FR2859998A1

FR2859998A1 - New graft copolymer containing sugar residues, useful as electrode coatings, in screening to identify ligands that bind sugars

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Publication number: FR2859998A1
Application number: FR0310956A
Authority: FR
Inventors: Thierry Livache; Pesce Karen Brengel; Emilie Mercey; Andre Roget; Rabia Sadir; Yves Levy; Jacob Hugues Lortat
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2003-09-18
Filing date: 2003-09-18
Publication date: 2005-03-25
Also published as: WO2005026219A1

Abstract

Graft copolymers (I) that contain sugar residues are new. Graft copolymers of formula (I) that contain sugar residues are new -[Ai(Li-Bi)]x-[Aj]y- (I) Ai and Ajelectrically polymerizable monomers, same or different at each occurrence; Biallose, altrose, arabinose, erythrose, fructose, galactose, glucose, gulose, idose, lyxose, mannose, psicose, ribulose, sorbose, tagatose, threose, talose, xylose, xylulose, monosaccharide derivatives such as acids, aminated (and optionally substituted) derivatives, 1-12C alkyl esters, alkyl ethers or 1-12C alkylamides, also polysaccharides containing at least two natural or synthetic monosaccharide residues and their derivatives, and the polysaccharides are optionally substituted by one or more of peptides, proteins, lipids, e.g. 8-30C fatty acids, steroids or their derivatives; Licovalent bond or spacer of formula -R1-[(CH2)n-R2]a-[(CH2)m-R3]b-(CH2)p-; n : 1-10; m and p : 0-10; a and b : 0-8; R1, R2 and R3CH2, O, S, NR', CO, CH=CH, NR'CO, CONR' or NHSO2; R' : hydrogen or 1-12C alkyl; x and y : integer at least 1; i : 1 to x; and j : 1 to y. proviso: not all of Ai and Aj can be p-phenylene-vinylene. Independent claims are also included for the following: (1) two methods for preparing (I); (2) electrode that includes one or more deposits of (I); and (3) screening method that comprises contacting the electrode of (2) with one or more potential ligands for the sugar.

Description

L'invention a pour objet des polymères greffés par des molécules chimiques synthétiques ou naturelles de type saccharidiques (mono, oligo ou polysaccharides et leurs dérivés) ainsi que leur procédé de préparation. Ces polymères permettent la fixation des molécules saccharidiques sur un support solide permettant le criblage de molécules, de complexes moléculaires ou de micro-organismes cibles mis en solution. The subject of the invention is polymers grafted with synthetic or natural chemical molecules of the saccharide type (mono, oligo or polysaccharides and their derivatives) as well as their method of preparation. These polymers allow the attachment of the saccharide molecules on a solid support allowing the screening of molecules, molecular complexes or target microorganisms in solution.

Le développement des technologies des puces à ADN a permis une avancée notable des programmes liés à la génomique fonctionnelle. En effet, la miniaturisation des techniques de dépôt ou de synthèse d'ADN a conduit à la réalisation d'analyses parallélisées, donc multiparamétriques, d'ADN sur les puces [Biochip Technologies ed. J. Cheng and LJ Kricka, Gordon, Breach/Harwood Académie publishers, (2001) ]. Plus récemment, l'émergence de la protéomique a donné naissance au concept de puces à protéines [Zhu and Snyder, Current Op. in Chem. Biol. 2003,7 : 55-63]. Celles-ci permettent l'analyse parallélisée d'interactions de type protéines/protéines ou plus généralement protéines/ligands. Auparavant, Ekins avait proposé des antibody microspot immunoassay permettant des analyses immunologiques simultanées sur un même support [Ekins, Tibtech march 1994, 12 : 89]. The development of microarray technologies has led to a significant advance in programs related to functional genomics. In fact, the miniaturization of DNA deposition or synthesis techniques has led to the realization of parallelized, hence multiparametric, DNA analyzes on chips [Biochip Technologies ed. J. Cheng and LJ Kricka, Gordon Breach / Harwood Academy publishers, (2001)]. More recently, the emergence of proteomics has given rise to the concept of protein chips [Zhu and Snyder, Current Op. Biol. 2003, 7: 55-63]. These allow the parallel analysis of protein-protein interactions or more generally proteins / ligands. Previously, Ekins had proposed microspot immunoassay antibodies allowing simultaneous immunological assays on the same support [Ekins, Tibtech march 1994, 12: 89].

De façon plus récente, la recherche en biologie s'est intéressé à la glycomique , c'est à dire à dire l'étude systématique des interactions carbohydrates/protéines. En effet, les glycoconjugés (c'est à dire toute molécule possédant un domaine de type glycane, comme les glycoprotéines, les glycolipides, les protéoglycanes, et plus généralement toute molécule contenant des carbohydrates ont un répertoire fonctionnel particulièrement large [voir par exemple Roseman J. Biol.Chem. More recently, research in biology has focused on glycomics, that is, the systematic study of carbohydrate / protein interactions. Indeed, glycoconjugates (that is to say any molecule having a glycan-type domain, such as glycoproteins, glycolipids, proteoglycans, and more generally any molecule containing carbohydrates have a particularly broad functional repertoire [see for example Roseman J. Biol.Chem.

2001,276,41527-41542 ou Essentials of Glycobiology. 1st ed. Varki, Ajit; Cummings, Richard ; Esko, Jeffrey ; Hudson ; Gerald ; Jamey, editors. Plainview (NY) : Cold Spring Harbor Laboratory Press; cl 999]. Chimiquement, ces carbohydrates sont des molécules constituées par l'assemblage de blocs monomériques simples. Ces assemblages peuvent être d'origine naturelle, et éventuellement fractionnés, ou d'origine synthétique. Les diverses fonctions des molécules appartenant à la famille des carbohydrates reposent sur la capacité des structures carbohydrates à interagir avec un très grand nombre de molécules. L'analyse des mécanismes de reconnaissance entre les carbohydrates et les autres molécules est un domaine de la recherche en pleine émergence. 2001,276,41527-41542 or Essentials of Glycobiology. 1st ed. Varki, Ajit; Cummings, Richard; Esko, Jeffrey; Hudson; Gerald; Jamey, editors. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; cl 999]. Chemically, these carbohydrates are molecules formed by the assembly of simple monomeric blocks. These assemblages can be of natural origin, and possibly fractionated, or of synthetic origin. The various functions of molecules belonging to the carbohydrate family rely on the ability of carbohydrate structures to interact with a very large number of molecules. The analysis of recognition mechanisms between carbohydrates and other molecules is a field of research in full emergence.

Elle devrait notamment permettre d'aboutir à la conception de nouvelles molécules In particular, it should lead to the design of new molecules

thérapeutiques et à une meilleure appréciation des risques toxicologiques de certaines molécules. A l'heure actuelle, il existe peu de méthodes systématiques permettant de produire des molécules saccharidiques. De ce fait, la détermination des caractéristiques structurales impliquées dans une interaction entre une molécule et un carbohydrate, ainsi que la caractérisation de l'interaction elle-même supposent d'entreprendre des travaux longs et fastidieux, souvent difficiles. therapeutics and a better appreciation of the toxicological risks of certain molecules. At present, there are few systematic methods for producing saccharide molecules. Therefore, the determination of the structural characteristics involved in an interaction between a molecule and a carbohydrate, as well as the characterization of the interaction itself, implies undertaking long and tedious work, often difficult.

Il serait donc utile, pour progresser dans la connaissance des mécanismes d'interaction entre des molécules de type saccharidique et leurs ligands, de pouvoir cribler des banques de molécules de type saccharidique vis à vis d'un ligand particulier. It would therefore be useful, in order to progress in the knowledge of the mechanisms of interaction between saccharide-type molecules and their ligands, to be able to screen libraries of saccharide-type molecules with respect to a particular ligand.

Les méthodes permettant l'étude d'interactions entre des molécules saccharidiques et d'autres molécules, comme par exemple des protéines, sont relativement limitées : Afin d'évaluer une interaction entre un sucre et une protéine, certains auteurs ont proposé l'utilisation de biocapteurs optiques basés sur la résonance plasmonique de surface (SPR), suivant le procédé Biacore [Ben Khalifa et al., Anal. Biochem., 2001, 293 :194- 203] ou sur une modulation d'une onde évanescente (procédé IASYS) [Kamei et al., Anal. Chem. 2001,295, 203-213]. Dans ces deux cas, ces méthodes d'analyse permettent d'obtenir des données fines d'affinité mais ne permettent pas une mise en parallèle des mesures de façon à permettre une analyse plus systématique et comparative des interactions sucres/protéines. Methods for studying interactions between saccharide molecules and other molecules, such as for example proteins, are relatively limited: In order to evaluate an interaction between a sugar and a protein, some authors have proposed the use of Optical biosensors based on surface plasmon resonance (SPR), according to the Biacore method [Ben Khalifa et al., Anal. Biochem., 2001, 293: 194-203] or on a modulation of an evanescent wave (IASYS method) [Kamei et al., Anal. Chem. 2001,295, 203-213]. In these two cases, these analytical methods make it possible to obtain fine affinity data but do not allow a parallelization of the measurements so as to allow a more systematic and comparative analysis of the sugar / protein interactions.

La fixation de polysaccharides différents sur une surface sous forme de spots, de façon à former une matrice, ou puce, qui permet d'étudier l'interaction de ces polysaccharides avec une protéine sur l'ensemble de cette surface a été décrite par différents auteurs. Ces substrats, nommés carbohydrate array ou oligosaccharide array constituent une évolution de la puce à protéines ou de la puce à ADN décrites cidessus. Ils permettent l'analyse parallélisée d'interactions entre des sucres et d'autres composés ou organismes. Plus précisément, la demande de brevet US 20020127599 décrit la fabrication d'une librairie de sucres complexes par une approche combinatoire incluant une étape enzymatique ; Wang et al., (Nature Biotech. 2002,20 : 275-281) et Fukui et al., (Nature Biotech. 2002, 20:1011-1017) décrivent tous deux des puces à sucres dans lesquelles les sucres sont simplement adsorbés sur un substrat de nitrocellulose, aucune réaction chimique n'étant nécessaire pour fabriquer la puce. Dans tous ces cas, la détection des interactions est réalisée par mesure de fluorescence. Une approche se fondant sur le greffage chimique a été développée par Houseman et al., (Chem. Biol. 2002,9 : 443). Fixing different polysaccharides on a surface in the form of spots, so as to form a matrix, or chip, which makes it possible to study the interaction of these polysaccharides with a protein on the whole of this surface has been described by various authors . These substrates, called carbohydrate array or oligosaccharide array constitute an evolution of the protein chip or the DNA chip described above. They allow the parallel analysis of interactions between sugars and other compounds or organisms. More specifically, the patent application US 20020127599 describes the manufacture of a library of complex sugars by a combinatorial approach including an enzymatic step; Wang et al., (Nature Biotech, 2002, 20: 275-281) and Fukui et al., (Nature Biotech, 2002, 20: 1011-1017) both describe sugar chips in which the sugars are simply adsorbed on a nitrocellulose substrate, no chemical reaction being necessary to manufacture the chip. In all these cases, the detection of the interactions is carried out by measuring fluorescence. An approach based on chemical grafting has been developed by Houseman et al., (Chem Biol., 2002, 9: 443).

Celle-ci consiste en une réaction de Diels et Aider entre un sucre modifié par un bras terminé par un groupe cyclopentadiène et une benzoquinone présente sur une couche autoassemblée déposée sur le substrat. Pour construire la matrice, des gouttelettes de différents sucres activés sont déposées sur le substrat et laissées 2 heures à 37 C afin que la réaction soit complète. Dans cet exemple, la détection est également réalisée par fluorescence. Une autre façon de réaliser des multi-capteurs à sucres a été décrite plus récemment [Smith et al., J. Am. Chem. Soc, 2003,125, 6140-6148] : elle consiste à fixer des sucres sur un substrat d'or portant une couche de thiols auto-assemblés. Les sucres sont préalablement modifiés par un thiol afin de former une liaison di-sulfure. Les temps de couplage entre le sucre modifié et le substrat étant très longs, la réaction est conduite dans des canaux moulés dans du polydiméthylsiloxane (PDMS), ce qui empêche toute évaporation. Les sucres sont donc déposés sous forme de 6 bandes parallèles espacées de lmm les unes des autres. La détection est alors réalisée par un procédé de SPR parallélisé. This consists of a Diels and Aider reaction between a cyclopentadiene-terminated arm modified sugar and a benzoquinone present on a self-assembled layer deposited on the substrate. To construct the matrix, droplets of various activated sugars are deposited on the substrate and left for 2 hours at 37 ° C. so that the reaction is complete. In this example, the detection is also carried out by fluorescence. Another way of making multi-sugar sensors has been described more recently [Smith et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 6140-6148]: it consists in fixing sugars on a gold substrate carrying a layer of self-assembled thiols. The sugars are previously modified with a thiol to form a di-sulfide bond. The coupling times between the modified sugar and the substrate being very long, the reaction is conducted in channels molded in polydimethylsiloxane (PDMS), which prevents any evaporation. The sugars are therefore deposited in the form of 6 parallel strips spaced 1mm apart from each other. The detection is then carried out by a parallelized SPR method.

Les procédés décrits ci-dessus pour la fabrication des puces à sucres ont plusieurs inconvénients : dans le procédé selon lequel les polysaccharides sont simplement adsorbés sur de la nitrocellulose, la fixation étant non spécifique, il sera difficile, voire impossible, d'immobiliser tous les sucres d'une façon identique surtout ceux dont la taille est petite. Or, pour étudier la relation structure/activité d'un échantillon de molécules, les mesures d'interactions avec des oligosaccharides très courts sont nécessaires. En outre, ce support est incompatible avec les méthodes permettant une détection sans traceur et en temps réel des interactions biologiques, notamment la technique SPR. Il n'est donc pas possible d'obtenir des données cinétiques à partir de cette technique. The processes described above for the manufacture of sugar chips have several disadvantages: in the method in which the polysaccharides are simply adsorbed on nitrocellulose, the fixing being nonspecific, it will be difficult, if not impossible, to immobilize all the sugars in an identical way especially those whose size is small. However, to study the structure / activity relationship of a sample of molecules, measurements of interactions with very short oligosaccharides are necessary. In addition, this support is incompatible with methods allowing detection without tracer and in real time biological interactions, in particular the SPR technique. It is therefore not possible to obtain kinetic data from this technique.

Les puces proposées par Houseman et al., ou Smith et al., permettent une fixation spécifique des oligosaccharides sur un substrat d'or bien adapté à une lecture en temps réel et sans traceur. Cependant, dans le premier cas, la fixation du sucre modifié fait intervenir une réaction chimique de couplage sur le substrat qui est très lente (2 heures à 37 C). Il est bien connu, dans le domaine des puces à ADN, que les problèmes liés au séchage des gouttelettes durant l'étape de greffage de la molécule biologique sur le substrat engendrent la formation de spots hétérogènes. Afin d'éviter ces problèmes de séchage, Smith et al., réalisent ces couplages dans des micro-canaux. Les temps de greffage sont là aussi extrêmement longs (12h) et conduisent à la formation, non pas de spots, mais de bandes parallèles. En outre, ces deux procédés supposent l'utilisation d'une couche autoassemblée de thiols dont la stabilité dans le temps est faible. Le procédé décrit par la The chips proposed by Houseman et al., Or Smith et al., Allow specific binding of the oligosaccharides on a gold substrate well adapted to a real-time and tracer-free reading. However, in the first case, the attachment of the modified sugar involves a chemical coupling reaction on the substrate which is very slow (2 hours at 37 C). It is well known in the field of DNA chips that the problems associated with the drying of the droplets during the step of grafting the biological molecule onto the substrate cause the formation of heterogeneous spots. In order to avoid these drying problems, Smith et al. Perform these couplings in micro-channels. The grafting times are also extremely long (12h) and lead to the formation, not of spots, but of parallel strips. In addition, these two methods involve the use of a self-assembled layer of thiols whose stability over time is low. The process described by

société Glycominds (demande de brevet américain US2002/0127599) est peu explicite et produit une réponse en fluorescence. Glycominds company (US patent application US2002 / 0127599) is not very explicit and produces a fluorescence response.

On a donc cherché à construire des puces à sucre de façon plus rapide et sur des substrats qui soient compatibles à la fois avec une lecture par fluorescence et avec des procédés optiques de type résonance plasmonique de façon à pouvoir réaliser des mesures en temps réel et à pouvoir mesurer la cinétique de l'interaction sucre/ligand. It has therefore been sought to build sugar chips more rapidly and on substrates that are compatible with both fluorescence readout and with plasmon resonance-type optical methods so that real-time measurements can be made. ability to measure the kinetics of the sugar / ligand interaction.

La solution à ce problème, qui fait l'objet de la présente invention, repose sur le greffage des sucres sur des polymères électropolymérisables. The solution to this problem, which is the subject of the present invention, is based on the grafting of sugars on electropolymerizable polymers.

On sait incorporer des molécules d'ADN directement lors de la synthèse d'un polymère conducteur comme le polypyrrole tout en gardant une bonne activité biologique [Shimidzu, Reactive polymers 1987, 6 :221-227 ou Wang et al.,. Anal. Chim. It is known to incorporate DNA molecules directly during the synthesis of a conductive polymer such as polypyrrole while maintaining a good biological activity [Shimidzu, Reactive polymers 1987, 6: 221-227 or Wang et al.,. Anal. Chim.

Acta 1999,402: 7-12]. De la même façon, des protéines peuvent être incorporées passivement dans des films de polymères conducteurs et garder une bonne activité [Umana et al., Anal. Chem ; 1986, 58:2979-2983 ou Hammerle et al., Sens. Actuat., 1992 , B6 :106-112]. Les procédés d'incorporation d'enzymes sont très utilisés dans le domaine des biocapteurs à glucose par exemple (immobilisation de la glucose oxydase). Acta 1999,402: 7-12]. In the same way, proteins can be passively incorporated into conductive polymer films and keep good activity [Umana et al., Anal. Chem; 1986, 58: 2979-2983 or Hammerle et al., Sens. Actu., 1992, B6: 106-112]. Enzyme incorporation methods are widely used in the field of glucose biosensors for example (immobilization of glucose oxidase).

Conformément à cet enseignement de l'art antérieur, nous avons donc essayé d'incorporer un oligosaccharide chargé (fragment d'héparane sulfate) dans une matrice de polymère (polypyrrole) puis de réaliser une reconnaissance spécifique grâce à une protéine adéquate et aucune réactivité n'a été détectée. In accordance with this teaching of the prior art, we have therefore tried to incorporate a charged oligosaccharide (heparan sulfate fragment) into a polymer matrix (polypyrrole) and then to achieve specific recognition by means of an adequate protein and no reactivity. has been detected.

Des polymères électropolymérisables greffés par des acides (poly) nucléiques sont déjà utilisés dans le domaine des puces à ADN et permettent le greffage ou la synthèse de brins d'ADN sur des surfaces solides. De tels polymères ont montré une bonne efficacité pour la préparation de supports de criblage de ligands d'acides polynucléiques (Livache et al.,. Nucleic Acids Res.1994, 22:2915-2921 ;W094/22889). Electropolymerizable polymers grafted with (poly) nucleic acids are already used in the field of DNA chips and allow grafting or synthesis of DNA strands on solid surfaces. Such polymers have shown good efficacy for the preparation of polynucleic acid ligand screening media (Livache et al., Nucleic Acids Res 1994, 22: 2915-2921, WO94 / 22889).

Toutefois, la chimie des saccharides est une chimie très différente de celle des acides nucléiques, et il n'était pas possible de prévoir, en se fondant sur les travaux concernant les polymères greffés par de l'ADN, que la synthèse par électropolymérisation de polymères greffés par des saccharides serait possible. En outre, le comportement des saccharides vis- à-vis de ligands potentiels est très différent de celui des molécules d'ADN vis-à-vis de leurs propres ligands : - le mécanisme de reconnaissance de l'ADN vis-à-vis de ses ligands (hybridation) est bien connu et correspond à des affinités fortes (>1015M-1) tandis que les However, saccharide chemistry is a very different chemistry from that of nucleic acids, and it was not possible to predict, based on work on DNA-grafted polymers, that polymer electropolymerization synthesis grafted with saccharides would be possible. In addition, the behavior of saccharides vis-à-vis potential ligands is very different from that of DNA molecules vis-à-vis their own ligands: - the mechanism of recognition of DNA vis-à-vis its ligands (hybridization) is well known and corresponds to strong affinities (> 1015M-1) while the

affinités des sucres pour leurs ligands protéiques par exemple sont faibles et variables (de 103 à 109M-1); - des interactions entre les saccharides (très hydrophiles) et le polymère support pourraient être du même ordre de grandeur et rendre l'analyse impossible ; - les essais réalisés sur des saccharides inclus dans une matrice de polypyrrole ont donné des résultats négatifs dans des tests de reconnaissance par des ligands tandis que des acides polynucléiques ou des protéines, dans les mêmes conditions, peuvent s'associer à leurs ligands. The affinities of sugars for their protein ligands for example are low and variable (from 103 to 109M-1); interactions between the saccharides (very hydrophilic) and the support polymer could be of the same order of magnitude and make the analysis impossible; the tests carried out on saccharides included in a polypyrrole matrix gave negative results in recognition tests by ligands whereas polynucleic acids or proteins, under the same conditions, can associate with their ligands.

La présente invention a donc pour objet des polymères constitués de monomères électropolymérisables greffés par des saccharides. The present invention therefore relates to polymers consisting of electropolymerizable monomers grafted with saccharides.

Les polymères de l'invention répondent à la formule générale (I) suivante :

dans laquelle : - A, et Aj représentent chacun un monomère électriquement polymérisable, les différents Ai et Aj pouvant être identiques ou différents ; - Bi représente un carbohydrate qui peut être choisi parmi : un monosaccharide, un oligosaccharide, un polysaccharide naturel ou synthétique, ou un de leurs dérivés naturel ou synthétique ; - Li représente une liaison covalente ou un bras espaceur reliant le monomère A; au groupement B; ; - x représente un nombre entier supérieur ou égal à 1 ; - i est un indice variant de 1 à x ; - y représente un nombre entier supérieur ou égal à 0 ; - j est un indice variant de 1 à y lorsque y # 0. The polymers of the invention have the following general formula (I):

wherein: - A, and Aj each represent an electrically polymerizable monomer, the different Ai and Aj may be the same or different; - Bi represents a carbohydrate which may be chosen from: a monosaccharide, an oligosaccharide, a natural or synthetic polysaccharide, or a natural or synthetic derivative thereof; Li represents a covalent bond or a spacer arm connecting the monomer A; group B; ; x represents an integer greater than or equal to 1; i is an index varying from 1 to x; y represents an integer greater than or equal to 0; - j is an index varying from 1 to y when y # 0.

Parmi les monomères A; et Aj électropolymérisables on peut citer l'acétylène, les acrylonitriles, le p-phénylène, le p-phénylène vinylène, le pyrène, le Among the monomers A; and Aj electropolymerizable include acetylene, acrylonitriles, p-phenylene, p-phenylene vinylene, pyrene,

pyrrole, le thiophène, le furanne, le sélénophène, la pyridazine, le carbazole, l'aniline, le phénol et leurs dérivés, comme par exemple les pyrroles substitués en position 1 ou 3. pyrrole, thiophene, furan, selenophene, pyridazine, carbazole, aniline, phenol and their derivatives, such as, for example, substituted 1 or 3 pyrroles.

Avantageusement, Ai et Aj sont choisis parmi le pyrrole et les dérivés substitués du pyrrole tels que par exemple le N-méthylpyrrole et le N-cyano-éthylpyrrole. Advantageously, Al and Aj are chosen from pyrrole and substituted pyrrole derivatives such as, for example, N-methylpyrrole and N-cyanoethylpyrrole.

Préférentiellement A, et Aj sont tous identiques. Preferably A, and Aj are all identical.

Selon la présente invention, les groupements carbohydrates Bi peuvent être choisis parmi ceux décrits par exemple dans l'ouvrage "Essentials of Glycobiology". According to the present invention, the carbohydrate groups Bi can be chosen from those described for example in the book "Essentials of Glycobiology".

Ist ed. Varki, Ajit ; Richard ; Jeffrey ; Hudson ; Gerald; Marth, Jamey, editors. Plainview (NY) : Cold Spring Harbor Laboratory Press; cl 999. Ist ed. Varki, Ajit; Richard; Jeffrey; Hudson; Gerald; Marth, Jamey, editors. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; cl 999.

Bi peut être choisi parmi les monosaccharides naturels suivants : allose, altrose, arabinose, érythrose, fructose, galactose, glucose, gulose, idose, lyxose, mannose, psicose, ribulose, sorbose, tagatose, thréose, talose, xylose, xylulose. Il peut être choisi parmi les dérivés de ces monosaccharides naturels. Parmi ceux-ci on peut citer les dérivés acides, comme par exemple l'acide glucuronique et l'acide iduronique ; dérivés aminés comme par exemple la glucosamine ; dérivés aminés substitués comme par exemple la glucosamine N-acétylée, la glucosamine N-sulfatée et la glucosamine O-sulfatée ; les dérivés alkyl esters en CI-C]2 ; les dérivés alkyl éthers en Ci -Ci 2 ; les dérivés alkyl amides en CI-CI2. Bi peut être un polysaccharide comportant au moins deux unités choisies parmi les monosaccharides naturels ou synthétiques et leurs dérivés, comme par exemple ceux cités ci-dessus. Dans ce cas, Bi peut être un homosaccharide ou un hétérosaccharide, il peut être linéaire ou ramifié. B, peut également être choisi parmi les polysaccharides tels que définis ci-dessus, substitués par au moins un groupement choisi parmi : les peptides, les protéines, les lipides, comme par exemple les acides gras en C8-C30, les stéroïdes et leurs dérivés. B, peut être un composé de synthèse ou un produit naturel obtenu par extraction à partir d'une source animale ou végétale. Bi may be selected from the following natural monosaccharides: allose, altrose, arabinose, erythrose, fructose, galactose, glucose, gulose, idose, lyxose, mannose, psicose, ribulose, sorbose, tagatose, threose, talose, xylose, xylulose. It can be chosen from the derivatives of these natural monosaccharides. Among these, mention may be made of acid derivatives, such as, for example, glucuronic acid and iduronic acid; amino derivatives such as glucosamine; substituted amino derivatives such as, for example, N-acetylated glucosamine, N-sulfated glucosamine and O-sulfated glucosamine; C 1 -C 2 alkyl ester derivatives; C1-C12 alkyl ether derivatives; the C 1 -C 2 alkyl amide derivatives. Bi may be a polysaccharide comprising at least two units chosen from natural or synthetic monosaccharides and their derivatives, such as those mentioned above. In this case, Bi can be a homosaccharide or a heterosaccharide, it can be linear or branched. B may also be chosen from polysaccharides as defined above, substituted with at least one group chosen from: peptides, proteins, lipids, such as, for example, C8-C30 fatty acids, steroids and their derivatives . B may be a synthetic compound or a natural product obtained by extraction from an animal or plant source.

Dans le polymère de l'invention, on peut prévoir que tous les groupements Bi soient identiques ou que plusieurs groupements B, distincts soient présents. Préférentiellement, pour faire un criblage de ligands potentiels, on choisit de préparer un polymère dans lequel plusieurs groupements Bi distincts sont présents. In the polymer of the invention, it can be provided that all the groups Bi are identical or that several groups B, distinct are present. Preferably, for screening potential ligands, it is chosen to prepare a polymer in which several distinct Bi groups are present.

Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention le rapport x/y est compris entre 1/1 et 1/ 1 000 000, préférentiellement entre 1/10 et 1/100 000, et encore plus préférentiellement entre 1/20 et 1/50 000. According to a preferred embodiment of the present invention the ratio x / y is between 1/1 and 1 / 1,000,000, preferably between 1/10 and 1/100 000, and even more preferably between 1/20 and 1 / 50,000.

Selon l'invention, Lj représente une liaison covalente entre A, et B, ou un bras espaceur reliant ces deux groupements. According to the invention, Lj represents a covalent bond between A and B, or a spacer arm connecting these two groups.

Lorsque Li représente un bras espaceur, avantageusement, il est choisi parmi les groupements répondant à la formule (II) : -R1- [ (CH2)n-R2 ]a- [(CH2)m-R3 ]b- (CH2)p- (II) dans laquelle : - n est un nombre entier allant de 1 à 10 ; - m est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 10 ; - p est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 10 ; - a est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 8 ; - b est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 8 ; - RI, R2 et R3 qui peuvent être identiques ou différents représentent un groupement choisi parmi : - CH2- ; -O- ; -S- ; -NR'- ; -CO- ; -CH=CH- ; -NR'C(O)-; -C(O)N(R')- ; NHS(02)- et R' représente un atome d'hydrogène ou une chaîne alkyle en Ci à C12. When Li represents a spacer arm, advantageously, it is chosen from the groups corresponding to formula (II): -R1- [(CH2) n -R2] a- [(CH2) m -R3] b- (CH2) p - (II) wherein: n is an integer from 1 to 10; m is 0 or is an integer from 1 to 10; p is 0 or is an integer from 1 to 10; - a is equal to 0 or is an integer ranging from 1 to 8; b is 0 or is an integer from 1 to 8; - RI, R2 and R3 which may be identical or different represent a group chosen from: - CH2-; -O-; -S-; -NR'-; -CO-; -CH = CH-; -NR'C (O) -; -C (O) N (R ') -; NHS (O 2) - and R 'represents a hydrogen atom or a C 1 -C 12 alkyl chain.

Au sens de la présente invention, le mot alkyle signifie une chaîne hydrogénocarbonée linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée. For the purposes of the present invention, the word alkyl signifies a linear, branched or cyclic, saturated or unsaturated hydrogenated carbonate chain.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un polymère de formule générale (I). The present invention also relates to a process for preparing a polymer of general formula (I).

Selon une première variante, ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - une première étape au cours de laquelle on procède à la préparation d'un copolymère de formule générale (III) : - [Ai*]x-[Aj]y- (III) dans laquelle Aj, x et y sont tels que définis précédemment , et Ai* représente un groupement A, comportant une fonction désignée *. According to a first variant, this process is characterized in that it comprises at least the following steps: a first step during which the preparation of a copolymer of general formula (III) is carried out: [Ai *] x- [Aj] y- (III) wherein Aj, x and y are as defined above, and Ai * represents a group A, having a function designated *.

- une deuxième étape au cours de laquelle on procède à la fixation, sur le polymère de formule (III) d'au moins un groupement de formule générale (IV) :

* *L,-B, (IV) a second step during which the polymer of formula (III) is attached to at least one group of general formula (IV):

* * L, -B, (IV)

dans laquelle B, est tel que défini précédemment et **L, représente un groupement L, porteur d'une fonction ** susceptible de réagir avec la fonction * de Ai pour former une liaison covalente Li-Ai. wherein B, is as defined above and ** L, represents a group L, carrying a function ** capable of reacting with the function * of Ai to form a covalent Li-Ai bond.

Selon une autre variante de l'invention, le procédé de préparation d'un polymère de formule générale (I) est caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - une première étape au cours de laquelle on procède à la préparation du composé de formule générale (V) :

dans laquelle A,, B,, et L; sont tels que définis ci-dessus, - une seconde étape au cours de laquelle on procède à la copolymérisation du composé (V) avec le monomère Aj tel que défini ci-dessus. According to another variant of the invention, the process for preparing a polymer of general formula (I) is characterized in that it comprises at least the following stages: a first stage during which the preparation is carried out of the compound of general formula (V):

wherein A ,, B ,, and L; are as defined above, - a second step during which the copolymerization of the compound (V) is carried out with the monomer A d as defined above.

Selon l'invention, au moins une étape de l'une ou l'autre des variantes du procédé conforme à l'invention fait intervenir au moins une réaction électrochimique. Cette copolymérisation électrochimique est avantageusement effectuée en surface d'une électrode ; en fin de réaction on obtient de la sorte une électrode dont la surface est partiellement ou totalement recouverte par un polymère conforme à l'invention. According to the invention, at least one step of one or other of the variants of the process according to the invention involves at least one electrochemical reaction. This electrochemical copolymerization is advantageously carried out on the surface of an electrode; at the end of the reaction, an electrode is obtained in this way, the surface of which is partially or completely covered by a polymer according to the invention.

Par exemple, pour la mise en oeuvre de la première variante du procédé conforme à l'invention, l'étape de préparation du copolymère de formule générale (III) et/ou l'étape de fixation du groupe de formule générale (IV) peuvent être effectuées par réaction électrochimique ; dans la seconde variante, la seconde étape est avantageusement effectuée par copolymérisation électrochimique du compose (V) avec les monomères Aj. For example, for carrying out the first variant of the process according to the invention, the step of preparing the copolymer of general formula (III) and / or the step of fixing the group of general formula (IV) may be performed by electrochemical reaction; in the second variant, the second step is advantageously carried out by electrochemical copolymerization of the compound (V) with the monomers Aj.

Le groupe (V) peut être fabriqué en couplant B, à un bras L, et un groupement polymérisable Ai. Préférentiellement, cette réaction peut être conduite sur l'extrémité réductrice du sucre Bi ou sur un autre groupement fonctionnel de B, lorsque celle-ci est bloquée comme c'est le cas pour de nombreux analogues synthétiques des saccharides. The group (V) can be manufactured by coupling B to an arm L and a polymerizable group Ai. Preferably, this reaction can be carried out on the reducing end of the sugar Bi or on another functional group of B, when this is blocked, as is the case for many synthetic analogues of the saccharides.

La copolymérisation électrochimique du mélange est par exemple effectuée en soumettant un mélange de monomères, comme par exemple le mélange [(V)/ Aj], durant une durée déterminée à un ou plusieurs sauts de potentiel de valeur suffisante pour provoquer la polymérisation par une oxydation ou une réduction des espèces monomériques présentes en solution. D'autres méthodes classiques en électrochimie telles que la voltampérométrie cyclique ou la chronopotentiométrie peuvent également être utilisées pour la fabrication des polymères décrits dans l'invention. L'adressage de ces réactions électrochimiques sur le substrat peut être assuré par différents moyens tels que des réseaux de microélectrodes ou par des réactions électrochimiques localisées telles que celles décrites plus loin. The electrochemical copolymerization of the mixture is, for example, carried out by subjecting a mixture of monomers, such as for example the [(V) / Aj] mixture, for a determined period of time to one or more potential jumps of sufficient value to cause the polymerization by oxidation. or a reduction of the monomeric species present in solution. Other conventional methods in electrochemistry such as cyclic voltammetry or chronopotentiometry can also be used for the manufacture of the polymers described in the invention. The addressing of these electrochemical reactions on the substrate can be provided by various means such as microelectrode arrays or by localized electrochemical reactions such as those described below.

De façon avantageuse l'électrode employée pour la réaction de polymérisation est susceptible d'être utilisée ultérieurement dans un procédé d'imagerie par résonance des plasmons de surface. Elle peut être constituée de n'importe quel matériau conducteur (métallique, semi-conducteur, plastique ou polymère conducteur) déposé ou non sur un support solide. Il peut, par exemple, s'agir d'électrodes métalliques ou de verre recouvertes par une couche d'or. Parmi les électrodes disponibles commercialement, on peut citer par exemple : les plaques commercialisées par la société Biacore sous la référence 99-1000-01. Advantageously the electrode employed for the polymerization reaction is likely to be used later in a surface plasmon resonance imaging method. It can be made of any conductive material (metal, semiconductor, plastic or conductive polymer) deposited or not on a solid support. It may, for example, be metal electrodes or glass covered by a layer of gold. Among the commercially available electrodes, there may be mentioned for example: the plates marketed by the company Biacore under the reference 99-1000-01.

La qualité du dépôt peut être contrôlée par le choix des conditions expérimentales : le rapport des monomères A, et Aj ou des monomères

-AI- Li bl et Aj en solution permet par exemple de moduler les densités de greffage de saccharides sur le polymère. The quality of the deposit can be controlled by the choice of the experimental conditions: the ratio of the monomers A, and Aj or monomers

For example, Li-Li bl and Aj in solution makes it possible to modulate the saccharide grafting densities on the polymer.

La méthode et les conditions électrochimiques permettent par exemple de modifier l'épaisseur et/ou la structure du film formé à la surface de l'électrode. De plus, lorsque le courant électrique nécessaire à la formation du polymère est contrôlé, il permet de mesurer et éventuellement de limiter l'épaisseur du film formé. The electrochemical method and conditions make it possible, for example, to modify the thickness and / or the structure of the film formed on the surface of the electrode. In addition, when the electric current necessary for the formation of the polymer is controlled, it makes it possible to measure and possibly to limit the thickness of the film formed.

Avantageusement, on peut associer plusieurs copolymères portant des sucres éventuellement différents sur une ou plusieurs électrodes. Les formats électrochimiques utilisés pour fonctionnaliser électrochimiquement plusieurs points sont déjà décrits dans la littérature. Lorsque l'on utilise des réseaux de (micro) électrodes Advantageously, one can associate several copolymers carrying possibly different sugars on one or more electrodes. The electrochemical formats used to electrochemically functionalize several points are already described in the literature. When using (micro) electrode networks

indépendantes les unes des autres, il est facile d'activer successivement les différentes électrodes en présence des différentes solutions dans lesquelles elles sont immergées successivement [solution du composé (V) ou du composé Ai ou du composé Aj]. De tels réseaux d'électrodes ont déjà été décrits [Fiaccabrino et al., Sensors and Actuators 1994, B19, 675 ; Heller et al., DNA Microarrays. A Practical Approach; 1999 Oxford Press: New York, Livache et al., Biosensors & Bioelectronics 1998, 13, 629]. Ainsi, un schéma de construction des polymères déposés sur chaque point du support peut être construit. Une autre façon de procéder consiste par exemple à utiliser la méthode électrospot [Brevet WO 00/47317] permettant de synthétiser successivement et électrochimiquement des dépôts ponctuels de polymères sur des surfaces d'électrodes non structurées. Dans ce cas, une électrode peut porter plusieurs dépôts ponctuels de copolymères (I) éventuellement différents. independent of each other, it is easy to activate successively the different electrodes in the presence of the different solutions in which they are successively immersed [solution of the compound (V) or the compound Ai or compound Aj]. Such arrays of electrodes have already been described [Fiaccabrino et al., Sensors and Actuators 1994, B19, 675; Heller et al., DNA Microarrays. A Practical Approach; 1999 Oxford Press: New York, Livache et al., Biosensors & Bioelectronics 1998, 13, 629]. Thus, a construction scheme of the polymers deposited on each point of the support can be constructed. Another way of proceeding consists for example in using the electrospot method [Patent WO 00/47317] for sequentially and electrochemically synthesizing point deposits of polymers on unstructured electrode surfaces. In this case, an electrode may carry several point deposits of copolymers (I) possibly different.

Dans ce cas, on obtient un support comportant des dépôts de polymères répartis sous forme de matrice ou puce, ces polymères comportant chacun un ou des sucres fixés de façon covalente au dit polymère. Cette puce peut être utilisée pour des essais biologiques faisant intervenir une reconnaissance entre un ou des sucres et un ou plusieurs ligands potentiels. Par ligand on entend toute molécule susceptible de présenter une affinité pour les sucres greffés sur le polymère. Notamment, le criblage de banques de molécules, de peptides, de protéines, de microorganismes, d'extraits de toute nature, comme des cellules, des broyats de tissus peuvent être envisagés par cette méthode. L'interaction avec les saccharides greffés sur le (co)polymère pourra être détectée au moyen de traceurs fluorescents ou directement par voie optique, par l'imagerie par résonance des plasmons de surface ou par toute méthode d'analyse d'affinité connue de l'homme du métier. In this case, a support is obtained comprising deposits of polymers distributed in matrix or chip form, these polymers each comprising one or more sugars covalently attached to said polymer. This chip can be used for biological assays involving recognition between one or more sugars and one or more potential ligands. By ligand is meant any molecule likely to have an affinity for sugars grafted onto the polymer. In particular, the screening of libraries of molecules, peptides, proteins, microorganisms, extracts of any kind, such as cells, tissue grinds can be envisaged by this method. The interaction with the saccharide grafted onto the (co) polymer may be detected by means of fluorescent tracers or directly optically, by resonance imaging of the surface plasmons or by any known affinity analysis method. skilled person.

L'invention a donc également pour objet un support sous forme d'une électrode comportant un ou plusieurs dépôts d'au moins un polymère greffé par un ou des saccharides et répondant à la formule (I). De préférence cette électrode a la forme d'une plaque. Avantageusement, elle est utilisable dans un procédé d'imagerie par résonance des plasmons de surface. The subject of the invention is therefore also a support in the form of an electrode comprising one or more deposits of at least one polymer grafted with one or more saccharides and corresponding to formula (I). This electrode is preferably in the form of a plate. Advantageously, it can be used in a surface plasmon resonance imaging method.

A titre d'exemple non limitatif illustrant ce qui précède un copolymère (polypyrrole portant des oligosaccharides) peut être obtenu :
1- par réaction chimique entre un polypyrrole activé (portant par exemple une fonction hydrazide liée au polymère électrosynthétisé par un bras espaceur) et un oligosaccharide (réaction sur l'extrémité réductrice) ; By way of nonlimiting example illustrating the above a copolymer (polypyrrole carrying oligosaccharides) can be obtained:
By chemical reaction between an activated polypyrrole (carrying for example a hydrazide function bonded to the polymer electrosynthesized by a spacer arm) and an oligosaccharide (reaction on the reducing end);

2- par copolymérisation électrochimique du pyrrole avec un oligosaccharide portant un bras espaceur puis un noyau pyrrole. 2- by electrochemical copolymerization of pyrrole with an oligosaccharide carrying a spacer arm and a pyrrole ring.

Ce procédé de greffage de carbohydrates sur des surfaces conductrices apporte des avantages par rapport aux techniques utilisées dans le domaine des puces à sucres de l'art antérieur. Parmi ceux ci, on peut citer la rapidité de la réaction électrochimique de couplage qui conduit à une fixation covalente du carbohydrate sur le polymère : elle dure moins d'une seconde dans le procédé de l'invention contre plusieurs heures dans les autres procédés cités. This method of grafting carbohydrates on conductive surfaces provides advantages over techniques used in the field of sugar chips of the prior art. Among these, mention may be made of the rapidity of the electrochemical coupling reaction which leads to a covalent attachment of the carbohydrate to the polymer: it lasts less than one second in the process of the invention against several hours in the other processes mentioned.

On peut également mentionner la facilité du contrôle de l'épaisseur du film qui, grâce au procédé de l'invention, peut être réduite à quelques nanomètres, ce qui est primordial lors de l'utilisation de méthodes optiques directes telle que l'imagerie SPR. We can also mention the ease of controlling the thickness of the film which, thanks to the method of the invention, can be reduced to a few nanometers, which is essential when using direct optical methods such as SPR imaging. .

Cette épaisseur peut être augmentée jusqu'à plusieurs m si nécessaire. This thickness can be increased to several meters if necessary.

La résolution spatiale du dépôt obtenu peut être excellente (quelques m) lorsque des réseaux de microélectrodes sont utilisés. The spatial resolution of the deposit obtained can be excellent (a few m) when microelectrode arrays are used.

Les copolymères (I) obtenus sont chimiquement très stables et peuvent être deshydratés en vue de leur stockage ; de plus lors d'une utilisation pour réaliser une analyse biologique, ils peuvent être régénérés dans la limite de la stabilité des sucres greffés. On peut par conséquent envisager de préparer un stock de puces ou supports selon l'invention portant des dépôts de polymères de formule (I), les conserver pendant un certain temps et les utiliser lorsqu'on le souhaite. The copolymers (I) obtained are chemically very stable and can be dehydrated for storage; moreover, when used to perform a biological analysis, they can be regenerated within the limit of the stability of the grafted sugars. It can therefore be envisaged to prepare a stock of chips or supports according to the invention bearing polymer deposits of formula (I), to preserve them for a certain time and to use them when desired.

Par ailleurs, les supports ou puces selon la présente invention sont les premiers substrats de criblage compatibles avec une lecture en temps réel et sans traceur comme par exemple en imagerie SPR. C'est un avantage fondamental lorsque des études fines d'interactions doivent être conduites ; l'utilisation de molécules marquées par des traceurs fluorescents qui, par définition, modifient les propriétés des molécules cibles étudiées, ne permettent pas d'obtenir des informations objectives satisfaisantes. De plus, la connaissance du comportement cinétique de l'interaction permet également de caractériser les mécanismes mis en jeu au court des phénomènes de reconnaissance [Moulard et al., J. Moreover, the supports or chips according to the present invention are the first screening substrates compatible with a real-time and tracer-free reading, for example in SPR imaging. This is a fundamental benefit when fine interaction studies need to be conducted; the use of molecules labeled with fluorescent tracers which, by definition, modify the properties of the target molecules studied, do not make it possible to obtain satisfactory objective information. In addition, the knowledge of the kinetic behavior of the interaction also makes it possible to characterize the mechanisms involved during short recognition phenomena [Moulard et al., J.

Virol. 2000,74, 1948-1960, Vives et al., Biochemistry 2002,41, 14779-14789] et cette capacité de parallélisation des mesures permet la comparaison des différents comportements observés. Elle permet de définir le profil de ligands potentiels d'une cible donnée. Virol. 2000, 74, 1948-1960, Vives et al., Biochemistry 2002, 41, 14779-14789] and this capacity of parallelization of the measurements makes it possible to compare the various observed behaviors. It allows to define the profile of potential ligands of a given target.

L'invention a donc en outre pour objet un procédé de criblage de ligands caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'un support matriciel ou puce greffé par des saccharides tel que décrit ci-dessus avec un ou plusieurs ligands potentiels. Cette mise en contact peut consister par exemple en une immersion d'un support tel que décrit ci-dessus dans une solution comprenant un ou plusieurs ligands potentiels. The invention therefore also relates to a method for screening ligands, characterized in that it comprises contacting a matrix support or saccharide-grafted chip as described above with one or more potential ligands. This bringing into contact may consist, for example, in immersing a support as described above in a solution comprising one or more potential ligands.

PARTIE EXPÉRIMENTALE :
Les essais décrits ci-dessous illustrent la fabrication de puces greffées par des glycosaminoglycanes. EXPERIMENTAL PART :
The tests described below illustrate the manufacture of chips grafted with glycosaminoglycans.

Figures :
La figure 1 illustre une chromatographie de filtration sur gel d'un mélange d'oligosaccharides issus de la digestion d'héparine par de l'héparinase. Figures:
FIG. 1 illustrates gel filtration chromatography of a mixture of oligosaccharides derived from the heparin digestion with heparinase.

La figure 2 illustre une chromatographie de filtration sur gel d'un mélange d'oligosaccharides issus de la digestion d'héparane sulfate par de l'héparinase. FIG. 2 illustrates gel filtration chromatography of a mixture of oligosaccharides derived from the heparan sulfate digestion with heparinase.

La figure 3 illustre les différentes étapes de la révélation en fluorescence. Figure 3 illustrates the different stages of fluorescence revelation.

La figure 4 illustre l'analyse par fluorescence de l'affinité de sucres greffés sur des polypyrroles pour le SDF. Photo de gauche : photo de la lame au microscope exposée 0,52s ; droite : schéma de composition de la lame. Figure 4 illustrates the fluorescence analysis of the affinity of sugars grafted on polypyrroles for SDF. Photo left: photo of the slide with exposed microscope 0.52s; right: diagram of composition of the blade.

La figure 5 illustre le principe de fonctionnement de l'imagerie SPR. Figure 5 illustrates the operating principle of SPR imaging.

La figure 6 illustre le schéma de dépôt de polymère greffé par des sucres et sa visualisation en imagerie SPR. FIG. 6 illustrates the pattern of deposit of polymer grafted with sugars and its visualization in SPR imaging.

La figure 7 représente les courbes cinétiques brutes d'interaction entre les polymères greffés par des saccharides et le SDF. Figure 7 shows the gross kinetic curves of interaction between saccharide-grafted polymers and SDF.

La figure 8 représente la matrice visualisée en imagerie SPR. FIG. 8 represents the matrix visualized in SPR imaging.

La figure 9 représente des pourcentages de réflexivité avant rinçage. Figure 9 shows percentages of reflexivity before rinsing.

La figure 10 représente des pourcentages de réflexivité après rinçage. Figure 10 shows percentages of reflexivity after rinsing.

A : PREPARATION DES OLIGOSACCHARIDES
1-Préparation d'oligosaccharides dérivés d'héparine. A: PREPARATION OF OLIGOSACCHARIDES
1-Preparation of Oligosaccharides Derived from Heparin

On procède de deux manières possibles (enzymatique ou chimique): a- Traitement enzymatique:
Six grammes d'héparine sont solubilisés dans un tampon contenant 5 mM de TRIS, 2 mM de CaCl2, 50 mM de NaCl et 0,1 mg/ml d'albumine. Le pH est ajusté à 7,5 avec de l'acide acétique. Cette solution est incubée à 25 C, avec de l'héparinase 1 (8 There are two possible ways (enzymatic or chemical): a- enzymatic treatment:
Six grams of heparin are solubilized in a buffer containing 5 mM TRIS, 2 mM CaCl2, 50 mM NaCl and 0.1 mg / ml albumin. The pH is adjusted to 7.5 with acetic acid. This solution is incubated at 25 ° C. with heparinase 1 (8

mU/ml) pendant environ 50h. (la réaction enzymatique est suivie par l'augmentation de la densité optique, mesurée à 232 nm). mU / ml) for about 50h. (The enzymatic reaction is followed by the increase in optical density, measured at 232 nm).

Le mélange est ensuite purifié par chromatographie de filtration sur gel comme illustré sur la figure 1. La phase solide est du Biogel P10, contenue dans une colonne de lm50 et 4,4 cm de diamètre, éluée à 1 ml/min avec du NaCl 0,25M. The mixture is then purified by gel filtration chromatography as illustrated in FIG. 1. The solid phase is Biogel P10, contained in a column of 1.50 cm and 4.4 cm in diameter, eluted at 1 ml / min with 0 NaCl. , 25M.

Les différents oligosaccharides obtenus (dp2, dp4, ...etc) sont dialysés contre de l'eau puis lyophilisés. (dp = degré de polymérisation). Les fractions dpl2 et HP6 (c'est-à-dire héparine de 6kDa de masse moléculaire, soit un dp d'environ 24) sont utilisées par la suite. The various oligosaccharides obtained (dp2, dp4, etc.) are dialyzed against water and then lyophilized. (dp = degree of polymerization). The fractions dp12 and HP6 (that is, heparin of 6kDa molecular weight, ie dp of about 24) are used subsequently.

Chaque groupe de molécules (dp) est ensuite sous-fractionné par chromatographie d'échange d'ions, sur une colonne Propac PA1, commercialisée sous la marque Dionex, référence 40137. b- Traitement chimique:
Un gramme d'héparine est solubilisé dans 20 ml de nitrite de sodium (NaN02) à 2,1 mg/ml. La solution est ajustée à pH 1,5 avec de l'acide sulfurique, puis incubée à 4 C pendant 3h. La réaction est arrêtée, et les oligosaccharides sont purifiés comme ci dessus. Each group of molecules (dp) is then subfractionated by ion exchange chromatography, on a Propac PA1 column, sold under the trademark Dionex, reference 40137. b- Chemical treatment:
One gram of heparin is solubilized in 20 ml of sodium nitrite (NaNO 2) at 2.1 mg / ml. The solution is adjusted to pH 1.5 with sulfuric acid and incubated at 4 ° C. for 3 h. The reaction is stopped, and the oligosaccharides are purified as above.

2-Préparation d'oligosaccharides dérivés d'héparane sulfate
Lorsque le matériel de départ est de l'héparane sulfate, on procède de la façon suivante:
Huit grammes d'héparane sulfate sont solubilisés dans 40 ml contenant 5 mM de TRIS, 2 mM de CaCl2, 50 mM de NaCI et 0,1 mg/ml d'albumine. Le pH est ajusté à 7,5 avec de l'acide acétique. Cette solution est incubée à 30 C, avec de l'héparinase III (25 mU/ml) pendant environ 72h. De héparinase III est ajoutée à nouveau, pour une période de 48 h, puis les produits sont purifiés comme décrit ci dessus. Le profil chromatographique est illustré par la figure 2. 2-Preparation of oligosaccharides derived from heparan sulfate
When the starting material is heparan sulfate, the procedure is as follows:
Eight grams of heparan sulfate are solubilized in 40 ml containing 5 mM TRIS, 2 mM CaCl 2, 50 mM NaCl and 0.1 mg / ml albumin. The pH is adjusted to 7.5 with acetic acid. This solution is incubated at 30 ° C. with heparinase III (25 mU / ml) for approximately 72 hours. Heparinase III is added again for a period of 48 hours and then the products are purified as described above. The chromatographic profile is illustrated in FIG.

B MODIFICATION DES OLIGOSACCHARIDES
Les oligosaccharides sont greffés sur des groupements pyrroles avec des bras de longueur et composition variables sur leur extrémité réductrice selon le protocole suivant B MODIFICATION OF OLIGOSACCHARIDES
The oligosaccharides are grafted onto pyrrole groups with arms of variable length and composition on their reducing end according to the following protocol

1. Synthèse des monomères pyrrole fonctionnalisés
Cette synthèse se fait en plusieurs étapes, dont la plus importante est le couplage de l'ester activé sur le groupe hydrazide de l'adipate ou sur le groupe hydrazine seul. Cette synthèse est illustrée par le schéma 1 ci-dessous :

1. Synthesis of functionalized pyrrole monomers
This synthesis is done in several steps, the most important of which is the coupling of the activated ester to the hydrazide group of adipate or to the hydrazine group alone. This synthesis is illustrated in Figure 1 below:

a Synthèse des pyrrole-acides Acide 5-pyrrolyl-caproïque (I) :

Synthesis of pyrrole-acids 5-pyrrolyl-caproic acid (I):

Dans un ballon muni d'un réfrigérant, on additionne le 2,5-diméthoxyTHF (490mmol, 64,85mL), l'acide 5-amino-caproïque (430mmol, 56,33g), l'acide acétique glacial (430mL) et du dioxanne (570mL). Le mélange est porté à reflux au chauffe-ballon pendant 4h. On laisse la réaction se poursuivre sous agitation magnétique toute la nuit à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite concentré à l'évaporateur rotatif sous vide. Le résidu est repris dans l'éthanol (2 fois) et concentré. Le produit pur est obtenu après une chromatographie sur colonne de silice. L'élution de la colonne est commencée avec du dichlorométhane pur, puis poursuivie avec un mélange de dichlorométhane/éthanol (élution croissante en éthanol : 2. 5% EtOH puis 5%EtOH). La purification est suivie par chromatographie sur couche mince (CCM) sur plaque de silice en utilisant comme éluant un mélange chloroforme 90/ méthanol 10. On obtient 67,41 g d'acide 5-pyrrolyl-caproïque, soit un rendement de 86%. Le produit sec est conservé à 4 C, à l'abri de la lumière. In a flask fitted with a condenser, 2,5-dimethoxyTHF (490 mmol, 64.85 ml), 5-aminocaproic acid (430 mmol, 56.33 g) and glacial acetic acid (430 ml) are added. dioxane (570mL). The mixture is refluxed to the heating balloon for 4 hours. The reaction is allowed to proceed with magnetic stirring overnight at room temperature. The reaction mixture is then concentrated in a rotary evaporator under vacuum. The residue is taken up in ethanol (2 times) and concentrated. The pure product is obtained after chromatography on a silica column. Elution of the column is started with pure dichloromethane and then continued with a mixture of dichloromethane / ethanol (increasing elution with ethanol: 2.5% EtOH and then 5% EtOH). The purification is followed by thin-layer chromatography (TLC) on a silica plate, using a chloroform 90 / methanol 10 mixture as eluent. 67.41 g of 5-pyrrolyl-caproic acid is obtained, ie a yield of 86%. The dry product is stored at 4 ° C., protected from light.

Caractérisation : 'H-RMN (200MHz ; CDCl3 / TMS) # (ppm) : 1,72 (m, 6H, -CH2-(CH2)3CH2-) ; 2,34 (t, 2H, -CH2-C02H) ; 3,87 (t, 2H, -CH2-N) ; 6,13 (dd, 2H, 3-H et 4-H du pyrrole) ; 6,64 (dd, 2H, 2-H et 5-H du pyrrole). Characterization: 1H-NMR (200MHz, CDCl3 / TMS) # (ppm): 1.72 (m, 6H, -CH2- (CH2) 3CH2-); 2.34 (t, 2H, -CH 2 -CO 2 H); 3.87 (t, 2H, -CH 2 -N); 6.13 (dd, 2H, 3-H and 4-H pyrrole); 6.64 (dd, 2H, 2-H and 5-H pyrrole).

Acide 10-pyrrolyl-undécanoïque (II) :

10-pyrrolyl-undecanoic acid (II):

Dans un ballon muni d'un réfrigérant, on additionne le 2,5-diméthoxyTHF (490mmol, 64,85mL), l'acide 10-amino-undécanoïque (430mmol, 86,56g), l'acide acétique glacial (430mL) et du dioxanne (570mL). Le mélange est porté à reflux au chauffe-ballon pendant 4h. On laisse la réaction se poursuivre sous agitation magnétique toute la nuit à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite concentré à l'évaporateur rotatif sous vide. Le produit pur est obtenu après une chromatographie sur 2.5-DimethoxyTHF (490mmol, 64.85mL), 10-amino-undecanoic acid (430mmol, 86.56g), glacial acetic acid (430mL) are added to a flask equipped with a condenser. dioxane (570mL). The mixture is refluxed to the heating balloon for 4 hours. The reaction is allowed to proceed with magnetic stirring overnight at room temperature. The reaction mixture is then concentrated in a rotary evaporator under vacuum. The pure product is obtained after chromatography on

colonne de silice. L'élution de la colonne est commencée avec du dichlorométhane pur, l'acide 10-pyrropyl undécanoïque étant encore plus apolaire que l'acide 5-pyrropyl caproïque , il n'y a pas besoin de faire un gradient entre le dichlorométhane et l'éthanol. La purification est suivie par chromatographie sur couche mince (CCM) sur plaque de silice avec chloroforme 90/ méthanol 10 comme éluant. On obtient 70,Og d'acide 10-pyrrolylundécanoïque, soit un rendement de 64,8%. Le produit sec est conservé à 4 C, à l'abri de la lumière. silica column. Elution of the column is started with pure dichloromethane, 10-pyrropyl undecanoic acid being even more apolar than 5-pyrropyl caproic acid, there is no need to make a gradient between dichloromethane and ethanol. Purification is followed by thin layer chromatography (TLC) on silica plate with chloroform 90 / methanol as eluent. 70 g of 10-pyrrolylundecanoic acid are obtained, ie a yield of 64.8%. The dry product is stored at 4 ° C., protected from light.

Caractérisation : 'H-RMN (200MHz; CDCl3 / TMS) 5 (ppm) : 1,64 (m, 14H, -CH2- (CH2)8- CH2-) ; 2,34 (t, 2H, -CH2-CO2H) ; 3,86 (t, 2H, -CH2-N) ; 6,13 (dd, 2H, 3-H et 4-H du pyrrole) ; (dd, 2H, 2-H et 5-H du pyrrole). b Synthèse despyrrole-esters activés
Pyrrole-[6]- N-hydroxysuccinimide : PC-NHS (III) :

Characterization: 1H-NMR (200MHz, CDCl3 / TMS) (ppm): 1.64 (m, 14H, -CH2- (CH2) 8-CH2-); 2.34 (t, 2H, -CH 2 -CO 2 C); 3.86 (t, 2H, -CH 2 -N); 6.13 (dd, 2H, 3-H and 4-H pyrrole); (dd, 2H, 2-H and 5-H pyrrole). b Synthesis of activated pyrol esters
Pyrrole- [6] - N-hydroxysuccinimide: PC-NHS (III):

Dans un ballon, on additionne I (144mmol, 26,055g), le NHS (144mmol, 16,56g), la DCC (159mmol, 32,75g) et le DMF (500mL). On laisse sous agitation durant toute la nuit, à température ambiante. La réaction est suivie par CCM, éluant : 95/ méthanol 5. Le mélange est ensuite filtré pour éliminer la DCU formée. Le filtrat est ensuite séché sous vide. On utilise par la suite la produit tel quel, sans purification supplémentaire. In a flask, I (144mmol, 26.055g), NHS (144mmol, 16.56g), DCC (159mmol, 32.75g) and DMF (500mL) are added. It is left stirring overnight at room temperature. The reaction is monitored by TLC, eluent: 95 / methanol 5. The mixture is then filtered to remove the DCU formed. The filtrate is then dried under vacuum. The product is subsequently used as is, without further purification.

Caractérisation :
1H-RMN (200MHz ; CDCl3 / TMS) # (ppm) : 1,72 (m, 6H,-CH2-(CH2)3- CH2-) ; 2,34 (t, 2H, -CH2-CO) ; 2,88 (tt, 4H, CH2-CH2 du NHS) ; (t, 2H, -CH2-N) ; 6,13 (dd, 2H, 3-H et 4-H du pyrrole) ; (dd, 2H, 2-H et 5-H du pyrrole). Characterization :
1H-NMR (200MHz, CDCl3 / TMS) # (ppm): 1.72 (m, 6H, -CH2- (CH2) 3- CH2-); 2.34 (t, 2H, -CH 2 -CO); 2.88 (tt, 4H, CH 2 -CH 2 NHS); (t, 2H, -CH 2 -N); 6.13 (dd, 2H, 3-H and 4-H pyrrole); (dd, 2H, 2-H and 5-H pyrrole).

Pyrrole-/11 ) N-hydroxysuccinimide: PU-NHS (IV) :

Pyrrole- / 11) N-hydroxysuccinimide: PU-NHS (IV):

Suivant le même protocole que précédemment pour le produit (III), on mélange II (95mmol, 23,9g), le NHS (95mmol, 10,925g) et la DCC (104.5mmol, 21,52g) dans 500mL de DMF. On laisse sous agitation durant toute la nuit, à température ambiante. Following the same protocol as above for the product (III), II (95 mmol, 23.9 g), NHS (95 mmol, 10.925 g) and DCC (104.5 mmol, 21.52 g) are mixed in 500 ml of DMF. It is left stirring overnight at room temperature.

La réaction est suivie par CCM dans un mélange choroforme 95/ méthanol 5. Le mélange réactionnel est ensuite filtré pour éliminer la DCU formée. Le filtrat est ensuite séché sous vide. On utilise par la suite la produit tel quel, sans purification supplémentaire, pour ne pas risquer de l'hydrolyser. The reaction is monitored by TLC in a 95% choroform / methanol mixture. The reaction mixture is then filtered to remove the DCU formed. The filtrate is then dried under vacuum. The product is subsequently used as such, without additional purification, to avoid the risk of hydrolyzing.

Caractérisation : 'H-RMN (200MHz ; CDCl3 / TMS) # (ppm) : 1,64 (m, 6H, -CH2-(CH2)s- CH2-) ; 2,6 (t, 2H, -CH2-CO) ; 2,89 (tt, 4H, CH2-CH2 du NHS) ; (t, 2H, -CH2-N) ; 6,13 (dd, 2H, 3-H et 4-H du pyrrole) ; (dd, 2H, 2-H et 5-H du pyrrole). c Synthèse des pyrrole-Hydrazides
Pyrrole Undecanoyl Hydrazide : PUH

Characterization: 1H-NMR (200MHz, CDCl3 / TMS) # (ppm): 1.64 (m, 6H, -CH2- (CH2) s-CH2-); 2.6 (t, 2H, -CH 2 -CO); 2.89 (tt, 4H, CH 2 -CH 2 NHS); (t, 2H, -CH 2 -N); 6.13 (dd, 2H, 3-H and 4-H pyrrole); (dd, 2H, 2-H and 5-H pyrrole). c Synthesis of pyrrole-hydrazides
Pyrrole Undecanoyl Hydrazide: PUH

Dans un ballon, on met l'ester activé PUNHS IV (20mmol, 6,96g), l'hydrazine 1M dans du THF (20mmol, 20mL), en mélange st#chiométrique, dans le DMF (180mL), afin d'éviter au maximum la formation de sous-produits ( dimères ). On laisse sous agitation toute la nuit, à température ambiante, en suivant la réaction par CCM (CHCl3 90 / MeOH 10). Ensuite, on évapore le DMF à l'aide de l'évaporateur rotatif sous vide. On observe la présence de plusieurs produits : PUH, PUHUP, des traces d'ester activé PUNHS IV. Les tentatives pour séparer le PUH des autres produits ont été infructueuses. Celui-ci a donc été utilisé sous forme de mélange avec le PUHUP et le PUNHS. In a flask, the activated ester PUNHS IV (20 mmol, 6.96 g), 1 M hydrazine in THF (20 mmol, 20 ml), in a stoichiometric mixture, is put in DMF (180 ml), in order to avoid maximum formation of by-products (dimers). The mixture is left stirring overnight at room temperature, following the reaction by TLC (90% CHCl 3 / MeOH). Then, the DMF is evaporated using the rotary evaporator under vacuum. We observe the presence of several products: PUH, PUHUP, traces of activated ester PUNHS IV. Attempts to separate PUH from other products have been unsuccessful. This was therefore used as a mixture with PUHUP and PUNHS.

Caractérisation :
Spectrométrie de masse : T = 200 C, solvants : CH2Cl2 / DMSO, m/z = 266. 3 (M+H)+ PUH ; 348. 1 (composé IV) ; 251 (composé II), 225. 3 (DCU). Characterization :
Mass spectrometry: T = 200 C, solvents: CH2Cl2 / DMSO, m / z = 266. 3 (M + H) + PUH; 348. 1 (compound IV); 251 (Compound II), 225. 3 (DCU).

Pyrrole Caproyl Adipate Hydrazide : PCAH

Pyrrole Caproyl Adipate Hydrazide: PCAH

On met en présence, dans un ballon, le PCNHS III (5mmol, 1,4g) et l'adipate dihydrazide (5mmol, 0,87g), dans 50mL de DMF. Etant donné que l'adipate se dissout mal, on a rajouté 15mL H20. On agite toute la nuit, à température ambiante ; il se forme un dépôt blanc. La CCM réalisée dans CHCI3 95/ MeOH 5, en fin de réaction, indique que tout l'ester activé PCNHS a été consommé. Le mélange est filtré sur verre fritté, on récupère 30mg de solide correspondant au NHS , insoluble dans un mélange DMF/ H2O. On évapore le mélange DMF/ H20 du filtrat, on obtient 2,1 g de produit brut. PCNHS III (5 mmol, 1.4 g) and adipate dihydrazide (5 mmol, 0.87 g) are placed in a flask in 50 ml of DMF. Since the adipate dissolves badly, 15 ml H 2 O have been added. Stirred overnight at room temperature; a white deposit is formed. The TLC carried out in CHCl 3 95 / MeOH 5, at the end of the reaction, indicates that all the activated PCNHS ester was consumed. The mixture is filtered on a sintered glass, 30 mg of solid corresponding to NHS, insoluble in a DMF / H 2 O mixture, are recovered. The DMF / H 2 O mixture is evaporated from the filtrate to give 2.1 g of crude product.

Caractérisation du produit brut en spectrométrie de masse:
3 pics caractéristiques : 173. 1 (M-H)+ soit 174. 1 pour l'adipate ; 336. 2 (M-H)+ soit 337. 2 pour le PCAH ; 399.2(M-H)+ soit 400. 2 pour le dimère PCACP. Characterization of the crude product in mass spectrometry:
3 characteristic peaks: 173. 1 (MH) + is 174. 1 for adipate; 336. 2 (MH) + 337. 2 for the PCAH; 399.2 (MH) + is 400. 2 for the PCACP dimer.

On purifie le produit de la réaction sur colonne de silice, on élue dans un gradient de DMSO (0-50%) dans CH2CI2. On arrive à éliminer l'adipate ainsi qu'une majorité du dimère PCACP. The product of the reaction is purified on a silica column, eluted in a gradient of DMSO (0-50%) in CH 2 Cl 2. It is possible to eliminate the adipate and a majority of the PCACP dimer.

La SM montre encore des traces de dimère. La masse de produit obtenue est 750mg (la masse attendue pour 100% de rendement est de 1,685g), soit un rendement d'environ 44%. MS still shows traces of dimer. The mass of product obtained is 750 mg (the expected mass for 100% yield is 1.685 g), a yield of about 44%.

Caractérisation :
1H-RMN (200MHz ; DMSO / TMS) # (ppm) : 1.42 (tt, 4H, -CH2-(CH2)2CH2- de l'adipate) ;
1. 95 (t, 2H, -CH2-CO-NH-NH2); 2. 04 (t, 2H,-CH2-CO-NH-NH- de l'adipate) ; 2. 46 (t, 2H,-CH2-CO-NH-NH- du caproyl) ; 3. 78 (t, 2H, -CH2-N) ; 4. 12 (si, 2H, -NH-NH2) ; 5. 91 (dd, 2H, 3-H et 4-H du pyrrole) ; 6,67 (dd, 2H, 2-H et 5-H du pyrrole) ; 8. 9 (s, 3H,-NH-NH- et NH-NH2). Characterization :
1H-NMR (200MHz, DMSO / TMS) # (ppm): 1.42 (tt, 4H, -CH 2 - (CH 2) 2 CH 2 - adipate);
1. 95 (t, 2H, -CH 2 -CO-NH-NH 2); 2. 04 (t, 2H, -CH 2 -CO-NH-NH- adipate); 2. 46 (t, 2H, -CH 2 -CO-NH-NH- caproyl); 3. 78 (t, 2H, -CH 2 -N); 4. 12 (Si, 2H, -NH-NH 2); 5. 91 (dd, 2H, 3-H and 4-H pyrrole); 6.67 (dd, 2H, 2-H and 5-H pyrrole); 8. 9 (s, 3H, -NH-NH- and NH-NH 2).

Pyrrole Undecanoyl Adipate Hydrazide : PUAH

Pyrrole Undecanoyl Adipate Hydrazide: PUAH

Dans un ballon, on met à réagir l'ester activé PUNHS IV (5mmol, 1,74g) avec l'adipate dihydrazide (5mmol, 0,87g) dans 50mL de DMSO, durant toute la nuit, à température ambiante. On suit la réaction par CCM dans CHC13 90/ MeOH 10. On In a flask, the activated ester PUNHS IV (5 mmol, 1.74 g) is reacted with the adipate dihydrazide (5 mmol, 0.87 g) in 50 ml of DMSO, overnight, at room temperature. The reaction is monitored by TLC in CHCl 3 90 / MeOH 10.

évapore ensuite le DMSO, à la pompe à vide sous agitation et chauffage. On obtient 6,2g de produit brut. then evaporates the DMSO at the vacuum pump with stirring and heating. 6.2 g of crude product are obtained.

Caractérisation du produit brut en spectrométrie de masse:
3 pics caractéristiques : 175. 1 (M+H)+ soit 174. 1 pour l'adipate ;408.2 (M+H)+ soit 407. 2 pour le PUAH ; 641.2 (M+H)+ soit 640. 2 pour le dimère PUAUP. Characterization of the crude product in mass spectrometry:
3 characteristic peaks: 175. 1 (M + H) + is 174. 1 for adipate, 408.2 (M + H) + is 407. 2 for PUAH; 641.2 (M + H) + is 640. 2 for the dimer PUAUP.

On purifie le mélange issu de la réaction sur colonne de silice, on élue dans un gradient de DMSO (de 0 à 20%) dans CH2CI2. On arrive à éliminer l'adipate ainsi qu'une majorité du dimère PCACP. The mixture obtained from the reaction is purified on a silica column and eluted in a gradient of DMSO (from 0 to 20%) in CH 2 Cl 2. It is possible to eliminate the adipate and a majority of the PCACP dimer.

La SM montre encore des traces de dimère. La masse obtenue de produit est 840mg, soit un rendement d'environ 41%. MS still shows traces of dimer. The resulting mass of product is 840mg, a yield of about 41%.

Caractérisation : 'H-RMN (200MHz ; DMSO / TMS) # (ppm) : 1.43 (tt, 4H, -CH2-(CH2)2CH2- de l'adipate) ;
1. 94 (t, 2H, -CH2-CO-NH-NH2);2.03 (t, 2H, -CH2-CO-NH-NH- de l'adipate) ; 2. 49 (t, 2H,-CH2-CO-NH-NH- de l'undecanoyl) ; 3. 79 (t, 2H, -CH2-N) ; 4. 12 (si, 2H, -NH-NH2) ; 5. 9 (dd, 2H, 3-H et 4-H du pyrrole) ; (dd, 2H, 2-H et 5-H du pyrrole) ; 8. 9 (s, 3H, -NH-NH- et NH-NH2). Characterization: 1H-NMR (200MHz; DMSO / TMS) # (ppm): 1.43 (tt, 4H, -CH 2 - (CH 2) 2 CH 2 - adipate);
1. 94 (t, 2H, -CH 2 -CO-NH-NH 2); 2.03 (t, 2H, -CH 2 -CO-NH-NH- of adipate); 2. 49 (t, 2H, -CH 2 -CO-NH-NH- undecanoyl); 3.79 (t, 2H, -CH 2 -N); 4. 12 (Si, 2H, -NH-NH 2); 5. 9 (dd, 2H, 3-H and 4-H pyrrole); (dd, 2H, 2-H and 5-H pyrrole); 8. 9 (s, 3H, -NH-NH- and NH-NH 2).

2 Couplage du Bras espaceur-pyrrole au Sucre. 2 Coupling of the Spacer-Pyrrole Arm to Sugar.

Les groupements pyrrole-bras espaceur sont le PUH, le PCAH et le PUAH synthétisés précédemment. Les sucres utilisés sont les fragments d'héparine ou d'héparine sulfate préparés précédemment. Le HP6 (- 6kDa) et le dp 12 (3kDa). a Réaction de couplage
On fixe par cette réaction le bras espaceur par sa fonction hydrazide à la fonction aldéhyde du sucre, le sucre étant en équilibre entre une forme pyranose et une forme ouverte comportant une fonction aldéhyde. Après avoir synthétisé les bras espaceurs pyrrolés, on assemble ceux-ci au sucre pour obtenir la molécule finale, prête pour la copolymérisation. The pyrrole-spacer arm groups are PUH, PCAH and PUAH synthesized previously. The sugars used are the heparin or heparin sulfate fragments prepared previously. HP6 (-6kDa) and dp 12 (3kDa). a coupling reaction
By this reaction, the spacer arm is attached by its hydrazide function to the aldehyde function of the sugar, the sugar being in equilibrium between a pyranose form and an open form comprising an aldehyde function. After having synthesized the pyrrole spacer arms, these are assembled to the sugar to obtain the final molecule, ready for the copolymerization.

On opère par une réaction de couplage, en deux étapes. La réaction se fait en 48H à 56 C, dans un mélange DMSO 20/ H20 1. Les étapes du couplage sont les suivantes : d'abord le bras espaceur pyrrole (PUH, PUAH ou PCAH) est couplé au sucre HP6 par une fonction hydrazone, qui s'hydrolyse facilement dans l'eau. C'est pourquoi, on réduit, dans une deuxième étape, cette fonction hydrazone en hydrazide It operates by a coupling reaction in two stages. The reaction is carried out at 48 ° C. at 56 ° C. in a DMSO 20 / H20 1 mixture. The coupling steps are as follows: firstly, the pyrrole spacer arm (PUH, PUAH or PCAH) is coupled to the HP6 sugar by a hydrazone function , which hydrolyzes easily in water. This is why, in a second step, this hydrazone function is reduced to hydrazide.

stable par un traitement par le cyano-borohydrure de sodium. Le principe général du couplage est résumé sur le schéma 2 ci-dessous. stable by treatment with sodium cyano borohydride. The general principle of coupling is summarized in Figure 2 below.

Principe de couplage

Principle of coupling

Schéma 2
Dans un Eppendorf, on mélange le réactif Pyrrole-bras espaceurHydrazide (50mM dans DMSO, 250uL) au sucre HP6 (20mM dans du tampon acétate 2M pH 4,2 , 12,5 L), on place les échantillons à l'étuve à 56 C durant 48H, après 6-8H de réaction, on ajoute le réducteur cyanoborohydrure de sodium (4M dans EtOH, 25L). A l'issue de la réaction, on enlève les sels par passage sur une colonne PD10 (mini colonne d'exclusion de marque Pharmacia). On effectue ensuite une lecture au spectromètre UVvisible, à la longueur d'onde # = 232nm, pour vérifier la présence du sucre. Figure 2
In an Eppendorf, the Pyrrole-spacer arm Hydrazide reagent (50mM in DMSO, 250uL) is mixed with HP6 sugar (20mM in 2M acetate buffer pH 4.2, 12.5L), the samples are placed in an oven at 56 ° C. C for 48H, after 6-8H of reaction, the sodium cyanoborohydride reducer (4M in EtOH, 25L) is added. At the end of the reaction, the salts are removed by passing through a PD10 column (Pharmacia mini-exclusion column). A UVvisible spectrometer is then read at the wavelength # = 232nm to check for the presence of the sugar.

Puis on regroupe les fractions collectées et on les lyophilise. The collected fractions are then pooled and lyophilized.

C : FABRICATION DE LA PUCE A SUCRES
La technique de l' électrospotting [Livache et al., Synthetic Metals, 2001, 121, 1443-1444] est transposée au greffage des sucres pyrrolés, on dépose par copolymérisations successives des pyrroles le sucre HP6 greffé sur l'un des monomères PUH, PUAH ou PCAH. C: MANUFACTURE OF THE SUGAR CHIP
The technique of electrospotting [Livache et al., Synthetic Metals, 2001, 121, 1443-1444] is transposed to the grafting of the pyrrole sugars, and by successive copolymerizations of the pyrroles the HP6 sugar grafted onto one of the PUH monomers is deposited. PUAH or PCAH.

Electropolymérisation
Les lames sont en verre d'indice de réfraction n = 1,776, recouvertes de chrome (2 nm) et d'or (49 nm). Le milieu réactionnel contient 20 mM de pyrrole, du tampon phosphate 25mM pH=6. 8 et le sucre-pyrrole aux concentrations spécifiées ci dessous. La construction de la puce est réalisée selon la méthode electrospot grâce à un robot x/y/z (Newport-microcontrol) ; le temps de polymérisation est de 125 ms sous une différence de potentiel de 2,4V. Après synthèse, les dépôts sont rincés à l'eau distillée puis séchés. electropolymerization
The slides are made of glass of refractive index n = 1.776, coated with chromium (2 nm) and gold (49 nm). The reaction medium contains 20 mM pyrrole, 25 mM phosphate buffer pH = 6. 8 and sugar-pyrrole at the concentrations specified below. The construction of the chip is carried out according to the electrospot method thanks to an x / y / z robot (Newport-microcontrol); the polymerization time is 125 ms at a potential difference of 2.4V. After synthesis, the deposits are rinsed with distilled water and then dried.

D : ETUDE DES INTERACTIONS CHIMIOKINES / SUCRE HP6
Les chimiokines sont une famille de molécules protéiques reconnaissant toutes les glycoaminoglycanes de type héparine [Lortat-Jacob et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99, 1229-1234]. D: CHEMIOKINES / SUGAR INTERACTIONS STUDY HP6
Chemokines are a family of protein molecules that recognize all heparin-like glycosaminoglycans [Lortat-Jacob et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99, 1229-1234].

1 Etude des interactions par fluorescence
Le principe de révélation en fluorescence de la complexation HP6/SDF biotinylée est représenté sur la figure 3, SDF étant une chimiokine commerciale prise comme modèle. Les plots de la puce sont mis en présence d'une solution tampon de rinçage ; ce tampon contient la protéine BSA, servant à bloquer l'or nu de la puce, afin d'éviter la fluorescence non spécifique. Une fois le blocage fait, on rince la puce, puis on ajoute lOOuL de SDF biotinylée à la concentration de 1 M diluée dans le tampon de rinçage durant 30 minutes. Puis on rince à nouveau avec le tampon, puis on met la R-streptavidine phycoérythrine (SAPE-molecular probes) 15 minutes, à l'abri de la lumière. On rince encore une fois, puis on dépose une lamelle de verre sur la puce, et on lit l'intensité de fluorescence (IF ou niveaux de gris) à l'aide du microscope à épifluorescence. 1 Study of fluorescence interactions
The principle of fluorescence revelation of the biotinylated HP6 / SDF complexation is shown in Figure 3, SDF being a commercial chemokine taken as a model. The pads of the chip are placed in the presence of a rinsing buffer solution; this buffer contains BSA protein, used to block the naked gold of the chip, to avoid nonspecific fluorescence. Once the blockage is done, the chip is rinsed, then 100 μL of biotinylated SDF at a concentration of 1 M diluted in the rinsing buffer is added for 30 minutes. Then rinse again with the buffer, then put the R-streptavidin phycoerythrin (SAPE-molecular probes) 15 minutes, protected from light. Rinsed again, then a glass coverslip is placed on the chip, and the fluorescence intensity (IF or gray levels) is read using the epifluorescence microscope.

Pour cette étude, les dépôts ont été faits sur une lame de verre recouverte de chrome (2 nm) et d'or (49 nm). La figure 4 illustre le schéma de dépôt des polymères et l'intensité de fluorescence mesurée. For this study, the deposits were made on a glass slide covered with chromium (2 nm) and gold (49 nm). Figure 4 illustrates the polymer deposition pattern and the measured fluorescence intensity.

25 plots de polypyrrole ont été déposés sur la lame 25 pads of polypyrrole were deposited on the slide

# Espèce 1 : HP6 + bras espaceur PCAH (PCAH-HP6) # Espèce 2 : sucre HP6 + bras espaceur PUAH (PUAH-HP6) # Espèce 3 : sucre HP6 + bras espaceur PUH (PUH-HP6) # Espèce 4 : sucre HP6 sans bras espaceur et non greffé au pyrrole (HP6 seul) # Espèce 5 : sucre Chondroitine Sulfate (CS) ne reconnaissant pas la protéine + bras espaceur PCAH (PCAH-CS) # Espèce 6 : (pas de composé biologique greffé, appelé Milieu Réactionnel (MR)
Ces plots ont été déposés à 6 concentrations différentes de monomère greffé par un sucre : A = 100M, B = 50 M, C = 25M, D = 10 M, E = 1 M, F = 500nM. Le plot grisé du schéma est un plot de MR sur lequel aucun dépôt n'a été fait. # Species 1: HP6 + PCAH spacer arm (PCAH-HP6) # Species 2: HP6 sugar + PUAH spacer arm (PUAH-HP6) # Species 3: HP6 sugar + PUH spacer arm (PUH-HP6) # Species 4: HP6 sugar no spacer arm and no pyrrole graft (HP6 alone) # Species 5: sugar Chondroitin Sulfate (CS) not recognizing protein + PCAH spacer arm (PCAH-CS) # Species 6: (no grafted organic compound, called Reaction Medium (MR)
These pads were deposited at 6 different concentrations of monomer grafted with a sugar: A = 100M, B = 50M, C = 25M, D = 10M, E = 1M, F = 500nM. The gray plot of the diagram is a plot of MR on which no deposit has been made.

Ces concentrations représentent la concentration en sucre total (sucre pyrrole et sucre seul). These concentrations represent the total sugar concentration (pyrrole sugar and sugar alone).

Le sucre Chondroitine Sulfate (CS) a été modifié par un pyrrole comme les autres sucres et a été utilisée comme témoin négatif, pour sa structure similaire à l'héparine HP6 et sa non reconnaissance de la protéine SDF. The sugar Chondroitin Sulfate (CS) was modified by a pyrrole like the other sugars and was used as a negative control, for its structure similar to HP6 heparin and its non recognition of the SDF protein.

Résultats :
L'objectif de cette expérience est : vérifier la reconnaissance du sucre HP6 par la protéine SDF biotinylée, déterminer si les bras espaceurs jouent un rôle important dans la reconnaissance, déterminer à partir de quelle concentration on peut détecter la reconnaissance si elle a lieu. Results:
The objective of this experiment is: to verify the recognition of HP6 sugar by biotinylated SDF protein, to determine whether the spacer arms play an important role in recognition, to determine from which concentration recognition can be detected if it takes place.

La photo obtenue sous microscope à épifluorescence (cf. fig. 4) illustre la reconnaissance de la SDF par les sucres. Les mesures d'intensités de fluorescence prises sur la photo sont récapitulées dans le tableau 1 : The photo obtained under an epifluorescence microscope (see Fig. 4) illustrates the recognition of SDF by sugars. The measurements of fluorescence intensities taken in the photo are summarized in Table 1:

5 10 15

5 10 15

<tb>
<tb> Concentration
<tb> en <SEP> sucre <SEP> ( M) <SEP> UH-HP6 <SEP> PUAH-HP6 <SEP> PCAH-HP6 <SEP> PCAH-CS <SEP> (A) <SEP> HP6seul <SEP> MR
<tb> 0,5 <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> 10
<tb> 1 <SEP> 24 <SEP> 12 <SEP> 22
<tb> 10 <SEP> 80 <SEP> 24 <SEP> 68
<tb> 25 <SEP> 218 <SEP> 66 <SEP> 130 <SEP> 0
<tb> 50 <SEP> 326 <SEP> 114 <SEP> 312 <SEP> 8 <SEP> 0
<tb> 100 <SEP> 346 <SEP> 172 <SEP> 8 <SEP> 12 <SEP> 0
<tb>
Tableau 1 : des mesures d'intensité de fluorescence. <Tb>
<tb> Concentration
<tb> into <SEP> sugar <SEP> (M) <SEP> UH-HP6 <SEP> PUAH-HP6 <SEP> PCAH-HP6 <SEP> PCAH-CS <SEP> (A) <SEP> HP6single <SEP > MR
<tb> 0.5 <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> 10
<tb> 1 <SEP> 24 <SEP> 12 <SEP> 22
<tb> 10 <SEP> 80 <SEP> 24 <SEP> 68
<tb> 25 <SEP> 218 <SEP> 66 <SEP> 130 <SEP> 0
<tb> 50 <SEP> 326 <SEP> 114 <SEP> 312 <SEP> 8 <SEP> 0
<tb> 100 <SEP> 346 <SEP> 172 <SEP> 8 <SEP> 12 <SEP> 0
<Tb>
Table 1: Fluorescence intensity measurements.

Les 3 plots MR, conformément à nos attentes, ne présentent pas de fluorescence, ce qui montre l'absence d'adsorption non spécifique à la surface du film de polypyrrole. The 3 MR pads, according to our expectations, do not exhibit fluorescence, which shows the absence of non-specific adsorption on the surface of the polypyrrole film.

Le témoin négatif PCAH-CS greffé au polypyrrole, ne présente qu'une très faible fluorescence, la protéine n'adsorbe pas sur le sucre. The negative control PCAH-CS grafted with polypyrrole, has a very weak fluorescence, the protein does not adsorb on sugar.

Le témoin HP6 non greffé au pyrrole mais immobilisé dans le polypyrrole, montre une fluorescence très inférieure au plots HP6 greffés au pyrrole. The control HP6 not grafted with pyrrole but immobilized in the polypyrrole, shows a fluorescence much lower than the HP6 pads grafted with pyrrole.

Ceci démontre que la détection de la reconnaissance protéine/ sucre nécessite que le sucre soit greffé sur un monomère participant à la copolymérisation. This demonstrates that the detection of protein / sugar recognition requires that the sugar is grafted onto a monomer participating in the copolymerization.

En comparant les intensités de fluorescence des trois bras espaceurs, on constate qu'on a une meilleure fluorescence pour le bras PUH, suivi du bras PCAH et enfin du bras PUAH. By comparing the fluorescence intensities of the three spacer arms, it is found that there is better fluorescence for the PUH arm, followed by the PCAH arm and finally the PUAH arm.

Nous pouvons déjà conclure que la technique d'immobilisation du sucre HP6 est favorable à la reconnaissance de la protéine, de plus, on peut déterminer We can already conclude that the technique of immobilization of HP6 sugar is favorable to the recognition of the protein, moreover, one can determine

la gamme de concentrations optimales : entre 10 M et 50 M, étant donné qu'il n'y aucune fluorescence pour les plots de 0,1 M et 1 M, et qu'il semble que les plots à 100 M présentent une intensité de fluorescence saturée. the range of optimal concentrations: between 10 M and 50 M, since there is no fluorescence for the 0.1 M and 1 M pads, and it appears that the 100 M pads have an intensity of saturated fluorescence.

2. Etude en SPRi
Les interactions peuvent être étudiées par imagerie SPR directement sur la puce et en temps réel [Guedon et al. Anal Chem. 2000,72(24):6003-9]. Cette technique ne nécessite pas l'utilisation de molécules marquées. Le principe de fonctionnement de l'analyse SPR est illustré par la figure 5. 2. Study in SPRi
Interactions can be studied by SPR imaging directly on the chip and in real time [Guedon et al. Anal Chem. 2000.72 (24): 6003-9]. This technique does not require the use of labeled molecules. The operating principle of SPR analysis is illustrated in Figure 5.

Objectif de l'expérience :
L'objectif premier de l'expérience est de vérifier la reconnaissance, en temps réel, du sucre HP6 par la protéine SDF en fonction de la nature du bras espaceur et le second est d'optimiser le signal mesurable en faisant varier la concentration en sucre sur les plots ainsi que celle en protéine cible injectée. Objective of the experiment:
The primary objective of the experiment is to verify the real time recognition of HP6 sugar by the SDF protein according to the nature of the spacer arm and the second is to optimize the measurable signal by varying the sugar concentration. on the pads as well as that of target protein injected.

Pour cette étude cinétique, les dépôts ont été fait sur un prisme recouvert de chrome (2 nm) et d'or (49 nm). 16 plots de polypyrrole ont été déposés sur le prisme. La durée d'électrocopolymérisation était de 125 ms. Ces plots se détaillent de la façon suivante (cf. fig. 6): # Espèce 1 : sucre HP6 + bras espaceur PCAH (PCAH-HP6) # Espèce 2 : sucre HP6 + bras espaceur PUAH (PUAH-HP6) # Espèce 3 : sucre HP6 + bras espaceur PUH (PUH-HP6) # Espèce 4 : sucre HP6 sans bras espaceur et non greffé au pyrrole (HP6 seul) # Espèce 5 : sucre Chondroitine Sulfate (CS) ne reconnaissant pas la protéine + bras espaceur PCAH (PCAH-CS) # Espèce 6 : (pas de composé biologique greffé, appelé Milieu Réactionnel (MR)
Ces plots ont été déposés à 4 concentrations différentes : A = 100 M, B = 25uM, C = 6,25 uM, D = 1,56M. For this kinetic study, the deposits were made on a prism coated with chromium (2 nm) and gold (49 nm). 16 pads of polypyrrole were deposited on the prism. The electrocopolymerization time was 125 ms. These plots are detailed as follows (see Fig. 6): # Species 1: HP6 sugar + PCAH spacer arm (PCAH-HP6) # Species 2: HP6 sugar + PUAH spacer arm (PUAH-HP6) # Species 3: HP6 sugar + PUH spacer arm (PUH-HP6) # Species 4: HP6 sugar without spacer arm and non pyrrole-grafted (HP6 alone) # Species 5: Chondroitin Sulfate sugar (CS) not recognizing protein + PCAH spacer arm (PCAH -CS) # Species 6: (no grafted organic compound, called Reaction Medium (MR)
These pads were deposited at 4 different concentrations: A = 100 M, B = 25uM, C = 6.25 μM, D = 1.56M.

Nous avons utilisé le sucre Chondroitine Sulfate (CS) comme témoin négatif, pour sa structure similaire à l'héparine HP6 et sa non reconnaissance de la protéine SDF. We used sugar Chondroitin Sulfate (CS) as a negative control for its structure similar to HP6 heparin and its non recognition of the SDF protein.

Sur la figure 4, l'image de gauche représente le prisme vu en imagerie SPR, lorsqu'il est en solution tampon de rinçage ; l'image de droite est un schéma de disposition des plots sur la surface dorée du prisme. In FIG. 4, the image on the left represents the prism seen in SPR imaging, when it is in rinsing buffer solution; the image on the right is a layout diagram of the studs on the golden surface of the prism.

Mesure d'interactions
Nous nous sommes placés vers 54 , pour être dans le flanc droit du pic d'absorption de la courbe de réflectivité. Measurement of interactions
We moved towards 54, to be in the right flank of the absorption peak of the reflectivity curve.

Toutes les mesures ont été faites avec un débit de 30 L / min. All measurements were made with a flow rate of 30 L / min.

Sur ce prisme, le protocole a été le suivant (exemples fig. 7): -passage du tampon de rinçage, solution contenant 1% de BSA, servant de bloquant pour l'expérience. On this prism, the protocol was as follows (examples in Fig. 7): -passage of the rinsing buffer, solution containing 1% of BSA, serving as a blocker for the experiment.

- mesure et enregistrement de la réflectivité en fonction de l'angle d'incidence - passage d'une solution contenant la protéine SDF diluée dans le tampon de rinçage, pendant 15 minutes. measurement and recording of the reflectivity as a function of the angle of incidence; passage of a solution containing the diluted SDF protein in the rinsing buffer for 15 minutes.

- retour en tampon de rinçage seul afin de mesurer la différence de niveau dans le même milieu avant et après l'interaction (rinçage pendant plus de 15 minutes). - return to rinse buffer alone to measure the difference in level in the same medium before and after the interaction (rinsing for more than 15 minutes).

- passage d'une solution NaCl 1M dans le tampon de rinçage (120L / min pendant 30 secondes) pour régénérer les plots : dissociation protéine/ sucre. - Passage of a 1M NaCl solution in the rinsing buffer (120L / min for 30 seconds) to regenerate the pads: protein / sugar dissociation.

- retour en tampon afin de mesurer la différence de niveau dans le même milieu entre avant et après la régénération. - return to buffer to measure the difference in level in the same medium between before and after regeneration.

Ce protocole a été effectué pour 7 concentrations différentes : 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM et 1 M. This protocol was performed for 7 different concentrations: 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM and 1 M.

La figure 7 représente les courbes cinétiques brutes pour les concentrations 100 nM (gauche) et 250nM (droite) en protéine SDF. Pour indication, les différentes injections sont séparées par une ligne verticale : tampon/ Protéine tampon/ NaCl (grand pic)/ tampon). Figure 7 shows the gross kinetic curves for the 100 nM (left) and 250 nM (right) concentrations of SDF protein. For indication, the different injections are separated by a vertical line: Buffer / Protein buffer / NaCl (large peak) / buffer).

Des images de la matrice sont représentées sur la figure 8 après chaque injection de protéine, avant rinçage, pour constater l'allumage des plots Images of the matrix are shown in FIG. 8 after each injection of protein, before rinsing, in order to observe the ignition of the pads.

spécifiques (on remarque le changement du gain augmentant parallèlement à la concentration de protéine injectée). specific (we notice the change in gain increasing in parallel with the concentration of injected protein).

La figure 8 illustre les variations de réflectivité avant rinçage dues à la fixation de SDF sur le sucre HP6. Pour une meilleure lisibilité des images, seules ont été représentées les zones prises en compte dans les mesures (fond artificiellement noir). FIG. 8 illustrates the variations in reflectivity before rinsing due to the fixing of SDF on the HP6 sugar. For a better readability of the images, only the zones taken into account in the measurements (artificially black background) were represented.

Les graphiques représentés sur les figures 9 et 10 représentent les variations de réflectivité avant rinçage (fig. 9) et après rinçage (fig. 10) dues à la fixation de la protéine SDF sur le sucre HP6 fixé au pyrrole par différents bras espaceurs en fonction de la concentration injectée. The graphs represented in FIGS. 9 and 10 represent the reflectivity variations before rinsing (FIG 9) and after rinsing (FIG 10) due to the attachment of the SDF protein to the HP6 sugar attached to the pyrrole by different spacer arms in function the injected concentration.

La figure 9 illustre des mesures prises en % de réflectivité, correspondant la reconnaissance entre la protéine SDF et le sucre HP6, avant rinçage. FIG. 9 illustrates measurements taken in% reflectivity, corresponding to the recognition between the SDF protein and the HP6 sugar, before rinsing.

Les plots HP6 1.56M ne sont pas représentés, car les prises ne sont pas significatives. The HP6 1.56M pads are not shown because the catches are not significant.

La figure 10 illustre des mesures prises en % de réflectivité, correspondant la reconnaissance entre la protéine SDF et le sucre HP6, après rinçage. FIG. 10 illustrates measurements taken in% of reflectivity, corresponding to the recognition between the SDF protein and the HP6 sugar, after rinsing.

Les plots HP6 1.56uM ne sont pas représentés, car les prises ne sont pas significatives
Avant le rinçage en tampon, nous pouvons détecter un signal significatif de fixation de la protéine SDF à des concentrations d'injection aussi faibles que 10 nM, pour les plots fonctionnalisés contenant 100 ou 25 M de sucre HP6. The HP6 1.56uM pads are not shown because the catches are not significant
Prior to buffer rinsing, we can detect a significant SDF protein binding signal at injection levels as low as 10 nM, for functionalized pads containing 100 or 25 M HP6 sugar.

On constate que lorsque l'on augmente la quantité de protéine injectée, le pourcentage en réflectivité correspondant croît de façon assez linéaire. De façon parallèle, plus le plot possède de sucre HP6 greffé, plus la reconnaissance biologique protéine SDF/ sucre HP6 est forte. On arrive à saturation vers 500nM en protéine SDF, puisqu'en injectant 1 M de protéine, le pourcentage ne croît quasiment plus. It is found that when the quantity of injected protein is increased, the corresponding reflectivity percentage increases in a fairly linear manner. In parallel, the more the block has grafted HP6 sugar, the more the biological recognition SDF protein / sugar HP6 is strong. Saturation is reached around 500nM in SDF protein, since by injecting 1M of protein, the percentage hardly increases anymore.

Le rinçage sert, au tout début, à décrocher le surplus de molécules biologiques fixées par adsorption sur le polymère comme sur le sucre ; son deuxième rôle est d'observer si le complexe se dissocie et à quelle vitesse ; à partir des données obtenues lors de l'injection et du rinçage, on peut calculer le Kd. Rinsing is used, at the very beginning, to unhook the surplus of biological molecules fixed by adsorption on the polymer as on the sugar; its second role is to observe if the complex dissociates itself and at what speed; from the data obtained during injection and rinsing, Kd can be calculated.

Après rinçage, on observe un signal spécifique de fixation à partir de lOnM en SDF pour les plots de 100M en sucre, et de 50 nM pour les plots de 25 M de sucre. After rinsing, a specific binding signal is observed from 10 nM in SDF for the pads of 100M in sugar, and 50 nM for the pads of 25 M of sugar.

Il est extrêmement important de noter que la chondroitine sulfatepyrrolée ne génère aucun signal (témoin négatif) et que le HP6 non modifié par un pyrrole ne génère aucune réponse non plus ; la pyrrolylation du sucre est donc nécessaire pour assurer une reconnaissance correcte entre le sucre et la protéine SDF. It is extremely important to note that chondroitin sulfatepyrrole does not generate any signal (negative control) and that pyrrole-modified HP6 does not generate any response either; the pyrrolylation of sugar is therefore necessary to ensure correct recognition between the sugar and the SDF protein.

Claims

wherein: - A, and Aj each represent an electrically polymerizable monomer, the different Ai and Aj may be the same or different; - B represents a carbohydrate which may be chosen from: a monosaccharide, an oligosaccharide, a natural or synthetic polysaccharide, or a natural or synthetic derivative thereof; Li represents a covalent bond or a spacer arm connecting the monomer Ai to the group Bj; x represents an integer greater than or equal to 1; i is an index varying from 1 to x; y represents an integer greater than or equal to 0; j is an index varying from 1 to y when y 0.

1. Polymer corresponding to the following general formula (I):

2. Polymer according to claim 1, characterized in that the electropolymerizable monomers A and Aj are selected from: acetylene, acrylonitriles, p-phenylene, p-phenylene vinylene, pyrene, pyrrole, thiophene, furan, selenophene, pyridazine, carbazole, aniline, phenol and their derivatives.

3. Polymer according to claim 2, characterized in that Ai and Aj are selected from pyrrole and substituted pyrrole derivatives such as N-methylpyrrole and N-cyanoethylpyrrole.

4. Polymer according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the monomers A, and Aj are all identical.

5. Polymer according to any one of claims 1 to 4, characterized in that B can be chosen from the following natural monosaccharides: allose, altrose, arabinose, erythrose, fructose, galactose, glucose, gulose, idose, lyxose, mannose , psicosis,

ribulose, sorbose, tagatose, threose, talose, xylose, xylulose; among the derivatives of these natural monosaccharides, such as acid derivatives, amino derivatives, substituted amino derivatives, C 1 -C 12 alkyl ester derivatives, C 1 -C 12 alkyl ether derivatives, C 1 -C 12 alkyl amide derivatives of these monosaccharides ; among polysaccharides comprising at least two units chosen from natural or synthetic monosaccharides and their derivatives; among the polysaccharides substituted with at least one group chosen from: peptides, proteins, lipids, such as, for example, C 8 -C 30 fatty acids, steroids and their derivatives.

6. Polymer according to any one of claims 1 to 5, characterized in that several distinct Bi groups are present.

7. Polymer according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the ratio x / y is between 1/1 and 1/1 000 000, preferably between 1/10 and 1/100 000, and even more preferably between 1/20 and 1/50 000.

8. Polymer according to any one of claims 1 to 7, characterized in that Li represents a spacer arm chosen from the groups corresponding to formula (II): -R1- [(CH2) n-R2] a- [( In which: n is an integer ranging from 1 to 10; -m is equal to 0 or is an integer ranging from 1 to 10; -p is 0 or is an integer from 1 to 10; -a is equal to 0 or is an integer ranging from 1 to 8; -b is 0 or is an integer from 1 to 8; -RI, R2 and R3 which may be the same or different represent a group selected from: -CH2-; -O-; -S-; -NR'-; -CO-; -CH = CH-; -NR'C (O) -; -C (O) N (R ') -; NHS (O 2) - and R 'represents a hydrogen atom or a C 1 -C 12 alkyl chain.

9. Process for the preparation of a polymer of general formula (I) according to any one of claims 1 to 8, characterized in that it comprises at least the following steps: a first step during which the process is carried out; the preparation of a copolymer of general formula (III):

- [Ai *] x- [Aj] y- (III) in which A, * represents a group Ai having a function designated *.

a second step during which the polymer of formula (III) is attached to at least one group of general formula (IV): Li-Bi (IV) in which L represents a group L, carrying a function ** capable of reacting with the function * of Ai to form a covalent bond L, -A ,.

10. Process for the preparation of a polymer of general formula (I) according to any one of Claims 1 to 8, characterized in that it comprises at least the following stages: a first step during which the process is carried out; the preparation of the compound of general formula (V):

a second step during which the copolymerization of the compound (V) is carried out with the monomer Aj.

11. The method of claim 9 or claim 10, characterized in that at least one step of the process involves at least one electrochemical reaction.

12. The method of claim 11, characterized in that the electrochemical copolymerization is performed on the surface of an electrode.

13. The method of claim 11 or claim 12, characterized in that an electrochemical copolymerization of the mixture is carried out by subjecting a mixture of monomers to a process selected from: one or more jumps potential; cyclic voltammetry; chronopotentiometry.

14. Method according to any one of claims 11 to 13, characterized in that it comprises the use of means selected from microelectrode networks or localized electrochemical reactions.

15. An electrode comprising one or more deposits of at least one polymer grafted with one or more saccharides and corresponding to the formula (I) according to any one of claims 1 to 8.

16. Electrode according to claim 15, characterized in that it is capable of being used in a method of resonance imaging of surface plasmons.

17. Electrode according to claim 15 or claim 16, characterized in that it consists of a conductive material deposited or not on a solid support.

18. Electrode according to any one of claims 15 to 17, characterized in that it comprises deposits of polymers distributed in matrix form.

19. A screening method characterized in that it comprises contacting an electrode according to any one of claims 15 to 18 with one or more potential ligands.

20. The method of claim 19, characterized in that it comprises at least one surface plasmon resonance imaging step.