FR2850396A1

FR2850396A1 - Vector for delivery of molecules to cells, useful e.g. for vaccination or for treating tumors, comprises the molecule coupled to a specific penetrating peptide

Info

Publication number: FR2850396A1
Application number: FR0301014A
Authority: FR
Inventors: Alphonse Garcia; Frederic Dessauge; Santos Susin
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Sorbonne Universite
Priority date: 2003-01-29
Filing date: 2003-01-29
Publication date: 2004-07-30
Anticipated expiration: 2023-01-29
Also published as: FR2850396B1

Abstract

Vector intended for transferring a molecule of interest (A) into a cell comprising a penetrating peptide (I) coupled to (A), is new. Vector intended for transfer of a molecule of interest (A) into a cell comprises a penetrating peptide (I) coupled to (A), where (I) is any of peptides (1)-(6) or their homologues with one or more amino acid substitutions or deletions, provided that penetration capacity is retained and homology after alignment, is at least 70, preferably 90 %. Val-Lys4Ile-Lys-Arg-Glu-Ile-Lys-Ile (S1) (Arg-Gln-Lys-Arg-Leu-Ile)3 (S2) (Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly)3 (S3) Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly-Ile-Ile-Gln-Gln-Arg-Arg-Thr-Arg-Asn-Gly (S4) Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Arg-Ala-Arg-Asn-Gly (S5) (Arg)7Ser-Arg-Gly-Arg-Arg-Arg-Thr-Tyr (S6) Independent claims are also included for: (1) polynucleotides (II) for preparing the new vector, comprising a sequence that encodes (A) and a sequence that encodes (I); (2) apoptotic peptides (III) that are: (a) sequences (7)-(10); or (b) homologues of (a) with one or more amino acid substitutions or deletions, provided that apoptotic capacity is retained and homology with (a), after alignment, is at least 70, best 90 %; (3) process for in vitro transfection of (A) into a cell by incubating the cell with the new vector; and (4) identifying (I). Arg(Xaa)nVal-Xaa-Phe (S7) Phe-Xaa-Xaa-Arg-Lys-Xaa-Arg-Lys (S8) Arg-Lys(Xaa)nVal-Xaa-Phe-Xaa-Xaa-Arg-Lys-Xaa-Arg-Lys (S9) Phe-Xaa-Xaa-Arg-Lys-Xaa-Arg-Lys-(Xaa)nVal-Xaa-Phe (S10) Xaa = any amino acid; and n = 0 or 1.

Description

VECTEURS DESTINES AU TRANSFERT DE MOLECULES D'INTERET
DANS DES CELLULES CIBLES La présente invention se rapporte à de nouveaux vecteurs destinés au transfert de protéines, d'acides nucléiques ou de toute autre molécule d'intérêt dans des cellules. Cette invention peut être appliquée à des domaines variés, notamment pour la délivrance in vivo de médicaments dans des cellules cibles d'un organisme ou le transfert in vitro ou ex vivo de molécules d'intérêt dans des cellules en culture. VECTORS FOR TRANSFERRING MOLECULES OF INTEREST
The present invention relates to novel vectors for the transfer of proteins, nucleic acids or any other molecule of interest into cells. This invention can be applied to various fields, in particular for the in vivo delivery of drugs into target cells of an organism or the in vitro or ex vivo transfer of molecules of interest into cells in culture.

Le développement de nouveaux médicaments nécessite non seulement l'identification de nouvelles molécules actives et de leur cibles, mais également la recherche de nouveaux modes d'administration ou de nouveaux moyens permettant de véhiculer efficacement les molécules actives vers leur cible. The development of new drugs requires not only the identification of new active molecules and their targets, but also the search for new modes of administration or new ways of effectively transporting active molecules to their target.

La membrane plasmique constituant une barrière physique à l'entrée de corps étrangers dans la cellule, lorsque la cible d'une molécule active est intracellulaire, le mode d'administration doit comprendre un moyen pour l'internalisation de la molécule dans le cytoplasme ou dans le noyau de la cellule cible. Since the plasma membrane constitutes a physical barrier to the entry of foreign bodies into the cell, when the target of an active molecule is intracellular, the mode of administration must include a means for the internalization of the molecule in the cytoplasm or in the nucleus of the target cell.

Différents méthodes et vecteurs sont décrits dans l'état de la technique pour le transfert d'acides nucléiques au noyau des cellules notamment en vue d'applications dans le domaine de la thérapie génique. Parmi ces vecteurs, un grand nombre sont dérivés de structure virale. D'autres méthodes ont été proposées incluant l'électroporation, la fusion membranaire au moyen de liposomes ou les micro-injections directes dans des cellules isolées. Various methods and vectors are described in the state of the art for the transfer of nucleic acids to the nucleus of cells, in particular with a view to applications in the field of gene therapy. Among these vectors, a large number are derived from viral structure. Other methods have been proposed including electroporation, liposome membrane fusion or direct microinjection into isolated cells.

Le brevet US 5,635,383 illustre également un autre type de vecteur, à base de polylysine, pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules. US Pat. No. 5,635,383 also illustrates another type of polylysine-based vector for the transfer of nucleic acids into cells.

On a également proposé d'utiliser des produits de couplage de molécules d'intérêt avec des ligands de récepteurs internalisables (Wagner et al. Adv. Drug. De/. Rev. 1994, 14: 113-135 ; Chen et al. FEBS Lett. 1994 338 :167- 169). It has also been proposed to use coupling products of molecules of interest with internalisable receptor ligands (Wagner et al., Adv Drug, De / Rev. 1994, 14: 113-135, Chen et al., FEBS Lett. 1994 338: 167-169).

Plus récemment, différents peptides ayant la capacité de transférer des molécules dans le cytoplasme ou le noyau des cellules ont été décrits (Prochiantz, 2000, Current Opinion in Cell Biology 12 : 400-406 ; Ford et al. More recently, various peptides having the ability to transfer molecules into the cytoplasm or nucleus of cells have been described (Prochiantz, 2000, Current Opinion in Cell Biology 12: 400-406, Ford et al.

2001, Gène Therapy, 8 : 1-4). 2001, Gene Therapy, 8: 1-4).

La structure de ces peptides, appelée domaine de transduction de protéines, comprend en particulier un motif polycationique de résidus riches en lysine et arginine. Ces peptides ont, de manière inhérente, la capacité de traverser la membrane des cellules et sont alors généralement localisés dans le noyau des cellules. The structure of these peptides, called the protein transduction domain, comprises in particular a polycationic moiety of residues rich in lysine and arginine. These peptides inherently have the ability to cross the cell membrane and are then generally located in the cell nucleus.

On peut citer, à titre d'exemples, les peptides dérivés de la protéine TAT de HIV-1 (US 6,316,003) ou de l'homéodomaine de la troisième hélice d'Antennapedia (NZ 503007). Examples which may be mentioned include peptides derived from the TAT protein of HIV-1 (US Pat. No. 6,316,003) or the homeodomain of the third Antennapedia helix (NZ 50,3007).

La demande de brevet FR 9709972 décrit également l'utilisation de fragments d'anticorps, choisis dans des régions spécifiques porteuses d'une activité de pénétration cellulaire. The patent application FR 9709972 also describes the use of antibody fragments, chosen from specific regions carrying a cell penetration activity.

Il n'existe cependant à ce jour pas de similarité claire entre les différents peptides identifiés permettant de définir une structure commune. Le mode d'action par lequel ces peptides sont internalisés dans les cellules n'a également pas encore été élucidé. Cependant, leur petite taille moléculaire, leur capacité à traverser la paroi des vaisseaux sanguins et à transférer des molécules de taille importante jusqu'au cytoplasme ou au noyau des cellules en font des candidats intéressants pour le transfert de molécules d'intérêt dans les cellules. However, there is currently no clear similarity between the different peptides identified to define a common structure. The mode of action by which these peptides are internalized in cells has not yet been elucidated. However, their small molecular size, ability to cross the blood vessel wall and transfer large molecules to the cytoplasm or cell nucleus make them attractive candidates for transferring molecules of interest into cells.

La présente invention découle en partie de l'étude de peptides capables de se fixer in vitro sur des protéines phosphatase 2A ou sur l'une de leurs sousunités (A), (B) ou (C), ces peptides étant tous dérivés de protéines connues pour moduler l'activité de la protéine phosphatase 2A. The present invention arises in part from the study of peptides capable of binding in vitro to phosphatase 2A proteins or to one of their subunits (A), (B) or (C), these peptides being all derived from proteins known to modulate the activity of protein phosphatase 2A.

Certains avantages de ces peptides, corrélés à leur propriété de liaison in vitro à la protéine phosphatase 2A, ont été décrits dans la demande de brevet FR 0110139. Some advantages of these peptides, correlated with their in vitro binding property to protein phosphatase 2A, have been described in patent application FR 0110139.

Les inventeurs ont maintenant constaté de manière inattendue, que certains fragments de protéines virales, parasitaires ou cellulaires, liant in vitro la protéine phosphatase 2A, ont la capacité de pénétrer dans le cytoplasme des cellules eucaryotes. Ces peptides sont appelés ci-après peptides pénétrants . Ces peptides étant de petites tailles, ils sont en outre susceptibles de transférer dans le cytoplasme et/ou le noyau des cellules, des molécules d'intérêt auxquelles ils sont couplés, sans interférer avec l'éventuelle activité biologique de ces dernières. The inventors have now unexpectedly found that certain fragments of viral proteins, parasitic or cellular, binding in vitro protein phosphatase 2A, have the capacity to penetrate the cytoplasm of eukaryotic cells. These peptides are hereinafter referred to as penetrating peptides. These peptides being small in size, they are also capable of transferring into the cytoplasm and / or the nucleus of the cells, molecules of interest to which they are coupled, without interfering with the possible biological activity of the latter.

Au sens de l'invention, on désigne par le terme peptide , une molécule comprenant un enchaînement d'acides aminés, ayant une taille comprise entre 3 et 30 acides aminés. On désigne par le terme polypeptide , une molécule comprenant un enchaînement d'acides aminés, ayant une taille comprise entre 3 et 300 acides aminés, de préférence inférieure à 100 acides aminés. For the purpose of the invention, the term "peptide" denotes a molecule comprising a chain of amino acids having a size of between 3 and 30 amino acids. The term "polypeptide" denotes a molecule comprising a chain of amino acids having a size of between 3 and 300 amino acids, preferably less than 100 amino acids.

Au sens de l'invention, on désigne par le terme peptide pénétrant , un peptide qui, lorsqu'il est mis en contact avec une cellule dans des conditions appropriées, passe du milieu extérieur dans le milieu intracellulaire, et notamment le cytoplasme ou le noyau de la cellule, dans des proportions significativement supérieures à une diffusion passive. For the purposes of the invention, the term "penetrating peptide" denotes a peptide which, when it is brought into contact with a cell under appropriate conditions, passes from the external medium into the intracellular medium, and in particular the cytoplasm or nucleus. of the cell, in proportions significantly higher than a passive diffusion.

Cette propriété peut se déterminer de différentes façons, et notamment selon un test de pénétration cellulaire tel que décrit dans la partie expérimentale ciaprès au paragraphe 1.3. This property can be determined in various ways, and in particular according to a cell penetration test as described in the experimental section below in paragraph 1.3.

Un premier objet de l'invention réside plus particulièrement dans un vecteur pour le transfert d'une molécule d'intérêt dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend : un peptide pénétrant choisi parmi l'une des séquences suivantes : a) VKKKKIKREIKI (SEQ ID NO:1), (RQKRLI)3 (SEQ ID NO :2), (RHSRIG)3 (SEQ ID N0:3) et RHSRIGIIQQRRTRNG (SEQ ID NO :4); RHSRIGVTRQRRARNG (SEQ ID NO :5) ;
RRRRRRRSRGRRRTY (SEQ ID NO :6) ; ou, b) une séquence homologue de l'une des séquences visées en (a), auquel est couplée ladite molécule d'intérêt. A first subject of the invention resides more particularly in a vector for the transfer of a molecule of interest into a cell, characterized in that it comprises: a penetrating peptide chosen from one of the following sequences: a) VKKKKIKREIKI (SEQ ID NO: 1), (RQKRLI) 3 (SEQ ID NO: 2), (RHSRIG) 3 (SEQ ID NO: 3) and RHSRIGIIQQRRTRNG (SEQ ID NO: 4); RHSRIGVTRQRRRNG (SEQ ID NO: 5);
RRRRRRRRSRGRRRTY (SEQ ID NO: 6); or, b) a sequence homologous to one of the sequences referred to in (a), to which said molecule of interest is coupled.

Le vecteur selon l'invention permet ainsi de transférer une molécule d'intérêt dans une cellule cible, lorsqu'il est mis en contact dans des conditions appropriées avec les cellules visées. Il peut naturellement être préparé en vue d'un transfert in vivo de molécules d'intérêt dans les cellules cibles d'un organisme ou d'un transfert ex vivo ou in vitro de molécules d'intérêt dans des cellules cibles en culture. Les applications de ces vecteurs seront décrites plus loin plus amplement. The vector according to the invention thus makes it possible to transfer a molecule of interest into a target cell, when it is contacted under appropriate conditions with the targeted cells. It can naturally be prepared for in vivo transfer of molecules of interest into the target cells of an organism or an ex vivo or in vitro transfer of molecules of interest into target cells in culture. The applications of these vectors will be described later more amply.

Plus préférentiellement, les peptides pénétrants selon l'invention sont dérivés des molécules CK2a de T. parva (SEQ ID NO:1), CK2a de P. Falciparum (SEQ ID NO :2), Vpr de HIV-1 (SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO :5) et la protamine (SEQ ID NO :6). More preferably, the penetrating peptides according to the invention are derived from the CK2a molecules of T. parva (SEQ ID NO: 1), CK2a of P. Falciparum (SEQ ID NO: 2), Vpr of HIV-1 (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5) and protamine (SEQ ID NO: 6).

Les peptides pénétrants selon l'invention comprennent également les peptides de séquences homologues aux séquences SEQ ID NO : 1-6 définies The penetrating peptides according to the invention also comprise the peptides of sequences homologous to the SEQ ID NO: 1-6 sequences defined.

plus haut. Ces peptides de séquences homologues sont encore appelés variants fonctionnels. upper. These peptides of homologous sequences are also called functional variants.

Par séquence homologue , il faut comprendre au sens de l'invention, une séquence se distinguant de l'une des séquences SEQ ID N0:1-6 avec laquelle elle serait alignée, par substitution ou délétion d'au moins un acide aminé et conservant néanmoins la capacité de pénétrer dans la cellule, ladite séquence homologue présentant au moins 70%, mieux au moins 80% et mieux encore au moins 90% d'identité sur la longueur de l'alignement réalisé avec la séquence d'origine choisie parmi les séquences visées en (a). By homologous sequence, it is to be understood within the meaning of the invention, a sequence which is distinguished from one of the sequences SEQ ID NO: 1-6 with which it would be aligned, by substitution or deletion of at least one amino acid and retaining nevertheless the capacity to penetrate the cell, said homologous sequence having at least 70%, better at least 80% and better still at least 90% identity over the length of the alignment made with the original sequence chosen from the sequences referred to in (a).

De préférence, on considèrera qu'un peptide homologue a conservé la propriété de pénétrer dans la cellule si le nombre de molécules transférées par le peptide de séquence homologue dans les cellules in vitro évalué à l'aide du test de pénétration cellulaire décrit ci-après dans la partie expérimentale n'est pas diminué de plus de 20 à 30% par rapport au nombre de molécules transférées par le peptide d'origine dont il dérive. Preferably, it will be considered that a homologous peptide has retained the property of entering the cell if the number of molecules transferred by the homologous sequence peptide into the cells in vitro evaluated using the cell penetration test described below. in the experimental part is not decreased by more than 20 to 30% relative to the number of molecules transferred by the original peptide from which it derives.

Une séquence homologue peut par exemple être identifiée en recherchant dans les bases de données une séquence de protéine connue pour lier in vitro la protéine phosphatase 2A et pouvant être alignée à l'aide d'un programme d'alignement optimal avec l'une des séquences SEQ ID NO 1-6. For example, a homologous sequence can be identified by searching the databases for a protein sequence known to bind Protein phosphatase 2A in vitro and can be aligned using an optimal alignment program with one of the sequences. SEQ ID NO 1-6.

Un programme d'alignement optimal classiquement utilisé pour déterminer l'identité entre deux séquences est par exemple le programme BESTFIT (Wisconsin Genetic Software Package, GCG). An optimal alignment program conventionally used to determine the identity between two sequences is, for example, the BESTFIT program (Wisconsin Genetic Software Package (GCG)).

Il peut s'agir également d'une séquence artificielle conçue par délétion ou substitution volontaire d'acides aminés par rapport à l'une des séquences SEQ ID NO :1-6. It may also be an artificial sequence designed by deletion or voluntary substitution of amino acids with respect to one of the sequences SEQ ID NO: 1-6.

De manière préférée, seuls les acides aminés dont la délétion n'affecte pas les propriétés de pénétration cellulaire dudit peptide pénétrant sont In a preferred manner, only the amino acids whose deletion does not affect the cell penetration properties of said penetrating peptide are

substitués ou supprimés. De préférence, un nombre de résidus n'excédent pas 20 à 30% de la longueur totale du peptide pénétrant est modifié. substituted or deleted. Preferably, a number of residues does not exceed 20 to 30% of the total length of the penetrant peptide is modified.

Les acides aminés essentiels, c'est à dire les acides aminés dont la délétion entraîne une diminution statistiquement significative de la capacité du peptide à pénétrer dans la cellule ou une augmentation statistiquement significative de sa toxicité, peuvent toutefois être modifiés le cas échéant par substitution avec des acides aminés équivalent, c'est à dire de même fonction chimique, dans la mesure où la structure du peptide pénétrant n'en est généralement pas altérée. The essential amino acids, ie the amino acids whose deletion results in a statistically significant decrease in the capacity of the peptide to enter the cell or a statistically significant increase in its toxicity, may, however, be modified if necessary by substitution with equivalent amino acids, ie with the same chemical function, insofar as the structure of the penetrating peptide is generally not impaired.

Le peptide pénétrant selon l'invention peut en outre comporter certaines modifications structurales, de nature chimique ou enzymatique par exemple. Ainsi, le peptide peut comporter certains groupes fonctionnels pouvant, par réaction chimique ou enzymatique, permettre un couplage avec une autre substance. Les polypeptides de l'invention peuvent en outre être modifiés chimiquement afin de les rendre résistants à des protéases ou moins visibles au système immunitaire. Ils peuvent également comporter une polylysine permettant d'améliorer les propriétés de compaction des polypeptides et d'internalisation au noyau des cellules. The penetrating peptide according to the invention may further comprise certain structural modifications, of a chemical or enzymatic nature, for example. Thus, the peptide can comprise certain functional groups which can, by chemical or enzymatic reaction, allow a coupling with another substance. The polypeptides of the invention may further be chemically modified to render them resistant to proteases or less visible to the immune system. They may also comprise a polylysine making it possible to improve the compaction properties of the polypeptides and internalization at the nucleus of the cells.

Tout moyen connu de l'homme du métier peut être utilisé pour la préparation du peptide pénétrant tel que défini ci-dessus. En particulier, les peptides peuvent être synthétisés par synthèse chimique, par exemple au moyen de synthétiseurs de peptides, ou par fragmentation ou délétion à partir de polypeptides, naturels ou non, de taille supérieure. Ils peuvent en outre être préparés par les techniques de génie génétique, par expression , dans un hôte cellulaire eucaryote ou procaryote, d'un acide nucléique correspondant. Ils peuvent également résulter de combinaisons de ces différentes méthodes. Any means known to those skilled in the art can be used for the preparation of the penetrating peptide as defined above. In particular, the peptides can be synthesized by chemical synthesis, for example by means of peptide synthesizers, or by fragmentation or deletion from polypeptides, natural or otherwise, of greater size. They may further be prepared by genetic engineering techniques by expression in a eukaryotic or prokaryotic cell host of a corresponding nucleic acid. They can also result from combinations of these different methods.

Un test de pénétration cellulaire ainsi qu'un test de viabilité cellulaire, utilisables pour tester les variants fonctionnels des peptides pénétrants, sont décrits ci-après dans la partie expérimentale. A cell penetration assay as well as a cell viability test, usable for testing the functional variants of the penetrating peptides, are described below in the experimental part.

Dans le présent texte, par molécule d'intérêt , il faut comprendre tout type de molécule caractérisée par le fait qu'elle se distingue du peptide pénétrant auquel elle est couplée et qu'elle n'est pas naturellement associée au peptide pénétrant auquel elle est couplée. De préférence, il s'agit d'une molécule qui ne présente pas seule, la capacité de pénétrer dans une cellule. In the present text, for each molecule of interest, it is necessary to understand any type of molecule characterized in that it is distinguished from the penetrant peptide to which it is coupled and that it is not naturally associated with the penetrating peptide to which it is coupled. Preferably, it is a molecule that does not have the unique ability to enter a cell.

On citera à titre d'exemples de molécules d'intérêt, les acides nucléiques, tels que les ADN, ARN, oligonucléotides, les acides nucléiques antisens, les plasmides ou les cosmides. On citera également comme exemples préférés de molécules d'intérêt les peptides ou les polypeptides, et notamment, les enzymes, les facteurs de régulation d'activité enzymatique, les ligands de récepteurs, les haptènes, les antigènes ou les anticorps et fragments d'anticorps. Examples of molecules of interest are nucleic acids, such as DNAs, RNAs, oligonucleotides, antisense nucleic acids, plasmids or cosmids. Other preferred examples of molecules of interest are peptides or polypeptides, and especially enzymes, enzymatic activity regulating factors, receptor ligands, haptens, antigens or antibodies and antibody fragments. .

Bien entendu, l'homme du métier choisira les molécules appropriées en fonction de l'application qu'il souhaite. Ces molécules d'intérêt peuvent être choisies notamment parmi les principes actifs de médicaments, incluant les immunotoxines, les antioxydants, les antibiotiques, les facteurs de croissances, les hormones intracellulaires, les cytokines, les toxines, les neuromédiateurs, les agents antimicrobiens, en particulier, antiviraux, antibactériens et antiparasitaires, ou antitumoraux ou encore tout autre agent thérapeutique ou prophylactique d'intérêt. Of course, those skilled in the art will choose the appropriate molecules according to the application he wants. These molecules of interest can be chosen in particular from the active ingredients of drugs, including immunotoxins, antioxidants, antibiotics, growth factors, intracellular hormones, cytokines, toxins, neuromediators, antimicrobial agents, in particular , antiviral, antibacterial and antiparasitic, or anti-tumor or any other therapeutic or prophylactic agent of interest.

La molécule d'intérêt est couplée au peptide pénétrant. Le terme couplé signifie au sens de l'invention tout type d'interaction permettant une association physique entre la substance et le polypeptide. Il est préférable cependant que l'interaction soit suffisamment stable pour que le vecteur ne se dissocie pas avant la pénétration cellulaire. Pour cette raison, un couplage préféré au sens de l'invention est un couplage covalent. Il peut être direct ou The molecule of interest is coupled to the penetrating peptide. For the purposes of the invention, the term "coupled" means any type of interaction allowing a physical association between the substance and the polypeptide. It is preferable, however, that the interaction is sufficiently stable so that the vector does not dissociate before cell penetration. For this reason, a preferred coupling within the meaning of the invention is a covalent coupling. It can be direct or

réalisé par l'intermédiaire d'un agent de pontage chimique bien connu de l'homme du métier, pour l'obtention du conjugué. En particulier, il peut s'effectuer par des liaisons de type maléimide, succinimide, peptidique, disulfide et thioether. On peut en particulier se référer à l'ouvrage Bioconjugate Techniques de Greg. T. HERMANSON (Académie Press, 1996) . realized by means of a chemical bridging agent well known to those skilled in the art, for obtaining the conjugate. In particular, it can be carried out by bonds of the maleimide, succinimide, peptidic, disulfide and thioether type. In particular, one can refer to Greg's Bioconjugate Techniques book. T. HERMANSON (Academy Press, 1996).

Une méthode particulière consiste par exemple à ajouter, à une extrémité d'un peptide pénétrant un lieur , constitué d'au moins une cystéine qui peut être aisément utilisée pour des liaisons disulfure, amine ou acide. Une autre approche consiste à coupler chimiquement un groupement biotinyl, qui permet de coupler ensuite toute substance liée à la streptavidine. A particular method is for example to add at one end of a penetrating peptide a linker consisting of at least one cysteine which can be easily used for disulfide, amine or acid linkages. Another approach consists in chemically coupling a biotinyl group, which then makes it possible to couple any substance bound to streptavidin.

De manière générale, tout procédé de couplage chimique, biochimique, enzymatique ou génétique connu dans la littérature peut être employé (pour revue voir par exemple Methods of lmmunological Analysis, Volume 2, René Masseyeff, Winfried Albert, Norman A. Staines VCH. Décembre 1992; Handbook of Expérimental immunology, Volume 1, 2nd Edition, Ed. D.M. In general, any chemical, biochemical, enzymatic or genetic coupling method known in the literature may be employed (for review see, for example, Methods of Immunological Analysis, Volume 2, René Masseyff, Winfried Albert, Norman A. Staines VCH, December 1992). Handbook of Experimental Immunology, Volume 1, 2nd Edition, Ed. DM

Weir, Blackwell Scientific Publications, Oxford. ) Dans un mode de réalisation, la molécule d'intérêt est couplée directement audit peptide pénétrant par pontage chimique. Weir, Blackwell Scientific Publications, Oxford. In one embodiment, the molecule of interest is coupled directly to said penetrating peptide by chemical bridging.

Le couplage peut également être le résultat du couplage de la molécule d'intérêt et du peptide pénétrant à une molécule, dite intermédiaire . Coupling can also be the result of the coupling of the molecule of interest and the penetrating peptide to a so-called intermediate molecule.

Lorsque le peptide pénétrant est couplé à une molécule d'intérêt de type peptide ou polypeptide, le vecteur peut avantageusement être produit par l'expression d'une séquence codante comprenant en cis, d'une part la séquence du peptide pénétrant et d'autre part la séquence d'un peptide ou polypeptide d'intérêt. L'invention vise en particulier un polynucléotide constitué de la séquence codante d'un peptide pénétrant et d'une autre séquence codant ledit peptide ou polypeptide d'intérêt. When the penetrant peptide is coupled to a molecule of interest of the peptide or polypeptide type, the vector can advantageously be produced by the expression of a coding sequence comprising in cis, on the one hand, the sequence of the penetrating peptide and on the other hand the sequence of a peptide or polypeptide of interest. In particular, the invention provides a polynucleotide consisting of the coding sequence of a penetrating peptide and another sequence encoding said peptide or polypeptide of interest.

L'invention vise également une méthode de préparation d'un tel vecteur, comprenant l'incorporation dans un hôte cellulaire approprié d'un polynucléotide défini ci-dessus sous une forme appropriée pour l'expression du peptide ou polypeptide pour lequel il code, suivi de la mise en culture de l'hôte cellulaire ainsi recombiné, et la récupération dudit peptide ou polypeptide ainsi exprimé. De préférence, l'hôte cellulaire est choisi parmi les cellules eucaryotes supérieures, notamment les lignées établies de cellules de mammifères. The invention also provides a method for preparing such a vector, comprising incorporating into a suitable cellular host a polynucleotide defined above in a form suitable for the expression of the peptide or polypeptide for which it encodes, followed by culturing the thus recombined cell host, and recovering said peptide or polypeptide thus expressed. Preferably, the cellular host is selected from higher eukaryotic cells, including established mammalian cell lines.

Dans un mode de réalisation particulier selon l'invention, le vecteur est constitué essentiellement d'un peptide pénétrant choisi parmi les peptides constitués par l'une des séquences suivantes : a) VKKKKIKREIKI (SEQ ID NO:1), (RQKRLI)3 (SEQ ID NO :2), (RHSRIG)3 (SEQ ID N0:3) et RHSRIGIIQQRRTRNG (SEQ ID NO :4); RHSRIGVTRQRRARNG (SEQ ID NO :5) ;
RRRRRRRSRGRRRTY (SEQ ID NO :6) ; ou, b) une séquence homologue de l'une des séquences visées en (a), auquel est couplée ladite molécule d'intérêt. In a particular embodiment according to the invention, the vector consists essentially of a penetrating peptide chosen from peptides constituted by one of the following sequences: a) VKKKKIKREIKI (SEQ ID NO: 1), (RQKRLI) 3 ( SEQ ID NO: 2), (RHSRIG) 3 (SEQ ID NO: 3) and RHSRIGIIQQRRTRNG (SEQ ID NO: 4); RHSRIGVTRQRRRNG (SEQ ID NO: 5);
RRRRRRRRSRGRRRTY (SEQ ID NO: 6); or, b) a sequence homologous to one of the sequences referred to in (a), to which said molecule of interest is coupled.

Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur selon l'invention peut en plus comprendre de manière avantageuse, une molécule susceptible de reconnaître spécifiquement un marqueur cellulaire de surface. De telles molécules sont notamment choisies parmi des anticorps ou fragment d'anticorps reconnaissant spécifiquement un antigène exprimé à la surface de cellules spécifiques. Le couplage d'une molécule susceptible de reconnaître spécifiquement un marqueur cellulaire de surface, d'un peptide pénétrant et d'une molécule active permet ainsi une meilleure spécificité d'adressage d'une molécule d'intérêt in vivo. In a particular embodiment, the vector according to the invention may additionally advantageously comprise a molecule capable of specifically recognizing a surface cell marker. Such molecules are in particular chosen from antibodies or antibody fragments specifically recognizing an antigen expressed on the surface of specific cells. The coupling of a molecule capable of specifically recognizing a surface cell marker, a penetrating peptide and an active molecule thus allows a better targeting specificity of a molecule of interest in vivo.

Dans un autre mode de réalisation, le vecteur selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend un polymère d'un peptide pénétrant tel que In another embodiment, the vector according to the invention is characterized in that it comprises a polymer of a penetrating peptide such that

défini plus haut, ou une fusion de différents peptides pénétrants tels que définis plus haut, auxquels est couplée ladite molécule d'intérêt. defined above, or a fusion of different penetrating peptides as defined above, to which is coupled said molecule of interest.

La répétition des motifs ou la combinaison des motifs des peptides pénétrants peut permettre dans certains cas d'accroître la capacité de pénétration du vecteur dans les cellules. The repetition of the motifs or the combination of the motifs of the penetrating peptides may in certain cases make it possible to increase the capacity of the vector to penetrate into the cells.

Naturellement, l'invention vise également l'utilisation d'un peptide pénétrant ou d'un vecteur tel que défini plus haut, dans la préparation d'une composition destinée au transfert d'une molécule d'intérêt dans une cellule. Naturally, the invention also relates to the use of a penetrating peptide or a vector as defined above, in the preparation of a composition intended for the transfer of a molecule of interest into a cell.

Le peptide pénétrant selon l'invention peut notamment être utilisé pour le traitement des cellules tumorales, lorsqu'il est couplé à une molécule antitumorale et, le cas échéant, à une molécule d'adressage à certaines cellules tumorales spécifiques. On citera en particulier le couplage du méthotrexate dont il a été montré que le transfert intracellulaire permet d'accroître l'efficacité d'agents anti-tumoraux ou du doxorubicine (Hamstra et al., 2000, Cancer Res 60:657-65 ; Rousselle et al., 2000, Mol Pharmacol 57 :679-86). The penetrating peptide according to the invention may in particular be used for the treatment of tumor cells, when it is coupled to an antitumor molecule and, where appropriate, to a molecule for addressing certain specific tumor cells. Of particular note is the coupling of methotrexate, the intracellular transfer of which has been shown to increase the efficacy of anti-tumor agents or doxorubicin (Hamstra et al., 2000, Cancer Res 60: 657-65; et al., 2000, Mol Pharmacol 57: 679-86).

Des molécules d'intérêt préférées sont notamment des molécules antivirales, antibactériennes et antiparasitaires. Preferred molecules of interest include antiviral, antibacterial and antiparasitic molecules.

Pour le transfert de molécules anti-tumorales, ou de molécules antivirales, antibactériennes et antiparasitaires, ou de molécules cytotoxiques, on préférera l'utilisation des peptides pénétrants de séquences SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO :6 ou de leur séquence homologue pour lesquels il a été montré que l'internalisation affecte la viabilité cellulaire. For the transfer of anti-tumor molecules, or antiviral, antibacterial and antiparasitic molecules, or of cytotoxic molecules, preference will be given to the use of the penetrating peptides of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 sequences or their homologous sequence for which internalization has been shown to affect cell viability.

Dans un autre mode de réalisation, on peut également utiliser des peptides pénétrants de séquences SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :2 couplés à des molécules qui affectent la viabilité cellulaire. In another embodiment, it is also possible to use penetrating peptides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 sequences coupled to molecules that affect cell viability.

Outre les applications in vivo des vecteurs selon l'invention, notamment dans le domaine thérapeutique, les vecteurs sont utiles pour de nombreuses In addition to the in vivo applications of the vectors according to the invention, especially in the therapeutic field, the vectors are useful for many

applications in vitro ou ex vivo. Par exemple, les vecteurs sont utiles comme moyen pour tester l'effet de certaines substances nucléaires ou cytoplasmiques nouvellement identifiées, sur la biologie de la cellule. De tels tests in vitro sont généralement très utiles avant d'envisager de nouvelles utilisations in vivo. in vitro or ex vivo applications. For example, the vectors are useful as a means for testing the effect of certain newly identified nuclear or cytoplasmic substances on the biology of the cell. Such in vitro tests are generally very useful before considering new uses in vivo.

Parmi les applications ex vivo envisageables, on citera en particulier l'expansion de cellules souches par stimulation de leur prolifération au moyen de l'internalisation de protéines telles que l'antigène grand T de SV40 ; l'internalisation d'antigènes par les cellules dendritiques en vue d'une vaccination, incluant notamment la thérapie anti-tumorale par stimulation du système immunitaire ou la thérapie génique par transfert d'acides nucléiques dans des cellules prélevées, par exemple des cellules du sang. Among the ex vivo applications that can be envisaged, mention will be made in particular of the expansion of stem cells by stimulation of their proliferation by means of the internalization of proteins such as the SV40 large T antigen; internalization of antigens by dendritic cells for vaccination, including in particular antitumor therapy by stimulation of the immune system or gene therapy by transfer of nucleic acids into sampled cells, for example blood cells .

Un autre aspect de l'invention concerne donc un procédé pour transférer in vitro une molécule d'intérêt dans une cellule comprenant : a) la préparation d'un vecteur selon l'invention tel que défini ci-dessus, comprenant le couplage d'une molécule d'intérêt à un peptide pénétrant, et b) l'incubation de la cellule avec le vecteur obtenu à l'étape a. dans des conditions permettant le transfert in vitro de la molécule d'intérêt dans la cellule. Another aspect of the invention therefore relates to a method for transferring in vitro a molecule of interest into a cell comprising: a) the preparation of a vector according to the invention as defined above, comprising the coupling of a molecule of interest to a penetrating peptide, and b) incubating the cell with the vector obtained in step a. under conditions allowing the in vitro transfer of the molecule of interest into the cell.

Les cellules visées pour les applications in vitro sont tout type de cellules, notamment des cellules procaryotes ou eucaryotes, des bactéries, des champignons, des levures, des protoplastes ou des cellules eucaryotes supérieures. Target cells for in vitro applications are any type of cells, including prokaryotic or eukaryotic cells, bacteria, fungi, yeasts, protoplasts or higher eukaryotic cells.

De préférence, ladite cellule est une cellule eucaryote en suspension dans un milieu de culture. Il peut notamment s'agir de cellules isolées d'un mammifère, de lignées cellulaires établies, de cellules primaires, de cellules Preferably, said cell is a eukaryotic cell suspended in a culture medium. It can in particular be cells isolated from a mammal, established cell lines, primary cells, cells

tumorales ou de cellules circulantes isolées des fluides biologiques, et notamment de cellules isolées du sang. tumors or circulating cells isolated from biological fluids, and in particular cells isolated from blood.

Les cellules de mammifères sont en particulier des cellules de mammifère non humain. Il peut cependant également s'agir de cellules humaines lorsqu'elles sont isolées de leur environnement naturel, et/ou lorsqu'elles sont modifiées par le vecteur de l'invention. Mammalian cells are in particular non-human mammalian cells. However, they can also be human cells when they are isolated from their natural environment, and / or when they are modified by the vector of the invention.

L'invention concerne donc des cellules traitées par un vecteur de l'invention, en particulier des cellules comportant ledit vecteur, ou des cellules exprimant la molécule d'intérêt apportée par ledit vecteur. Ces cellules, auxquelles une caractéristique particulière d'expression d'une molécule d'intérêt a été conférée par suite de leur modification avec le vecteur de l'invention, sont avantageusement des cellules de mammifère humain ou non humain. The invention thus relates to cells treated with a vector of the invention, in particular cells comprising said vector, or cells expressing the molecule of interest provided by said vector. These cells, to which a particular characteristic of expression of a molecule of interest has been conferred as a result of their modification with the vector of the invention, are advantageously mammalian or non-human mammalian cells.

Pour certaines applications particulières, la cellule visée est une cellule eucaryote d'un tissu prélevé d'un organisme, par exemple prélevé chez un patient, et susceptible d'être administrée à un organisme, par exemple à un patient, après internalisation de la molécule d'intérêt. For some particular applications, the target cell is a eukaryotic cell of a tissue taken from an organism, for example taken from a patient, and capable of being administered to an organism, for example to a patient, after internalization of the molecule. interest.

De telles applications dites ex vivo concernent notamment le domaine de la thérapie génique ou de la thérapie cellulaire pour lesquelles une molécule d'intérêt qui n'est pas produite adéquatement dans les cellules d'un patient est introduite ex vivo dans les cellules prélevées du patient puis les cellules, après avoir internalisé le vecteur comprenant la molécule d'intérêt, sont administrées au patient. Such ex vivo applications concern in particular the field of gene therapy or cell therapy for which a molecule of interest which is not produced properly in the cells of a patient is introduced ex vivo into the cells taken from the patient. then the cells, after having internalized the vector comprising the molecule of interest, are administered to the patient.

Par production non adéquate, on entend une production dont le niveau n'est pas physiologique, et est corrélée à l'observation d'une pathologie chez un patient. By unsuitable production is meant a production whose level is not physiological, and is correlated with the observation of a pathology in a patient.

Ainsi, dans un mode de mise en #uvre de la méthode selon l'invention, la molécule d'intérêt est une molécule qui n'est pas produite adéquatement dans la cellule dans laquelle le vecteur doit être transféré. Thus, in one embodiment of the method according to the invention, the molecule of interest is a molecule that is not produced properly in the cell in which the vector is to be transferred.

Il a également été constaté de façon plus particulièrement surprenante, que, contrairement aux peptides pénétrants déjà décrits dans l'état de la technique, le peptide selon l'invention de séquence SEQ ID NO : 1 se localise au cytoplasme et non au noyau des cellules après internalisation. Or, dans certaines applications, il peut être avantageux d'éviter le transfert de la molécule d'intérêt au noyau des cellules ou de cibler le transfert préférentiellement au cytoplasme des cellules. It has also been found, more particularly surprisingly, that, unlike the penetrating peptides already described in the state of the art, the peptide according to the invention of sequence SEQ ID NO: 1 is localized to the cytoplasm and not to the nucleus of the cells. after internalization. However, in some applications, it may be advantageous to avoid the transfer of the molecule of interest to the nucleus of the cells or to target the transfer preferentially to the cytoplasm of the cells.

Aussi, dans un mode de mise en #uvre particulier de la méthode, pour le transfert d'une molécule d'intérêt essentiellement au cytoplasme d'une cellule, le peptide pénétrant choisi pour la préparation du vecteur est le peptide de séquence SEQ ID NO : 1 ou un variant fonctionnel de ce peptide. Also, in a particular mode of implementation of the method, for the transfer of a molecule of interest essentially to the cytoplasm of a cell, the penetrant peptide chosen for the preparation of the vector is the peptide of sequence SEQ ID NO : 1 or a functional variant of this peptide.

On considérera qu'une molécule d'intérêt est transférée essentiellement au cytoplasme des cellules, si, en moyenne, plus de 80% des molécules d'intérêt internalisées dans une cellule sont localisées au cytoplasme. It will be considered that a molecule of interest is transferred essentially to the cytoplasm of cells if, on average, more than 80% of the molecules of interest internalized in a cell are located in the cytoplasm.

Le terme localisation cytoplasmique s'entend par opposition à une localisation nucléaire. Bien entendu, les molécules sont également susceptibles d'être localisées dans des organelles localisées dans le cytoplasme, telles que des granules de sécrétion, des vésicules d'endocytoses, les mitochondries ou le corps de golgi. The term cytoplasmic localization is understood as opposed to a nuclear localization. Of course, the molecules are also likely to be localized in organelles located in the cytoplasm, such as secretory granules, endocytosis vesicles, mitochondria or the body of golgi.

L'invention vise naturellement une composition comprenant des cellules dans lesquelles un vecteur selon l'invention a été internalisé. The invention naturally aims at a composition comprising cells in which a vector according to the invention has been internalized.

L'invention concerne également une composition thérapeutique comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, un vecteur The invention also relates to a therapeutic composition comprising, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, a vector

selon l'invention tel que défini ci-dessus, dans lequel la molécule d'intérêt est un principe actif de médicament. according to the invention as defined above, wherein the molecule of interest is a drug active ingredient.

Dans un mode réalisation particulier, la molécule d'intérêt est un antigène et la composition pharmaceutique ainsi obtenue est une composition immunogène et/ou vaccinante. In a particular embodiment, the molecule of interest is an antigen and the pharmaceutical composition thus obtained is an immunogenic and / or vaccinating composition.

De manière générale, les inventeurs ont constaté que la propriété de lier in vitro la protéine phosphatase 2A pourrait être corrélée au caractère pénétrant des peptides identifiés. Aussi, tout peptide ayant la capacité de lier in vitro la protéine phosphatase 2A pourrait être sélectionné en vue de déterminer son caractère pénétrant. Un autre aspect de l'invention concerne plus généralement une méthode pour identifier des peptides pénétrants utilisables dans des vecteurs pour le transfert de molécule d'intérêt dans les cellules, ladite méthode comprenant : a. la sélection, parmi des peptides dérivés d'une protéine interagissant avec une protéine phosphatase 2A ou l'une de ses sous-unités (A), (B) ou (C), de peptides ayant la capacité de lier in vitro la protéine phosphatase 2A et b. l'identification, parmi les peptides sélectionnés en a. des peptides pénétrants à l'aide d'un test de pénétration cellulaire. In general, the inventors have found that the property of binding in vitro protein phosphatase 2A could be correlated with the penetrating nature of the peptides identified. Also, any peptide having the ability to bind in vitro protein phosphatase 2A could be selected for its penetrating character. Another aspect of the invention more generally relates to a method for identifying penetrating peptides useful in vectors for transfer of molecule of interest into cells, said method comprising: a. the selection, among peptides derived from a protein interacting with a protein phosphatase 2A or one of its subunits (A), (B) or (C), of peptides having the capacity to bind the protein phosphatase in vitro 2A and b. identification, among the peptides selected in a. penetrating peptides using a cell penetration assay.

Les peptides sélectionnés pour leur liaison avec une protéine phosphatase 2A ou l'une de ses sous-unités, sont de préférence déterminés parmi des fragments de protéines virales, parasitaires ou cellulaires, lesquelles protéines ont été montrées interagir in vivo ou in vitro avec une protéine phosphatase de type 2A. The peptides selected for their binding with a protein phosphatase 2A or one of its subunits are preferably determined from fragments of viral, parasitic or cellular proteins, which proteins have been shown to interact in vivo or in vitro with a protein. phosphatase type 2A.

De telles protéines virales, parasitaires ou cellulaires sont en particulier choisies parmi l'une des protéines suivantes : antigène t de SV40 ou de polyôme, antigène moyen t de polyôme, sous unité de PP2A de type B (B, B', B"), CK2a, CaMIV, p70S6-kinase, Pak1/Pak3, Tap42/alpha 4, PTPA, Such viral, parasitic or cellular proteins are in particular chosen from one of the following proteins: SV40 or polyoma antigen, medium polyoma antigen, PP2A subunit of type B (B, B ', B ") , CK2a, CaMIV, p70S6-kinase, Pak1 / Pak3, Tap42 / alpha4, PTPA,

Set/I1/I2-PP2A, E4orf4, tau, Vpr ou CD28, CCXR2 (récepteur de chemokine). Set / I1 / I2-PP2A, E4orf4, tau, Vpr or CD28, CCXR2 (chemokine receptor).

Une méthode pour l'identification d'un peptide liant spécifiquement une holoenzyme protéine phosphatase de type 2A ou l'une de ses sous-unités préférée est la méthode comprenant les étapes consistant à : a) déposer sous forme de spots, sur un support, des peptides dont la séquence est issue d'une protéine virale, parasitaire ou cellulaire, chaque spot correspondant au dépôt d'un peptide de séquence définie, b) mettre en contact le support solide avec une solution contenant une holoenzyme protéine phosphatase 2A ou l'une de ses sous-unités dans des conditions permettant aux peptides présents sur le support, de lier l'holoenzyme ou l'une de ses sous-unités, et, c) à identifier sur le support solide, le peptide sur lequel se fixe la protéine phosphatase 2A ou l'une de ses sous-unités. A method for the identification of a peptide specifically binding a type 2A protein phosphatase holoenzyme or a preferred subunit thereof is the method comprising the steps of: a) spotting, on a support, peptides whose sequence is derived from a viral, parasitic or cellular protein, each spot corresponding to the deposition of a peptide of defined sequence, b) contacting the solid support with a solution containing a holoenzyme protein phosphatase 2A or the one of its subunits under conditions allowing the peptides present on the support, to bind the holoenzyme or one of its subunits, and, c) to identify on the solid support, the peptide on which the protein phosphatase 2A or any of its subunits.

Selon l'étape a), différents peptides sont déposés sur un support solide à des positions définies ( spot ), chaque position correspondant à une séquence peptidique spécifique et l'ensemble formant ainsi un réseau de peptides ( array ) à deux dimensions. Différentes méthodes de préparation de tels réseaux ont été décrites récemment (pour revue, Figeys et Pinto, 2001 Electrophoresis 22 : 208-216 ; Walter et al., 2000 Curr Opin Microbiol 3 : 298-302). L'ensemble de ces méthodes comprend en général la fixation covalente de peptides sur un support, en particulier à l'aide de lieurs (linkers) chimiques. A titre d'exemple, l'homme du métier pourra notamment se reporter à la technique des SPOT synthesis consistant à synthétiser directement sur une membrane de cellulose, des peptides comprenant jusqu'à 20 résidus (Frank et Overwing, Methods in Molecular Biology, 1996, vol. 66 : 149-169, Epitope Mapping Protocols edited by : G. E. Morris Humana Press Inc., Totowa NJ). According to step a), different peptides are deposited on a solid support at defined positions (spot), each position corresponding to a specific peptide sequence and the assembly thus forming a two-dimensional array of peptides. Various methods for preparing such networks have been recently described (for review, Figeys and Pinto, 2001 Electrophoresis 22: 208-216, Walter et al., 2000 Curr Opin Microbiol 3: 298-302). All of these methods generally comprise the covalent attachment of peptides to a support, in particular using chemical linkers. By way of example, one skilled in the art can refer in particular to the technique of SPOT synthesis consisting in directly synthesizing on a cellulose membrane, peptides comprising up to 20 residues (Frank and Overwing, Methods in Molecular Biology, 1996). , 66: 149-169, Epitope Mapping Protocols edited by: GE Morris Humana Press Inc., Totowa NJ).

De manière générale, toute méthode peut être utilisée dès lors que celle-ci permet l'obtention d'un réseau de peptides déposés sur un support solide, utilisable pour détecter des interactions spécifiques entre les peptides déposés et des composés particuliers. In general, any method can be used as long as it makes it possible to obtain a network of peptides deposited on a solid support, which can be used to detect specific interactions between the peptides deposited and particular compounds.

De façon très préférée, l'ensemble des séquences de peptides déposés recouvre la séquence complète de la protéine virale, parasitaire ou cellulaire dont ces séquences sont issues. Ainsi, la méthode permet de tester en une seule étape la séquence complète d'une protéine donnée, celle-ci étant sectionnée en un nombre fini de peptides, de séquences généralement chevauchantes. Very preferably, all the peptide sequences deposited cover the complete sequence of the viral, parasitic or cellular protein from which these sequences are derived. Thus, the method makes it possible to test in a single step the complete sequence of a given protein, which is divided into a finite number of peptides, generally overlapping sequences.

Les peptides déposés sous forme de spot sont de préférence d'une taille inférieure à 20 acides aminés, et mieux, d'une taille inférieure à 15 acides aminés. The peptides deposited in spot form are preferably less than 20 amino acids in size, and more preferably less than 15 amino acids in size.

Les peptides sont déposés par exemple sur un support formé par une membrane de cellulose. The peptides are deposited for example on a support formed by a cellulose membrane.

Le réseau ainsi obtenu est mis en contact à l'étape b), avec une holoenzyme protéine phosphatase de type 2A ou l'une de ses sous-unités. The network thus obtained is contacted in step b) with a holoenzyme protein phosphatase type 2A or one of its subunits.

Par holoenzyme protéine phosphatase de type 2A , il faut comprendre tout complexe dimérique (AC) ou hétérotrimérique (ABC), purifié d'un extrait cellulaire ou reconstitué après purification des deux sous-unités (A) et (C) d'une protéine phosphatase de type (2A) et le cas échéant d'une sous-unité (B). Les protéines phosphatases de type (2A) sont de préférence issues de mammifères. By holoenzyme protein phosphatase type 2A, it is necessary to understand any dimeric (AC) or heterotrimeric (ABC) complex, purified from a cell extract or reconstituted after purification of the two subunits (A) and (C) of a protein phosphatase of type (2A) and if necessary of a subunit (B). Protein phosphatases type (2A) are preferably derived from mammals.

Les supports sont incubés par exemple dans une solution tampon comprenant les protéines phosphatases purifiées ou l'une de leurs sousunités purifiées. Une solution tampon utilisable est le TBS (TRIS BORATE) contenant 5% de régilait écrémé et 3% de BSA. The supports are incubated, for example, in a buffer solution comprising the purified phosphatase proteins or one of their purified subunits. A buffer solution that can be used is TBS (TRIS BORATE) containing 5% skim milk and 3% BSA.

Le peptide sur lequel se fixe l'holoenzyme protéine phosphatase de type 2A est identifié en général par le marquage direct ou indirect de la protéine The peptide on which holoenzyme protein phosphatase type 2A binds is generally identified by the direct or indirect labeling of the protein

phosphatase et l'identification des spots au niveau desquels s'est fixée la protéine marquée. La fixation de la PP2A ou l'une de ses sous-unités au niveau de l'un des spots de peptides peut ainsi être révélée en particulier à l'aide d'antisérums, selon les techniques classiquement utilisées pour le Western Blot ou le test ELISA en phase solide, après incubation du support contenant le réseau de peptides avec un anticorps dirigé contre les sousunités (A) ou (B) ou (C) ou un mélange d'anticorps dirigé contre les sousunités (A), (B) ou (C) de PP2A. phosphatase and identification of the spots at which the labeled protein binds. The binding of PP2A or one of its subunits at one of the peptide spots can thus be revealed, in particular using antisera, according to the techniques conventionally used for the Western blot or the test. Solid-phase ELISA, after incubation of the peptide network-containing support with an antibody directed against subunits (A) or (B) or (C) or a mixture of antibodies directed against the subunits (A), (B) or (C) PP2A.

L'invention vise également une méthode de préparation d'un peptide pénétrant utilisable dans des vecteurs pour le transfert d'une molécule d'intérêt dans une cellule, ladite méthode comprenant a) l'identification de peptides dérivés d'une protéine interagissant avec une protéine phosphatase 2A ou l'une de ses sous-unités (A), (B) ou (C), ayant la capacité de lier in vitro ladite protéine phosphatase 2A, b) l'identification d'au moins un peptide pénétrant parmi ceux identifiés à l'étape (a) à l'aide d'un test de pénétration cellulaire, et c) la préparation, partout moyen connu, du peptide identifié à l'étape (b). The invention also relates to a method for preparing a penetrating peptide that can be used in vectors for transferring a molecule of interest into a cell, said method comprising a) the identification of peptides derived from a protein interacting with a protein phosphatase 2A or one of its subunits (A), (B) or (C), having the capacity to bind in vitro said protein phosphatase 2A, b) the identification of at least one peptide penetrating among those identified in step (a) using a cell penetration test, and c) the preparation, anywhere known means, of the peptide identified in step (b).

Les exemples présentés ci-après établissent de façon claire la capacité des peptides pénétrants selon l'invention à pénétrer dans les cellules. Ils démontrent en outre que les peptides pénétrants selon l'invention permettent l'internalisation dans les cellules de molécules de haut poids moléculaire telles que la peroxydase. Enfin, il a été montré que certains vecteurs n'affectent pas la viabilité des cellules et représentent donc des vecteurs utiles pour tout type d'applications in vivo ou in vitro. D'autres vecteurs, affectant la viabilité des cellules sont plus particulièrement utiles pour le transfert de molécules cytotoxiques, par exemple pour détruire in vivo ou ex vivo des cellules tumorales ou des cellules infectées ou encore tout type de pathogène. The examples presented below clearly establish the ability of the penetrating peptides according to the invention to penetrate the cells. They further demonstrate that the penetrating peptides according to the invention allow the internalization in cells of high molecular weight molecules such as peroxidase. Finally, it has been shown that certain vectors do not affect cell viability and therefore represent useful vectors for any type of in vivo or in vitro application. Other vectors, affecting the viability of the cells are more particularly useful for the transfer of cytotoxic molecules, for example for destroying in vivo or ex vivo tumor cells or infected cells or any type of pathogen.

DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Les figures 1A et 1B représentent, sous forme d'histogrammes, les valeurs de pénétration intracellulaire dans les cellules Hela (figure la) et les cellules Jurkat (figure 1 b) obtenues à l'aide du test de pénétration cellulaire pour les peptides couplés à la péroxydase cités dans le tableau 1. DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1: FIGS. 1A and 1B represent, in the form of histograms, the intracellular penetration values in the Hela cells (FIG. 1a) and the Jurkat cells (FIG. 1b) obtained using the penetration test for the peroxidase-coupled peptides listed in Table 1.

Figure 2 : Les figures 2A à 2D illustrent les effets des différents peptides couplés à la péroxydase sur la viabilité des cellules Héla évalués à l'aide du test de viabilité MTT. La viabilité des cellules Héla (exprimée en pourcentage par rapport à la population initiale) a été testée en présence de concentrations croissantes, respectivement de peptides SEQ ID NO :1 (haut) et SEQ ID NO :2 (bas) (2A), SEQ ID NO :6 (2B), SEQ ID NO :5 (haut) et SEQ ID NO :4 (bas) (2C), SEQ ID NO :3 (haut) (2D) et SEQ ID NO : 11 (bas). Figure 2: Figures 2A to 2D illustrate the effects of the different peroxidase-coupled peptides on the viability of Hela cells evaluated using the MTT viability test. The viability of the Hela cells (expressed as a percentage relative to the initial population) was tested in the presence of increasing concentrations, respectively of peptides SEQ ID NO: 1 (high) and SEQ ID NO: 2 (low) (2A), SEQ ID NO: 6 (2B), SEQ ID NO: 5 (high) and SEQ ID NO: 4 (low) (2C), SEQ ID NO: 3 (high) (2D) and SEQ ID NO: 11 (low).

Figure 3 : Les figures 3A à 3D illustrent les effets des différents peptides couplés à la péroxydase sur la viabilité des cellules Jurkat évalués à l'aide du test MTS (Kit Proméga). La viabilité des cellules Jurkat (exprimée en pourcentage par rapport à la population initiale) a été testée en présence de concentrations croissantes, respectivement de peptides SEQ ID NO : 1 (haut) et SEQ ID NO :2 (bas) (3A), SEQ ID NO :6 (3B), SEQ ID NO :5 (haut) et SEQ ID NO :4 (bas) (3C), SEQ ID NO :3 (haut) (3D) et SEQ ID NO : 11 (bas). Figure 3: Figures 3A to 3D illustrate the effects of the different peptides coupled to the peroxidase on the viability of Jurkat cells evaluated using the MTS test (Kit Proméga). The viability of the Jurkat cells (expressed as a percentage relative to the initial population) was tested in the presence of increasing concentrations, respectively peptides SEQ ID NO: 1 (high) and SEQ ID NO: 2 (low) (3A), SEQ ID NO: 6 (3B), SEQ ID NO: 5 (high) and SEQ ID NO: 4 (low) (3C), SEQ ID NO: 3 (high) (3D) and SEQ ID NO: 11 (low).

Figure 4: La figure 4 illustre la localisation intracellulaire des différents conjugués peptide pénétrant-streptavidine-peroxydase. En particulier, la figure 4A montre la localisation intracellulaire d'un vecteur selon l'invention comportant le peptide pénétrant SEQ ID NO : 1. Figure 4: Figure 4 illustrates the intracellular localization of the different peptide penetrant-streptavidin-peroxidase conjugates. In particular, FIG. 4A shows the intracellular localization of a vector according to the invention comprising the penetrating peptide SEQ ID NO: 1.

La figure 4B montre la localisation intracellulaire d'un vecteur selon l'invention comportant le peptide pénétrant SEQ ID NO 2. FIG. 4B shows the intracellular localization of a vector according to the invention comprising the penetrating peptide SEQ ID NO 2.

La figure 4C montre la localisation intracellulaire d'un vecteur selon l'invention comportant le peptide pénétrant SEQ ID NO 5. FIG. 4C shows the intracellular localization of a vector according to the invention comprising the penetrating peptide SEQ ID No. 5.

La figure 4D montre la localisation intracellulaire d'un vecteur selon l'invention comportant une fusion des peptides pénétrants SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO :5. FIG. 4D shows the intracellular localization of a vector according to the invention comprising a fusion of the penetrating peptides SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO: 5.

La figure 4E montre la localisation intracellulaire d'un vecteur selon l'invention comportant le peptide non pénétrant de séquence RHSRIG (SEQ ID NO 7). FIG. 4E shows the intracellular localization of a vector according to the invention comprising the non-penetrating peptide of sequence RHSRIG (SEQ ID No. 7).

EXEMPLES 1. Matériel et méthodes 1.1 Préparation de vecteurs selon l'invention A titre d'exemple, des vecteurs constitués de l'un des différents peptides listés dans le tableau 1 auquel ont été couplés une enzyme, la peroxydase, représentant la molécule d'intérêt selon l'invention ont été préparés de la manière suivante : Chacun des peptides listés dans le tableau 1 ont été synthétisés sous forme biotinylés, purifiés par HPLC (Neosystem) selon les techniques classiques. EXAMPLES 1. Materials and Methods 1.1 Preparation of Vectors According to the Invention As an example, vectors consisting of one of the different peptides listed in Table 1 to which an enzyme, peroxidase, representing the molecule of interest according to the invention were prepared in the following manner: Each of the peptides listed in Table 1 were synthesized in biotinylated form, purified by HPLC (Neosystem) according to conventional techniques.

Quatre moles de peptides ont ensuite été incubées avec une mole d'avidine- péroxydase pendant vingt minutes à température ambiante afin d'obtenir des complexes peptides biotinylés-avidine-péroxydase. Four moles of peptides were then incubated with one mole of avidin-peroxidase for twenty minutes at room temperature to obtain biotinylated-avidin-peroxidase peptide complexes.

Tableau 1 : Peptides mimant des sites de liaison de protéines-cibles avec des PP2A

Table 1: Peptides mimicking protein-target binding sites with PP2A

<tb>
<tb> Protéines <SEP> d'origine <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> Séquences <SEP> peptides
<tb> CD28 <SEP> N0:8 <SEP> -PRRPGPTRKHY
<tb> NO:9 <SEP> -(PRRPGPTRK)2
<tb> CK2a <SEP> T.parva <SEP> N0:1 <SEP> -VKKKKIKREIKI
<tb> CK2a <SEP> P.Falciparum <SEP> NO <SEP> :2 <SEP> -(RQKRLI)3
<tb> Vpr <SEP> (HIV-1) <SEP> NO:7 <SEP> -RHSRIG
<tb> NO:10 <SEP> -(RHSRIG)2
<tb> NO:3 <SEP> - <SEP> (RHSRIG)3
<tb> *NO:11 <SEP> -(AHSRIG)3
<tb> NO:5 <SEP> RHSRIGVTRQRRARNG
<tb> NO:4 <SEP> RHSRIGIIQQRRTRNG
<tb> Protamine <SEP> NO:6 <SEP> RRRRRRRSRGRRRRTY**
<tb> <Tb>
<tb> Proteins <SEP> of origin <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> Sequences <SEP> peptides
<tb> CD28 <SEP> N0: 8 <SEP> -PRRPGPTRKHY
<tb> NO: 9 <SEP> - (PRRPGPTRK) 2
<tb> CK2a <SEP> T.parva <SEP> N0: 1 <SEP> -VKKKKIKREIKI
<tb> CK2a <SEP> P.Falciparum <SEP> NO <SEP>: 2 <SEP> - (RQKRLI) 3
<tb> Vpr <SEP> (HIV-1) <SEP> NO: 7 <SEP> -RHSRIG
<tb> NO: 10 <SEP> - (RHSRIG) 2
<tb> NO: 3 <SEP> - <SEP> (RHSRIG) 3
<tb> * NO: 11 <SEP> - (AHSRIG) 3
<tb> NO: 5 <SEP> RHSRIGVTRQRRARNG
<tb> NO: 4 <SEP> RHSRIGIIQQRRTRNG
<tb> Protamine <SEP> NO: 6 <SEP> RRRRRRRSRGRRRRTY **
<Tb>

* Ce peptide conçu comme mutant de Vpr est très homologue (73%) à la protéine glucosamine transférase de Chlamydia muridarum) (UDP- 3-O-[3-hydroxymyristoyl EEC 231). This peptide, designed as a Vpr mutant, is highly homologous (73%) to Chlamydia muridarum glucosamine transferase protein (UDP-3-0- [3-hydroxymyristoyl EEC 231)).

** Ce peptide ne correspond pas à un site d'interaction déterminé mais est issu de la séquence de la protamine qui est une protéine connue pour interagir et pour activer certaines protéines phosphatase 2A (Qi
Cheng et al. 1996 biochemistry, 35: 15593-15600). ** This peptide does not correspond to a determined interaction site but comes from the protamine sequence which is a protein known to interact and to activate certain phosphatase 2A proteins (Qi
Cheng et al. 1996 Biochemistry, 35: 15593-15600).

1.2 Lignées cellulaires Une expérience de transfert de molécule est présentée pour deux lignées cellulaires humaines transformées et utilisées en routine dans les laboratoires : - Les cellules Hela : une lignée dérivée d'un carcinome cervical (tumeur solide) - Les cellules Jurkat : une lignée dérivée d'un lymphome (cellules tumorales en suspension) 1.3 Dosages quantitatifs des peptides intemalisés Tampon de lyse :0,1M tampon Tris pH 8 contenant 0,5 % NP40. 1.2 Cell lines A molecule transfer experiment is presented for two human cell lines transformed and routinely used in laboratories: - Hela cells: a line derived from a cervical carcinoma (solid tumor) - Jurkat cells: a derived line Lymphoma (tumor cells in suspension) 1.3 Quantitative assays of the intemalised peptides Lysis buffer: 0.1M Tris buffer pH 8 containing 0.5% NP40.

Tampon OPD: 25,7 ml phosphate de sodium dibasique 0,2 M + 24,3 ml acide citrique 0,1 M + 50 ml d'eau distillée ; ajuster à pH 5,0. OPD buffer: 25.7 ml 0.2 M Dibasic sodium phosphate + 24.3 ml 0.1 M citric acid + 50 ml distilled water; adjust to pH 5.0.

Test de pénétration intracellulaire des divers vecteurs dans la cellule Hela Les cellules Hela (104 pour 1001) sont ensemencées dans des plaques de 96 puits (fonds plats) avec du milieu complet DMEM en présence de 2,5 % de pénicilline/ampicilline et de 10 % de sérum de veau foetal. Après une nuit d'incubation à 37 C dans une étuve à CO2 (5%), on ajoute les vecteurs selon l'invention (peptides biotinylés-avidine peroxydase) à différentes dilutions. Intracellular Penetration Test of the Various Vectors in the Hela Cell The Hela cells (104 per 1001) are seeded in 96-well plates (flat bottoms) with complete DMEM medium in the presence of 2.5% penicillin / ampicillin and 10 % fetal calf serum. After overnight incubation at 37 ° C. in a CO2 incubator (5%), the vectors according to the invention (biotinylated peptides-avidin peroxidase) are added at different dilutions.

Après quatre heures d'incubation, le surnageant est aspiré et les cellules sont lavées trois fois avec du PBS, trypsinées et reprises pour numération After four hours of incubation, the supernatant is aspirated and the cells are washed three times with PBS, trypsinized and taken up for counting.

dans 1 ml de PBS. Après numération, les cellules sont reprises dans 300 Fil de tampon de lyse. in 1 ml of PBS. After counting, the cells are taken up in 300 lysis buffer.

Mesure de l'activité peroxydase Dans une plaque ELISA de 96 puits, on incube 50 l de tampon OPD avec 50 l de tampon de lyse ou 50 l de lysat cellulaire (en général on effectue différentes dilutions successives (au 1/2)). Pour révéler, on ajoute (à l'abri de la lumière) 50 l de la solution d'OPD. La réaction (environ 10min) est arrêtée avec 100 l d'HCL 1 N. Measurement of peroxidase activity In a 96-well ELISA plate, 50 l of OPD buffer are incubated with 50 l of lysis buffer or 50 l of cell lysate (in general, various successive dilutions (1/2) are carried out). To reveal, 50 l of the OPD solution is added (protected from light). The reaction (about 10 min) is stopped with 100 l of 1 N HCl.

Analyse du résultat L'activité peroxydase est déterminée par lecture des absorbances à une longueur d'onde de 490 nm dans un lecteur ELISA (Filtre de référence à 620 nm) et la quantité de peroxydase dans les lysats est calculée d'après la courbe de référence puis rapportée au même nombre de cellules (103 ou 104). Analysis of the Result The peroxidase activity is determined by reading the absorbances at a wavelength of 490 nm in an ELISA reader (reference filter at 620 nm) and the amount of peroxidase in the lysates is calculated according to the reference then reported to the same number of cells (103 or 104).

Le nombre de molécules de peptides est calculé de la manière suivante : Molécules de peptides = (6 * 1023 / PM du peptide) * ng de PO*10-9 . The number of peptide molecules is calculated as follows: Peptide Molecules = (6 * 1023 / PM peptide) * ng PO * 10-9.

Test de pénétration intracellulaire des divers vecteurs dans la cellule Jurkat Les cellules Jurkat en phase exponentielle de croissance (5000 cellules pour 50ml dans une plaque de 96 puits) sont cultivées une nuit avec du milieu RPMI 1640 avec 10 % de SVF et des antibiotiques à 37 c dans une étuve à C02. Intracellular Penetration Test of the Various Vectors in the Jurkat Cell Jurkat cells in the exponential growth phase (5000 cells per 50 ml in a 96-well plate) are cultured overnight with RPMI 1640 medium with 10% FCS and 37% antibiotics. c in a C02 oven.

Après 4 heures d'incubation en présence de différentes quantités de vecteurs, les cellules sont lavées 3 fois avec du PBS, comptées, et l'activité peroxydase est déterminée comme pour les cellules Hela avec 50 l de lysat cellulaire. After 4 hours of incubation in the presence of different amounts of vectors, the cells are washed 3 times with PBS, counted, and the peroxidase activity is determined as for Hela cells with 50 l of cell lysate.

1.4 Analyse de la viabilité cellulaire Viabilité des cellules Hela :protocole MTT Les cellules Hela (104 pour 100 l) sont ensemencées dans des plaques de 96 puits (fonds plats) avec du milieu complet DMEM contenant 2,5 % pénicilline/ampicilline et 10 % sérum de veau foetal. Après une nuit d'incubation à 37 c dans une étuve à CO2, les cellules sont cultivées en présence de différentes concentrations de vecteurs. Après 72h d'incubation, le milieu contenant les vecteurs est aspiré et le MTT à 0,5 mg/ml (dilué dans du DMEM seul) est ajouté à raison de 100 l par puits. L'incubation est réalisée dans le noir à 37 C pendant 30 minutes puis le MTT est aspiré et 50 l de DMSO sont ajoutés dans tous les puits. Il faut attendre une dizaine de minutes pour la lyse complète des cellules et bien remuer le lysat pour homogénéiser la dissolution du produit de réaction dans le puits. Les plaques sont ensuite lues à 570 nm avec un filtre de référence à 690 nm. 1.4 Cell Viability Analysis Viability of Hela Cells: MTT Protocol Hela cells (104 per 100 l) are seeded in 96-well plates (flat bottoms) with complete DMEM medium containing 2.5% penicillin / ampicillin and 10% fetal calf serum. After overnight incubation at 37 ° C. in a CO2 incubator, the cells are cultured in the presence of different concentrations of vectors. After 72 hours of incubation, the medium containing the vectors is aspirated and the MTT at 0.5 mg / ml (diluted in DMEM alone) is added at a rate of 100 l per well. The incubation is carried out in the dark at 37 ° C. for 30 minutes, then the MTT is aspirated and 50 μl of DMSO are added to all the wells. It takes ten minutes for the complete lysis of the cells and stir the lysate to homogenize the dissolution of the reaction product in the well. The plates are then read at 570 nm with a reference filter at 690 nm.

Viabilité des cellules Jurkat : le protocole MTS (Kit Promega ) Des cellules Jurkat en phase de croissance ensemencées dans une plaque de 96 puits (5000 cellules dans 50 l par puits) sont incubées (24 à 72 heures) avec 50 l de vecteurs (différentes dilutions en présence de RPMI 1640, de 10 % de SVF et d'antibiotiques). Pour mesurer la viabilité, on ajoute dans chaque puits, 20 l de la solution de réactif MTS préparé extemporanément (2 ml de la solution MTS avec 100 l de la solution PMS (kit Promega), puis la plaque est placée pour une incubation de 4 heures en atmosphère humide à 37 C sous 5% C02 dans l'obscurité et la lecture des absorbances est effectuée dans un lecteur de plaque Elisa à une longueur d'onde de 490 nm. Viability of Jurkat cells: the MTS protocol (Promega Kit) Jurkat cells in the growth phase seeded in a 96-well plate (5000 cells in 50 l per well) are incubated (24 to 72 hours) with 50 l of vectors (different dilutions in the presence of RPMI 1640, 10% FCS and antibiotics). To measure the viability, 20 l of the MTS reagent solution prepared extemporaneously (2 ml of the MTS solution with 100 l of the PMS solution (Promega kit)) are added to each well, then the plate is placed for a 4-fold incubation. hours in a humid atmosphere at 37 ° C. under 5% CO2 in the dark and the absorbance reading is carried out in an Elisa plate reader at a wavelength of 490 nm.

2. Résultats L'effet des différents peptides couplés à la peroxydase sur la pénétration intracellulaire et la viabilité cellulaire a été analysé dans les cellules Hela et J u rkat. 2. Results The effect of the different peroxidase-coupled peptides on intracellular penetration and cell viability was analyzed in Hela and J u rkat cells.

2. Identification de peptides pénétrants Parmi l'ensemble des peptides répertoriés dans le tableau 1, quatre peptides ont la possibilité de pénétrer dans la cellule Hela (Fig.1A) et/ou dans la cellule Jurkat (Fig.1 B) sans affecter la viabilité cellulaire (Figures 2 et 3). Ces peptides représentent donc des vecteurs non toxiques pour le transfert intracellulaire de molécule d'intérêt. Il s'agit plus précisément : - d'un peptide de 12 acides aminés (SEQ ID NO :1 ) dérivé d'un site d'interaction de la sous-unité A de la protéine phosphatase 2A (PP2A) avec la protéine CK2a de T. parva. Ce peptide interagit avec la sous- unité A mais ne lie pas l'holoenzyme ABC de PP2A ; - d'un peptide de 18 acides aminés (SEQ ID NO : 2) correspondant à trois répétitions d'un hexa motif de 6 acides aminés ;cette séquence, dérivée de la protéine CK2a de P. Falciparum, est homologue à la séquence de T. parva qui lie PP2A ; - d'un peptide de 16 acides aminés (SEQ ID NO :5) correspondant à une séquence de HIV-1 Vpr qui est homologue à la séquence du peptide de séquence SEQ ID NO : 4 représentant un site de liaison avec PP2A avec un autre HIV-1 Vpr ; - d'un peptide de 18 acides aminés (SEQ ID NO : 3) correspondant à trois répétitions d'un hexamotif de six acides aminés dérivé de la séquence de SEQ ID NO :7. 2. Identification of Penetrating Peptides Among all the peptides listed in Table 1, four peptides have the possibility of entering the Hela cell (FIG. 1A) and / or the Jurkat cell (FIG. cell viability (Figures 2 and 3). These peptides therefore represent nontoxic vectors for the intracellular transfer of molecule of interest. It is more specifically: a peptide of 12 amino acids (SEQ ID NO: 1) derived from a site of interaction of the subunit A of the protein phosphatase 2A (PP2A) with the protein CK2a of T. parva. This peptide interacts with the A subunit but does not bind the PP2A ABC holoenzyme; a peptide of 18 amino acids (SEQ ID NO: 2) corresponding to three repeats of a hexa motif of 6 amino acids, this sequence, derived from the CK2a protein of P. falciparum, is homologous to the T sequence; parva that binds PP2A; a peptide of 16 amino acids (SEQ ID NO: 5) corresponding to a sequence of HIV-1 Vpr which is homologous to the sequence of the peptide of sequence SEQ ID NO: 4 representing a binding site with PP2A with another HIV-1 Vpr; an 18-amino acid peptide (SEQ ID NO: 3) corresponding to three repetitions of a hexamotif of six amino acids derived from the sequence of SEQ ID NO: 7.

2. 2 Peptides affectant la viabilité cellulaire : des vecteurs utilisables pour le traitement de tumeurs et/ou le transport de molécules anti- tumorales ou cytotoxiques Les études de viabilité effectuées sur l'ensemble des peptides répertoriés dans le tableau 1 a permis d'identifier deux peptides qui ont la possibilité de pénétrer dans la cellule Hela et dans la cellule Jurkat affectant la viabilité cellulaire : - SEQ ID NO : 4 qui reproduit le site de liaison avec PP2A avec un autre
HIV-1 Vpr et affecte clairement la viabilité des cellules Hela (Figure 2C) et Jurkat (Figure 3C). 2. 2 Peptides affecting cell viability: vectors that can be used for the treatment of tumors and / or the transport of anti-tumor or cytotoxic molecules The viability studies carried out on all the peptides listed in Table 1 made it possible to identify two peptides which have the possibility of penetrating the Hela cell and the Jurkat cell affecting cell viability: SEQ ID NO: 4 which reproduces the binding site with PP2A with another
HIV-1 Vpr and clearly affects the viability of Hela cells (Figure 2C) and Jurkat (Figure 3C).

- SEQ ID NO : 6 : un peptide dérivé de la protamine (un activateur connu des PP2A) qui affecte la viabilité des cellules Hela (Figure 2B) et Jurkat (Figure 3B). SEQ ID NO: 6: a peptide derived from protamine (a known PP2A activator) which affects the viability of Hela cells (FIG. 2B) and Jurkat cells (FIG. 3B).

2. 3 Localisation cellulaire des vecteurs selon l'invention après internalisation Afin de déterminer plus précisément la localisation cellulaire des vecteurs selon l'invention dans les cellules, la localisation intracellulaire des différents conjugués peptide-streptavidine-peroxydase a été observée au microscope après révélation de l'activité peroxydase telle que décrite dans la section Matériel et Méthodes. 2. 3 Cellular localization of the vectors according to the invention after internalization In order to determine more precisely the cellular localization of the vectors according to the invention in the cells, the intracellular localization of the various peptide-streptavidin-peroxidase conjugates was observed under a microscope after revelation of the peroxidase activity as described in the Materials and Methods section.

Les résultats sont présentés dans la figure 4. On observe une localisation intracellulaire exclusivement cytoplasmique du vecteur comportant le peptide pénétrant de séquence SEQ ID NO : 1 couplé à la peroxydase (figure 4A) et un peptide comprenant une fusion du peptide SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO : 5 (figure 4D). En revanche, on observe une localisation mixte, nucléaire et cytoplasmique des vecteurs comportant le peptide pénétrant de séquence SEQ ID NO :2 (figure 4B) ou SEQ ID NO :5 (figure 4C). The results are shown in FIG. 4. An exclusively cytoplasmic intracellular localization of the vector comprising the penetrating peptide of sequence SEQ ID NO: 1 coupled to peroxidase (FIG. 4A) and a peptide comprising a peptide SEQ ID NO: 1 fusion are observed. and SEQ ID NO: 5 (FIG. 4D). On the other hand, we observe a mixed, nuclear and cytoplasmic localization of the vectors comprising the penetrating peptide of sequence SEQ ID NO: 2 (FIG. 4B) or SEQ ID NO: 5 (FIG. 4C).

3. Discussion 3.1 Les peptides mimant des sites de liaison de certaines protéines avec des PP2A : un nouveau système pour le transfert infra-cellulaire La présente invention décrit six peptides pénétrants dérivés de trois protéines (CK2a, Vpr, protamine), capables d'interagir avec des protéines phosphatases 2A. Ces six peptides qui ont en commun des séquences riches en résidus arginine ou lysine, pourraient donc pénétrer dans la cellule en utilisant un mécanisme général d'internalisation. Un mécanisme commun pour l'internalisation des peptides ayant des séquences riche en arginine a été récemment proposé (Tomoki Suzuki, et al (2002), Possible Existence of Common Internalization Mechanisms among Arginine-rich Peptides, JBC 277 :2437-2443). De façon générale, la présence de séquences riches en arginine ou en lysine caractérise les protéines liant les protéines phosphatases 2A. Ces données suggèrent que d'autres peptides pénétrants pourraient être identifiés dans la famille des molécules polypeptidiques interagissant avec des protéines phosphatases 2A. 3. Discussion 3.1 Peptides mimicking binding sites of certain proteins with PP2A: a new system for intracellular transfer The present invention describes six penetrating peptides derived from three proteins (CK2a, Vpr, protamine), capable of interacting with protein phosphatases 2A. These six peptides, which share sequences rich in arginine or lysine residues, could therefore penetrate the cell using a general internalization mechanism. A common mechanism for internalising peptides having arginine-rich sequences has recently been proposed (Tomoki Suzuki, et al (2002), Possible Existence of Common Internalization Mechanisms among Arginine-Rich Peptides, JBC 277: 2437-2443). In general, the presence of arginine or lysine-rich sequences characterizes protein phosphatase-binding proteins 2A. These data suggest that other penetrating peptides could be identified in the family of polypeptide molecules interacting with 2A protein phosphatases.

3. 2 Des peptides pénétrants toxiques capables de transporter des molécules dans le cytoplasme ou le noyau des cellules : une nouvelle approche anti-tumorale Vpr, une protéine codée par le virus VIH-1, est impliquée dans le maintien d'une charge virale élevée et dans l'établissement de la pathogenèse liée au VIH. L'expression de Vpr, exogène ou due à l'infection provirale de HIV-1, induit l'apoptose dans des cellules HeLa, dans des lignées lymphoïdes T, dans des lymphocytes primaires et dans les cellules transformées (Stewart et al. J Virol 1997 ; 71 : 5579-9 ; Stewart et al. 1999, PNAS, 96,12039-12043). 3. 2 Penetrating penetrating peptides capable of transporting molecules into the cytoplasm or nucleus of cells: a new anti-tumor approach Vpr, a protein encoded by the HIV-1 virus, is involved in maintaining a high viral load and in establishing HIV-related pathogenesis. Expression of Vpr, exogenous or due to HIV-1 proviral infection, induces apoptosis in HeLa cells, in T lymphoid lineages, in primary lymphocytes and in transformed cells (Stewart et al., J. Virol 1997, 71: 5579-9, Stewart et al., 1999, PNAS, 96, 12039-12043).

Par ailleurs, il a été rapporté que l'interaction de PP2A avec une autre protéine virale, Adenovirus E4orf4 (Marcellus et al. J Virol. (2000) 74 : 7877) peut induire l'apoptose des cellules tumorales. En résumé, les résultats suggèrent l'hypothèse que l'activation de certaines protéines Furthermore, it has been reported that the interaction of PP2A with another viral protein, Adenovirus E4orf4 (Marcellus et al J Virol (2000) 74: 7877) can induce apoptosis of tumor cells. In summary, the results suggest the hypothesis that activation of some proteins

phosphatases 2A serait un nouveau moyen d'induire l'apoptose des tumeurs. 2A phosphatases would be a new way to induce apoptosis of tumors.

Dans ce sens, les résultats illustrés dans la figure 2 suggèrent que le peptide SEQ ID NO : 4 dérivé de HIV-1 Vpr pourrait représenter un biopeptide antitumoral. L'absence d'effet biologique du peptide SEQ ID NO :5 (dont la séquence diffère de quatre acides aminés par rapport à SEQ ID NO : 4, voir tableau 1) suggère que la structure du peptide SEQ ID NO : 4 est critique pour réguler la viabilité de Hela. Par conséquent l'obtention de molécules chimiques mimant la structure du peptide SEQ ID NO :4 pourrait donc constituer de nouvelles substances anti-tumorales. En outre, l'activité antitumorale pourrait être renforcée par le couplage audit peptide d'une molécule anti-tumorale dans la mesure où il a été montré par les exemples ci-dessus qu'un tel peptide peut pénétrer activement dans des lignées de cellules tumorales et transférer dans ces cellules des molécules de poids moléculaire important, telles que la peroxydase, sans en affecter son activité enzymatique. Elle pourrait également être couplée à certains agents thérapeutiques dont il a été montré que l'internalisation dans les cellules tumorales permet d'accroître l'efficacité de certaines molécules antitumorales.In this sense, the results illustrated in Figure 2 suggest that peptide SEQ ID NO: 4 derived from HIV-1 Vpr could represent an antitumor biopeptide. The lack of biological effect of the peptide SEQ ID NO: 5 (whose sequence differs from four amino acids with respect to SEQ ID NO: 4, see Table 1) suggests that the structure of peptide SEQ ID NO: 4 is critical for regulate the viability of Hela. Therefore obtaining chemical molecules mimicking the structure of peptide SEQ ID NO: 4 could therefore constitute new anti-tumor substances. In addition, the antitumor activity could be enhanced by coupling to said peptide of an anti-tumor molecule since it has been shown by the above examples that such a peptide can actively penetrate tumor cell lines. and transferring into these cells molecules of high molecular weight, such as peroxidase, without affecting its enzymatic activity. It could also be coupled with certain therapeutic agents whose internalization in tumor cells has been shown to increase the efficacy of certain antitumor molecules.

Claims

RRRRRRRRSRGRRRTY (SEQ ID NO: 6); or, b) a homologous sequence differing from one of the sequences SEQ ID NO: 1-6 with which it would be aligned, by substitution or deletion of at least one amino acid and nevertheless retaining the capacity to enter the cell, said homologous sequence exhibiting at least 70%, better still at least 80% and better still at least 90% identity over the length of the alignment made with the original sequence chosen from the sequences referred to in (a) to which is coupled said molecule of interest.

1. A vector intended for the transfer of a molecule of interest into a cell, characterized in that it comprises: a penetrating peptide chosen from one of the following sequences: a) VKKKKIKREIKI (SEQ ID NO: 1), ( RQKRLI) 3 (SEQ ID NO: 2), (RHSRIG) 3 (SEQ ID NO: 3) and RHSRIGIIQQRRTRNG (SEQ ID NO: 4); RHSRIGVTRQRRRNG (SEQ ID NO: 5);

2. Vector according to claim 1, characterized in that said molecule of interest is chosen from a nucleic acid, a peptide or a polypeptide.

3. Vector according to any one of claims 1 to 2, characterized in that said molecule of interest is an active ingredient of a drug.

4. Vector according to any one of claims 1 to 3, characterized in that said molecule of interest is coupled to said peptide penetrating by chemical bridging.

5. Vector according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it further comprises a molecule capable of specifically recognizing cell marker expressed on the surface of a specific cell type.

6. Vector according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it consists essentially of a penetrating peptide selected from one of the following sequences: a) VKKKKIKREIKI (SEQ ID NO: 1), (RQKRLI ) (SEQ ID NO: 2), (RHSRIG) 3 (SEQ ID NO: 3) and RHSRIGIIQQRRTRNG (SEQ ID NO: 4); RHSRIGVTRQRRRNG (SEQ ID NO: 5);

RRRRRRRRSRGRRRTY (SEQ ID NO: 6); or, b) a sequence differing from one of the SEQ ID sequences

NO: 1-6 with which it would be aligned, by substitution or deletion of at least one amino acid and nevertheless retaining the capacity to enter the cell, said homologous sequence having at least 70%, better at least 80% and better still at least 90% identity over the length of the alignment made with the original sequence chosen from the sequences referred to in (a), to which said molecule of interest is coupled.

7. Vector according to any one of claims 1 to 6, characterized in that it comprises a polymer of a penetrating peptide as defined in claim 1, or a fusion of different penetrating peptides as defined in claim 1 , to which said molecule of interest is coupled.

8. Vector according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the molecule of interest is a peptide or a polypeptide.

9. Polynucleotide for the preparation of a vector intended for the transfer of a molecule of interest into a cell, consisting of the coding sequence of a penetrating peptide as defined in claim 1 and of another sequence coding for a peptide or polypeptide of interest.

10. Use of a penetrating peptide or a vector as defined in one of claims 1 to 8, in the preparation of a composition for transferring a molecule of interest into a cell.

11. A method for transferring in vitro a molecule of interest in a cell comprising a) preparing a vector according to any one of claims 1 to 8, comprising coupling said molecule of interest to a penetrating peptide, and b) incubating the cell with the vector obtained in step a. under conditions allowing the in vitro transfer of the molecule of interest into the cell.

12. The method of claim 11, characterized in that said cell is a eukaryotic cell suspended in a culture medium.

13. The method of claim 11, characterized in that said cell is a eukaryotic cell of a tissue taken from an organism and may be administered to an organism after internalization of the molecule of interest in the cell.

14. Method according to one of claims 11 to 13, characterized in that the molecule of interest is selected from a nucleic acid, a peptide or a polypeptide.

15. Method according to any one of claims 11 to 14, characterized in that the molecule of interest is an active ingredient of a drug.

16. Method according to any one of claims 11 to 15, characterized in that the molecule of interest is not adequately produced by the cell in which the vector is to be transferred.

17. Method according to claim 11, for the transfer of a molecule of interest essentially to the cytoplasm of a cell, characterized in that the penetrant peptide chosen for the preparation of the vector is the peptide of sequence SEQ ID NO: 1 or a functional variant of this peptide.

18. The method of claim 11, for the transfer of a cytotoxic molecule, an antiviral molecule, antibacterial, antiparasitic or anti-tumor molecule in a cell, characterized in that the penetrating peptide is selected from SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 or one of their homologous sequence by substitution or deletion of at least one amino acid and nevertheless retaining the capacity to enter the cell, said homologous sequence having an identity of at least 70 %, better at least 80% and more preferably at least 90% identity with SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.

19. A therapeutic composition comprising, in association with a pharmaceutically acceptable carrier, a vector according to any one of claims 1 to 8, wherein the molecule of interest is a drug active ingredient.

20. Composition according to claim 19, characterized in that the molecule is an antigen and the composition is immunogenic.

21. Composition according to claim 20, characterized in that the composition is vaccinating.

22. A composition comprising cells in which a vector according to any one of claims 1 to 8 has been internalized.

23. A method for identifying penetrating peptides for use in vectors for transferring a molecule of interest into a cell, said method comprising a) selecting from peptides derived from a protein that interacts with a protein phosphatase 2A or one of its subunits (A), (B) or (C), peptides having the ability to bind in vitro protein phosphatase 2A and b) identification, among the peptides selected in a. penetrating peptides using a cell penetration assay.

24. A method of preparing a penetrating peptide for use in vectors for transferring a molecule of interest into a cell, said method comprising a) identifying peptides derived from a protein that interacts with a protein phosphatase 2A or one of its subunits (A), (B) or (C) having the capacity to bind in vitro said protein phosphatase 2A, b) the identification of at least one peptide penetrating among those identified in step (a) using a cell penetration test, and c) the preparation, by any known means, of the peptide identified in step (b).