'échantillon (dilutions à voir) - Filtrer avec Triton 0,1 %, ôter le vide - Mettre 1 - 2 ml ?? et laisser 2 min - Filtrer Ajouter du Titron 0,1 % sans arrêter la pompe 1 ml isopropanol Laisser la pompe en marche et ôter la tour Déposer la membrane sur du sopalin pour la sécher - Montage membrane: huile membrane - huile - lamelle huile (bien écraser la lamelle) Observer au microscope à'épifluorescence 3. INTERPRETATION: MICROSCOPIE PAR EPIFLUORESCENCE Nombre de champs comptés sur membrane-filtre et nombre de bactéries par champs Nombre de Nombre moyen de champs colonies par comptés champs 0 - 10 11 - 25 6 26- 50 3 51 -75 2 76 - 100 Répétition* > 100 * Echantillon dilué et procédure répétée R = nombre moyen de colonie par champ x Fm (facteur microscopique) x dilution Fm (pour 1 ml filtré)= 15 625,1 Page 46 sur 83 OBJECTIFS: Cette technique de dénombrement par filtration et lecture par microscopie épifluorescence doit permettre le dénombrement de la solution bactérienne utilisée pour les essais. The protocol is as follows: * DEFT method protocol Membrane filtration 1. MEDIA o Buffer for methyl orange ml 0.1 M citric acid (1.05 g / 50 ml H2O) 0.1 M NaOH (0.6 g 1150 ml H2O) up to pH = 6.6 Sterilize the buffer by filtration o Stock solution methyl orange 0.25 g / 10 ml buffer to be stored in the cold and in the dark solution Fresh solution Acridine (for a maximum of one week) 0.025% (0.5 ml stock solution in 50 ml buffer) o 0.1% triton (filtered) o Isopropanol (filtered) Page 45 of 83 2. PROTOCOLS - Installation of the filtration device - Sterilize with alcohol , flambe Rinse the bowl with sterile water Remove the membrane Nucleopore 0.6 μm 0.25 mm 0 glossy side up Filter 5 ml of Triton 0.1% Filter the sample (dilutions to see) - Filter with Triton 0,1%, remove the vacuum - Put 1 - 2 ml ?? and leave 2 min - Filter Add Titon 0.1% without stopping the pump 1 ml isopropanol Leave the pump running and remove the tower Remove the membrane on the sopalin to dry it - Diaphragm assembly: oil membrane - oil - oil lamella ( well crush the coverslip) Observe under the microscope with epifluorescence 3. INTERPRETATION: EPIFLUORESCENCE MICROSCOPY Number of fields counted on membrane-filter and number of bacteria per field Number of Average number of fields colonies by counted fields 0 - 10 11 - 25 6 26 - 50 3 51 -75 2 76 - 100 Repetition *> 100 * Diluted sample and repeated procedure R = average number of colonies per field x Fm (microscopic factor) x dilution Fm (for 1 ml filtered) = 15 625.1 OBJECTIVES: This technique of enumeration by filtration and reading by epifluorescence microscopy must allow the enumeration of the bacterial solution used for the tests.

RESULTATS: Echantillons Méthode de Méthode DEFT dénombrement Log(UFC/ML) Log(UFC/ML) 1 8.26 8.40 2 8.20 8.36 3 8.34 8.30 NOMBRE D'ESSAIS: 3 essais ont été réalisés pour cette expérimentation. RESULTS: Samples Method Method DEFT Count Log (UFC / ML) Log (UFC / ML) 1 8.26 8.40 2 8.20 8.36 3 8.34 8.30 NUMBER OF TESTS: 3 trials were conducted for this experiment.

CONCLUSION: Les résultats montrent que la méthode DEFT est adaptée pour la traçabilité du TRACEO en milieu indistriel. Cependant, les réactifs toxiques utilisés dans cette méthode demandent de nombreuses précautions d'utilisation. CONCLUSION: The results show that the DEFT method is adapted for the traceability of TRACEO in an industrial environment. However, the toxic reagents used in this method require many precautions for use.

Page 47 sur 83 PRECIPITATION DU SYSTEME TRACEO POUR UNE DLC DE 7 JOURS AVEC Page 47 of 83 PRECIPITATION OF THE TRACEO SYSTEM FOR A 7-DAY DLC WITH

UN SUCRE DIFFERENT LE MANNITOLA SUGAR DIFFERENT MANNITOL

DATE: 16 novembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Le temps de précipitation de notre système TRACEO est déterminé à pH=6.2 avec un milieu contenant du glucose à 2% et I autre du mannitol à la même concentration. DATE: November 16, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIENCE: The precipitation time of our TRACEO system is determined at pH = 6.2 with a medium containing glucose at 2% and I other at mannitol at the same concentration.

OBJECTIFS: L'objectif est d'obtenir un temps de précipitation plus court de notre milieu en y ajoutant un sucre différent entraînant une acidification plus lente. OBJECTIVES: The objective is to obtain a shorter precipitation time of our environment by adding a different sugar resulting in a slower acidification.

Page 48 sur 83 RESULTATS: Glucose Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification (heures) (jrs) barre 17-nov 18h00 0 0,0 6,15 + - 20-nov 9h00 63 2,6 6,15 - + 21-nov 12h00 90 3,8 6,26 - + 24-nov 9h00 159 6,6 5,57 - + 11h45 161,75 6,7 5,45 - + 13h30 163,5 6,8 5,34 - + 17h15 167,25 7,0 5,16 - + 25-nov 9h30 183,5 7,6 4,99 - + 11 h15 185,25 7,7 4,95 Début + Début 13h45 187,75 7,8 4,91 + +/- + 15h00 189 7,9 4,89 +++ - +++ _17h00 191 8,0 4,92 +++ - +++ RESULTS: Glucose Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification (hours) (days) bar 17-nov 18h00 0 0,0 6,15 + - 20-nov 9:00 63 2,6 6,15 - + 21- Nov 12.00 90 3.8 6.26 - + 24-Nov 9.00 159 6.6 5.67 - + 11.45 161.75 6.7 5.45 - + 1.30 pm 163.5 6.8 5.34 - + 17.15 pm 167 , 25 7.0 5.16 - + 25-nov 9.30 183.5 7.6 4.99 - + 11.15 185.25 7.7 4.95 Start + Start 13.45 187.75 7.8 4.91 + +/- + 15.00 189 7.9 4.89 +++ - +++ _17.00 191 8.0 4.92 +++ - +++

II

Mannitol I Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification (heures) (jrs) barre 17-nov 18h00 0 0,0 6,18 - + - 20-nov 9h00 63 2,6 6,20 - + - 21-nov 12h00 90 3,8 6,26 - + - 24-nov 9h00 159 6,6 5,89 - + - 11 h45 161,75 6,7 5,82 - + - 13h30 163,5 6,8 5,72 - + - 17h15 167,25 7,0 5,68 - + - 25-nov 9h30 183,5 7,6 5,49 - + - 11h15 185,25 7,7 5,48 - + - 13h45 187,75 7,8 5,39 Début + Début 15h00 189 7,9 5,38 - + - 17h00 191, 8,0 5,33 + 17h45 191,75 8,0 5,37 + 26-nov 10h30 209 8,7 5,27 + 17h30 216 9,0 5,24 + 27-nov 9h00 231,5 9,6 5,12 + 15h00 237,5 9,9 5,13 + 17h00 239,5 10,0 5,1 + 28-nov 9h00 255,5 10,6 4,99 + 01-déc 9h00 327,5 13,6 4,9 +++ - +++ Page 49 sur 83 NOMBRE D'ESSAIS: 2 essais ont été réalisés. Mannitol I Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification (hours) (dd) bar 17-nov 18h00 0 0,0 6,18 - + - 20-nov 9h00 63 2,6 6,20 - + - 21-nov 12:00 90 3.8 6.26 - + - 24-nov 9.00 159 6.6 5.69 - + - 11.45 161.75 6.7 5.82 - + - 13.30 163.5 6.8 5.72 - + - 17h15 167,25 7,0 5,68 - + - 25-nov 9h30 183,5 7,6 5,49 - + - 11h15 185,25 7,7 5,48 - + - 13h45 187,75 7,8 5 , 39 Start + Start 15:00 189 7,9 5,38 - + - 17:00 191, 8,0 5.33 + 17:45 191.75 8,0 5.37 + 26-nov 10.30 am 209 8.7 5.27 + 5.30 pm 216 9.0 5.24 + 27-nov 9.00 231.5 9.6 5.12 + 15.00 237.5 9.9 5.13 + 17.00 239.5 10.0 5.1 + 28-nov 9.00 255 5 10.6 4.99 + 01-dec 9.00 327.5 13.6 4.9 +++ - +++ Page 49 of 83 NUMBER OF TESTS: 2 tests were performed.

CONCLUSION: L'acidification dans le temps de notre système est plus lente avec le mannitol qu'avec le glucose. CONCLUSION: The acidification over time of our system is slower with mannitol than with glucose.

Le temps de précipitation est également augmenté dans le cas de l'utilisation du mannitol. En effet, le temps de précipitation avec le milieu glucosé est de 7.8-7.9 jours alors qu'il est de 13.6 jours avec le milieu mannitol. The precipitation time is also increased in the case of the use of mannitol. In fact, the precipitation time with the glucose medium is 7.8-7.9 days whereas it is 13.6 days with the mannitol medium.

Comparaison du pH en fonction du sucre utilisé lors d'une DLC 7 jours glucose Mannitol 5.0 10.0 15.0 Temps(jours) Page 50 sur 83 PRECIPITATION DE LA SOUCHE 503M10 DANS UN MILIEU DE PH PLUS ELEVE: DATE: 16 novembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: La précipitation de notre système est déterminé en présence d'un milieu de pH plus élevé : 7.75 comparativement au milieu TRACEO de pH 6.2. Comparison of pH versus sugar used in DLC 7 days glucose Mannitol 5.0 10.0 15.0 Time (days) Page 50 of 83 PRECIPITATION OF 503M10 STRAIN IN HIGHER PH ENVIRONMENT: DATE: November 16, 2003 CONDITIONS OF USE EXPERIENCE: The precipitation of our system is determined in the presence of a higher pH medium: 7.75 compared to TRACEO pH 6.2 medium.

OBJECTIFS: L'objectif de cette étude est d'augmenter ou diminuer le temps de précipitation de notre système. OBJECTIVES: The objective of this study is to increase or decrease the precipitation time of our system.

Page 51 sur 83 RESULTATS: pH=6,2 Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification (heures) (jrs) barre 17-nov 18h00 0 0,0 6,15 - + 20-nov 9h00 63 2,6 6,15 - + 21-nov 12h00 90 3,8 6,26 - + 24-nov 9h00 159 6,6 5,57 - + 11h45 161,75 6,7 5,45 - + 13h30 163,5 6,8 5,34 - + 17h15 167,25 7,0 5,16 - + 25-nov 9h30 183,5 7,6 4,99 - + 11 h15 185,25 7,7 4,95 Début + Début 13h45 187,75 7,8 4,91 + +/- + 15h00 189 7,9 4,89 +++ - +++ 17h00 191 8,0 4,92 +++ - +++ _.__ pH=7,75 Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification (heures) (jrs) barre 17-nov 18h00 0 0,0 7,75 - + - 20-nov 9h00 63 2,6 7,76 - + - 21-nov 12h00 90 3,8 7,78 + - 24-nov 9h00 159 6,6 5,14 - + - 11 h45 161,75 6,7 5,12 Début + Début 13h30 163,5 6,8 5,12 Blanc + 17h15 167,25 7,0 5,07 Blanc + 18h30 168,5 7,0 5,04 Blanc + 25-nov 9h30 183,5 7,6 5,00 - + 11 h15 185,25 7,7 4,96 - + 13h45 187,75 7,8 5,00 - +/- + 15h00 189 7,9 4,98 ++ - ++ 17h00 191 8,0 4,96 ++ - ++ Page 52 sur 83 NOMBRE D'ESSAIS: 2 essais ont été réalisés. RESULTS: pH = 6.2 Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification (hours) (days) bar 17-nov 18h00 0 0,0 6,15 - + 20-nov 9:00 63 2,6 6,15 - + 21-nov 12.00 90 3.8 6.26 - + 24-nov 9.00 159 6.6 5.67 - + 11.45 161.75 6.7 5.45 - + 13.30 163.5 6.8 5.34 - + 17h15 167,25 7,0 5,16 - + 25-nov 9h30 183,5 7,6 4,99 - + 11 hr 185,25 7,7 4,95 Start + Start 13h45 187,75 7,8 4.91 + +/- + 15.00 189 7.9 4.89 +++ - +++ 17.00 191 8.0 4.92 +++ - +++ _.__ pH = 7.75 Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification (hours) (dd) bar 17-nov 18.00 0 0.0 7.75 - + - 20-nov 9.00 63 2.6 7.76 - + - 21-nov 12.00 90 3.8 7.78 + - 24-Nov 09.00 159 6.6 5.64 - + - 11.45 161.75 6.7 5.12 Start + Start 13.30 163.5 6.8 5.12 White + 17.15 167.25 7.0 5 , 07 White + 18h30 168.5 7.0 5.04 White + 25-nov 9.30 183.5 7.6 5.00 - + 11.15 185.25 7.7 4.96 - + 13.45 187.75 7, 8 5.00 - +/- + 15.00 189 7.9 4.98 ++ - ++ 17.00 191 8.0 4.96 ++ - ++ Page 52 of 83 NUMBER OF TESTS: 2 tests were carried out made.

CONCLUSION: Pour le milieu à pH 7.75, l'acidification est ralentie dans la première partie de la courbe. CONCLUSION: For the medium at pH 7.75, the acidification is slowed down in the first part of the curve.

Le temps final de précipitation est identique à celui du pH 6.2. The final precipitation time is identical to that of pH 6.2.

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UTILISATION DU TAMPON IMIDAZOLEUSE OF IMIDAZOLE BUFFER

DATE: 16 novembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Le tampon imidazole O. 1 M est utilisé à la place de l'eau distillée dans le milieu TRACEO. DATE: November 16, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIMENT: The imidazole O. 1 M buffer is used instead of the distilled water in the TRACEO medium.

Des essais sont réalisés dans le milieu tamponné imidazole dans lequel sont rajoutées différentes concentrations en chlorure de calcium. Tests are carried out in the imidazole buffered medium in which are added different concentrations of calcium chloride.

La réaction de précipitation est obtenue en milieu liquide en ajoutant différentes quantités d'acide lactique. The precipitation reaction is obtained in liquid medium by adding different amounts of lactic acid.

OBJECTIFS: L'objectif est de déterminer l'effet du tampon imidazole couplé avec le chlorure de calcium sur la précipitation du milieu TRACEO. OBJECTIVES: The objective is to determine the effect of imidazole buffer coupled with calcium chloride on the precipitation of TRACEO medium.

Page 54 sur 83 RESULTATS: V acide [acide pH6,2 précipitation pH6, 2 précipitation lactique (pl) lactique] (g/l) Tracéo + Tracéo + Eau + CacI2 Imidazole + 10mM CacI2 10mM 0 0 6,21 - 6,19 - 0,12 6,14 - 6,13 - 0,24 6,1 - 6,11 0,36 6,05 Flocons 6,09 Flocons 0,48 6,01 5,99 0,6 5,98 5,95 0,72 5,91 5,88 0,84 5,86 5,85 Gros flocons 0,96 5,78 Gros flocons 5,80 1,08 5,73 5,78 1,2 5,69 5,69 1,32 5,66 5,66 1,44 5,57 5,58 1,56 5,54 5,57 1,68 5,49 5,54 1,8 5,39 +++ 5,49 1,92 5,45 2,04 5,41 +++ 2,16 5,36 NOMBRE D'ESSAIS: 2 essais ont été réalisés. RESULTS: V acid [acid pH6,2 precipitation pH6, 2 lactic (pl) lactic precipitation] (g / l) Traceo + Tracéo + Water + CacI2 Imidazole + 10mM CacI2 10mM 0 0 6,21 - 6,19 - 0,12 6,14 - 6,13 - 0,24 6,1 - 6,11 0,36 6,05 Flakes 6,09 Flakes 0,48 6,01 5,99 0,6 5,98 5, 95 0.72 5.91 5.88 0.84 5.86 5.85 Large flakes 0.96 5.78 Large flakes 5.80 1.08 5.73 5.78 1.2 5.69 5.69 1.32 5.66 5.66 1.44 5.57 5.58 1.56 5.54 5.57 1.68 5.49 5.54 1.8 5.39 +++ 5.49 1, 92 5.45 2.04 5.41 +++ 2.16 5.36 NUMBER OF TESTS: 2 trials were conducted.

CONCLUSION: Ces résultats nous montrent que le tampon imidazole n'a pas d'effet sur le pH de précipitation du TRACEO. CONCLUSION: These results show that the imidazole buffer has no effect on the precipitation pH of TRACEO.

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TAMPON PHOSPHATEPHOSPHATE BUFFER

DATE: 16 novembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: La DLC du TRACEO est testée pour différents temps avec ou sans tampon phosphate. DATE: November 16, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIENCE: The TRACEO DLC is tested for different times with or without phosphate buffer.

OBJECTIFS: L'objectif de cette étude est de déterminer l'effet du phosphate sur le temps de précipitation de notre système. Le phosphate a une action tampon qui peut être nécessaire pour retarder la précipitation de notre milieu. OBJECTIVES: The objective of this study is to determine the effect of phosphate on the precipitation time of our system. Phosphate has a buffering action that may be necessary to delay the precipitation of our medium.

RESULTATS: Tableau 7 - Précipitation du milieu TRACEO en fonction de la présence ou de l'absence du tampon phosphate 0,1 M Sucre % glycérol DLC Milieu Jours précipitation Moyenne jours Tamponné Glucose 0 7 8,6-9,63 9,12 Glucose 0 7 X 10,7 10,70 Glucose 0 9 8,6-9,6 9, 10 Glucose 0 9 X 9,6-9,7 9,65 Glucose 15 12 9,6-10,6 10,10 Glucose 15 12 X 12,02 12,02 Glucose 15 15 10,7 10,70 Glucose 15 15 X 13,6- 13,7 13,65 NOMBRE D'ESSAIS: 8 essais ont été réalisés. RESULTS: Table 7 - Precipitation of TRACEO medium according to the presence or absence of phosphate buffer 0.1 M Sugar% glycerol DLC Medium Days precipitation Average days Buffered Glucose 0 7 8,6-9,63 9,12 Glucose 0 7 X 10.7 10.70 Glucose 0 9 8.6-9.6 9, 10 Glucose 0 9 X 9.6-9.7 9.65 Glucose 15 12 9.6-10.6 10.10 Glucose 15 12 X 12.02 12.02 Glucose 15 15 10.7 10.70 Glucose 15 15 X 13.6- 13.7 13.65 NUMBER OF TESTS: 8 tests were carried out.

CONCLUSION: Le tampon phosphate 0.1M augmente le temps de précipitation. En effet, pour une DLC attendue de 7 jours, nous obtenons un temps moyen de précipitation de 9.12 jours avec le milieu tamponné alors qu'il est de 10.7 jours avec le milieu tamponné. II en est de même pour les DLC attendue de 9 jours, 12 jours et 15 jours. CONCLUSION: 0.1M phosphate buffer increases the precipitation time. Indeed, for an expected DLC of 7 days, we obtain a mean precipitation time of 9.12 days with the buffered medium while it is 10.7 days with the buffered medium. The same is true for the expected DLCs of 9 days, 12 days and 15 days.

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LE CITRATETHE CITRATE

DATE: 20 NOVEMBRE 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Des essais sont réalisés en milieu liquide. Le pH de précipitation est mis en évidence par ajout d'acide lactique dans différents milieux contenant 0, 20 et 40 mM de trinatriumcitrate. DATE: NOVEMBER 20, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIENCE: Tests are carried out in a liquid medium. The precipitation pH is evidenced by adding lactic acid in various media containing 0, 20 and 40 mM trinatriumcitrate.

OBJECTIFS: L'objectif est de déterminer l'effet du citrate sur notre milieu TRACEO et sa précipitation. OBJECTIVES: The objective is to determine the effect of citrate on our TRACEO medium and its precipitation.

Page 57 sur 83 RESULTATS: Tableau 8 - pH de précipitation de différents milieux contenant du trinatriumcitrate V acide [acide pH Tracéo Précipitation [acide pHCitrate précipitation V acide [acide pH Citrate précipitation lactique (pl) lactique] (g/I) Citrate OmM lactique] (g/1) 20mM lactique (pl) lactique] (g/I) 40mM 0 0 6,2 - 0 6,25 - 0 0 6,25 - 0,06 6,17 - 0,06 6,24 Gros flocons 10 0,06 6,23 - 0,12 6,15 - 0,12 6,23 +gros 20 0,12 6,22 - 0,18 6,13 - 0,18 6,21 - 30 0,18 6,21 Flocons 0,24 6,11 0,24 6,19 - 40 0,24 6,2 - 0,3 6,09 - 0,3 6,15 - 50 0,3 6,19 - 0,36 6,07 0,36 6,14 - 60 0,36 6,15 Gros flocons 0,42 6,04 - 0,42 6,12 - 70 0,42 6,14 - 0,48 6,02 - 0,48 6,1 - 80 0,48 6,13 - 0,54 6 - 0,54 5;92 - 90 0,54 6,12 - 0,6 5,99 - 0,6 5,9 - 100 0,6 6,11 - 0,66 5,97 Petits flocons 0,66 5,9 110 0,66 6,1 - 0,72 5,94 0,72 5,89 - 120 0,72 6,09 - 0,78 5,92 0,78 5,89 130 0,78 6,09 - 0,84 5,86 Gros flocons 0,84 5,89 ? 140 0,84 6,08 - 0,9 5,81 0,9 5,94 - 150 0,9 6,07 - 0,96 5,78 0,96 5,93 - 160 0,96 6,06 - 1,02 5,76 1,02 5,93 - 170 1,02 6,05 - 1,08 5,73 1,08 5,93 - 180 1,08 6,03 1,14 5,66 1,14 5,92 - 190 1,14 6,02 - 1,2 5,64 1,2 5,91 - 200 1,2 6,01 210 1,26 5,62 1,26 5,9 - 210 1,26 5,96 Gros flocons 220 1,32 5,57 1,32 5,89 - 310 1,86 5,84 - 230 1,38 5,56 1,38 5,88 - 410 2,46 5,77 - 240 1,44 5,54 1,44 5,86 - 510 3,06 5,72 - 250 1,5 5,51 1,5 5,82 - 610 3,66 5,64 260 1,56 5,49 1,56 5,81 - 710 4,26 5,52 - 270 1,62 5,46 1,62 5,79 - 810 4,86 5,47 - 280 1,68 5,43 1,68 5,78 - 910 5,46 5,38 +++ 290 1,74 5,4 1,74 5,77 - 300 1,8 5,38 1,8 5,76 - 310 1,86 5,36 1,86 5,75 - 320 1,92 5,34 1,92 5,74 - 330 1,98 5,33 1,98 5,7 - 340 2,04 5,31 2,04 5,69 - 440 2,1 5,25 +++ 2,64 5,61 +++ 540 3,24 5,5 640 _ 3,84 5,41 Page 58 sur 83 NOMBRE D'ESSAIS: 3 essais ont été réalisés. RESULTS: Table 8 - Precipitation pH of different media containing trinatriumcitrate V acid [Trocalo acid pH Precipitation [acid pHCitrate precipitation V acid [acid pH Citrate lactic (pl) lactic precipitation] (g / I) OmM lactic citrate ] (g / 1) 20mM lactic (pl) lactic (g / I) 40mM 0 0 6.2 - 0 6.25 - 0 0 6.25 - 0.06 6.17 - 0.06 6.24 Large flakes 10 0.06 6.23 - 0.12 6.15 - 0.12 6.23 + fat 20 0.12 6.22 - 0.18 6.13 - 0.18 6.21 - 30 0.18 6.21 Flakes 0.24 6.11 0.24 6.19 - 40 0.24 6.2 - 0.3 6.09 - 0.3 6.15 - 50 0.3 6.19 - 0.36 6.07 0.36 6.14 - 60 0.36 6.15 Large flakes 0.42 6.04 - 0.42 6.12 - 70 0.42 6.14 - 0.48 6.02 - 0, 48 6.1 - 80 0.48 6.13 - 0.54 6 - 0.54 5, 92 - 90 0.54 6.12 - 0.6 5.99 - 0.6 5.9 - 100 0, 6 6.11 - 0.66 5.97 Small flakes 0.66 5.9 110 0.66 6.1 - 0.72 5.94 0.72 5.89 - 120 0.72 6.09 - 0, 78 5.92 0.78 5.89 130 0.78 6.09 - 0.84 5.86 Large flakes 0.84 5.89? 140 0.84 6.08 - 0.9 5.81 0.9 5.94 - 150 0.9 6.07 - 0.96 5.78 0.96 5.93 - 160 0.96 6.06 - 1.02 5.76 1.02 5.93 - 170 1.02 6.05 - 1.08 5.73 1.08 5.93 - 180 1.08 6.03 1.14 5.66 1.14 5.92 - 190 1.14 6.02 - 1.2 5.64 1.2 5.91 - 200 1.2 6.01 210 1.26 5.62 1.26 5.9 - 210 1.26 5.96 Large flakes 220 1.32 5.57 1.32 5.89 - 310 1.86 5.84 - 230 1.38 5.56 1.38 5.88 - 410 2.46 5.77 - 240 1.44 5.54 1.44 5.86 - 510 3.06 5.72 - 250 1.5 5.51 1.5 5.82 - 610 3.66 5.64 260 1.56 5.49 1 , 56 5.81 - 710 4.26 5.52 - 270 1.62 5.46 1.62 5.79 - 810 4.86 5.47 - 280 1.68 5.43 1.68 5.78 910 5.46 5.38 +++ 290 1.74 5.4 1.74 5.77 - 300 1.8 5.38 1.8 5.76 - 310 1.86 5.36 1.86 5, 75 - 320 1.92 5.34 1.92 5.74 - 330 1.98 5.33 1.98 5.7 - 340 2.04 5.31 2.04 5.69 - 440 2.1 5, 25 +++ 2,64 5,61 +++ 540 3,24 5,5 640 _ 3,84 5,41 Page 58 of 83 NUMBER OF TESTS: 3 tests were carried out.

CONCLUSION: Ces résultats nous indique que le trinatrium citrate a un effet tampon dans le milieu TRACEO. CONCLUSION: These results indicate that trinatrium citrate has a buffering effect in TRACEO medium.

En effet, pour une concentration de 0.6g/1 à 1.32g/I d'acide lactique, le pH du milieu contenant 20mM de citrate varie très peu. II en est de même pour la concentration 40mM. Indeed, for a concentration of 0.6 g / l to 1.32 g / l of lactic acid, the pH of the medium containing 20 mM citrate varies very little. It is the same for the 40mM concentration.

Une concentration en acide lactique plus importante est nécessaire dans le milieu TRACEO + citrate pour obtenir une précipitation. A higher concentration of lactic acid is required in the TRACEO + citrate medium to obtain precipitation.

La présence de trinatrium citrate dans le milieu TRACEO peut permettre de rallonger la DLC de notre témoin de rupture de chaîne du froid. The presence of trinatrium citrate in the TRACEO medium may lengthen the DLC of our cold chain break indicator.

D'autres essais doivent être réalisés pour valider ces résultats. Further tests must be performed to validate these results.

pH du milieu Tracéo en fonction de la concentration en Citrate après ajout d'acide lactique ---OmM citrate ---20 mM citrate 40 Mm citrate 0 2 4 6 Concentration en acide lactique (g/1) Page 59 sur 83 VALIDATION DE DLC (6, 15 ET 21 JOURS) DATE: 28 novembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Les conditions sont présentées dans le tableau suivant: DLC % glycérol Glucose Mannitol Tampon phosphate 0.1 M 6 jours 0 X X X jours 15 X X X 21 jours 20 X X X OBJECTIFS: L'objectif est de valider les résultats obtenus précédemment en associant au milieu TRACEO les éléments suivants: Glycérol, sucres et tampon phosphate 0.1 M. Page 60 sur 83 RESULTATS: Croissance de la souche 58 DLC 6J 6J=-2J 4 C et 4J à 8 C Milieu TRACEO DC (+glucose) avec glycérol 0% + caséine 50g/l GO Milieu TS 0,1g/I tryptonel 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 28-nov 18h00 0 0,00 6,2 - + - 01-déc 9h00 63 2,63 6,2 - + - 04-déc 9h15 135,25 5,64 6,08 - + - 05-déc 9h15 159,25 6,64 5,49 - + - 06-déc 9h15 183,25 7,64 5,56 - + - 07-déc 9h15 207,25 8,64 08-déc 9h00 231 9,63 4,77 + - + Milieu TRACEO DC (+ mannitol) avec glycérol 0% + caséine 50g/l MO Milieu TS 0,1 g/1 tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 28-nov 18h00 0 0,00 6,21 - + - 01-déc 9h00 63 2,63 6,21 - + - 04-déc 9h15 135,25 5,64 6,09 - + - 05-déc 10h00 160 6,67 5,94 - + - 06-déc 9h15 183,25 7,64 5,92 - + - 07-déc 9h15 207,25 8,64 - 08-déc 9h00 231,25 9,64 5,14 + - 12h00 234,25 9,76 5,11 - + - 16h00 238,25 9,93 5,11 - + - 17h30 239,75 9,99 5,08 - + - 09-déc 9h15 255,5 10,65 5,06 Blanc + 12h00 258,25 10,76 5,09 18h00 264,25 11,01 5,08 10-déc 16h00 286,25 11,93 5,03 Début + 11-déc 9h15 303,5 12,65 4,92 ++ - +/- 8 C colo+ 8 C colo+ Page 61 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche 58 DLC 6J 6J=2J 4 C et 4J à 8 C Milieu TRACEO DC Tamponné phosphate 0,1 M (+glucose) avec glycérol 0% + caséine 50g/I GOT Milieu TS 0,lg/l tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification barre Heures Jours 28-nov 18h00 0 0,00 6,28 - + - 01-déc 9h00 63 2,63 6,29 - + _ 04-déc 9h15 135,25 5,64 6,29 - + - 05-déc 10h00 160 6,67 6,18 - + - 07-déc 9h15 207,25 8,64 08-déc 9h00 231 9,63 4,83 ++/- + + 09-déc 9h00 255 10,63 4,89 ++/+(limite) +/- 09-déc 12h00 258 10,75 4,83 ++ - + Milieu TRACEO DC Tamponné phosphate (+ mannitol) avec glycérol 0% + caséine 50g/I IMOT Milieu TS 0,lg/I tryptone/ 0,85% NACL 8 C colo+ Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code Opacification barre Heures Jours 28-nov 18h00 0 0,00 6,2 - + - 01-déc 9h00 63 2,63 6,21 - + _ 04-déc 9h15 135,25 5,64 6,17 - + _ 05-déc 10h00 160 6,67 5,94 - + - 05-déc 17h00 167 6,96 5,92 - + _ 07-déc 9h15 207,25 8,64 - + _ 08-déc 9h00 231 9,63 5,27 - + - 12h00 234 9,75 5,09 - + _ 16h00 238 9,92 5,06 - + _ 17h30 239,5 9,98 5,06 - + _ 09-déc 9h15 255,25 10,64 4,99 Blanc ++ + +/- 12h00 Arrêt Exsudat +i Eau dans I boite 8 C colo+ TO Milieu mou ( Mannitol + tampon phosphate) Page 62 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche 58 DLC 9J 9J=3J 4 C et 6J à 8 C Milieu TRACEO DC (+glucose) avec glycérol 0% + caséine 50g/l GO Milieu TS 0,1g/l tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 28-nov 18h00 0 0,00 6,2 - + - 01-déc 9h00 63 2,63 6,2 - + _ 04-déc 9h15 135,25 5,64 6 - + - 05-déc 10h00 160 6,67 5,94 - + - 06-déc 9h30 183,5 7,65 - 07-déc 9h45 207,75 8,66 +/- 1 + et 1 08-déc 9h00 231 9,63 4,74 + - + Milieu TRACEO DC (+ mannitol) avec glycérol 0% + caséine 50g/l MO Milieu TS 0,1g/l tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 28-nov 18h00 0 0,00 6,21 - + - 01-déc 9h00 63 2,63 6,21 - + _ 04-déc 9h15 135,25 5,64 6,15 - + - 05-déc 10h00 160 6,67 5,98 - + - 06-déc 9h30 183,5 7,65 - + _ 07-déc 9h45 207,75 8,66 - + _ 08-déc 9h00 231 9,63 5,22 - + _ 12h00 234 9,75 5,24 - + _ 16h00 238 9,92 5,22 - + _ 17h30 239,5 9,98 5,21 - + _ 09-déc 9h15 255,25 10,64 5,12 Blanc+ + _ 12h00 258 10,75 5,08 18h00 264 11,00 5,03 10-déc 16h00 286 11,92 4,94 Début 11-déc 9h15 303,25 12,64 4,91 +/- + +/- 12h00 306 12,75 4,86 +++ - +++ 8 C Page 63 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche 58 DLC 9J 9J=3J 4 C et 6J à 8 C Milieu TRACEO DC Tamponné phosphate 0,IM (+glucose) avec glycérol 0% + caséine 50g/l Milieu TS 0,lg/I tryptone/ 0,85% pH of Tracéo medium as a function of citrate concentration after addition of lactic acid --- OmM citrate --- 20 mM citrate 40 Mm citrate 0 2 4 6 Lactic acid concentration (g / 1) Page 59 of 83 VALIDATION OF DLC (6, 15 AND 21 DAYS) DATE: November 28, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIENCE: The conditions are presented in the following table: DLC% glycerol Glucose Mannitol Phosphate buffer 0.1 M 6 days 0 XXX days 15 XXX 21 days 20 XXX OBJECTIVES The objective is to validate the results obtained previously by associating with the TRACEO medium the following elements: Glycerol, sugars and 0.1M phosphate buffer Page 60 of 83 RESULTS: Growth of the strain 58 DLC 6J 6J = -2J 4 C and 4J at 8 C Medium TRACEO DC (+ glucose) with glycerol 0% + casein 50g / l GO Medium TS 0.1g / I tryptonel 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Reading barcode Opacification Hours Days 28-nov 18h00 0 0 , 00 6,2 - + - 01-dec 9h00 63 2,63 6,2 - + - 04-déc 9h15 135,25 5,64 6,08 - + - 05-dice c 9h15 159,25 6,64 5,49 - + - 06-dec 9h15 183,25 7,64 5,56 - + - 07-dec 9h15 207,25 8,64 08-dec 9:00 231 9,63 4, 77 + - + Medium TRACEO DC (+ mannitol) with glycerol 0% + casein 50g / l MO Medium TS 0.1 g / 1 tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Reading barcode Opacification Hours Days 28-nov 18h00 0 0,00 6,21 - + - 01-dec 9h00 63 2,63 6,21 - + - 04-déc 9h15 135,25 5,64 6,09 - + - 05-dec 10:00 160 6,67 5 , 94 - + - 06-dec 9h15 183,25 7,64 5,92 - + - 07-dec 9h15 207,25 8,64 - 08-dec 9:00 231,25 9,64 5,14 + - 12:00 234, 25 9.76 5.11 - + - 16.00 238.25 9.93 5.11 - + - 17.30 239.75 9.99 5.08 - + - 09-Dec 9.15 255.5 10.65 5.06 White + 12h00 258.25 10.76 5.09 18.00 264.25 11.01 5.08 10-Dec 16.00 286.25 11.93 5.03 Start + 11-Dec 9h15 303.5 12.65 4.92 + + - +/- 8 C colo + 8 C colo + Page 61 of 83 Table of growth results of strain 58 DLC 6J 6J = 2J 4 C and 4J at 8 C Medium TRACEO DC Buffered 0.1 M phosphate (+ glucose) with 0% glycerol + 50g / I casein GOT Medium TS 0, lg / l tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification bar Hours Days 28-nov 18h00 0 0,00 6,28 - + - 01-dc 9:00 63 2,63 6, 29 - + _ 04-dec 9h15 135,25 5,64 6,29 - + - 05-dec 10:00 160 6,67 6,18 - + - 07-dec 9h15 207,25 8,64 08-dec 9:00 231 9 , 63 4.83 ++ / - + + 09-Dec 9.00 255 10.63 4.89 ++ / + (limit) +/- 09-Dec 12.00 258 10.75 4.83 ++ - + Medium TRACEO DC Buffered phosphate (+ mannitol) with glycerol 0% + casein 50g / I IMOT Medium TS 0, lg / I tryptone / 0.85% NACL 8 C colo + Date Time Time pH Precipitation Reading code Opacification bar Hours Days 28-nov 18h00 0 0 , 00 6,2 - + - 01-dec 9h00 63 2,63 6,21 - + _ 04-déc 9h15 135,25 5,64 6,17 - + _ 05-dec 10:00 160 6,67 5,94 - + - 05-Dec 17:00 167 6.96 5.92 - + _ 07-Dec 9h15 207.25 8.64 - + _ 08-Dec 9.00 231 9.63 5.27 - + - 12.00 234 9.75 5, 09 - + _ 16h00 238 9,92 5,06 - + _ 17h30 239,5 9,98 5,06 - + _ 09-déc 9h15 255,25 10,64 4,99 White ++ + +/- 12:00 Exsudat + i Ea u in I box 8 C colo + TO Soft medium (Mannitol + phosphate buffer) Page 62 of 83 Table of growth results of strain 58 DLC 9J 9J = 3J 4 C and 6J to 8 C Medium TRACEO DC (+ glucose) with glycerol 0% + casein 50g / l GO Medium TS 0.1g / l tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Reading bar code Opacification Hours Days 28-nov 18h00 0 0,00 6,2 - + - 01-dec 9h00 63 2,63 6,2 - + _ 04-déc 9h15 135,25 5,64 6 - + - 05-dec 10:00 160 6,67 5,94 - + - 06-dec 9:30 183,5 7,65 - 07-Dec 9h45 207,75 8,66 +/- 1 + and 1 08-Dec 9:00 231 9,63 4,74 + - + Medium TRACEO DC (+ mannitol) with glycerol 0% + casein 50g / l MO Medium TS 0.1g / l tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Barcode reading Opacification Hours Days 28-Nov 18h00 0 0,00 6,21 - + - 01-dc 9:00 63 2,63 6,21 - + _ 04-Dec 9h15 135,25 5,64 6,15 - + - 05-Dec 10:00 160 6,67 5,98 - + - 06-Dec 9:30 183,5 7,65 - + _ 07-Dec 9:45 am 207, 75 8.66 - + _ 08-dec 9.00 231 9.63 5.22 - + _ 12.00 234 9.75 5.24 - + _ 4.00 pm 238 9.92 5.22 - + _ 5.30 pm 239.5 9.98 5.21 - + _ 09-Dec 9.15 255.25 10.64 5.12 White + + _ 12.00 258 10.75 5.08 18.00 264 11.00 5.03 10-Dec 16.00 286 11.92 4.94 Start 11-Dec 9.15 303.25 12.64 4.91 +/- + +/- 12.00 306 12 , 75 4.86 +++ - +++ 8 C Page 63 of 83 Table of growth results of strain 58 DLC 9J 9J = 3J 4 C and 6J to 8 C Medium TRACEO DC Buffered phosphate 0, IM (+ glucose ) with glycerol 0% + casein 50g / l Medium TS 0, lg / I tryptone / 0.85%

NACLNACL

Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 28-nov 18h00 0 0,00 6,28 - + _ 01-déc 9h00 63 2,63 6,29 - + _ 04-déc 9h15 135,25 5,64 6,29 - + _ 05-déc 10h00 160 6,67 6,23 06-déc 9h30 183,5 7,65 - 07-déc 9h45 207,75 8,66 - 08-déc 9h00 231 9,63 4,99 +1- + +1- 12h00 234 9,75 4,89 ++ - ++ Milieu TRACEO DC Tamponné phosphate (+ mannitol) avec glycérol 0% + caséine 50g/l MOT Milieu TS 0,lg/I tryptone10,85% Date Time Time pH Precipitation Barcode reading Opacification Hours Days 28-Nov 18:00 0 0,00 6,28 - + _ 01-Dec 9:00 63 2,63 6,29 - + _ 04-Dec 9h15 135,25 5,64 6 , 29 - + _ 05-dec 10:00 160 6,67 6,23 06-dec 9:30 183,5 7,65 - 07-dec 9:45 207,75 8,66 - 08-dec 9:00 231 9,63 4,99 + 1- + + 1- 12h00 234 9,75 4,89 ++ - ++ Medium TRACEO DC Buffered phosphate (+ mannitol) with glycerol 0% + casein 50g / l MOT Medium TS 0, lg / I tryptone10,85%

NACLNACL

Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 28-nov 18h00 0 0,00 6,2 - + _ 01-déc 9h00 63 2,63 6,21 - + _ 04-déc 9h15 135,25 5,64 6,16 - + _ 05-déc 10h00 160 6,67 6,08 - + _ 06-déc 9h30 183,5 7,65 - 07-déc 9h45 207,75 8,66 - 08-déc 9h00 231 9,63 5,15 Exsudat 12h00 234 9,75 5,1 16h00 238 9,92 5,13 Milieu blanc mais pas précipitation 17h30 239,5 9,98 5,15 09-déc 9h15 255,25 10,64 5,03 Blanc ++ + +/- 12h00 258 10,75 5,07 18h00 264 11,00 5,08 10-déc 16h00 286 11,92 4,96 +/- + +/11-déc 9h15 303,25 12,64 4,91 +/- + +/_ 12h00 306 12,75 4,89 +++ - +++ Date Time Time pH Precipitation Barcode reading Opacification Hours Days 28-nov 18h00 0 0,00 6,2 - + _ 01-dc 9:00 63 2,63 6,21 - + _ 04-dec 9h15 135,25 5,64 6 , 16 - + _ 05-dec 10:00 160 6,67 6,08 - + _ 06-dec 9:30 183,5 7,65 - 07-dec 9:45 207,75 8,66 - 08-dec 9:00 231 9,63 5 , 15 Exudate 12.00 234 9.75 5.1 16.00 238 9.92 5.13 White medium but no precipitation 17.30 239.5 9.98 5.15 09-Dec 9.15 255.25 10.64 5.03 White ++ +/- 12.00 258 10.75 5.07 18.00 264 11.00 5.08 10-Dec 16.00 286 11.92 4.96 +/- + + / 11-Dec 9.15 303.25 12.64 4.91 +/- + + / _ 12h00 306 12,75 4,89 +++ - +++

IGOT ExsucIGOT Exsuc

Page 64 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche 58 DLC 12J 12J=4J 4 C et 8J à 8 C Milieu TRACEO DC (+glucose) avec glycérol 15% + caséine 50g/l G15GIy Milieu TS 0,lg/I tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,09 - + _ 02-déc 9h00 111,5 4,65 6,13 - + _ 05-déc 10h00 183,5 7,65 5,85 - + _ 06-déc 9h30 207,5 8,65 - 07-déc 9h45 231,5 9,65 + 08-déc 9h00 255,5 10,65 4,75 + - + Milieu TRACEO DC (+ mannitol) avec glycérol 15% + caséine 50g/I M15Gly Milieu TS 0,1 g/l tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,12 - + 02-déc 9h00 111,5 4,65 6,19 - + - 05-déc 10h00 184,5 7,69 6,09 - + - 06-déc 10h00 208,5 8,69 - 07-déc 10h00 232,5 9,69 - 08-déc 9h00 255,5 10,65 5,25 - + - 12h00 258,5 10,77 5,3 - + _ 16h00 262,5 10,94 5,29 - + _ 17h30 264 11,00 5,23 - + - 09-déc 9h15 279,75 11,66 5,12 Blanc+ 12h00 282,5 11,77 5,1 18h00 288,5 12,02 5,1 10-déc 16h00 310,5 12,94 4,95 +++ - +++ 8 C 8 C Page 65 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche 58 DLC 12J 12J=4J 4 C et 8J à 8 C Milieu TRACEO DC Tamponné phosphate 0,IM (+glucose) avec glycérol 15% + caséine 50g/l G15GIy T Milieu TS 0,lg/I tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,25 - + _ 02-déc 9h00 111,5 4,65 6,28 - + _ 05-déc 10h00 184,5 7,69 6,21 - + _ 06-déc 10h00 208,5 8,69 - 07-déc 10h00 232,5 9,69 - 08-déc 9h00 255,5 10,65 5,22 - + _ 12h00 258,5 10,77 5,08 - + _ 16h00 262,5 10,94 5,06 - + _ 17h30 264 11,00 5,01 - + _ 09-déc 9h15 279,75 11,66 4,97 Blanc ++ + _ 12h00 282,5 11,77 4,98 18h00 288,5 12,02 4,96 +++ _ +++ Milieu TRACEO DC Tamponné phosphate (+ mannitol) avec glycérol 15% + caséine 50g/I M15GIyT Milieu TS 0,lg/l tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,25 - + _ 02-déc 9h00 111,5 4,65 6,27 - + - 05-déc10h00 184,5 7,69 6,33 - + _ 06-déc 10h00 208,5 8,69 - 07-déc 10h00 232,5 9,69 - 08-déc 9h00 255,5 10,65 5,91 - + _ 12h00 258,5 10,77 5,85 - + _ 16h00 262,5 10,94 5,76 - + _ 17h30 264 11,00 5,71 - + _ 09-déc 9h15 279,75 11,66 5,56 - + _ 12h00 282,5 11,77 5,58 - + - 18h00 288,5 12,02 5,47 - + _ 10-déc 16h00 310,5 12,94 5,31 - + _ 11-déc 9h15 327,75 13,66 5,21 - + _ 12h00 330,5 13,77 5,15 - + _ 12-déc 9h15 351,75 14,66 5,1 +/ _ + _ 14h30 357 14,88 5,15 +/ - + _ 13-déc 16h30 383 15,96 +/ - + - 14-déc 16h30 407 16,96 + - + Page 66 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche 58 DLC 15j 15J=5J 4 C et 10J à 8 C Milieu TRACEO DC (+glucose) avec glycérol 15% + caséine 50g/l G15GIy Milieu TS 0,lg/I tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,09 - + 03-déc 9h00 135,5 5,65 6,11 - + _ 05-déc 10h00 184,5 7,69 6,03 08-déc 9h00 255,5 10,65 4,9 +/- +/- + 12h00 258,5 10,77 4,91 +++ _ + Milieu TRACEO DC (+ mannitol) avec glycérol 15% + caséine 50g/I M15GIy Milieu TS 0,1 g/I tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,12 - + _ 03-déc 9h00 135,5 5,65 6,18 - + _ 05-déc 10h00 184,5 7,69 6,15 - + _ 08-déc 9h00 255,5 10,65 5,79 - + _ 12h00 258,5 10,77 5,4 - + _ 16h00 262,5 10,94 5,34 - + _ 17h30 264 11,00 5,39 - + _ 09-déc 9h15 279,75 11,66 5,21 - + _ 12h00 282,5 11,77 5,15 - + _ 18h00 288,5 12,02 5,11 - + _ 10-déc 16h00 310,5 12,94 5 +++ _ +++ 8 1 8 1 Page 67 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche 58 DLC 15j 15J=5J 4 C et 10J à 8 C Milieu TRACEO DC Tamponné phosphate 0,1M (+ glucose) avec glycérol 15%+ caséine 50g/I G15GIy T Milieu TS 0,1g/I tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,25 - + - 03-déc 9h00 135,5 5,65 6,25 - + - 05-déc 10h00 184,5 7,69 6,27 - + - 08-déc 9h00 255,5 10,65 6,11 - + - 12h00 258,5 10,77 6,06 - + - 16h00 262,5 10,94 5,98 - + 17h30 264 11,00 5,97 - + - 09-déc 9h15 279,75 11,66 5,6 - + - 10-déc 16h00 286,5 11,94 5,13 - + - 11-déc 9h15 327,75 13,66 5 +/- + +/- 12h00 330,5 13,77 4,96 +++ - +++ Milieu TRACEO DC Tamponné phosphate (+ mannitol) avec glycérol 15% + caséine 50g/I M15GIy T Milieu TS 0,lg/I tryptonel 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,25 - + - 03-déc 9h00 135,5 5,65 6,25 + - 05-déc 10h00 184,5 7,69 6,35 - + - 08-déc 9h00 255,5 10,65 6,19 - + 12h00 258,5 10,77 6,14 - + - 16h00 262,5 10,94 6,07 - + - 17h30 264 11,00 6,04 - + - 09-déc 9h15 279,75 11,66 6,05 - + - 18h00 288,5 12,02 6,02 - + - 10-déc 10h00 304,5 12,69 5,94 - + - 11-déc 9h15 327,75 13,66 5,83 - + 12h00 330,5 13,77 5,75 - + - 12-déc 9h15 351,75 14,66 5,71 - + - 14h30 357 14,88 5,12 - + - 13-déc 16h30 383 15,96 - + - 14-déc 16h30 407 16,96 + - + 8 C 8 C Page 68 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche 58 DLC 18J 18J=6J 4 C et 12J à 8 C Milieu TRACEO DC (+glucose) avec glycérol 20% + caséine 50g/I G20GIy Milieu TS 0,1g/I tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,09 - + - 04-déc 9h00 159,5 6,65 6,1 - + - 08-déc 9h00 255,5 10,65 5,85 - + - 12h00 258,5 10,77 - + - 17h30 264 11,00 5,81 + - 09-déc 9h30 279 11,63 5,61 - + - 10-déc 16h00 310,5 12,94 4,97 +++ +++ Milieu TRACEO DC (+ mannitol) avec glycérol 20% + caséine 50g/l M20GIy Milieu TS 0,lg/I tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,15 - + - 04-déc 9h00 159,5 6,65 6,17 - + - 08-déc 9h00 255,5 10,65 5,92 - + 17h30 264 11,00 6,00 - + - 09-déc 9h30 280 11,67 5,71 - + - 10-déc 16h00 289,5 12,06 5,49 - + - 11-déc 9h15 327,75 13,66 5,36 - + - 12h00 330,5 13,77 5,33 - + - 12-déc 14h30 357 14,88 5,12 +/- + - 18h35 361 15,04 5,05 +1- + - 13-déc 17h00 383 15,96 + - + 8 8 Page 69 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche 58 DLC 18J 6J 4 C et 12J à 8 C Milieu TRACEO DC Tamponné phosphate 0,IM (+glucose) avec glycérol 20% + caséine 50g/I G20GIy T Milieu TS 0,1g/I tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,22 - + - 04-déc 9h00 159,5 6,65 6,26 - + - 08-déc 9h00 255,5 10,65 5,95 - + - 17h30 264 11,00 5,67 - + - 09-déc 9h30 280 11,67 5,33 - + - 10-déc 16h00 310,5 12,94 5,06 - + - 11-déc 9h15 327,75 13,66 4,98 ++ - +++ Milieu TRACEO DC Tamponné phosphate (+ mannitol) avec glycérol 20% + caséine 50g/l M20GIy T Milieu TS 0,1 g/I tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,25 - + - 04-déc 9h00 159,5 6,65 6,25 + - 08-déc 9h00 255,5 10,65 6,21 - + - 17h30 264 11,00 6,14 - + - 09-déc 9h30 280 11,67 5,83 - + - 10-déc 16h00 286,5 11,94 5,71 - + - 11-déc 9h15 327,75 13,66 5,63 - + - 12h00 330,5 13,77 5,54 - + - 12-déc 9h15 351,75 14,66 5,45 - + - 14h30 357 14,88 5,45 - + - 18h35 361 15,04 5,41 - + 15-déc 9h 423,5 17,65 +/- + - 16-déc 9h30 448 18,67 5,14 +/- + +/- 17-déc 9h15 471,75 19,66 5,1 +/- - +/- 8 C 8 C Page 70 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche DLC 21 j 21J=7J 4 C et 14J à 8 C Milieu TRACEO DC (+glucose) avec glycérol 20% + caséine 50g/l I G20GIy Milieu TS 0,1g/I tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,09 + - 05-déc 9h00 183,5 7,65 6,09 - + - 08-déc 9h00 255,5 10,65 5,88 - + 17h30 264 11,00 5,84 - + - 09-déc 9h30 280 11,67 5,66 - + - 17h30 288 12,00 5,53 - + - 10-déc 16h00 310,5 12,94 4,94 +++ - +++ Milieu TRACEO DC (+ mannitol) avec glycérol 20% + caséine 50g/I M20GIy Milieu TS 0,1 g/I tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,15 - + - 05-déc 9h00 183,5 7,65 6,15 - + - 08-déc 9h00 255,5 10,65 6,09 - + - 09-déc 9h30 280 11,67 5,95 - + - 10-déc 16h00 310,5 12,94 5,43 - + - 11-déc 9h15 327,75 13,66 5,37 - + - 12h00 330,5 13,77 5,27 - + - 12-déc 9h15 351,75 14,66 5,13 +/- + - 14h30 357 14,88 5,14 +/- + 18h35 361 15,04 5,06 +/- + 13-déc 16h30 383 15,96 +/- + +/- 14-déc 16h30 407 16,96 +/- +/- +/- 15-déc 9h 423,5 17,65 +++ - +++ Page 71 sur 83 Tableau de résultats de croissance de la souche DLC 21 j 21 J=-.7J 4 C et 14J à 8 C Milieu TRACEO DC Tamponné phosphate 0,1 M (+ glucose) avec glycérol 20% + caséine 50g/l G20GIyT Milieu TS 0,1g/I tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,22 - + _ 05-déc 9h00 183,5 7,65 6,25 - + _ 08-déc 9h00 255,5 10,65 6,18 - + _ 09-déc 9h30 280 11,67 5,77 - + _ 10-déc 16h00 310,5 12,94 5,2 - + - 11-déc 9h15 327,75 13,66 5,04 +1- - +++ Milieu TRACEO DC Tamponné phosphate (+ mannitol) avec glycérol 20% + caséine 50g/I M20GIyT Milieu TS 0,1g/I tryptone/ 0,85% NACL Date Heure Temps pH Précipitation Lecture code barre Opacification Heures Jours 27-nov 17h30 0 0,00 6,25 - + _ 05-déc 9h00 183,5 7,65 6,25 - + _ 08-déc 9h00 255,5 10,65 6,29 - + _ 09-déc 9h30 280 11,67 6,22 - + _ 10-déc 16h00 310,5 12,94 5,8 - + _ 11-déc 9h15 327,75 13,66 5,65 - + _ 12H00 330,5 13,77 5,53 - + _ 12-déc 9h15 351,75 14,66 5,48 - + _ 14h30 357 14,88 5,43 - + _ 18h35 361 15,04 5,36 - + _ 13-déc 16h55 383 15,96 - + _ 15-déc 9h 423,5 17,65 - + _ 16-déc 9h30 448 18,67 5,04 +/- + +/_ 17-déc 9h15 471,75 19,66 5,03 ++ _ ++ Page 72 sur 83 NOMBRE D'ESSAIS: 24 essais sont réalisés. Page 64 of 83 Table of growth results of strain 58 DLC 12J 12J = 4J 4 C and 8J to 8 C Medium TRACEO DC (+ glucose) with glycerol 15% + casein 50g / l G15GIy Medium TS 0, lg / I tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Barcode reading Opacification Hours Days 27-Nov 17h30 0 0,00 6,09 - + _ 02-Dec 9:00 111,5 4,65 6,13 - + _ 05-dec 10.00 hrs 183.5 7.65 5.85 - + _ 06-Dec 9.30 hrs 207.5 8.65 - 07-Dec 0945 231.5 9.65 + 08-Dec 9.00 255.5 10.65 4.75 + - + Medium TRACEO DC (+ mannitol) with glycerol 15% + casein 50g / I M15Gly Medium TS 0.1 g / l tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Reading barcode Opacification Hours Days 27-nov 17h30 0 0 , 00 6,12 - + 02-dec 9:00 111,5 4,65 6,19 - + - 05-dec 10:00 184,5 7,69 6,09 - + - 06-dec 10:00 208,5 8,69 - 07-Dec 10:00 232.5 9.69 - 08-Dec 9.00 255.5 10.65 5.25 - + - 12.00 258.5 10.77 5.3 - + _ 16.00 262.5 10.94 5.29 - + _ 5:30 pm 264 11,00 5,23 - + - 09-dec 9h15 279,75 11,66 5,12 White + 12h00 282,5 11,7 7 5.1 18.00 288.5 12.02 5.1 10-Dec 16.00 310.5 12.94 4.95 +++ - +++ 8 C 8 C Page 65 of 83 Table of strain growth results 58 DLC 12J 12J = 4J 4 C and 8J to 8 C Medium TRACEO DC Buffered phosphate 0, IM (+ glucose) with glycerol 15% + casein 50g / l G15GIy T Medium TS 0, lg / I tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Barcode Reading Opacification Hours Days 27-Nov 17:30 0 0,00 6,25 - + _ 02-Dec 9:00 111,5 4,65 6,28 - + _ 05-Dec 10:00 184.5 7, 69 6,21 - + _ 06-dec 10:00 208,5 8,69 - 07-dec 10:00 232,5 9,69 - 08-dec 9:00 255,5 10,65 5,22 - + _ 12:00 258,5 10 , 77 5.08 - + _ 16.00 262.5 10.94 5.06 - + _ 17.30 264 11.00 5.01 - + _ 09-dec 9h15 279.75 11.66 4.97 White ++ + _ 12.00 282.5 11.77 4.98 18.00 288.5 12.02 4.96 +++ _ +++ Medium TRACEO DC Buffered phosphate (+ mannitol) with glycerol 15% + casein 50g / I M15GIyT Medium TS 0, lg / l tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Barcode reading Opacification Hours Days 27-Nov 17h30 0 0, 00 6,25 - + _ 02-dec 9:00 111,5 4,65 6,27 - + - 05-déc10h00 184,5 7,69 6,33 - + _ 06-dec 10:00 208,5 8,69 - 07 -dec 10h00 232.5 9.69 - 08-dec 9.00 255.5 10.65 5.91 - + _ 12.00 258.5 10.77 5.85 - + _ 16.00 262.5 10.94 5.76 - + _ 5.30 pm 264 11.00 5.71 - + _ 09-Dec 9h15 279.75 11.66 5.56 - + _ 12.00 282.5 11.77 5.58 - + - 18.00 288.5 12.02 5 , 47 - + _ 10-dec 16h00 310,5 12,94 5,31 - + _ 11-dec 9h15 327,75 13,66 5,21 - + _ 12h00 330,5 13,77 5,15 - + _ 12-Dec 9:15 351.75 14.66 5.1 + / _ + _ 2.30 pm 357 14.88 5.15 +/- + _ 13-Dec 16.30 383 15.96 +/- + - 14-Dec 16.30 407 16 , 96 + - + Page 66 of 83 Table of growth results of strain 58 DLC 15j 15J = 5J 4 C and 10J to 8 C Medium TRACEO DC (+ glucose) with glycerol 15% + casein 50g / l G15GIy Medium TS 0 , lg / I tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Barcode reading Opacification Hours Days 27-Nov 17h30 0 0,00 6,09 - + 03-dc 9:00 135,5 5,65 6,11 - + _ 05-Dec 10:00 184.5 7.69 6.03 08-Dec 9.00 255.5 10.65 4, 9 +/- +/- + 12h00 258,5 10,77 4,91 +++ _ + Medium TRACEO DC (+ mannitol) with glycerol 15% + casein 50g / I M15GIy Medium TS 0.1 g / I tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Barcode reading Opacification Hours Days 27-Nov 17h30 0 0,00 6,12 - + _ 03-Dec 9:00 135,5 5,65 6,18 - + _ 05-Dec 10:00 184.5 7.69 6.15 - + _ 08-Dec 9.00 255.5 10.65 5.79 - + _ 12.00 258.5 10.77 5.4 - + _ 16.00 262.5 10.94 5, 34 - + _ 5.30 pm 264 11.00 5.39 - + _ 09-dec 9h15 279.75 11.66 5.21 - + _ 12.00 282.5 11.77 5.15 - + _ 18.00 288.5 12, 02 5,11 - + _ 10-d 16:00 310,5 12,94 5 +++ _ +++ 8 1 8 1 Page 67 of 83 Table of growth results of strain 58 DLC 15j 15J = 5J 4 C and 10J to 8 C Medium TRACEO DC Buffered phosphate 0.1M (+ glucose) with glycerol 15% + casein 50g / I G15GIy T Medium TS 0.1g / I tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Reading bar code Opacification Hours Days 27-Nov 17.30 0 0.00 6.25 - + - 03-Dec 09.00 135.5 5.65 6.25 - + - 05-Dec 10.00 184, 5 7.69 6.27 - + - 08-Dec 9.00 255.5 10.65 6.11 - + - 12.00 258.5 10.77 6.06 - + - 16.00 262.5 10.94 5.98 - + 5.30 pm 264 11.00 5.97 - + - 09-Dec 9h15 279.75 11.66 5.6 - + - 10-Dec 16.00 286.5 11.94 5.13 - + - 11-Dec 9h15 327, 75 13.66 5 +/- + +/- 12.00 330.5 13.77 4.96 +++ - +++ Medium TRACEO DC Buffered phosphate (+ mannitol) with glycerol 15% + casein 50g / I M15GIy T Medium TS 0, lg / I tryptonel 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Barcode reading Opacification Hours Days 27-Nov 17h30 0 0,00 6,25 - + - 03-dc 9:00 135,5 5,65 6,25 + - 05-Dec 10:00 184.5 7.69 6.35 - + - 08-Dec 9.00 255.5 10.65 6.19 - + 12.00 258.5 10.77 6.14 - + - 16.00 262.5 10.94 6.07 - + - 5.30 pm 264 11.00 6.04 - + - 09-Dec 9.15 am 279.75 11.66 6.05 - + - 18.00 288.5 12.02 6.02 - + - 10 -dec 10h00 304.5 12.69 5.94 - + - 11-Dec 9h15 327.75 13.66 5.83 - + 12h00 330.5 13.77 5.75 - + - 12-Dec 9h15 351.75 14.66 5.71 - + - 14.30 357 14.88 5.12 - + - 13-Dec 16.30 383 15.96 - + - 14-Dec 16.30 407 16.96 + - + 8 C 8 C Page 68 of 83 Table of growth results for strain 58 DLC 18J 18J = 6J 4 C and 12J at 8 C Medium TRACEO DC (+ glucose) with glycerol 20% + casein 50g / I G20GIy Medium TS 0.1g / I tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Barcode reading Opacification Hours Days 27-Nov 17:30 0 0.00 6.09 - + - 04-Dec 09.00 159.5 6.65 6.1 - + - 08-Dec 9.00 255.5 10.65 5.85 - + - 12.00 258.5 10.77 - + - 5.30 pm 264 11.00 5.81 + - 09-Dec 9.30 am 279 11.63 5.61 - + - 10-dec 16.00 310.5 12.94 4.97 +++ +++ Medium TRACEO DC (+ mannitol) with glycerol 20% + casein 50g / l M20GIy Medium TS 0, lg / I tryptone / 0, 85% NACL Date Time Time pH Precipitation Barcode reading Opacification Hours Days 27-Nov 17:30 0 0,00 6,15 - + - 04-Dec 9:00 159,5 6,65 6,17 - + - 08-Dec 9:00 255, 5 10.65 5.92 - + 5.30 pm 264 11.00 6.00 - + - 09-Dec 9.30 am 280 11.67 5.71 - + - 10-Dec 16.00 289.5 12.06 5.49 - + - 11-Dec 9:15 327.75 13.66 5.36 - + - 12.00 330.5 13.77 5.33 - + - 12-Dec 14.30 357 14.88 5.12 +/- + - 18.35 361 15.04 5.05 + 1- + - 13-Dec 17.00 383 15.96 + - + 8 8 Page 69 of 83 Table of Growth Results for Strain 58 DLC 18J 6J 4 C and 12J to 8 C Medium TRACEO DC Buffered phosphate 0, IM (+ glucose) with glycerol 20% + casein 50g / I G20GIy T Medium TS 0.1g / I tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Barcode Reading Opacification Hours Days 27-Nov 17.30 0 0.00 6.22 - + - 04-Dec 09.00 159.5 6.65 6.26 - + - 08-Dec 9.00 255.5 10.65 5, 95 - + - 5.30 pm 264 11.00 5.67 - + - 09-Dec 9.30 am 280 11.67 5.33 - + - 10-Dec 16.00 310.5 12.94 5.06 - + - 11-Dec 9.15 am 327 , 75 13.66 4.98 ++ - +++ Medium TRACEO DC Buffered phosphate (+ mannitol) with glycerol 20% + casein 50g / l M20GIy T Medium TS 0.1 g / I tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Barcode Reading Opacification Hours Days 27-Nov 17.30 0 0.00 6.25 - + - 04-Dec 09.00 159.5 6.65 6.25 + - 08-Dec 9.00 255.5 10.65 6 , 21 - + - 5.30 pm 264 11.00 6.14 - + - 09-Dec 9.30 am 280 11.6 7 5.83 - + - 10-Dec 16.00 286.5 11.94 5.71 - + - 11-Dec 9h15 327.75 13.66 5.63 - + - 12.00 330.5 13.77 5.54 - + - 12-Dec 915 351.75 14.66 5.45 - + - 14.30 357 14.88 5.45 - + - 18.35 361 15.04 5.41 - + 15-Dec 9h 423.5 17.65 + / - + - 16-dec 9.30 448 18.67 5.14 +/- + +/- 17-Dec 9.15 471.75 19.66 5.1 +/- - +/- 8 C 8 C Page 70 of 83 Table of growth results of the strain DLC 21 j 21J = 7J 4 C and 14J to 8 C Medium TRACEO DC (+ glucose) with glycerol 20% + casein 50g / l I G20GIy Medium TS 0.1g / I tryptone / 0, 85% NACL Date Time Time pH Precipitation Barcode reading Opacification Hours Days 27-Nov 17h30 0 0,00 6,09 + - 05-Dec 9:00 183,5 7,65 6,09 - + - 08-Dec 9:00 255.5 10.65 5.88 - + 5.30 pm 264 11.00 5.84 - + - 09-dec 9.30 280 11.67 5.66 - + - 17.30 288 12.00 5.53 - + - 10-Dec 16.00 310, 5 12.94 4.94 +++ - +++ Medium TRACEO DC (+ mannitol) with glycerol 20% + casein 50g / I M20GIy Medium TS 0.1 g / I tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Reading code b ring Opacification Hours Days 27-Nov 17:30 0 0,00 6,15 - + - 05-Dec 9:00 183,5 7,65 6,15 - + - 08-Dec 9:00 255.5 10.65 6.09 - + - 09-Dec 9.30 280 11.67 5.95 - + - 10-Dec 16.00 310.5 12.94 5.43 - + - 11-Dec 9h15 327.75 13.66 5.37 - + - 12.00 330.5 13.77 5.27 - + - 12-dec 9.15 351.75 14.66 5.13 +/- + - 14.30 357 14.88 5.14 +/- + 18.35 361 15.04 5.06 +/- + 13-Dec 16.30 383 15.96 +/- + +/- 14-Dec 16.30 407 16.96 +/- +/- +/- 15-Dec 9h 423.5 17.65 +++ - +++ Page 71 of 83 Table of growth results of strain DLC 21 d 21 J = -. 7J 4 C and 14J to 8 C Medium TRACEO DC Buffered 0.1 M phosphate (+ glucose) with glycerol 20% + casein 50g / l G20GIyT Medium TS 0.1g / I tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Barcode reading Opacification Hours Days 27-Nov 17:30 0 0,00 6,22 - + _ 05-Dec 9:00 183,5 7,65 6.25 - + _ 08-dec 9.00 255.5 10.65 6.18 - + _ 09-dec 9.30 280 11.67 5.77 - + _ 10-Dec 16.00 310.5 12.94 5.2 - + - 11-Dec 9h15 327.75 13.66 5.04 + 1- - +++ M TRACEO DC Buffered phosphate (+ mannitol) with glycerol 20% + casein 50g / I M20GIyT Medium TS 0.1g / I tryptone / 0.85% NACL Date Time Time pH Precipitation Reading bar code Opacification Hours Days 27-nov 17h30 0 0 , 00 6,25 - + _ 05-dec 9:00 183,5 7,65 6,25 - + _ 08-dec 9:00 255,5 10,65 6,29 - + _ 09-dec 9:30 280 11,67 6, 22 - + _ 10-d 16h00 310,5 12,94 5,8 - + _ 11-dec 9h15 327,75 13,66 5,65 - + _ 12H00 330,5 13,77 5,53 - + _ 12 -dec 9h15 351,75 14,66 5,48 - + _ 14:30 357 14,88 5,43 - + _ 18h35 361 15,04 5,36 - + _ 13-dec 16h55 383 15,96 - + _ 15- Dec 9h 423.5 17.65 - + _ 16-Dec 9.30 448 18.67 5.04 +/- + + / _ 17-Dec 9h15 471.75 19.66 5.03 ++ _ ++ Page 72 of 83 NUMBER OF TESTS: 24 tests are carried out.

CONCLUSION: Ces différents résultats permettent de valider les résultats obtenus précédemment. Les temps de précipitation sont enregistrés dans le tableau ci dessous pour tous les essais réalisés. CONCLUSION: These different results make it possible to validate the results obtained previously. The precipitation times are recorded in the table below for all the tests carried out.

Certains essais de DLC 21 jours sont à valider. En effet, certaines DLC ne sont pas répétables entre le mois d'août et le mois de novembre. Some 21-day DLC trials are to be validated. Indeed, some DLCs are not repeatable between August and November.

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RECAPITULATIF DE TOUS LES ESSAIS DLC REALISES SUMMARY OF ALL DLC TESTS REALIZED

Date Sucre % glycérol DLC attendue Milieu Inoculum pHi pHf Jours précipitation Moyenne analyse jours Tamponné départ 21-août Glucose 0 7 1,00E+04 6,38 4,71 7,7-10,7 9,20 30-sept Glucose 0 7 1,00E+04 6,27 5,03 8,8 8,80 02-oct Glucose 0 7 1,00E+04 6,26 4,92 8,2-9,0 8,60 07-oct Glucose 0 7 1,00E+04 6,28 5,43 7,8-7,9 7,85 22-oct Glucose 0 7 1,00E+04 6 5,12 8,6-8,9 8,75 22-oct Glucose 0 7 1,00E+05 6 5,01 8,6-8,9 8,75 22-oct Glucose 0 7 1,00E+04 5,8 9,8-11,6 10,70 04-nov Glucose 0 7 1,00E+04 6,33 4,79 9,0-9,6 9,30 04-nov Glucose 0 7 1,00E+05 6,33 4,8 8,6-8,7 8,65 04-nov Glucose 0 7 1,00E+07 6,33 4,87 5,6-6,0 5,80 17-nov Glucose 0 7 1,00E+04 6,15 4,89 7,8-7,9 7,85 17-nov Glucose 0 7 1,00E+04 7,75 4,98 7,8-7,9 7,85 22-nov Glucose 0 7 1,00E+05 5,9 9,8-11,6 8,57 28-nov Glucose 0 6 1,00E+04 6,2 4,77 8,6-9,63 9,12 28-nov Glucose 0 6 X 1,00E+04 6,2 4,83 10,7 10,70 17-nov Imidazole 0 7 1,00E+04 6,59 4,89 7,9-8 7,95 17-nov Mannitol 0 7 1,00E+04 6,18 4,9 10,6-13,6 12,10 28-nov Mannitol 0 6 1,00E+04 6,2 4,92 11,9-12,65 12,28 28-nov Mannitol 0 6 X 1,00E+04 6,2 4,99 pb milieu 28-nov Glucose 0 9 1,00E+04 6,2 4,74 8,6-9,6 9,10 28-nov Glucose 0 9 X 1,00E+04 6,28 4,89 9,6-9,7 9,65 28-nov Mannitol 0 9 1,00E+04 6,21 4,86 12,75 12,75 28-nov Mannitol 0 9 X 1,00E+04 6,2 4,89 12,6-12,7 12,65 21-août Glucose 2 7 1,00E+04 6,4 4,7 7,7-10,7 9,20 30-sept Glucose 2 7 1,00E+04 6,28 4,93 9,8 9,80 02-oct Glucose 2 7 1,00E+04 6,26 4,91 8,2-8,9 8,55 07-oct Glucose 2 7 1,00E+04 6,25 5,3 7,9-8,0 7,95 Page 74 sur 83 Date Sugar% glycerol DLC expected Medium Inoculum pHi pHf Days precipitation Average analysis days Buffered starting 21-August Glucose 0 7 1.00E + 04 6.38 4.71 7.7-10.7 9.20 30-seven Glucose 0 7 1,00E + 04 6,27 5,03 8,8 8,80 02-oct Glucose 0 7 1,00E + 04 6,26 4,92 8,2-9,0 8,60 07-oct Glucose 0 7 1,00E + 04 6,28 5,43 7,8-7,9 7,85 22-oct Glucose 0 7 1,00E + 04 6 5,12 8,6-8,9 8,75 22-oct Glucose 0 7 1,00E + 05 6 5,01 8,6-8,9 8,75 22-oct Glucose 0 7 1,00E + 04 5,8 9,8-11,6 10,70 04-nov Glucose 0 7 1.00E + 04 6.33 4.79 9.0-9.6 9.30 04-Nov Glucose 0 7 1.00E + 05 6.33 4.8 8.6-8.7 8.65 04 -nov Glucose 0 7 1.00E + 07 6.33 4.87 5.6-6.0 5.80 17-Nov Glucose 0 7 1.00E + 04 6.15 4.89 7.8-7.9 7.85 17-Nov Glucose 0 7 1.00E + 04 7.75 4.98 7.8-7.9 7.85 22-Nov Glucose 0 7 1.00E + 05 5.9 9.8-11 6 8.57 28-Nov Glucose 0 6 1.00E + 04 6.2 4.77 8.6-9.63 9.12 28-Nov Glucose 0 6 X 1.00 E + 04 6.2 4.83 10 , 7 10,70 17-nov Imidazole 0 7 1,00E + 04 6,59 4,89 7,9-8 7,95 17-nov Mannitol 0 7 1,00E + 04 6,18 4,9 10,6 -13.6 12.10 28-nov Mannitol 0 6 1.00E + 04 6,2 4,92 11,9-12,65 12,28 28-nov Mannitol 0 6 X 1,00E + 04 6,2 4,99 bp medium 28-nov Glucose 0 9 1,00E + 04 6, 2 4,74 8,6-9,6 9,10 28-nov Glucose 0 9 X 1,00E + 04 6,28 4,89 9,6-9,7 9,65 28-nov Mannitol 0 9 1, 00E + 04 6,21 4,86 12,75 12,75 28-Nov Mannitol 0 9 X 1,00E + 04 6,2 4,89 12,6-12,7 12,65 21-August Glucose 2 7 1 , 00E + 04 6.4 4.7 7.7-10.7 9.20 30-seven Glucose 2 7 1.00E + 04 6.28 4.93 9.8 9.80 02-oct Glucose 2 7 1 , 00E + 04 6,26 4,91 8,2-8,9 8,55 07-oct Glucose 2 7 1,00E + 04 6,25 5,3 7,9-8,0 7,95 Page 74 on 83

RECAPITULATIF DE TOUS LES ESSAIS DLC REALISES - SUITE SUMMARY OF ALL DLC TESTS CARRIED OUT - CONTINUED

Date Sucre % glycérol DLC attendue Milieu Inoculum pHi pHf Jours précipitation Moyenne analyse jours Tamponné départ 14-août Glucose 15 12 1,00E+04 6,54 5,21 11,7-12,6 12,15 08-oct Glucose 15 12 1,00E+04 6,23 5,02 9,3-11,9 10,60 17-oct Glucose 15 12 1,00E+04 6,15 5,03 11,0-11,8 11,40 28-nov Glucose 15 12 1,00E+04 6,09 4,75 9,6-10,6 10,10 28-nov Glucose 15 12 X 1,00E+04 6,25 4,96 12,02 12,02 28-nov Mannitol 15 12 1,00E+04 6,12 4,95 12,0-12,9 12,45 28-nov Mannitol 15 12 X 1,00E+04 6,25 Attente 28-nov Glucose 15 15 1,00E+04 6,09 4,91 10,7 10,70 28-nov Glucose 15 15 X 1,00E+04 6,25 4,96 13,6-13,7 13,65 28-nov Mannitol 15 15 1,00E+04 6,12 5 12,0-12,9 12,45 28-nov Mannitol 15 15 X 1,00E+04 6,25 16,96 16,90 08-oct Glucose 16,5 12 1,00E+04 6,23 5,09 11,9-12,0 11,95 17-nov Glucose 16,5 12 1,00E+04 6,15 5,06 12,0-12,6 12,30 22-nov Glucose 18 15 1,00E+04 6,33 5,04 11,9-12,6 12,25 28-nov Glucose 20 18 1,00E+04 6,09 4,97 11,6-12,9 12,25 28-nov Glucose 20 18 X 1,00E+04 6,22 4,98 12,9-13,66 13,28 28-nov Mannitol 20 18 1,00E+04 6,15 15,96 15,96 28-nov Mannitol 20 18 X 1,00E+04 6,25 5,1 18.67-19.66 19,17 14-août Glucose 20 21 1,00E+04 6,5 5,23 19-20 19,50 14-août Glucose 20 21 1,00E+04 6,47 5,31 18,6-19,0 18,80 28-nov Glucose 20 21 1,00E+04 6,09 4,94 12-12,9 12,45 28-nov Glucose 20 21 X 1,00E+04 6,22 5,04 12,9-13,66 13,28 28-nov Mannitol 20 21 1,00E+04 6,15 16.96-17.65 17,31 28-nov Mannitol 20 21 X 1,00E+04 6,25 5,03 18.67-19.66 19,17 14-août Glucose 25 25 1,00E+04 6,51 Pas de précipitation Page 75 sur 83 CROISSANCE DE LA SOUCHE 503M10 A 4 C AVEC DIFFERENTS Date Sugar% glycerol DLC expected Medium Inoculum pHi pHf Days precipitation Average analysis days Buffered starting 14-August Glucose 15 12 1,00E + 04 6,54 5,21 11,7-12,6 12,15 08-oct Glucose 15 12 1,00E + 04 6,23 5,02 9,3-11,9 10,60 17-oct Glucose 15 12 1,00E + 04 6,15 5,03 11,0-11,8 11,40 28- Nov Glucose 15 12 1.00E + 04 6.09 4.75 9.6-10.6 10.10 28-Nov Glucose 15 12 X 1.00E + 04 6.25 4.96 12.02 12.02 28 Mannitol Nov 12 1,00E + 04 6,12 4.95 12.0-12.9 12.45 28-Nov Mannitol 15 12 X 1.00 E + 04 6.25 Waiting 28-Nov Glucose 15 15 1, 00E + 04 6.09 4.91 10.7 10.70 28-Nov Glucose 15 15 X 1.00 E + 04 6.25 4.96 13.6-13.7 13.65 28-Nov Mannitol 15 15 1 , 00E + 04 6,12 5 12,0-12,9 12,45 28-nov Mannitol 15 15 X 1,00E + 04 6,25 16,96 16,90 08-oct Glucose 16,5 12 1,00E +04 6.23 5.09 11.9-12.0 11.95 17-Nov Glucose 16.5 12 1.00E + 04 6.15 5.06 12.0-12.6 12.30 22-nov Glucose 18 15 1.00E + 04 6.33 5.04 11.9-12.6 12.25 28-Nov Glucose 20 18 1.00E + 04 6.09 4.97 11.6-12.9 12, 25 28-Nov Glucose 20 18 X 1.00 E + 04 6.22 4.98 12.9-13.66 13.2 8 28-Nov Mannitol 20 18 1.00 E + 04 6.15 15.96 15.96 28-Nov Mannitol 20 18 X 1.00 E + 04 6.25 5.1 18.67-19.66 19.17 14-August Glucose 20 21 1.00E + 04 6.5 5.23 19-20 19.50 14-August Glucose 20 21 1.00E + 04 6.47 5.31 18.6-19.0 18.80 28-Nov Glucose 20 21 1.00 E + 04 6.09 4.94 12-12.9 12.45 28-Nov Glucose 20 21 X 1.00 E + 04 6.22 5.04 12.9-13.66 13.28 28- nov Mannitol 20 21 1.00 E + 04 6.15 16.96-17.65 17.31 28-Nov Mannitol 20 21 X 1.00 E + 04 6.25 5.03 18.67-19.66 19.17 14-August Glucose 25 25 1, 00E + 04 6,51 No precipitation Page 75 of 83 GROWTH OF THE STRAIN 503M10 AT 4 C WITH DIFFERENT

SUCRESSUGAR

DATE: 17 novembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Le temps de précipitation du milieu TRACEO est étudié à 4 C avec le milieu TRACEO + glucose 2% et le mannitol 2% La croissance en milieu solide de la souche dans le milieu contenant le mannitol pour une DLC de 7 jours (1/3 à 4 C et 2/3 à 8 C) est déterminée comparativement au glucose. DATE: November 17, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIMENT: The precipitation time of TRACEO medium is studied at 4 C with TRACEO medium + glucose 2% and mannitol 2% Solid growth of the strain in the medium containing mannitol for a 7-day DLC (1/3 to 4 C and 2/3 to 8 C) is determined compared to glucose.

OBJECTIFS: L'objectif est de connaître l'effet du mannitol à cette température sur la durée de la précipitation. OBJECTIVES: The objective is to know the effect of mannitol at this temperature on the duration of the precipitation.

RESULTATS: Glucose Date Heure Temps(Heures) Temps(Jours) pH Précipitation lecture Code Opacification 17-nov 18h00 0 0,00 6,21 - + - 28-nov 10h00 257 10,71 5,46 - + - 01-déc 9h00 328 13,67 4,96 - + - 01-déc 17h30 336,5 14,02 4,96 Début + Début 02-déc 8h30 351,5 14,65 4,9 +++ _ +++ Mannitol Date Heure Temps(Heures) Temps(Jours) pH Précipitation lecture Code Opacification 17-nov 18h00 0 0,00 6,2 - + - 28-nov 10h00 257 10,71 5,82 + - 01-déc 9h00 328 13,67 5,29 - + - 01-déc 17h30 336,5 14,02 5,23 - + 02-déc 8h30 351,5 14,65 5,21 Début + Début 14h15 357,25 14,89 5,2 + 03-déc 9h00 376 15,67 5,19 + NOMBRE D'ESSAIS: Page 76 sur 83 2 essais sont réalisés. RESULTS: Glucose Date Time Time (Hours) Time (Days) pH Precipitation reading Code Opacification 17-Nov 18:00 0 0,00 6,21 - + - 28-Nov 10:00 257 10,71 5,46 - + - 01-Dec 9:00 328 13.67 4.96 - + - 01-Dec 17.30 336.5 14.02 4.96 Start + Start 02-Dec 8.30 351.5 14.65 4.9 +++ _ +++ Mannitol Date Time Time (Hours) Time (Days) pH Precipitation reading Code Opacification 17-Nov 18.00 0 0.00 6.2 - + - 28-Nov 10.00 257 10.71 5.82 + - 01-Dec 9.00 328 13.67 5.29 - + - 01-dec 17h30 336,5 14,02 5,23 - + 02-dec 8:30 351,5 14,65 5,21 Start + Start 14:15 357,25 14,89 5,2 + 03-dec 9:00 376 15,67 5,19 + NUMBER OF TESTS: Page 76 of 83 2 tests are carried out.

CONCLUSION: Ce tableau nous montre que la DLC est augmentée lorsque le sucre fermentescible est du mannitol. En effet, dans le premier cas pour un milieu contenant 0% de glycérol et pour une DLC de 7 jours le temps de précipitation est de 7.85 jours en présence de glucose et de 13.6 en présence de mannitol soit une différence de 5.75 jours. CONCLUSION: This table shows us that the DLC is increased when the fermentable sugar is mannitol. Indeed, in the first case for a medium containing 0% glycerol and for a 7-day DLC the precipitation time is 7.85 days in the presence of glucose and 13.6 in the presence of mannitol is a difference of 5.75 days.

Page 77 sur 83 DETERMINATION D'UN TEMPS DE DETECTION-TRAÇABILITE Page 77 of 83 DETERMINING A DETECTION-TRACEABILITY TIME

INDUSTRIELLEINDUSTRIAL

DATE: 24 novembre 2003 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: L'expérience consiste à déterminer un temps de détection sur une solution bactérienne définie. DATE: November 24, 2003 CONDITIONS OF THE EXPERIENCE: The experiment consists in determining a detection time on a defined bacterial solution.

7 milieux sont testés dans cette expérience: N milieu Milieu Base Sucre 2% Glycérol (%) Tampon Tampon 0.1 M 0.2M lA1 TRACEO Glucose 0 1A2 TRACEO Mannitol 1A3 TRACEO Mannitol 15 1A4 TRACEO Mannitol 20 X 1A5 TRACEO Mannitol 25 X 1A6 TRACEO Mannitol 30 X 1A7 TRACEO Mannitol 20 X OBJECTIFS: Cette expérience permet de déterminer une technique qui permette de tracer une solution bactérienne prédéfinie. 7 media are tested in this experiment: N medium Medium Base Sugar 2% Glycerol (%) Buffer Buffer 0.1M 0.2M lA1 TRACEO Glucose 0 1A2 TRACEO Mannitol 1A3 TRACEO Mannitol 15 1A4 TRACEO Mannitol 20 X 1A5 TRACEO Mannitol 25 X 1A6 TRACEO Mannitol 30 X 1A7 TRACEO Mannitol 20 X OBJECTIVES: This experiment makes it possible to determine a technique which makes it possible to trace a predefined bacterial solution.

Cette technique peut être utilisée facilement dans le milieu industriel de fabrication du milieu. This technique can be used easily in the industrial medium manufacturing environment.

RESULTATS: NOMBRE D'ESSAIS: 7 essais ont été nécessaires pour cette étude. RESULTS: NUMBER OF TESTS: 7 trials were necessary for this study.

CONCLUSION: Le graphe nous montre que cette technique permet de donner un temps de détection qui est de 14.6 jours pour la condition lA1. CONCLUSION: The graph shows us that this technique allows to give a detection time which is 14.6 days for the condition lA1.

Page 78 sur 83 Pour les autres conditions, nous n'obtenons pas de temps de détection. Mais cette technique peut être améliorée de façon à être calibrée pour une autre condition de culture. Page 78 of 83 For other conditions, we do not get detection time. But this technique can be improved to be calibrated for another culture condition.

II reste donc d'autres essais à réaliser ultérieurement. There are therefore other tests to be performed later.

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DETERMINATION DE TEMPS DE PRECIPITATION EN PRESENCE DETERMINATION OF PRECIPITATION TIME IN PRESENCE

DE DIFFERENTS TAMPONS PHOSPHATEDIFFERENT PHOSPHATE BUFFERS

DATE: 9 janvier 2004 CONDITIONS DE L'EXPERIENCE: Milieu de Sucres Glycérol % Tampon Tampon Tampon base 2% phosphate phosphate phosphate 0.1M 0.15M 0.20 M TRACEO Glucose 15 X X TRACEO Glucose 17.5 X X TRACEO Glucose 20 X X TRACEO Glucose 22.5 X X TRACEO Mannitol 15 X X TRACEO Mannitol 17.5 X X TRACEO Mannitol 20 X X TRACEO Mannitol 22.5 X X TRACEO Glucose 15 X TRACEO Glucose 17.5 X TRACEO Glucose 20 X TRACEO Glucose 22.5 X TRACEO Mannitol 15 X TRACEO Mannitol 17.5 X TRACEO Mannitol 20 X TRACEO Mannitol 22.5 X Ces expériences ont été réalisées à deux températures: 4 C constant 8 C constant OBJECTIFS: Cette expérience permet de valider les résultats obtenus avec le tampon phosphate. La microbiologie prévisionnelle confirmera le choix de ces températures comparativement à 1/3 4 C et 2/3 à 8 C. DATE: January 9, 2004 CONDITIONS OF THE EXPERIENCE: Medium Sugar Glycerol% Buffer Buffer Buffer base 2% phosphate phosphate phosphate 0.1M 0.15M 0.20M TRACEO Glucose 15 XX TRACEO Glucose 17.5 XX TRACEO Glucose 20 XX TRACEO Glucose 22.5 XX TRACEO Mannitol 15 XX TRACEO Mannitol 17.5 XX TRACEO Mannitol 20 XX TRACEO Mannitol 22.5 XX TRACEO Glucose 15 X TRACEO Glucose 17.5 X TRACEO Glucose 20 X TRACEO Glucose 22.5 X TRACEO Mannitol 15 X TRACEO Mannitol 17.5 X TRACEO Mannitol 20 X TRACEO Mannitol 22.5 X These experiments were carried out at two temperatures: 4 C constant 8 C constant OBJECTIVES: This experiment makes it possible to validate the results obtained with the phosphate buffer. The predictive microbiology will confirm the choice of these temperatures compared to 1/3 4 C and 2/3 to 8 C.

Page 80 sur 83 RESULTATS: Ces essais sont actuellement en cours de réalisation. RESULTS: These trials are currently underway.

NOMBRE D'ESSAIS: 96 essais sont réalisés dans cette expérience. NUMBER OF TESTS: 96 tests are carried out in this experiment.

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Claims

2865825 Claim

1. Device for controlling the freshness of a product; said device being characterized in that it implements a label comprising bacteria intended to cause an opacification of said label in case of crossing a determined threshold of storage temperature of said product; said label being in particular intended to be affixed to a barcode associated with said product; said device being further characterized in that: - said label is parameterized according to a consumption limit date of said product on which it is affixed, - said label undergoes opacification upon the occurrence of said consumption limit date and / or before said consumption limit date in the case where said temperature of said product has exceeded a determined threshold for a determined period; so that the opacification of the label renders illegible the barcode of the product.

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