FR2862314A1

FR2862314A1 - Method for diagnosing encephalopathy, or the risk of developing it, useful particularly in screening cattle for bovine spongiform encephalopathy, based on detecting specific nucleic acid markers

Info

Publication number: FR2862314A1
Application number: FR0313275A
Authority: FR
Inventors: Annelies Resink; Magali Rouquette
Original assignee: ExonHit Therapeutics SA
Current assignee: ExonHit Therapeutics SA
Priority date: 2003-11-13
Filing date: 2003-11-13
Publication date: 2005-05-20

Abstract

Method for detecting presence, or risk of developing, encephalopathy in mammals, from presence of specific markers. Method for detecting presence, or risk of developing, encephalopathy in mammals comprises determining, in a biological sample, at least one of the following targets: (a) nucleic acid (NA), i.e. any of 22 sequences reproduced, or their fragments with at least 5, preferably 6-10, consecutive bases; (b) the complements of (a); (c) functional analogs of NA or its complements, derived from another species or a natural variant; or (d) a polypeptide (PP) encoded by (a)-(c). Independent claims are also included for the following: (1) product containing at least one NA, or its fragment, complement or functional analog, immobilized on a support; (2) product containing at least one PP encoded by NA, its fragments of at least 15 bases, complements or functional analogs; and (3) kits that contain NA, or its fragments, complements or functional analogs.

Description

Identification de marqueurs diagnosticIdentification of diagnostic markers

pour les encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles La présente demande concerne des marqueurs biologiques des encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles et leurs utilisations dans des méthodes de diagnostic. Elle concerne également des outils et/ou kits utilisables pour la mise en oeuvre de ces méthodes (réactifs, sondes, amorces, anticorps, puces, cellules, etc.), leur préparation et leurs utilisations. L'invention est utilisable pour détecter la présence d'une infection chez les mammifères, y compris en phase précoce. The present application relates to biological markers of transmissible spongiform subacute encephalopathies and their uses in diagnostic methods. It also relates to tools and / or kits that can be used to implement these methods (reagents, probes, primers, antibodies, chips, cells, etc.), their preparation and their uses. The invention is useful for detecting the presence of an infection in mammals, including in the early phase.

Les maladies à prions, également appelées encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles ou maladies à agents transmissibles non conventionnels (ATNC) sont des maladies du système nerveux central rencontrées chez certains mammifères, dont l'homme. Prion diseases, also known as transmissible spongiform encephalopathies or unconventional transmissible diseases (NCTA), are diseases of the central nervous system found in some mammals, including man.

Les formes les plus connues de ces maladies sont la tremblante du mouton chez les ovins, l'Encéphalopathie Spongiforme Bovine (ESB) chez les bovins, la maladie de Creutzfeld-Jakob (MCJ), le kuru et l'insomnie fatale familiale chez l'homme. The best-known forms of these diseases are sheep scrapie in sheep, Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) in cattle, Creutzfeld-Jakob disease (CJD), kuru and fatal familial insomnia in dogs. man.

L'agent infectieux n'est pas encore définitivement déterminé, mais l'hypothèse la plus acceptée est que ces maladies sont associées à l'accumulation dans le cerveau d'une protéine prion (PrP) de conformation anormale par rapport à la conformation observée chez les individus sains. The infectious agent is not yet definitively determined, but the most accepted hypothesis is that these diseases are associated with the accumulation in the brain of a prion protein (PrP) of abnormal conformation with respect to the conformation observed in healthy individuals.

La découverte d'une nouvelle variante de MJC (vMJC) après l'épidémie bovine de ESB en Angleterre confirme que ces maladies sont transmissibles et vraisemblablement peuvent franchir la barrière des espèces par le biais de l'alimentation. Leur évolution lente et fatale, est associée à des lésions qui affectent exclusivement le système nerveux central. The discovery of a new variant of MJC (vMJC) after the BSE outbreak in England confirms that these diseases are transmissible and are likely to cross the species barrier through food. Their slow and fatal evolution is associated with lesions that exclusively affect the central nervous system.

Avec la découverte de vMCJ, des mesures d'urgences ont été mises en place pour évaluer l'ampleur de l'épidémie de l'ESB et pour protéger la santé publique. L'Union européenne impose désormais le test systématique de toute viande provenant de bovins abattus et âgés de plus de 30 mois. Le temps d'incubation de l'ESB étant autour de cinq années, période durant laquelle l'infection peut se propager latéralement et verticalement, le développement d'un test diagnostic sur des animaux vivants revêt une importance vitale. Un test précoce offrirait un moyen sûr d'exclure les animaux infectés de la chaîne alimentaire. Le test utilisé aujourd'hui détecte uniquement de façon post mortem les animaux infectés à un stade tardif de la maladie. With the discovery of vCJD, emergency measures were put in place to assess the extent of the BSE epidemic and to protect public health. The European Union is now imposing a systematic test of all meat from slaughtered cattle over 30 months old. As the incubation time of BSE is around five years, during which time the infection can spread laterally and vertically, the development of a diagnostic test on live animals is of vital importance. An early test would provide a safe way to exclude infected animals from the food chain. The test used today detects only post-mortem animals infected at a late stage of the disease.

Il y a un besoin urgent de mettre sur pied un test diagnostique capable de détecter des encéphalopathies à un stade précoce chez des animaux vivants et de façon rapide. Un tel test permettrait de suivre tous les animaux à risque en les testant de multiple fois au cours de leur vie. There is an urgent need for a diagnostic test capable of detecting encephalopathies at an early stage in live animals in a rapid manner. Such a test would track all the animals at risk by testing them multiple times in their lifetime.

La demande WO02/074986, appartenant au demandeur, décrit plusieurs marqueurs génétiques des encéphalopathies. Par une recherche extensive utilisant une approche innovante, différents marqueurs supplémentaires de l'ESB ont été identifiés et validés dans des expériences d'hybridation, permettant d'établir un test pré-symptomatique utilisable à partir du sang d'un mammifère vivant. Application WO02 / 074986, belonging to the applicant, describes several genetic markers of encephalopathies. Through extensive research using an innovative approach, several additional markers of BSE have been identified and validated in hybridization experiments, making it possible to establish a pre-symptomatic test that can be used from the blood of a living mammal.

Les marqueurs identifiés ont été isolés par la technique DATAS (demande de brevet n WO99/46403). DATAS identifie des différences qualitatives de l'expression de gènes et fournit une analyse systématique de l'ARN épissé entre deux conditions: sains/infecté. DATAS mène à l'identification de variants ARN fonctionnellement distincts. La technique DATAS comprend trois étapes distinctes: la collecte de tissu, l'isolement des ARNs et la construction d'un répertoire contenant des différences qualitatives et identifiant des nouveaux fragments de gènes, qui ne peuvent pas être isolés par d'autres techniques génétiques. The identified markers were isolated by the DATAS technique (patent application WO99 / 46403). DATAS identifies qualitative differences in gene expression and provides a systematic analysis of spliced RNA between two conditions: healthy / infected. DATAS leads to the identification of functionally distinct RNA variants. The DATAS technique consists of three distinct steps: tissue collection, RNA isolation, and the construction of a directory containing qualitative differences and identifying new gene fragments, which can not be isolated by other genetic techniques.

Par comparaison de l'expression qualitative des gènes dans les cellules sanguines de mammifères sains et infectés naturellement ou expérimentalement par l'ESB, différentes signatures de marqueurs génétiques ont été isolées. Les mammifères naturellement infectés étaient au stade final de la maladie, alors que les mammifères infectés par voie orale avec 1 g de cerveaux infectés par l'ESB, représentaient le stade précoce de la maladie. By comparing the qualitative expression of genes in the blood cells of healthy mammals infected naturally or experimentally with BSE, different signatures of genetic markers have been isolated. Naturally infected mammals were at the final stage of the disease, while mammals infected orally with 1 g of BSE-infected brains represented the early stage of the disease.

La mise en oeuvre de la méthodologie DATAS sur des cellules sanguines de vaches a permis l'identification et l'isolement de plusieurs milliers de marqueurs génétiques, répartis en deux répertoires représentatifs de l'expression qualitative des gènes entre des vaches saines et des vaches infectées naturellement d'une part, et entre des vaches saines et des vaches infectées expérimentalement d'autre part. The implementation of the DATAS methodology on cow blood cells has enabled the identification and isolation of several thousand genetic markers, divided into two repertoires representative of the qualitative expression of genes between healthy cows and infected cows. naturally on the one hand, and between healthy and experimentally infected cows on the other.

Les marqueurs contenus dans ces répertoires ont été sélectionnés et validés selon deux approches: Dans la première approche, les fragments de gènes communs aux deux répertoires DATAS ainsi produits ont été identifiés. La séquence de ces 11 marqueurs est représentée dans les séquences SEQ ID NO: 1-11. The markers contained in these directories have been selected and validated according to two approaches: In the first approach, the gene fragments common to the two DATAS directories thus produced have been identified. The sequence of these 11 markers is represented in the sequences SEQ ID NO: 1-11.

Dans la seconde approche, les différents clones des deux expériences DATAS ont été déposés sur lames de verre. Les lames ont été hybridées avec des sondes produites à partir de matériel biologique de vaches infectées naturellement et de vaches saines utilisées comme contrôle. Au travers de deux types d'analyses comparant soit deux animaux sains versus deux animaux infectés soit un animal sain versus deux animaux infectés, 11 clones communs aux deux analyses ont été observés comme présentant une dérégulation dans les deux conditions normal versus infecté. Les 11 séquences d'acides nucléiques sont décrites ci-dessous comme SEQ ID NO: 12-22. In the second approach, the different clones of the two DATAS experiments were deposited on glass slides. The slides were hybridized with probes made from biological material from naturally infected cows and healthy cows used as controls. Using two types of analysis comparing either two healthy animals versus two infected animals or one healthy animal versus two infected animals, 11 clones common to both analyzes were observed to show deregulation in both normal versus infected conditions. The 11 nucleic acid sequences are described below as SEQ ID NO: 12-22.

La présente demande fournit ainsi un ensemble de marqueurs biologiques qui peuvent être utilisés, seuls ou en combinaison(s), pour détecter, caractériser ou suivre une encéphalopathie spongiforme transmissible chez un mammifère. L'invention est utile notamment pour détecter la présence de maladies à prion chez des sujets mammifères, notamment ovins, bovins ou humains. Elle est particulièrement avantageuse dans la mesure où elle peut être réalisée sur des mammifères vivants, à partir de fluides biologiques tels que le sang, plasma, plaquettes, etc. Un objet de la présente demande concerne une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer une encéphalopathie chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence), dans un échantillon biologique du mammifère, d'une molécule cible choisie parmi: a) un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1 à 22 ou un fragment de celles-ci ayant au moins 5, de préférence 6, 7, 8, 9 ou 10 bases consécutives, b) un acide nucléique ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) un analogue fonctionnel d'un acide nucléique selon a) ou b), ou d) un polypeptide codé par un acide nucléique selon a) à c), la présence (ou l'absence) d'une telle molécule cible dans l'échantillon étant une indication de la présence ou du risque de développer une encéphalopathie chez ce mammifère. The present application thus provides a set of biological markers that can be used, alone or in combination (s), to detect, characterize or track a transmissible spongiform encephalopathy in a mammal. The invention is useful in particular for detecting the presence of prion diseases in mammalian subjects, in particular sheep, cattle or humans. It is particularly advantageous insofar as it can be carried out on living mammals, from biological fluids such as blood, plasma, platelets, etc. An object of the present application relates to a method for detecting the presence or risk of developing encephalopathy in a mammal, comprising determining the presence (or absence) of a target molecule in a biological sample of the mammal selected from: a) a nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1 to 22 or a fragment thereof having at least 5, preferably 6, 7, 8, 9 or 10 consecutive bases, b) an acid nucleic acid having a sequence complementary to a sequence according to a), c) a functional analogue of a nucleic acid according to a) or b), or d) a polypeptide encoded by a nucleic acid according to a) to c), the presence ( or lack thereof) of such a target molecule in the sample being an indication of the presence or risk of developing encephalopathy in that mammal.

Dans une variante particulière de mise en oeuvre, la méthode comprend la détermination (simultanée) de la présence ou absence d'au moins, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus des molécules cibles telles que définies ci-dessus. In a particular variant of implementation, the method comprises the (simultaneous) determination of the presence or absence of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more of the target molecules such as as defined above.

La molécule cible peut être la séquence complète du gène ou de l'ARN ou de la protéine correspondant aux séquences SEQ ID NOs: 1-22, ou un fragment de celles-ci, par exemple comportant un domaine de variabilité (épissage, délétion, polymorphisme, etc.). Un analogue fonctionnel désigne plus particulièrement un analogue provenant d'une autre espèce (par exemple homme, mouton, etc.), ou un variant naturel résultant par exemple de polymorphisme, épissage, etc. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode comprend la détermination de la présence d'au moins un acide nucléique selon a) à c). Différentes techniques utilisables pour détecter une espèce d'acide nucléique dans un échantillon sont utilisables dans la présente invention, comme par exemple le Northern Blot, l'hybridation sélective, l'utilisation de supports revêtus d'oligonucléotides sondes, l'amplification d'acide nucléique comme par exemple par RT-PCR, PCR quantitative et ligation-PCR, etc. Ces méthodes peuvent comprendre l'utilisation d'une sonde nucléique (par exemple un oligonucléotide) capable de détecter sélectivement ou spécifiquement l'acide nucléique cible dans l'échantillon. L'amplification peut être réalisée selon différentes méthodes connues en soi de l'homme du métier, telles que la PCR, la LCR, l'amplification médiée par transcription (TMA), l'amplification par déplacement de brin (SDA), NASBA, l'emploi d'oligonucléotides spécifiques d'allèles (ASO), l'amplification spécifique d'allèle, le Southern blot, l'analyse conformationnelle SSCA, l'hybridation in situ (e.g., FISH), la migration sur gel, l'analyse d'hétéroduplexes, etc. Selon un mode préféré de mise en oeuvre, la méthode comprend la détection de la présence ou de l'absence d'un acide nucléique selon a) à c) par hybridation sélective ou amplification sélective. The target molecule may be the complete sequence of the gene or of the RNA or of the protein corresponding to the sequences SEQ ID NOs: 1-22, or a fragment thereof, for example having a domain of variability (splicing, deletion, polymorphism, etc.). A functional analogue refers more particularly to an analogue from another species (eg human, sheep, etc.), or a natural variant resulting for example from polymorphism, splicing, etc. In a particular embodiment, the method comprises determining the presence of at least one nucleic acid according to a) to c). Different techniques that can be used to detect a species of nucleic acid in a sample can be used in the present invention, such as, for example, Northern Blot, selective hybridization, the use of probed oligonucleotide-coated supports, and the amplification of acid. nucleic acid as for example by RT-PCR, quantitative PCR and ligation-PCR, etc. These methods may include the use of a nucleic probe (eg an oligonucleotide) capable of selectively or specifically detecting the target nucleic acid in the sample. The amplification may be carried out according to various methods known per se to those skilled in the art, such as PCR, CSF, transcription-mediated amplification (TMA), strand displacement amplification (SDA), NASBA, the use of allele-specific oligonucleotides (ASO), allele-specific amplification, Southern blotting, SSCA conformational analysis, in situ hybridization (eg, FISH), gel migration, heteroduplex analysis, etc. According to a preferred mode of implementation, the method comprises the detection of the presence or absence of a nucleic acid according to a) to c) by selective hybridization or selective amplification.

L'hybridation sélective est typiquement réalisée en utilisant des sondes nucléiques, de préférence immobilisées sur un support, tel qu'un support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation de sondes nucléiques. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, etc. Les sondes nucléiques peuvent être tout acide nucléique (ADN, ARN, PNA, etc.), de préférence simple-brin, comprenant une séquence spécifique d'une molécule cible telle que définie en a) à c) ci-dessus. Les sondes comprennent typiquement de 5 à 400 bases, de préférence de 8 à 200, plus préférentiellement moins de 100. Les sondes peuvent être des oligonucléotides synthétiques, produits sur la base des séquences de molécules cibles de l'invention selon des techniques de synthèse classique. Les sondes peuvent également être synthétisées directement in situ, sur le support, selon des méthodes connues en soi de l'homme du métier. Les sondes peuvent également être fabriquées par des techniques génétiques, par exemple par amplification, recombinaison, ligation, etc. Une telle sonde constitue un autre objet de la présente demande, ainsi que son utilisation (essentiellement in vitro) pour la détection d'une encéphalopathie chez un sujet. De manière particulièrement préférée, on utilise un ensemble de sondes nucléiques comprenant tout ou un fragment de 5 bases consécutives au moins de chacune des séquences SEQ ID NO: 1-22, ou d'un brin complémentaire de celles-ci, avantageusement immobilisées sur un support. Selective hybridization is typically performed using nucleic probes, preferably immobilized on a support, such as a solid or semi-solid support having at least one surface, flat or not, allowing the immobilization of nucleic probes. Such supports are for example a blade, ball, membrane, filter, column, plate, etc. They can be made of any compatible material, such as glass, silica, plastic, fiber, metal, polymer, etc. The nucleic probes may be any nucleic acid (DNA, RNA, PNA, etc.), preferably single-stranded, comprising a sequence specific for a target molecule as defined in a) to c) above. The probes typically comprise from 5 to 400 bases, preferably from 8 to 200, more preferably less than 100. The probes may be synthetic oligonucleotides, produced on the basis of the target molecule sequences of the invention according to conventional synthesis techniques. . The probes can also be synthesized directly in situ, on the support, according to methods known per se to those skilled in the art. The probes can also be manufactured by genetic techniques, for example by amplification, recombination, ligation, etc. Such a probe is another object of the present application, as well as its use (essentially in vitro) for the detection of encephalopathy in a subject. Particularly preferably, a set of nucleic probes comprising all or a fragment of at least 5 consecutive bases of each of the sequences SEQ ID NO: 1-22, or of a complementary strand thereof, advantageously immobilized on a support.

L'hybridation peut être réalisée dans des conditions classiques, connues de l'homme du métier et ajustables par celui-ci (Sambrook et al). En particulier, l'hybridation peut être réalisée dans des conditions de stringence élevée, moyenne ou faible, selon le niveau de sensibilité recherché, la quantité de matériel disponible, etc. Par exemple, des conditions appropriées d'hybridation incluent une température comprise entre 62 et 67 C pendant 2 à 18 heures. Après l'hybridation, différents lavages peuvent être réalisés pour éliminer les molécules non-hybridées, typiquement dans des tampons SSC comprenant du SDS, tels que un tampon comprenant 0,1 à 10 X SSC et 0,1% SDS. Hybridization can be carried out under standard conditions, known to those skilled in the art and adjustable by it (Sambrook et al). In particular, the hybridization can be carried out under conditions of high, medium or low stringency, depending on the desired level of sensitivity, the quantity of available material, etc. For example, suitable hybridization conditions include a temperature of 62 to 67 C for 2 to 18 hours. After hybridization, different washes can be performed to remove unhybridized molecules, typically in SSC buffers comprising SDS, such as a buffer comprising 0.1 to 10 X SSC and 0.1% SDS.

Dans un mode de mise en oeuvre typique, les acides nucléiques (ou les puces ou supports) sont pré-hybridés dans un tampon d'hybridation (Rapid Hybrid Buffer, Amersham) contenant typiquement 100 gg/ml d'ADN de sperme de saumon à 65 C pendant 30 min. Les acides nucléiques de l'échantillon sont ensuite mis en contact avec les sondes (typiquement appliqués sur le support ou la puce) à 65 C pendant 2 à 18 heures. De préférence, les acides nucléique de l'échantillon sont marqués au préalable, par tout marquage connu (radioactif, enzymatique, fluorescent, luminescent, etc.). Les supports sont ensuite lavés dans un tampon 5X SSC, 0,1% SDS à 65 C pendant 30 min, puis dans un tampon 0.2X SSC, 0,1% SDS. Le profil d'hybridation est analysé selon des techniques classiques, comme par exemple en mesurant le marquage sur le support au moyen d'un instrument adapté (par exemple Instantlmager, Packard Instruments). Les conditions de l'hybridation peuvent naturellement être ajustées par l'homme du métier, par exemple en modifiant la température d'hybridation et/ou la concentration saline du tampon. In a typical embodiment, the nucleic acids (or the chips or supports) are prehybridized in hybridization buffer (Rapid Hybrid Buffer, Amersham) typically containing 100 μg / ml of Salmon sperm DNA 65 C for 30 min. The nucleic acids of the sample are then placed in contact with the probes (typically applied on the support or the chip) at 65 ° C. for 2 to 18 hours. Preferably, the nucleic acids of the sample are marked beforehand with any known labeling (radioactive, enzymatic, fluorescent, luminescent, etc.). The supports are then washed in a 5 × SSC buffer, 0.1% SDS at 65 ° C. for 30 min, then in a 0.2 × SSC buffer, 0.1% SDS. The hybridization profile is analyzed according to conventional techniques, for example by measuring the marking on the support by means of a suitable instrument (for example Instantlmager, Packard Instruments). Hybridization conditions can naturally be adjusted by those skilled in the art, for example by modifying the hybridization temperature and / or the salt concentration of the buffer.

L'amplification sélective est de préférence réalisée en utilisant une amorce ou une paire d'amorces permettant l'amplification de tout ou partie d'un des acides nucléiques cibles dans l'échantillon, lorsque celui-ci y est présent. L'amorce peut être spécifique d'une séquence cible selon SEQ ID NO: 1-22, ou d'une région flanquant la séquence cible dans un acide nucléique de l'échantillon. L'amorce comprend typiquement un acide nucléique simple-brin, d'une longueur comprise avantageusement entre 5 et 50 bases, de préférence entre 5 et 30. Une telle amorce constitue un autre objet de la présente demande, ainsi que son utilisation (essentiellement in vitro) pour la détection d'une encéphalopathie chez un sujet. The selective amplification is preferably performed using a primer or pair of primers for amplifying all or part of one of the target nucleic acids in the sample, when present therein. The primer may be specific for a target sequence according to SEQ ID NO: 1-22, or a region flanking the target sequence in a nucleic acid of the sample. The primer typically comprises a single-stranded nucleic acid, preferably between 5 and 50 bases long, preferably between 5 and 30. Such a primer constitutes another object of the present application, as well as its use (essentially in in vitro) for the detection of encephalopathy in a subject.

2862314 7 Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend la détermination de la présence d'un polypeptide selon d). La mise en évidence d'un polypeptide dans un échantillon peut être réalisée par toute technique connue en soi, comme notamment au moyen d'un ligand spécifique, par exemple un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps. De préférence, le ligand est un anticorps spécifique du polypeptide, ou un fragment d'un tel anticorps (par exemple un Fab, Fab', CDR, etc.), ou un dérivé d'un tel anticorps (par exemple un anticorps simple-chaîne, ScFv). Le ligand est typiquement immobilisé sur un support, tel qu'une lame, bille, colonne, plaque, etc. La présence du polypeptide cible dans l'échantillon peut être détectée par mise en évidence d'un complexe entre la cible et le ligand, par exemple en utilisant un ligand marqué, en utilisant un deuxième ligand de révélation marqué, etc. Des techniques immunologiques utilisables et bien connues sont les techniques ELISA, RIA, etc. Des anticorps spécifiques des polypeptides cibles peuvent être produits par des techniques conventionnelles, notamment par immunisation d'un animal non-humain avec un immunogène comprenant le polypeptide (ou un fragment immunogène de celui-ci), et récupération des anticorps (polyclonaux) ou des cellules productrices (pour produire des monoclonaux) . Des techniques de production d'anticorps poly- ou monoclonaux, de fragments ScFv, d'anticorps humains ou humanisés sont décrites par exemple dans Harlow et al., Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988; Ward et al., Nature 341 (1989) 544; Bird et al., Science 242 (1988) 423; WO94/02602; US5,223,409; US5,877,293; WO93/01288. L'immunogène peut être fabriqué par synthèse, ou par expression, dans un hôte approprié, d'un acide nucléique cible tel que défini ci-avant. Un tel anticorps, monoclonal ou polyclonal, ainsi que ses dérivés ayant la même spécificité antigénique, constituent également un objet de la présente demande, de même que leur utilisation pour détecter une encéphalopathie. In another embodiment, the method comprises determining the presence of a polypeptide according to d). The detection of a polypeptide in a sample can be carried out by any technique known per se, such as in particular by means of a specific ligand, for example an antibody or an antibody fragment or derivative. Preferably, the ligand is an antibody specific for the polypeptide, or a fragment of such an antibody (for example an Fab, Fab ', CDR, etc.), or a derivative of such an antibody (for example a single antibody). chain, ScFv). The ligand is typically immobilized on a support, such as a slide, ball, column, plate, etc. The presence of the target polypeptide in the sample may be detected by demonstrating a complex between the target and the ligand, for example using a labeled ligand, using a second labeled revealing ligand, etc. Immunological techniques that can be used and are well known are ELISA, RIA, etc. Antibodies specific for the target polypeptides may be produced by conventional techniques, including immunizing a non-human animal with an immunogen comprising the polypeptide (or an immunogenic fragment thereof), and recovering antibodies (polyclonal) or producing cells (to produce monoclonals). Techniques for producing poly- or monoclonal antibodies, ScFv fragments, human or humanized antibodies are described for example in Harlow et al., Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988; Ward et al., Nature 341 (1989) 544; Bird et al., Science 242 (1988) 423; WO94 / 02602; US5,223,409; US5,877,293; WO93 / 01288. The immunogen may be synthetically manufactured, or by expression, in a suitable host, of a target nucleic acid as defined above. Such an antibody, monoclonal or polyclonal, as well as its derivatives having the same antigenic specificity, are also an object of the present application, as well as their use for detecting encephalopathy.

La méthode de l'invention est applicable à tout échantillon biologique du mammifère testé, en particulier tout échantillon comportant des acides nucléiques ou des polypeptides. On peut citer avantageusement un échantillon de sang, plasma, plaquette, salive, urine, selles, etc., plus généralement tout tissu, organe ou, avantageusement, fluide biologique comportant des acides nucléiques ou des polypeptides. Dans un mode de mise en oeuvre préféré, l'échantillon est un échantillon de sang ou plasma. L'échantillon peut par ailleurs être pré-traité pour faciliter l'accessibilité des molécules cibles, par exemple par lyse (mécanique, chimique, enzymatique, etc.), purification, centrifugation, séparation, etc. L'échantillon peut également être marqué, pour faciliter la détermination de la présence des molécules cibles (marquage fluorescent, radioactif, luminescent, chimique, enzymatique, etc.). The method of the invention is applicable to any biological sample of the mammal under test, in particular any sample comprising nucleic acids or polypeptides. A sample of blood, plasma, platelet, saliva, urine, stool, etc., may be advantageously mentioned, more generally any tissue, organ or, advantageously, biological fluid comprising nucleic acids or polypeptides. In a preferred embodiment, the sample is a sample of blood or plasma. The sample may also be pre-treated to facilitate the accessibility of the target molecules, for example by lysis (mechanical, chemical, enzymatic, etc.), purification, centrifugation, separation, etc. The sample can also be labeled, to facilitate the determination of the presence of the target molecules (fluorescent, radioactive, luminescent, chemical, enzymatic labeling, etc.).

L'invention est applicable à tout mammifère, de préférence choisi parmi les bovins, ovins et humains. La méthode de l'invention est particulièrement utile pour la détection de la tremblante du mouton chez les ovins, de l'Encéphalopathie Spongiforme Bovine (ESB) chez les bovins, et de la maladie de Creutzfeld-Jakob (MCJ), le kuru et l'insomnie fatale familiale chez l'homme. The invention is applicable to any mammal, preferably selected from cattle, sheep and humans. The method of the invention is particularly useful for the detection of sheep scrapie in sheep, Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) in cattle, and Creutzfeld-Jakob disease (CJD), kuru and lamb familial fatal insomnia in men.

Un objet particulier de la présente demande concerne une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer une ESB chez un bovin, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence), dans un échantillon biologique du bovin, d'une ou plusieurs molécules cibles choisies parmi: a) un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 22 ou un fragment de celles-ci ayant au moins 5, de préférence 6, 7, 8, 9 ou 10 bases consécutives, b) un acide nucléique ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) un polypeptide codé par un acide nucléique selon a) ou b). A particular object of the present application relates to a method for detecting the presence or risk of developing BSE in cattle, including determining the presence (or absence) in a biological sample of cattle of one or more a plurality of target molecules selected from: a) a nucleic acid comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 22 or a fragment thereof having at least 5, preferably 6, 7, 8, 9 or 10 consecutive bases, b ) a nucleic acid having a sequence complementary to a sequence according to a); c) a polypeptide encoded by a nucleic acid according to a) or b).

Un autre objet particulier de la présente demande concerne une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer une ESB chez un bovin ou un ovin, comprenant la mise en contact d'un échantillon biologique du bovin ou ovin contenant des acides nucléiques avec un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 22, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, et la détermination du profil d'hybridation, le profil indiquant la présence ou le risque de développer une ESB chez le bovin ou ovin. De préférence, le produit comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 acides nucléiques différents choisis parmi les acides nucléiques mentionnés ci-dessus. Dans un mode particulier de mise en oeuvre, le produit comprend chacun des acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 1 à 22, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci. Another particular object of the present application relates to a method for detecting the presence or risk of developing BSE in cattle or sheep, comprising contacting a biological sample of the bovine or ovine containing nucleic acids with a product. comprising a support on which is immobilized at least one nucleic acid comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 22, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a sequence complementary thereto , and the determination of the hybridization profile, the profile indicating the presence or risk of developing BSE in cattle or sheep. Preferably, the product comprises at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 different nucleic acids selected from the nucleic acids mentioned above. In a particular embodiment, the product each comprises nucleic acids of sequence SEQ ID NO: 1 to 22, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a sequence complementary to those this.

Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 22, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci ou un analogue fonctionnel de celles- ci. De préférence, le produit comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, acides nucléiques différents choisis parmi les acides nucléiques mentionnés ci-dessus. Another subject of the present application relates to a product comprising a support on which at least one nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to 22, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, an acid, is immobilized. nucleic acid having a sequence complementary thereto or a functional analogue thereof. Preferably, the product comprises at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, different nucleic acids selected from the nucleic acids mentioned above.

Dans un mode particulier de mise en oeuvre, le produit comprend chacun des acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 1 à 22, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un polypeptide codé par un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 22, un fragment de celles-ci ayant au moins 15 bases consécutives, un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci ou un analogue fonctionnel de celles-ci. De préférence, le produit comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 polypeptides différents choisis parmi les polypeptides mentionnés cidessus. In a particular embodiment, the product each comprises nucleic acids of sequence SEQ ID NO: 1 to 22, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a sequence complementary to those Another object of the present application relates to a product comprising a support on which is immobilized at least one polypeptide encoded by a nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to 22, a fragment thereof having at least 15 consecutive bases, a nucleic acid having a sequence complementary thereto or a functional analogue thereof. Preferably, the product comprises at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 different polypeptides selected from the polypeptides mentioned above.

Le support peut être tout support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation d'acides nucléiques ou de polypeptides. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, polystyrène, téflon, etc. Les réactifs peuvent être immobilisés sur la surface du support par des techniques connues, ou, dans le cas des acides nucléiques, synthétisés directement in situ sur le support. Des techniques d'immobilisation incluent l'adsorption passive (Inouye et al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 1469), la liaison covalente. Des techniques sont décrites par exemple dans WO90/03382, WO99/46403). Les réactifs immobilisés sur le support peuvent être ordonnés selon un schéma pré-établi, pour faciliter la détection et l'identification des complexes formés, et selon une densité variable et adaptable. The support can be any solid or semi-solid support having at least one surface, flat or not, allowing the immobilization of nucleic acids or polypeptides. Such supports are for example a blade, ball, membrane, filter, column, plate, etc. They can be made of any compatible material, such as glass, silica, plastic, fiber, metal, polymer, polystyrene, teflon, etc. The reagents can be immobilized on the surface of the support by known techniques, or, in the case of nucleic acids, synthesized directly in situ on the support. Immobilization techniques include passive adsorption (Inouye et al., J. Clin Microbiol 28 (1990) 1469), the covalent bond. Techniques are described for example in WO90 / 03382, WO99 / 46403). The reagents immobilized on the support can be ordered according to a pre-established scheme, to facilitate the detection and identification of the complexes formed, and in a variable and adaptable density.

Dans un mode de mise en oeuvre, le produit de l'invention comprend un pluralité d'oligonucléotides synthétiques, d'une longueur comprise entre 5 et 100 bases, spécifiques d'un ou plusieurs acides nucléiques cibles définis en a) à c). In one embodiment, the product of the invention comprises a plurality of synthetic oligonucleotides, of a length of between 5 and 100 bases, specific for one or more target nucleic acids defined in a) to c).

Les produits de l'invention comprennent typiquement des molécules contrôle, permettant d'étalonner et/ou normaliser les résultats. The products of the invention typically comprise control molecules for calibrating and / or normalizing the results.

Un autre objet de la présente demande concerne un kit comprenant un compartiment ou conteneur comprenant moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 22, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci ou un analogue fonctionnel de celles- ci. De préférence, le produit comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 acides nucléiques différents choisis parmi les acides nucléiques mentionnés ci-dessus. Dans un mode particulier de mise en oeuvre, le produit comprend chacun des acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 1 à 22, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci. Le kit peut comprendre par ailleurs des réactifs pour une réaction d'hybridation ou immunologique, ainsi que, le cas échéant, des contrôles et/ou instructions. Another object of the present application relates to a kit comprising a compartment or container comprising less a nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to 22, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, a nucleic acid having a sequence complementary thereto or a functional analogue thereof. Preferably, the product comprises at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 different nucleic acids selected from the nucleic acids mentioned above. In a particular embodiment, the product each comprises nucleic acids of sequence SEQ ID NO: 1 to 22, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a sequence complementary to those this. The kit may furthermore comprise reagents for a hybridization or immunological reaction, as well as, if appropriate, controls and / or instructions.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un produit ou kit tel que défini ci-dessus pour la détection d'une encéphalopathie chez un sujet mammifère. Another subject of the invention relates to the use of a product or kit as defined above for the detection of encephalopathy in a mammalian subject.

Un autre objet de l'invention concerne un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1-22, ou un fragment de celles-ci comprenant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, ou un analogue fonctionnel de celles-ci, en particulier un analogue provenant d'une autre espèce. Another subject of the invention relates to a nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1-22, or a fragment thereof comprising at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a sequence complementary thereto. , or a functional analogue thereof, in particular an analogue from another species.

L'invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression comportant ces acides nucléiques, ainsi que toute cellule recombinante comprenant un tel vecteur ou acide nucléique. The invention also relates to a cloning vector or expression comprising these nucleic acids, as well as any recombinant cell comprising such a vector or nucleic acid.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1-22, ou un fragment de celles-ci comprenant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, ou un analogue fonctionnel de celles-ci, en particulier un analogue provenant d'une autre espèce, pour la détection (essentiellement in vitro) d'une encéphalopathie chez un sujet mammifère. Another subject of the invention relates to the use of a nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1-22, or a fragment thereof comprising at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a sequence complementary thereto, or a functional analogue thereof, in particular an analogue from another species, for the detection (essentially in vitro) of encephalopathy in a mammalian subject.

Selon un exemple particulier de mise en oeuvre de l'invention, on prélève un échantillon de sang d'un mammifère à tester. L'échantillon de sang est traité de manière à rendre les acides nucléiques plus accessibles, et ceux-ci sont marqués. Les aides nucléiques sont ensuite appliqués sur un produit tel que défini ci-avant et le profil d'hybridation est déterminé, permettant de diagnostiquer la présence ou non d'une encéphalopathie chez le sujet. La méthode de l'invention est simple, pratiquée ex vivo, sur des animaux vivants, et permet la détection précoce d'une maladie à prion. According to a particular embodiment of the invention, a blood sample is taken from a mammal to be tested. The blood sample is processed to make the nucleic acids more accessible, and these are labeled. The nucleic aids are then applied to a product as defined above and the hybridization profile is determined, to diagnose the presence or absence of encephalopathy in the subject. The method of the invention is simple, practiced ex vivo, on live animals, and allows the early detection of prion disease.

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LISTE DE SEQUENCESSEQUENCE LIST

SEQ ID NO: 1 - Cluster NROA c21_1 Homologie avec NM 001416: Homo sapiens eukaryotic translation initiation factor 4A, isoform 1 (EIF4A1) mRNA 15 20 25 1 TTGAGAAGCG TTATTGTGGG GAGGTCATAG TTGATGACTA AGGAAACTTG 51 CTGTACATCA ATACCTCTGG CCAGTAGGTC AGTGGTAATC AATACTCTGC 101 TGGAGCCAGA GCGGAACTCC CTCATGATAA CGTCTCGTTC TTTTTGGTCC 151 ATGTCTCCGT GCATGGCAGA GACGGTGAAG TCTCGGGCAT GCATCTTCTC 201 GGTGAGCCAA TCCACCTTCC TTCGGGTGTT GATGAAGATG ACTGCCTGGG 251 TAATGGTCAG GGTTTCATAC AAGTCGCACA GTGTGTCCAG CTTCCACTCC 301 TCTCGTTCCA CATTGATGTA GAACTGACGG ATACCCTCCA GCGTCAACTC 351 TTCCTTCTTG ACAAGAATTC TAATTGGGTC CCTCATGAAC TTCTTGGTCA 401 CCTCCCGCCC ATAACGCTTC TCAA SEQ ID NO: 2 - Cluster NROA_c12_1 Homologie avec NM_15862: Homo sapiens actin related protein 2/3 complex, subunit 2, 43kDa 5ARPC2) transcript variant 1 mRNA 1 CTTGTATGGT GTATGGAAGT TACTTGGTAA ATCCAGAATC AGGATACAAT 51 GTCTCCTTGC TATACGACCT TGAAAATCTG CCTGCATCCA AGGATTCCAT 40 101 CGTGCATCAA GCTGGCATGT TGAAACGAAA CTGTTTTGCC TCTGTCTTTG 151 AGAAATACTT CCAGTTCCAG GAATGAGGGC AAGGAATGAG AGTTAGGGGC 201 AGTTATCCAT TATAGGGATG ATGAGACCAT GTATGTTGAG TCAAAAAAAG 251 ACAGAGTCAC AGTAGTCTTC AGCACAGTGT TTAAGGATGA CGACGATGTG 301 GTCATTGGAA AGGTGTTCAT GCAGGAGTTC AAAGAAGGAC GCAGAGCCAG 351 CCACACAGCC CCACAGGTCC TCTTCAGCCA CAGGGAACCT CCCTTAGAGC 401 TGAAAGATAC CGATGCCGCC GTGGGTGACA ACATTGGCTA CATTACCTTC 451 GTGCTGTTCC CTGCCCCAAT ATAA SEQ ID NO: 3 - Cluster NROB c160_1 Homologie avec AF513721: Bos grunniens myosin regulatory light chain mRNA 5 1 CCAGTGTGTT GCCCCTGAGA AGCGTTATAT GCGGTAGTGA GGGGAATTTC 51 AATTACATCG AGTTCACACG CATCCTTAAG CATGGAGCGA AAGACAAAGA 101 CGACTAAAAA GAACTTCAAA CTCCAGCCAA ACGTTCCTTG TTGCCACTCT 151 GGGTATTTCT GAGACTTTCT CTTAGAGCCT GTTGCATGCC CTTAGCTTTA 201 CAGCTTCTGC CTTTCTTTTG TATTTATTCT CAGCCATTTG GGGCACATGC 251 ATCTCTATAA TCAGACTGGA TATGGGACTT CTTGTCATTT TAAGAGTAGA 301 AAATAGGGTA ATTTAACTTA CCAGCTGCCG TCTACCCTCC CCCAAAGTCA 351 TAACGCTTCT CNNNNNNNCA GC SEQ ID NO: 4 - Cluster NROB cl_11 Homologie avec BM429753: 1Duo2OH3.abl Bos Taurus duodenum #1 library Bos Taurus cDNA, mRNA sequence 1 TCTGCAGAAT TCGCCTCTGA GAAGCGTTAT GCTGAGAGGG GGGACTGGAA 51 GCTTTGCTGA TATTTACTCA ATATTCACAA GGGGCCTGTG TAATGTGTTT 101 CACAGGTAGT GCTAATGCTC AATGCAAGAT GCATTTCAGC CTTGTAATTC 151 CTTTCATTTG AGTCTTTGAA CCATGTCCAA TGAACCAGAG CTCAAACTAA 201 TCAATTTTGT AGTTGGTATT TGTTGGAGGG GAGGCAGGCA TGGACAGCAA 251 TAGGGAGTGA GCTGGAGAGA TGCTTTGCTA ACCATAGTAA ACTGTGAAAA 301 AATAGTTACT TCCTGAAAAA AGGAAATATT CTTGAGAGCA CCTTCATAAT 351 GTCATCAAAT ACATGGCTAA ATACATTGTC TTGAGCCTCC TTCCTAATGT 401 TTCTTAGTTT TTTTTCATAT TCCATCTTTA GTAATTCAAT TTCCCCCTCT 451 TTTTCCTGCA TAATCTTCTC GCATGCTTGA GCACACTCCT TTTCCACTTT 501 TTGGATTTCC ATTTCTAATT GATCAATATA TCTTT SEQ ID NO: 5 - Cluster NROB et 15 Homologie avec NM 003127: Homo sapiens spectrin, alpha, non-erythocytic 1 (alpha-55 fodrin) (SPTANI) mRNA 1 AGAAGCGTTA TCGGGTAGGC TAACCTAGGA GCAGAGGATC AGTTCACGAA 51 GAGCGAGCGG GTGAACTCGA CGTAATCAAA AGCAGTGGGG AGTTCGCGGC 101 CCTTGCTGTC CACGTAGGGC TTCATGTGGG AGACGCAGTA GTCGGCTTGT 151 TCCCGAGTCA GGTTCTGGTA CAGCTCCTCC TTGGTCACAT AAGGCTTCCC 201 TTCAGAGCTC AGGGCCCGGA AGGCGCTCTC AATCTCCTCG CTGGACTTGA 251 CGTTCTCGGT CTCACGGCTG ATCATAAAGG CCATGTACTC TTGCAGGGAG 301 ACGTGGCCGT CCCTGTTAGG ATCCACAGTG TCCAGGATGG CCTCGAACTC 351 AGGGTCGGGC TCCCCTTCCT CCACCATGGG CAGGTCATAG CCCAGGGAGC 401 GCAGACAGGA TTTGAACTCC TGGTGGTTCA GCCGGCCAGA CTTGTCCTTG 451 TCGAAGTGTT TGAACATCAT GCTGAATTCT TTGAGGGCCT TACAGATAAC 501 GCTTCTCAAA GGCGAATTCT GCAGATA SEQ ID NO: 6 - Cluster NROB_cl_13 Homologie avec NM_003295: Homo sapiens tumor protein, translationally-controlled 1 (TPT1) mRNA 1 GAGAAGCGTT ATGGCGGGGA GGTACCGAAA GCACAGTAAT CACTGGTGTC 51 GATATTGTCA TGAGCCATCA CTTGCAGGAA ACCAGCTTCA CAAAAGAAGC 101 CTACAAGAAG TACATCAAAG ATTACATGAA GTCAATCAAA GGGAAACTTG 151 AAGAACAGAG ACCAGAAAGA GTAAAACCTT TTATGACAGG GGCTGCAGAA 201 CAAATCAAGC ACATCCTTGC TAATTTCAAA AACTATCAGT TCTTTATTGG 251 TGAAAACATG AATCCAGATG GCATGGTTGC TCTGCTGGAC TACCGTGAGG 301 ATGGTGTAAC CCCATATATG ATTTTCTTTA AGGATGGTTT AGAGATGGAA 351 AAATGTTAAC AAAGTTGGCA GTTACTTTGG ATCAATCACC TCCCCCCCAT 401 AACGCTTCTC TAATGCTTATTCATGCAGAC AACACCAGGA CTTAGACAGA 451 TGGGACTGAT GTCATCTCGA GCTCTTCATT TGTTTTGAAC GTTGATTTAT 501 TTGGAGCGGA GGCATTGTTT TTGAGAAAAC GTGTCATGTA GGTCCC SEQ ID NO: 7 - Cluster NROB c795 1 Homologie avec X85799: B. Taurus mRNA from clone TUS4 (unknown function) 1 GGGGTAGGTC AAAAAAAGTC CAAACCAAAA ACAAAACCTG CCAAAACCAA 51 CAAAAAACCT CCGAAATCTG AAGACAACTG AATCAATCCC TGCAGTCTCA 101 CTTTCTCTTG GAAAGAAAAG TTGGATAATC CAACCCTTTT ACAAAGGATA 151 ATACAAGGGT GACAGTTCCA AGCTCTCAGG AACAGGGTCT TAGACGCTTT 201 TGGAGGTTGA GAGGCACAAA ACGGCAGTCT GAAAATTCCT TTCATCTCAC 251 GGCACTGATT GAGTTTAGAC TTGATTTCTC CTCCCCTACC TACCCGATAT 301 AACGCTTCTC SEQ ID NO: 8 EXB-NROB0367-01 Homologie avec AJ318335: Ovis aries partial mRNA for high affinity IgE receptor gamma 20 subunit (fceRlggene) 1 GAAGGGCAGG CGCGAAAGGC AGCTACAGCC AGTGAGAAAT CAGATGGCAT 51 TTACACGGGC CTGAGCACCC GGACCCAGGA GACTTATGAG ACCCTGAAGC 101 ATGAGAAACC ACCACAATAG CTTTAGAACA GATGCCCTTT GTCACTTCCT 151 T SEQ ID NO: 9 - EXB-NROB1653-01 Homologie avec NM 004397: Homo sapiens DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) box 35 polypeptide 6 (RNA helicase, 54 kDa)) (DDX6) 1 AATGTAAGGG GGATTAGAGT GATTATGGGA GCAGCTAAAG ATGAGAGGGG 51 CTCAGTTTTC CGCAACACTA AATCTAAAAA GTATTTTGGC TTCTTACTGT 101 AGAGAGCAGA CCTCTACAGG AATCCTACAT TGGAAAAGAG ACCCAGAGGT 151 CTGCGGTTCA CTGCTGCCAC ACTGTCTCAC ATAGTACCTT TGGAGTAGGC 201 CTGACAGAGA GCACAGGGAA GCTTCAGAAA CCTGTAATTC AAGATTTTAT 251 TTTTTTGAGA CGTTCTCTCT GATACTGTTC CCCGCCAGCC TTTTTTAAAA 301 GTTTGAGAAA CTTTTCAAGC TCTGCAAAAG GGGACAAAGA ATTTGCCTTG 351 CAGTGTGGGG ATATGATTGA GCGGCAGTG SEQ ID NO: 10 EXB-NROB1743-01 Homologie avec NM 078480: Homo sapiens fuse-binding protein interacting repressor (SIAHBPI) transcript variant 1 mRNA 1 GTGGTAGGTG ACTGAGGAGT GTGGCAAGTT TGGTGCTGTC AACCGTGTCA 51 TCATCTACCA AGAGAAGCAG GGCGAGGAAG AGGACGCGGA GATCATTGTC 101 AAGATTTTTG TGGAGTTTTC CGTAGCCTCT GAGACTCACA AGGCCATCCA 151 GGCCCTCAAT GGGCGCTGGT TTGCTGGCCG CAAGGTGGTG GCTGAAGTGT 201 ATGACCAGGA GCGTTTTGAT AACAGTGACC TCTCTGCATG ACCTCCCCCC 251 C SEQ ID NO: 11 - EXB-NROA1346-01 Homologie avec AB098926: Bos Taurus mRNA for similar to beta 2-microglobulin, partial cds 1 GATCAGTACA GCTGCCGAGT GAAACACGTT ACTTTGGAAC AACCCCGGAT 51 AGTTAAGTGG GATCGAGACC TGTAAGCAGC ACCATCGAGA TTTGAACATT 101 CTTCATTTGG TATAATATCT GGAAAATTCT GTTTCCCTGC TCTTTAATAC 151 TGATATGCTT TTATGCTTTA TGCGCATAAT CAGAAGTCAT ATTCATGTTA 201 CCATAAATAC CTTCTTTATA ATTTTACCGT GGGTGCTACA TGTCCATGTT 251 TGACCTTCCT AGGCAGGTGT CTGCAGTGGA GGTCCACAAA SEQ ID NO: 12 Cluster NROB C3 1 Homologie avec NM_1.73704: Homo sapiens cytochrome c oxidase I (MTCO1), mRNA. 4/2003 1 TGAGAAGCGT AATGGTGGGG AGGCCATCCG TTTAATCATT CTAGATTTGT 51 CGTGGTTAAG TCTACAGTCA AGACTTCTCG TTTAGATGCA AATGCTTCTC 101 AGATGATGAA AACTATTAGT ATAACTGCTG TTAGGGAAAT GAATGAGCCT 151 ATTGATGAGA TAGTATTTCA TATTGTGTAT GCATCTGGGT AGTCGGAGTA 201 TCGTCGAGGC ATGCCAGATA GTCCTAGAAA GTGTTGTGGG AAGAAGGTTA 251 TATTGACGCC TACAAATATA ATTGCGAAGT GGATTTTGGC TCATGTATCG 15 301 TTGAGAGTAT AACCTGAGAA TAGTGGGAAT CAATGAACAA ATCCCCCTAT 351 AATAGCAAAT ACAGCTCCTA TTGATAAAAC ATAGTGGAAA TGTGCGACAA 401 CGTAGTATGT GTCGTGAAGA ACAATATCGA GGGAAGAGTT GGCTAAGACA 451 ATTCCAGTTA AACCCCCTAC TGTAAATAAG AAAATAAAGC CTAGGGCTCA 501 CATTATAGCA GGAGACCATT TGATATTACC TCCATGAAGT GTTGCCAATC 551 AGCTGAAGAC TTTTACCCCG GTCGGAATAG CAATAATTAT AGTGGCTGAT 601 GTGAAGTAGG CTCGTGTGTC GACGTCTATT CCGACAGTGA ATATATGGTG 651 GGCTCATACG ATGAAACCTA GAAATCCGAT TGGCATTATA GCCCAAACTA 701 TTCCCATATA TCCGAATGGT TCTTTTTTTC CTGAGTAGTA GGTCACGATA 751 TGAGAGATTA TTCCAAACCC AGGTAAGATT AAAATATAGA CTTCGGGGTG 801 TCCAAAGAAT CAGAATAAGT GTTGATATAG AATAGGGTCA ACCCTATA SEQ ID NO: 13 - Cluster NROB_c911_1 Homologie avec BE754689: 208273 MARC 2BOV Bos taurus cDNA 5', mRNA sequence. 4/2001 1 GCTTGGGGGG GCAGCAACAT CAGCCTGGCG CAGCTGGTGG CGCTCAAGAA 51 GCAGCTGGGC ATGGACGGGC TGTCCCAGTG AGGACCCCTC CCCCACCCGG 101 ATGAACCCTG GGAGGACCGG AGTTTTCTGC AGCACGACCC AGCGCCTCAT 151 TGTTAATAGT GTTCTGTGTC TGCTGGGAGC CCATGGCCCA CGCCAGTCAG 201 TTAACCTGGT TTCTCCTGAG ACCAGTGTGT GCAGCAGCCG GAAAGGCAGT 251 AGCCAGCAAG GCTGTGAACT GAAGTCTTTT GAGTGTTTGG TTTTTTCTCA 301 GGAAGCCCAA AGCCTACCCT TACTCACTTT TCTTAAATCC ATCCCCACCC 351 CTACCCCCGC CCCGGTAACG CTTCTCCAGN NNNNNNNCAG CAC SEQ ID NO: 14 - Cluster NROB_c233_1 Homologie avec NM_003418: Homo sapiens zinc finger protein 9 (a cellular retroviral 50 nucleic acid binding protein) (ZNF9), mRNA. 4/2003 1 AGAAGCGTTA TGGTTGGGGA GGTACAGATG TCACTTGATG TTATTTAATA 55 51 GCTACTGAGG TCAGACAATC CAAGGCAGTC ATTATGCTAA AATTAAAGTT 101 ATTTATGGAA GCTCACAGAC ACTTCCAGGA TCGGTTTTAC CTCTCCCA SEQ ID NO: 15 Cluster NROB_c195_1 Homologie avec NM_004126: Homo sapiens guanine nucleotide binding protein (G protein), gamma 11 (GNG11), mRNA. 4/2003 1 AGAAGCGGTA TTTAGGGGAG GGATGAGAGG CATACAGCTT TCAGACAAGA 51 CCACATCTAG GTGAGCGCTT AAGAAAGTCT CATTTAAATT TCATTGTTAC 101 TCCTTTAAAA GGGGGTTGGT TTTATTTTGG AAAACGACAA CAAACGACCT 151 CTTCCACTGA GGAGGAAGTG TCTCCCCAGT TATTCATGAA ATAATGCAGC 201 TGCCTTTTTC TTTAAAGGGA TTCTTGTCTT CTGGAATTCC TTTCACCAGA 251 GGATCCTCTC TAGAACGTTC TTCAATATAG TTCTTTATTT CTTCTGAACA 301 TTTAGACACC TGCTGTCTCT GCAACTTAAC TTCTTTGCGA AGTTGCTCAA 351 CTTCCATCTT CAGCTTTTCC TTTTCTGGCA GATCTTCGAT GTGAAGAGCC 401 GGCATTTTCG CCCTACCCCC CATCACGCTT CT SEQ ID NO: 16 - Cluster NROB_cl 46 Homologie avec BF429749: 255611 MARC BSM Bos taurus cDNA 5', mRNA sequence. 11/2000 1 GTGTTCTGCA GAATTCGCCT CTGAGAAGCG TTATTGTGGT GGGGGGGAGT 51 TAATTAGCCC TAAGGTTTGT AAGGTAGTGA TAGGATTGGG AGCTTGGTGT 101 TCATCAGATC CCTTTCAAGT GTAGGACAAT AGGAAAAACT TGGATCCAAA 151 AGTTCAGTGT TTTCTCTGTA GTATTAGTTG TGACCATCAT GAACTCTCTA 201 AGCCACATTA GGGGATGGGG GAAATCAGGG TGGTTATATT TAAAAGTATT 251 ATTGCTAAGT GTAATCTGTT CTCTAGGGTC AAGTCACTCC ACCTTTAAAA 301 GGCTATTGAG AAAACTCATC GTTGGTGCCA ATGCAAGTTC AGTTGGCCTC 351 CAACTTCATG TTGTCTACAG TTCCCATCCC TGTCA SEQ ID NO: 17 - Cluster NROA c113 1 Homologie avec Y18201: Bos taurus mRNA for MHC class II (BOLA DQB), clone DQBI b13. 2/2001 15 20 25 1 GAAGCGTTAT GTNGAGCAGA CGCGGGCCGA GGCGGACACG GTGTGCAGAC 51 ACAACTACCA GGTGGAAGCC CCCTTCACCT GGCAGCGGGA AGTGGAACCT 101 ACAGTGACCA TCTTCCTGTC CAGGACAGAG GCTCTAAACC ACCACAACCT 151 GCTGGTCTGC TCGGTGACAG ATTTCTATCC GGGCCAGATC AAGGTTCGGT 201 GGTTCCGGAA TGACCAGGAG GAGACAGCTG GTGTTGTGGC CACACCTCTT 251 ATTAGGAATG GGGACTGGAC CTTTCAGCTG TTCATGATGC TGGAGATGAC 301 CCCCCAGCGA GGAGATGTCT ACACCTGCCG CGTGGAGCAC CCCAGCCTCC 351 AGAGCCCCAT CATGGTGGAG TGGCGGGCGC AGTCTGAATC TGCCCAGAGC 401 AAGATGCTGA GTGGTATTGG AGGCTTCGTG CTGGGGCTGA TCTTCCTCGG 451 GCTGGGTCTC ATTGTCCATC ACAGAAGCCA GAAGGGGCTC ATGCGCTGAC 501 TCCTGAGGAT ATTTTGGGAT TGGTGTTTGC TCTTCTATAA TGCGTGCCTG 551 ACCTCGCCGG GAATTCCCAG ATGCTTGTCA GCCTGTCGCA CTCTGAGATC 601 AGAGTCGGTC ACCAGGTCAT TTCCTGTGGC CATCCCCCAA CCAAGGATCT 651 GGCTAGCATA TAACGCTTCT AAATGGGNNN NNNNTGCAGA TA SEQ ID NO: 18 EXB-NROB1626-01 Homologie avec NM_003092: Homo sapiens small nuclear ribonucleoprotein polypeptide 35 B" (SNRPB2), mRNA. 4/2003 1 TGTGGAGGGT AATCAGGGAC CTGAGGATTT GGTGTTGCAT TTCCTTGGGT 51 ATTAGCTGAA TTTGGTGTTC CCTGACCAGG CTTTTTGTTC ACAGTTGTTG 101 CAGTCTGTTC CACAGTTTTG GCTTTTTTCT TTTCTTTTTT CTTTTCTTTG 151 TCAGCAAAAG TGCCACGCAT TTTAGATATT ATATCGGAAT CTGTTTTGGC 201 ATACTGGATT CGCATTGGTT TGCCATAAAA TGGAAATCCT TGTATCTGTC 251 TCAAGGCATT TGTAGATGAG CCCAATTCCT TAAATATAAC AAAGGCTTGT 50 301 CCCCT SEQ ID NO: 19 - EXB-NROB1729-01 Homologie avec NM_006762: Homo sapiens Lysosomalassociated multispanning membrane protein-5 (LAPTM5), mRNA. 4/2003 10 15 20 25 1 GAGAAGCGTT ATGCGGGTGA GGTGGCCCAC GGCAAGGCCT CCTGCAAGTT 51 CTCAAAGACG GGCTACCTCA GGATCGCTGA ACTGGTCTCC AGCTTTCTGC 101 TCATCACCAT GCTCTTCATC ATCAGCTTGA GCCTGCTGGT TGGTGTGGTC 151 AAGAACCGGG AGAAGTACCT GCTGCCCTTC CTGTCCCTGC AAATCATGGA 201 CTTCCTCCTG TGCCTGCTCA CCCTGATGGG CTCTTACATC GAACTGCCCG 251 CCTACCTCAA GTTTGCCTCC CGGAGCAGCA GGCGGGTGAG CCCCTCCAAG 301 GTCCCACTGA TGACCCTACA GCTGTTGGAC TTCTGCCTGA GCATCCTGAC 351 CCTCTGCAGC TCCTACATGG AGGTGCCCAC CTATCTCA SEQ ID NO: 20 - EXB- NROB1555-01 Homologie avec A V616393: AV616393 Bos taurus ovary fetus Bos taurus cDNA clone ElOV005A10 5', mRNA sequence. 11/2001 1 GGCCCAGATG GCTAGGGGGT CACCTGATTC GACCAATTGT TATCTTAGCT 51 GCTCAGTGAA CTTGGAACCA AAACGGTAGT CCTGATTTAA AAATGGAAAA 101 GCAGATAATT CCCCAGACCA TGCATTACTT TTGTCTTAGA AGGAAAAGTT 151 ATCCACGTGT TATGTTTGTA GGTACACAGC GTATACAACA GGTAACAAAT 201 GAACTCTGTC ACAGCAAGCA GCGCCAGCTA CTCACTTCAC ACAGCTGAAC 251 CGAACACCGA ACGCTCCCGT CACACACCGC GGGGGAAGGG GCTCTCCCCA 301 CCAACACCCA CTCGTCACTC GGGGTCCTGA CTGCCCACGC CTCATATTCA SEQ ID NO: 21 - EXB-NROB1502- 01 Homologie avec A Y033938: Bos taurus glucose transporter 3 mRNA, complete cds. 7/2001 1 CTGTTTTAGG CGCCTATGTT TTCATCGTCT TCACTGTCTT CCTCGTTATC 51 TTCTGGGTCT TCACCTTCTT CAAAGTTCCT GAGACCCGTG GCAGGACTTT 101 TGAGGAAATT ACACGAGCCT TTGAAGGGCA GACGCAGACA GGAACCCGCG 151 GTGAGAAAGG CCCCATCATG GAGATGAACA GCATCCAGCC C SEQ ID NO: 22 - EXB- NROA1648-01 Homologie avec NM_001629: Homo sapiens arachidonate 5- lipoxygenase-activating protein (ALOX5AP), mRNA. 4/2003 1 TGGGTGACAG GTCATTAGAT TTACAGCCTC TTTTAAATGG CTTCTAGGTA 51 TCGATTGGCT GAGCACACCC ACCCGGAATT CAGCAGAGAC TCAAGGGATG 101 AGAAGGAGAG GGGAGATGGT GGTAGTGACG GTCTTGATGT AGTTTTCAAA 151 GTCACTTCCG AAAAGGGCGA TGAAGAAATA GTTGAGTATC CCAGCGAGGG 201 ACATGGCAAA TAGGAACAGG ATAATGCGTT TCCCAAATAT GTTATTCAGG 251 CGTGCTCTGA GTTCTCTCCC CGAGGTAGCC GACAAAGTAC TTCTGCCTCA 301 CGA SEQ ID NO: 1 - Cluster NROA c21_1 Homology with NM 001416 Homo sapiens eukaryotic translation initiation factor 4A, isoform 1 (EIF4A1) mRNA 15 20 25 1 TTGAGAAGCG TTATTGTGGG GAGGTCATAG TTGATGACTA AGGAAACTTG 51 CTGTACATCA ATACCTCTGG CCAGTAGGTC AGTGGTAATC AATACTCTGC 101 TGGAGCCAGA GCGGAACTCC CTCATGATAA CGTCTCGTTC TTTTTGGTCC 151 ATGTCTCCGT GCATGGCAGA GACGGTGAAG TCTCGGGCAT GCATCTTCTC 201 GGTGAGCCAA TCCACCTTCC TTCGGGTGTT GATGAAGATG ACTGCCTGGG 251 TAATGGTCAG GGTTTCATAC AAGTCGCACA GTGTGTCCAG CTTCCACTCC 301 TCTCGTTCCA CATTGATGTA GAACTGACGG ATACCCTCCA GCGTCAACTC 351 TTCCTTCTTG ACAAGAATTC TAATTGGGTC CCTCATGAAC TTCTTGGTCA 401 CCTCCCGCCC ATAACGCTTC TCAA SEQ ID NO: 2 - Cluster NROA_c12_1 homology with NM_15862: Homo sapiens actin related protein 2/3 complex, subunit 2, 43kDa 5ARPC2) variant transcript 1 mRNA 1 CTTGTATGGT GTATGGAAGT TACTTGGTAA ATCCAGAATC AGGATACAAT 51 GTCTCCTTGC TATACGACCT TGAAAATCTG CCTGCATCCA AGGATTCCAT 40 101 CGTGCATCAA GCTGGCATGT TGAAACGAAA CTGTTTTGCC TCTGTCTTTG 151 AGAAATACTT CCAGTTCCAG GAATGAGGGC AAGGAATGAG AGTTAGGGGC 201 AGTTATCCAT TATAGGGATG ATGAGACCAT GTATGTTGAG TCAAAAAAAG 251 ACAGAGTCAC AGTAGTCTTC AGCACAGTGT TTAAGGATGA CGACGATGTG 301 GTCATTGGAA AGGTGTTCAT GCAGGAGTTC AAAGAAGGAC GCAGAGCCAG 351 CCACACAGCC CCACAGGTCC TCTTCAGCCA CAGGGAACCT CCCTTAGAGC 401 TGAAAGATAC CGATGCCGCC GTGGGTGACA ACATTGGCTA CATTACCTTC 451 GTGCTGTTCC CTGCCCCAAT ATAA SEQ ID NO: 3 - Cluster NROB c160_1 Homology with AF513721 Bos grunniens myosin regulatory light chain mRNA May 1 CCAGTGTGTT GCCCCTGAGA AGCGTTATAT GCGGTAGTGA GGGGAATTTC 51 AATTACATCG AGTTCACACG CATCCTTAAG CATGGAGCGA AAGACAAAGA 101 CGACTAAAAA GAACTTCAAA CTCCAGCCAA ACGTTCCTTG TTGCCACTCT 151 GGGTATTTCT GAGACTTTCT CTTAGAGCCT GTTGCATGCC CTTAGCTTTA 201 CAGCTTCTGC CTTTCTTTTG TATTTATTCT CAGCCATTTG GGGCACATGC 251 ATCTCTATAA TCAGACTGGA TATGGGACTT CTTGTCATTT TAAGAGTAGA 301 AAATAGGGTA ATTTAACTTA CCAGCTGCCG TCTACCCTCC CCCAAAGTCA 351 TAACGCTTCT CNNNNNNNCA GC SEQ ID NO: 4 - Cluster NROB cl_11 Homology with BM429753: 1Duo2OH3.abl Bos Tau rus duodenum # 1 library Bos Taurus cDNA, mRNA sequence 1 TCTGCAGAAT TCGCCTCTGA GAAGCGTTAT GCTGAGAGGG GGGACTGGAA 51 GCTTTGCTGA TATTTACTCA ATATTCACAA GGGGCCTGTG TAATGTGTTT 101 CACAGGTAGT GCTAATGCTC AATGCAAGAT GCATTTCAGC CTTGTAATTC 151 CTTTCATTTG AGTCTTTGAA CCATGTCCAA TGAACCAGAG CTCAAACTAA 201 TCAATTTTGT AGTTGGTATT TGTTGGAGGG GAGGCAGGCA TGGACAGCAA 251 TAGGGAGTGA GCTGGAGAGA TGCTTTGCTA ACCATAGTAA ACTGTGAAAA 301 AATAGTTACT TCCTGAAAAA AGGAAATATT CTTGAGAGCA CCTTCATAAT 351 GTCATCAAAT ACATGGCTAA ATACATTGTC TTGAGCCTCC TTCCTAATGT 401 TTCTTAGTTT TTTTTCATAT TCCATCTTTA GTAATTCAAT TTCCCCCTCT 451 TTTTCCTGCA TAATCTTCTC GCATGCTTGA GCACACTCCT TTTCCACTTT 501 TTGGATTTCC ATTTCTAATT GATCAATATA TCTTT SEQ ID nO: 5 - Cluster NROB and 15 homology with NM 003127 Homo sapiens spectrin, alpha, non-erythocytic 1 (alpha-55 fodrin) (SPTANI) mRNA 1 AGAAGCGTTA TCGGGTAGGC TAACCTAGGA GCAGAGGATC AGTTCACGAA 51 GAGCGAGCGG GTGAACTCGA CGTAATCAAA AGCAGTGGGG AGTTCGCGGC 101 CCTTGCTGTC CACGTAGGGC TTCATGTGGG AGACGCAGTA GTCGGCTTGT 1 51 TCCCGAGTCA GGTTCTGGTA CAGCTCCTCC TTGGTCACAT AAGGCTTCCC 201 TTCAGAGCTC AGGGCCCGGA AGGCGCTCTC AATCTCCTCG CTGGACTTGA 251 CGTTCTCGGT CTCACGGCTG ATCATAAAGG CCATGTACTC TTGCAGGGAG 301 ACGTGGCCGT CCCTGTTAGG ATCCACAGTG TCCAGGATGG CCTCGAACTC 351 AGGGTCGGGC TCCCCTTCCT CCACCATGGG CAGGTCATAG CCCAGGGAGC 401 GCAGACAGGA TTTGAACTCC TGGTGGTTCA GCCGGCCAGA CTTGTCCTTG 451 TCGAAGTGTT TGAACATCAT GCTGAATTCT TTGAGGGCCT TACAGATAAC 501 GCTTCTCAAA GGCGAATTCT GCAGATA SEQ ID NO: 6 - Cluster NROB_cl_13 homology with NM_003295 Homo sapiens tumor protein, translationally-controlled 1 (TPT1) mRNA 1 GAGAAGCGTT ATGGCGGGGA GGTACCGAAA GCACAGTAAT CACTGGTGTC 51 GATATTGTCA TGAGCCATCA CTTGCAGGAA ACCAGCTTCA CAAAAGAAGC 101 CTACAAGAAG TACATCAAAG ATTACATGAA GTCAATCAAA GGGAAACTTG 151 AAGAACAGAG ACCAGAAAGA GTAAAACCTT TTATGACAGG GGCTGCAGAA 201 CAAATCAAGC ACATCCTTGC TAATTTCAAA AACTATCAGT TCTTTATTGG 251 TGAAAACATG AATCCAGATG GCATGGTTGC TCTGCTGGAC TACCGTGAGG 301 ATGGTGTAAC CCCATATATG ATTTTCTTTA AGGATGGTTT AGAGATGGAA 351 AAATGTTAAC AAAGTTGGCA GTTACTTTGG ATCAATCACC TCCCCCCCAT 401 AACGCTTCTC TAATGCTTATTCATGCAGAC AACACCAGGA CTTAGACAGA 451 TGGGACTGAT GTCATCTCGA GCTCTTCATT TGTTTTGAAC GTTGATTTAT 501 TTGGAGCGGA GGCATTGTTT TTGAGAAAAC GTGTCATGTA GGTCCC SEQ ID NO: 7 - Cluster NROB C 795 1 homology with X85799 B. Taurus mRNA from cloned TUS4 (unknown function) 1 GGGGTAGGTC AAAAAAAGTC CAAACCAAAA ACAAAACCTG CCAAAACCAA 51 CAAAAAACCT CCGAAATCTG AAGACAACTG AATCAATCCC TGCAGTCTCA 101 CTTTCTCTTG GAAAGAAAAG TTGGATAATC CAACCCTTTT ACAAAGGATA 151 ATACAAGGGT GACAGTTCCA AGCTCTCAGG AACAGGGTCT TAGACGCTTT 201 TGGAGGTTGA GAGGCACAAA ACGGCAGTCT GAAAATTCCT TTCATCTCAC 251 GGCACTGATT GAGTTTAGAC TTGATTTCTC CTCCCCTACC TACCCGATAT 301 AACGCTTCTC SEQ ID NO: 8 EXB-NROB0367-01 homology with AJ318335: Ovis aries partial mRNA for high affinity IgE receptor gamma subunit (fceRlggene) 1 GAAGGGCAGG CGCGAAAGGC AGCTACAGCC AGTGAGAAAT CAGATGGCAT 51 TTACACGGGC CTGAGCACCC GGACCCAGGA GACTTATGAG ACCCTGAAGC 101 ATGAGAAACC ACCACAATAG CTTTAGAACA GATGCCCTTT GTCACTTC Homology with NM 004397: Homo sapiens DEAD / H (Asp-Glu-Ala-Asp / His) box polypeptide 6 (RNA helicase, 54 kDa)) (DDX6) CT 151 T SEQ ID NO: 9 - EXB-NROB1653-01 1 AATGTAAGGG GGATTAGAGT GATTATGGGA GCAGCTAAAG ATGAGAGGGG 51 CTCAGTTTTC CGCAACACTA AATCTAAAAA GTATTTTGGC TTCTTACTGT 101 AGAGAGCAGA CCTCTACAGG AATCCTACAT TGGAAAAGAG ACCCAGAGGT 151 CTGCGGTTCA CTGCTGCCAC ACTGTCTCAC ATAGTACCTT TGGAGTAGGC 201 CTGACAGAGA GCACAGGGAA GCTTCAGAAA CCTGTAATTC AAGATTTTAT 251 TTTTTTGAGA CGTTCTCTCT GATACTGTTC CCCGCCAGCC TTTTTTAAAA 301 GTTTGAGAAA CTTTTCAAGC TCTGCAAAAG GGGACAAAGA ATTTGCCTTG 351 CAGTGTGGGG ATATGATTGA GCGGCAGTG SEQ ID NO: 10 EXB-NROB1743-01 homology with NM 078480 Homo sapiens fuse-binding protein interacting repressor (SIAHBPI) transcript variant 1 mRNA 1 GTGGTAGGTG ACTGAGGAGT GTGGCAAGTT TGGTGCTGTC AACCGTGTCA 51 TCATCTACCA AGAGAAGCAG GGCGAGGAAG AGGACGCGGA GATCATTGTC 101 AAGATTTTTG TGGAGTTTTC CGTAGCCTCT GAGACTCACA AGGCCATCCA 151 GGCCCTCAAT GGGCGCTGGT TTGCTGGCCG CAAGGTGGTG GCTGAAGTGT 201 ATGACCAGG A GCGTTTTGAT AACAGTGACC TCTCTGCATG ACCTCCCCCC 251 C SEQ ID NO: 11 - EXB-NROA1346-01 Homology with AB098926: Bos Taurus mRNA for similar to beta 2-microglobulin, partial cds 1 GATCAGTACA GCTGCCGAGT GAAACACGTT ACTTTGGAAC AACCCCGGAT 51 AGTTAAGTGG GATCGAGACC TGTAAGCAGC ACCATCGAGA TTTGAACATT 101 CTTCATTTGG TATAATATCT GGAAAATTCT GTTTCCCTGC TCTTTAATAC 151 TGATATGCTT TTATGCTTTA TGCGCATAAT CAGAAGTCAT ATTCATGTTA 201 CCATAAATAC CTTCTTTATA ATTTTACCGT GGGTGCTACA TGTCCATGTT 251 TGACCTTCCT AGGCAGGTGT CTGCAGTGGA GGTCCACAAA SEQ ID NO: 12 Cluster C3 NROB 1 homology with NM_1.73704: Homo sapiens cytochrome c oxidase I (MTCO1), mRNA. 4/2003 1 TGAGAAGCGT AATGGTGGGG AGGCCATCCG TTTAATCATT CTAGATTTGT 51 CGTGGTTAAG TCTACAGTCA AGACTTCTCG TTTAGATGCA AATGCTTCTC 101 AGATGATGAA AACTATTAGT ATAACTGCTG TTAGGGAAAT GAATGAGCCT 151 ATTGATGAGA TAGTATTTCA TATTGTGTAT GCATCTGGGT AGTCGGAGTA 201 TCGTCGAGGC ATGCCAGATA GTCCTAGAAA GTGTTGTGGG AAGAAGGTTA 251 TATTGACGCC TACAAATATA ATTGCGAAGT GGATTTTGGC TCATGTATCG 15,301 TTGAGAGTAT AACCTGAGAA TAGTGGGAAT CAATGAACAA ATCCCCCTAT 351 AATAGCAAAT ACAGCTCCTA TTGATAAAAC ATAGTGGAAA TGTGCGACAA 401 CGTAGTATGT GTCGTGAAGA ACAATATCGA GGGAAGAGTT GGCTAAGACA 451 ATTCCAGTTA AACCCCCTAC TGTAAATAAG AAAATAAAGC CTAGGGCTCA 501 CATTATAGCA GGAGACCATT TGATATTACC TCCATGAAGT GTTGCCAATC 551 AGCTGAAGAC TTTTACCCCG GTCGGAATAG CAATAATTAT AGTGGCTGAT 601 GTGAAGTAGG CTCGTGTGTC GACGTCTATT CCGACAGTGA ATATATGGTG 651 GGCTCATACG ATGAAACCTA GAAATCCGAT TGGCATTATA GCCCAAACTA 701 TTCCCATATA TCCGAATGGT TCTTTTTTTC CTGAGTAGTA GGTCACGATA 751 TGAGAGATTA TTCCAAACCC AGGTAAGATT AAAATATAGA CTTCGGGGTG 801 TCCAAAGAAT CAGAATAAGT GTTGATATAG AATAGGGTCA A CCCTATA SEQ ID NO: 13 - Cluster NROB_c911_1 Homology with BE754689: 208273 MARC 2BOV Bos taurus cDNA 5 ', mRNA sequence. 4/2001 1 GCTTGGGGGG GCAGCAACAT CAGCCTGGCG CAGCTGGTGG CGCTCAAGAA 51 GCAGCTGGGC ATGGACGGGC TGTCCCAGTG AGGACCCCTC CCCCACCCGG 101 ATGAACCCTG GGAGGACCGG AGTTTTCTGC AGCACGACCC AGCGCCTCAT 151 TGTTAATAGT GTTCTGTGTC TGCTGGGAGC CCATGGCCCA CGCCAGTCAG 201 TTAACCTGGT TTCTCCTGAG ACCAGTGTGT GCAGCAGCCG GAAAGGCAGT 251 AGCCAGCAAG GCTGTGAACT GAAGTCTTTT GAGTGTTTGG TTTTTTCTCA 301 GGAAGCCCAA AGCCTACCCT TACTCACTTT TCTTAAATCC ATCCCCACCC 351 CTACCCCCGC CCCGGTAACG CTTCTCCAGN NNNNNNNCAG CAC SEQ ID NO: 14 - Cluster NROB_c233_1 Homology with NM_003418: Homo sapiens zinc finger protein 9 (a cellular retroviral 50 nucleic acid binding protein) (ZNF9), mRNA. 4/2003 1 AGAAGCGTTA TGGTTGGGGA GGTACAGATG TCACTTGATG TTATTTAATA 55 51 GCTACTGAGG TCAGACAATC CAAGGCAGTC ATTATGCTAA AATTAAAGTT 101 ATTTATGGAA GCTCACAGAC ACTTCCAGGA TCGGTTTTAC CTCTCCCA SEQ ID NO: 15 Cluster NROB_c195_1 Homology with NM_004126: Homo sapiens guanine nucleotide binding protein (G protein), gamma 11 (GNG11), mRNA. 4/2003 1 AGAAGCGGTA TTTAGGGGAG GGATGAGAGG CATACAGCTT TCAGACAAGA 51 CCACATCTAG GTGAGCGCTT AAGAAAGTCT CATTTAAATT TCATTGTTAC 101 TCCTTTAAAA GGGGGTTGGT TTTATTTTGG AAAACGACAA CAAACGACCT 151 CTTCCACTGA GGAGGAAGTG TCTCCCCAGT TATTCATGAA ATAATGCAGC 201 TGCCTTTTTC TTTAAAGGGA TTCTTGTCTT CTGGAATTCC TTTCACCAGA 251 GGATCCTCTC TAGAACGTTC TTCAATATAG TTCTTTATTT CTTCTGAACA 301 TTTAGACACC TGCTGTCTCT GCAACTTAAC TTCTTTGCGA AGTTGCTCAA 351 CTTCCATCTT CAGCTTTTCC TTTTCTGGCA GATCTTCGAT GTGAAGAGCC 401 GGCATTTTCG CCCTACCCCC CATCACGCTT CT SEQ ID NO: 16 - Cluster NROB_cl 46 Homology with BF429749: 255611 MARC BSM Bos taurus cDNA 5 ', mRNA sequence. 11/2000 1 GTGTTCTGCA GAATTCGCCT CTGAGAAGCG TTATTGTGGT GGGGGGGAGT 51 TAATTAGCCC TAAGGTTTGT AAGGTAGTGA TAGGATTGGG AGCTTGGTGT 101 TCATCAGATC CCTTTCAAGT GTAGGACAAT AGGAAAAACT TGGATCCAAA 151 AGTTCAGTGT TTTCTCTGTA GTATTAGTTG TGACCATCAT GAACTCTCTA 201 AGCCACATTA GGGGATGGGG GAAATCAGGG TGGTTATATT TAAAAGTATT 251 ATTGCTAAGT GTAATCTGTT CTCTAGGGTC AAGTCACTCC ACCTTTAAAA 301 GGCTATTGAG AAAACTCATC GTTGGTGCCA ATGCAAGTTC AGTTGGCCTC 351 CAACTTCATG TTGTCTACAG TTCCCATCCC TGTCA SEQ ID NO: 17 - NROA cluster c113 1 Homology with Y18201: Bos taurus mRNA for MHC class II (BOLA DQB), clone DQBI b13. 2/2001 15 20 January 25 GAAGCGTTAT GTNGAGCAGA CGCGGGCCGA GGCGGACACG GTGTGCAGAC 51 ACAACTACCA GGTGGAAGCC CCCTTCACCT GGCAGCGGGA AGTGGAACCT 101 ACAGTGACCA TCTTCCTGTC CAGGACAGAG GCTCTAAACC ACCACAACCT 151 GCTGGTCTGC TCGGTGACAG ATTTCTATCC GGGCCAGATC AAGGTTCGGT 201 GGTTCCGGAA TGACCAGGAG GAGACAGCTG GTGTTGTGGC CACACCTCTT 251 ATTAGGAATG GGGACTGGAC CTTTCAGCTG TTCATGATGC TGGAGATGAC 301 CCCCCAGCGA GGAGATGTCT ACACCTGCCG CGTGGAGCAC CCCAGCCTCC 351 AGAGCCCCAT CATGGTGGAG TGGCGGGCGC AGTCTGAATC TGCCCAGAGC 401 AAGATGCTGA GTGGTATTGG AGGCTTCGTG CTGGGGCTGA TCTTCCTCGG 451 GCTGGGTCTC ATTGTCCATC ACAGAAGCCA GAAGGGGCTC ATGCGCTGAC 501 TCCTGAGGAT ATTTTGGGAT TGGTGTTTGC TCTTCTATAA TGCGTGCCTG 551 ACCTCGCCGG GAATTCCCAG ATGCTTGTCA GCCTGTCGCA CTCTGAGATC 601 AGAGTCGGTC ACCAGGTCAT TTCCTGTGGC CATCCCCCAA CCAAGGATCT 651 GGCTAGCATA TAACGCTTCT AAATGGGNNN NNNNTGCAGA TA SEQ ID NO: 18 EXB-NROB1626-01 Homology with NM_003092: Homo sapiens small nuclear ribonucleoprotein B "(SNRPB2) polypeptide, mRNA 4/2003 1 TGTGGAGGGT AATCAGGGAC CTG AGGATTT GGTGTTGCAT TTCCTTGGGT 51 ATTAGCTGAA TTTGGTGTTC CCTGACCAGG CTTTTTGTTC ACAGTTGTTG 101 CAGTCTGTTC CACAGTTTTG GCTTTTTTCT TTTCTTTTTT CTTTTCTTTG 151 TCAGCAAAAG TGCCACGCAT TTTAGATATT ATATCGGAAT CTGTTTTGGC 201 ATACTGGATT CGCATTGGTT TGCCATAAAA TGGAAATCCT TGTATCTGTC 251 TCAAGGCATT TGTAGATGAG CCCAATTCCT TAAATATAAC AAAGGCTTGT 50,301 CCCCT SEQ ID NO: 19 - EXB-NROB1729-01 homology with NM_006762 : Homo sapiens Lysosomalassociated multispanning membrane protein-5 (LAPTM5), mRNA. 4/2003 10 15 20 25 1 GAGAAGCGTT ATGCGGGTGA GGTGGCCCAC GGCAAGGCCT CCTGCAAGTT 51 CTCAAAGACG GGCTACCTCA GGATCGCTGA ACTGGTCTCC AGCTTTCTGC 101 TCATCACCAT GCTCTTCATC ATCAGCTTGA GCCTGCTGGT TGGTGTGGTC 151 AAGAACCGGG AGAAGTACCT GCTGCCCTTC CTGTCCCTGC AAATCATGGA 201 CTTCCTCCTG TGCCTGCTCA CCCTGATGGG CTCTTACATC GAACTGCCCG 251 CCTACCTCAA GTTTGCCTCC CGGAGCAGCA GGCGGGTGAG CCCCTCCAAG 301 GTCCCACTGA TGACCCTACA GCTGTTGGAC TTCTGCCTGA GCATCCTGAC 351 CCTCTGCAGC TCCTACATGG AGGTGCCCAC CTATCTCA SEQ ID NO: 20 - EXB-NROB1555-01 Homology with A V616393: AV616393 Bos taurus ovary fetus Bos taurus cDNA clone ElOV005A10 5 ', mRNA sequence. 11/2001 1 GGCCCAGATG GCTAGGGGGT CACCTGATTC GACCAATTGT TATCTTAGCT 51 GCTCAGTGAA CTTGGAACCA AAACGGTAGT CCTGATTTAA AAATGGAAAA 101 GCAGATAATT CCCCAGACCA TGCATTACTT TTGTCTTAGA AGGAAAAGTT 151 ATCCACGTGT TATGTTTGTA GGTACACAGC GTATACAACA GGTAACAAAT 201 GAACTCTGTC ACAGCAAGCA GCGCCAGCTA CTCACTTCAC ACAGCTGAAC 251 CGAACACCGA ACGCTCCCGT CACACACCGC GGGGGAAGGG GCTCTCCCCA 301 CCAACACCCA CTCGTCACTC GGGGTCCTGA CTGCCCACGC CTCATATTCA SEQ ID NO: 21 - EXB-NROB1502- 01 Homology with A Y033938: Bos taurus glucose carry 3 mRNA, complete cds. 7/2001 1 CTGTTTTAGG CGCCTATGTT TTCATCGTCT TCACTGTCTT CCTCGTTATC 51 TTCTGGGTCT TCACCTTCTT CAAAGTTCCT GAGACCCGTG GCAGGACTTT 101 TGAGGAAATT ACACGAGCCT TTGAAGGGCA GACGCAGACA GGAACCCGCG 151 GTGAGAAAGG CCCCATCATG GAGATGAACA GCATCCAGCC C SEQ ID NO: 22 - EXB NROA1648-01 Homology with NM_001629 Homo sapiens arachidonate 5- lipoxygenase-activating protein (ALOX5AP), mRNA. 4/2003 1 TGGGTGACAG GTCATTAGAT TTACAGCCTC TTTTAAATGG CTTCTAGGTA 51 TCGATTGGCT GAGCACACCC ACCCGGAATT CAGCAGAGAC TCAAGGGATG 101 AGAAGGAGAG GGGAGATGGT GGTAGTGACG GTCTTGATGT AGTTTTCAAA 151 GTCACTTCCG AAAAGGGCGA TGAAGAAATA GTTGAGTATC CCAGCGAGGG 201 ACATGGCAAA TAGGAACAGG ATAATGCGTT TCCCAAATAT GTTATTCAGG 251 CGTGCTCTGA GTTCTCTCCC CGAGGTAGCC GACAAAGTAC TTCTGCCTCA 301 CGA

Claims

A method for detecting the presence or risk of developing encephalopathy in a mammal, comprising determining the presence, in a biological sample of the mammal, of a target molecule selected from: a) a nucleic acid comprising a selected sequence from SEQ ID NO: 1 to 22 or a fragment thereof having at least 5, preferably 6, 7, 8, 9 or 10 consecutive bases, b) a nucleic acid having a sequence complementary to a sequence according to a) C) a functional analogue of a nucleic acid according to a) or b) from another species or a natural variant, or d) a polypeptide encoded by a nucleic acid according to a) to c), the presence of such a target molecule in the sample being an indication of the presence or risk of developing encephalopathy in that mammal.

The method of claim 1 comprising (simultaneous) determination of the presence of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more of the target molecules.

3. The method according to claim 1 or 2, comprising detecting the presence or absence of a nucleic acid according to a) to c) by selective hybridization or selective amplification.

The method of claim 1 or 2, comprising detecting the presence or absence of a polypeptide according to d) using a specific antibody or a fragment or derivative thereof.

The method of claim 1 for detecting the presence or risk of developing BSE in cattle, comprising determining the presence, in a biological sample of the bovine, of one or more target molecules selected from: a) a nucleic acid comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 22 or a fragment thereof having at least 5, preferably 6, 7, 8, 9 or 10 consecutive bases, b) a nucleic acid having a complementary sequence of a sequence according to a), c) a polypeptide encoded by a nucleic acid according to a) or b).

A method for detecting the presence or risk of developing BSE in cattle or sheep, comprising contacting a biological sample of the bovine or ovine containing nucleic acids with a product comprising a carrier on which is immobilized at at least one nucleic acid comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 22, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a sequence complementary thereto, and determining the profile of hybridization, the pattern indicating the presence or risk of developing BSE in cattle or sheep.

7. Use of a nucleic acid probe specific for a target nucleic acid as defined in claim 1, said probe comprising from 5 to 400 bases for the in vitro detection of encephalopathy in a subject.

8. Use of a nucleic primer allowing the amplification of all or part of a target nucleic acid as defined in claim 1, said primer being single-strand, of a length of between 5 and 50 bases, for the in vitro detection of encephalopathy in a subject.

9. Product comprising a support on which is immobilized at least one nucleic acid comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 22, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, a nucleic acid having a sequence complementary to those or a functional analogue thereof.

A product comprising a support on which is immobilized at least one polypeptide encoded by a nucleic acid comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 22, a fragment thereof having at least 15 consecutive bases, a nucleic acid having a complementary sequence thereof or a functional analogue thereof.

11. Kit comprising a compartment or container comprising at least one nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to 22, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, a nucleic acid having a sequence complementary to those ci or a functional analogue thereof.

12. Use of a nucleic acid comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 1-22, or a fragment thereof comprising at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a complementary sequence thereof, or a functional analogue thereof from another species or natural variant for the in vitro detection of encephalopathy in a mammalian subject.