FR2846008A1 - Kit for screening for antiprion agents, useful for treating neurodegenerative diseases associated with protein aggregation, comprises yeast with the PSI+ phenotype and an antibiogram - Google Patents

Kit for screening for antiprion agents, useful for treating neurodegenerative diseases associated with protein aggregation, comprises yeast with the PSI+ phenotype and an antibiogram Download PDF

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Abstract

Kit used to screen agents for antiprion activity comprising a yeast (A) having the (PSI+) phenotype and an antibiogram, is new. Independent claims are also included for: (1) method of screening compounds for antiprion activity comprising culturing a lawn of (A) in vitro, applying test compounds by the antibiogram method, incubation for 2-4 days at 20-25 degreesC and analysis of the coloration of cell colonies; and (2) antiprion agents of formula (I). R' = hydrogen, amino or NHR2; R2 = 1-10C alkyl or alkylaminoalkyl; X = fluoro, chloro, bromo, iodo, trifluoromethyl, methylthio, methoxy, hydroxy, nitro, acetyl, aminocarbonyl, carboxy or COOR3; R3 = 1-4C alkyl; p and n = 0-2; and q = 0 or 1.

Description

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Criblage de molécules à activité anti-prion : kits, méthodes et molécules criblées.  Screening of molecules with anti-prion activity: kits, methods and screened molecules.

La présente invention se rapporte à du criblage de molécules à activité anti-prion. Elle vise plus particulièrement des kits de criblage de molécules à activité anti-prion, les méthodes de criblage, et une famille de molécules à activité anti-prion mise en évidence à l'aide du crible selon l'invention. The present invention relates to the screening of molecules with anti-prion activity. It relates more particularly to screening kits for molecules with anti-prion activity, screening methods, and a family of molecules with anti-prion activity demonstrated using the screen according to the invention.

Les prions sont des protéines infectieuses responsables chez les mammifères de certaines maladies neuro-dégénératives de type encéphalopathies spongiformes comme la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l'homme ou encore les maladies dites de la vache folle chez les bovins ou tremblante du mouton chez les ovins. Ces différentes maladies sont provoquées par des agents infectieux non conventionnels : à la différence des agents infectieux traditionnels (bactéries, virus par exemple), ils ne contiennent pas d'acides nucléiques. Le Professeur Stanley Prusiner a formulé l'hypothèse de la protéine seule , selon laquelle l'agent infectieux ne serait constitué que d'une protéine. Cette protéine existe naturellement dans les cellules sous une forme normale (ou PrP), c'est-à-dire soluble, essentiellement sous forme d'hélice a et non agrégée donc fonctionnelle. Dans certaines conditions encore inconnues, cette protéine peut se transformer en une forme prion (ou PrPsc) . Sous cette forme prion, la protéine forme des agrégats insolubles, essentiellement sous forme de feuillets ss. Le caractère infectieux de cette conformation prion PrPsc viendrait du fait que, outre les caractéristiques indiquées précédemment, la protéine sous forme prion gagne également la capacité à catalyser le passage de la forme cellulaire normale PrPC vers la forme prion PrPsc dans un mécanisme de type boule de neige . Prions are infectious proteins responsible in mammals for certain neuro-degenerative diseases of the spongiform encephalopathy type such as Creutzfeldt-Jakob disease in humans or the so-called mad cow disease in cattle or scrapie in sheep . These different diseases are caused by unconventional infectious agents: unlike traditional infectious agents (bacteria, viruses for example), they do not contain nucleic acids. Professor Stanley Prusiner has formulated the protein-only hypothesis that the infectious agent is only one protein. This protein exists naturally in cells in a normal form (or PrP), that is to say soluble, essentially in the form of an α-helix and therefore not aggregated and therefore functional. Under certain conditions still unknown, this protein can transform into a prion form (or PrPsc). In this prion form, the protein forms insoluble aggregates, essentially in the form of ss sheets. The infectious nature of this PrPsc prion conformation would come from the fact that, in addition to the characteristics indicated above, the protein in prion form also gains the capacity to catalyze the passage from the normal cellular form PrPC to the prion form PrPsc in a ball-type mechanism. snow.

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La levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae contient plusieurs protéines se comportant comme des prions (FernandezBellot et Cullin, 2001). Dès les années soixante, deux mécanismes génétiques non conventionnels y sont décrits. En 1994, les phénotypes correspondants [PSI+] et [URE3] ont été proposés comme résultant de l'inactivation auto-catalytique des protéines Sup35p et Ure2p respectivement. Ces protéines prions présentent donc a priori une analogie mécanistique avec les systèmes mammifères délétères pour la santé publique. A l'instar de la protéine PrP, la protéine Sup35p normale passe d'un état soluble à un état insoluble et agrégé dès que la protéine est en contact avec une autre protéine Sup35p sous la forme prion. Cet état agrégé est vérifié tant par des expériences de centrifugation que par des expériences de localisation intracellulaire. Les prions de la levure peuvent être éliminés ( curés ) par une forte dose (3 à 5 mM) de chlorure de guanidium. Suite à un tel traitement (qui doit être appliqué sur au moins six à dix générations), les agrégats protéiques générés par la présence des prions disparaissent et la protéine en question (Sup35p, par exemple) se retrouve sous une forme normale, soluble, fonctionnelle mais ayant conservé la susceptibilité d'être convertie sous une forme prion si elle se retrouvait à nouveau en contact avec une autre protéine Sup35p dans un tel état. Baker's yeast Saccharomyces cerevisiae contains several proteins behaving like prions (FernandezBellot and Cullin, 2001). As early as the 1960s, two unconventional genetic mechanisms were described. In 1994, the corresponding phenotypes [PSI +] and [URE3] were proposed as resulting from the auto-catalytic inactivation of the proteins Sup35p and Ure2p respectively. These prion proteins therefore have a priori a mechanistic analogy with mammalian systems harmful to public health. Like the PrP protein, the normal Sup35p protein changes from a soluble state to an insoluble and aggregated state as soon as the protein is in contact with another Sup35p protein in the prion form. This aggregated state is verified both by centrifugation experiments and by intracellular localization experiments. The yeast prions can be eliminated (cure) by a large dose (3 to 5 mM) of guanidium chloride. Following such treatment (which must be applied over at least six to ten generations), the protein aggregates generated by the presence of prions disappear and the protein in question (Sup35p, for example) is found in a normal, soluble, functional form. but having retained the susceptibility to be converted into a prion form if it were again to come into contact with another Sup35p protein in such a state.

La protéine Sup35p, en complexe hétérodimérique avec la protéine Sup45p, forme un facteur de terminaison de la traduction. Ce facteur reconnaît les codons stop opales (UGA). The Sup35p protein, in a heterodimeric complex with the Sup45p protein, forms a translation termination factor. This factor recognizes opal stop codons (UGA).

Sous sa forme cellulaire normale (soluble et active) dans les souches [psi-], Sup35p, en association avec Sup45p termine efficacement la traduction au niveau de ces codons opales. In its normal cell form (soluble and active) in strains [psi-], Sup35p, in combination with Sup45p effectively terminates translation at these opal codons.

Dans une souche [PSI+] où la protéine Sup35p est sous forme prion, elle est majoritairement présente sous forme d'agrégats In a strain [PSI +] where the protein Sup35p is in prion form, it is mainly present in the form of aggregates

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insolubles. Ne pouvant pas se lier à Sup45p, elle est ainsi non fonctionnelle dans la terminaison de la traduction. Une petite fraction de l'ensemble des protéines Sup35p cellulaire reste toutefois soluble dans ces cellules [PSI+] où elle permet, en complexe avec Sup45p, d'assurer un service minimum de terminaison de la traduction, service essentiel à la survie de la levure. Un système colorimétrique permettant de détecter, de façon indirecte, la forme sous laquelle la protéine Sup35p est présente : normale ou prion, a été élaboré à partir de ces constatations. Ce système, décrit depuis longtemps (voir l'article de synthèse par Fernandez-Bellot et Cullin, 2001), est basé sur l'utilisation de l'allèle adel-14 du gène ADE1, codant pour une enzyme de la voie de biosynthèse de l'adénine : la SAICAR synthétase. Cette enzyme catalyse la formation de 4-(N-succinocarboxamide)-5-aminoimidazole ribonucléotide (SAICAR) à partir de 4-carboxy-5-aminoimidazole ribonucléotide (CAIR). L'allèle adel-14 contient un codon opale dans le cadre de lecture du gène ADE1. Dans une souche [psi-], Sup35p en association avec Sup45p va donc arrêter la traduction du gène ADE1 au niveau de ce codon stop. La protéine adel-14p ainsi traduite sera tronquée et donc non fonctionnelle. En conséquence les substrats en amont de l'enzyme Adelp vont s'accumuler, notamment la 5-aminoimidazole ribonucléotide (AIR). L'AIR étant oxydé en un composé de couleur rouge, les colonies formées par les cellules [psi-] seront de couleur rouge. En outre, ces cellules seront auxotrophes pour l'adénine. A l'inverse, dans une souche [PSI+], la protéine Sup35p est essentiellement présente sous forme d'agrégats donc incapable de s'associer avec Sup45p pour stopper la traduction au niveau du codon opale de l'allèle adel-14 du gène ADE1. En conséquence, les ribosomes vont faire une pause au niveau de ce codon stop avant de reprendre leur activité de traduction (translecture). Une certaine quantité de protéine Adelp fonctionnelle sera donc synthétisée, les  insoluble. Unable to bind to Sup45p, it is thus non-functional in the termination of the translation. A small fraction of all of the cellular Sup35p proteins, however, remains soluble in these cells [PSI +] where it makes it possible, in complex with Sup45p, to provide a minimum translation termination service, an essential service for the survival of yeast. A colorimetric system making it possible to detect, indirectly, the form in which the Sup35p protein is present: normal or prion, was developed from these findings. This system, described for a long time (see the review article by Fernandez-Bellot and Cullin, 2001), is based on the use of the adel-14 allele of the ADE1 gene, coding for an enzyme of the biosynthetic pathway of adenine: SAICAR synthetase. This enzyme catalyzes the formation of 4- (N-succinocarboxamide) -5-aminoimidazole ribonucleotide (SAICAR) from 4-carboxy-5-aminoimidazole ribonucleotide (CAIR). The adel-14 allele contains an opal codon for reading the ADE1 gene. In a strain [psi-], Sup35p in association with Sup45p will therefore stop the translation of the ADE1 gene at this stop codon. The adel-14p protein thus translated will be truncated and therefore non-functional. As a result, the substrates upstream of the Adelp enzyme will accumulate, in particular 5-aminoimidazole ribonucleotide (AIR). AIR is oxidized to a red colored compound, the colonies formed by cells [psi-] will be red. In addition, these cells will be auxotrophic for adenine. Conversely, in a strain [PSI +], the protein Sup35p is essentially present in the form of aggregates therefore unable to associate with Sup45p to stop the translation at the level of the opal codon of the adel-14 allele of the ADE1 gene. . Consequently, the ribosomes will pause at this stop codon before resuming their translation activity (translecture). A certain amount of functional Adelp protein will therefore be synthesized,

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cellules seront autotrophes pour l'adénine et formeront des colonies de couleur blanche à rosée.  cells will be autotrophic for adenine and will form white to dew colonies.

Dans un article paru dans P.N.A.S, l'équipe du Pr. Stanley Prusiner divulgue un test de détection de molécules à activité anti-prion (Korth et al., 2001). Ce test est effectué sur un modèle de mammifères (neuroblastomes murins infectés par PrPsc). Les conditions de sécurité (laboratoire P3) et de cultures cellulaires (manipulations assez lourdes) ne permettent pas de réaliser du criblage à haut débit. In an article published in P.N.A.S, the team of Pr. Stanley Prusiner discloses a test for the detection of molecules with anti-prion activity (Korth et al., 2001). This test is carried out on a mammalian model (murine neuroblastomas infected with PrPsc). The security conditions (P3 laboratory) and cell cultures (fairly heavy handling) do not allow high-throughput screening.

La demande WO 98/30909 décrit également un procédé de criblage de molécules à activité anti-prion réalisé sur des rongeurs infectés par un agent transmissible non conventionnel. Cette méthode de criblage présente les mêmes limites que la méthode décrite dans P.N.A.S. Application WO 98/30909 also describes a method for screening molecules with anti-prion activity carried out on rodents infected with an unconventional transmissible agent. This screening method has the same limitations as the method described in P.N.A.S.

Les travaux des inventeurs les ont amenés à réaliser un système de criblage haut débit pour mettre en évidence des molécules possédant une activité anti-prion, basé sur le système rapporteur colorimétrique de la protéine Sup35p, décrit ci-dessus. The work of the inventors led them to produce a high throughput screening system for detecting molecules having anti-prion activity, based on the colorimetric reporter system of the Sup35p protein, described above.

La présente invention est donc relative à un kit de criblage de molécules à activité anti-prion, caractérisé en ce qu'il comporte en combinaison une levure de phénotype [PSI+] avec un antibiogramme. The present invention therefore relates to a kit for screening molecules with anti-prion activity, characterized in that it comprises in combination a yeast of phenotype [PSI +] with an antibiogram.

Bien que basé sur les prions des levures, le kit selon l'invention permet d'isoler des molécules actives contre les prions de mammifères. L'exemple 7 suivant montre que les molécules les plus actives isolées par le Pr. Prusiner présentent également une activité dans le crible selon l'invention. Although based on yeast prions, the kit according to the invention makes it possible to isolate molecules active against prions of mammals. Example 7 below shows that the most active molecules isolated by Pr. Prusiner also exhibit activity in the screen according to the invention.

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Pourtant, on observe de nombreuses différences entre les prions de levure et les prions de mammifères. Dans un article de la revue Cellular and Molecular Life Sciences , le Professeur C.Cullin propose même au vu de ces différences de distinguer les prions de levures de ceux des mammifères en employant le terme de propagons . Comme différences notables entre les prions (mammifères) et les propagons (levure), on peut citer le caractère cytoplasmique des propagons alors que le prion PrP des mammifères est une protéine ancrée à la membrane plasmique, le caractère pathologique des prions de mammifères, ainsi qu'un certain nombre de différences biophysiques (structure ternaire et quaternaire, réversibilité du curage...) L'un des principaux avantages d'un tel crible réside dans sa parfaite innocuité ce qui permet de le réaliser dans un laboratoire de biologie moléculaire classique de niveau L2, et non, comme requis dans les techniques antérieures, dans un laboratoire de niveau P3. However, there are many differences between yeast prions and mammalian prions. In an article in the journal Cellular and Molecular Life Sciences, Professor C. Cullin even suggests, given these differences, to distinguish yeast prions from those of mammals using the term propagons. As notable differences between prions (mammals) and propagons (yeast), one can cite the cytoplasmic character of the propagons whereas the PrP prion of mammals is a protein anchored to the plasma membrane, the pathological character of mammalian prions, as well as '' a number of biophysical differences (ternary and quaternary structure, reversibility of cleaning ...) One of the main advantages of such a screen lies in its perfect safety which allows it to be carried out in a classical molecular biology laboratory. level L2, and not, as required in the prior art, in a laboratory of level P3.

De plus, la grande facilité d'utilisation et le très faible coût de ce kit rend le criblage à haut débit réalisable. L'utilisation de l'antibiogramme permet en outre de tester en une seule expérience un gradient de concentration, contrairement aux tests classiques, dans lesquels seule une concentration est testée. Pour chaque molécule dont on teste l'activité anti-prion, l'utilisation de l'antibiogramme permet également d'avoir des informations sur la toxicité du produit ainsi que sur le rapport activité/concentration, et de déterminer ainsi la meilleure concentration efficace. In addition, the great ease of use and the very low cost of this kit makes high throughput screening feasible. The use of the antibiogram also makes it possible to test a concentration gradient in a single experiment, unlike conventional tests, in which only one concentration is tested. For each molecule for which the anti-prion activity is tested, the use of the antibiogram also makes it possible to have information on the toxicity of the product as well as on the activity / concentration ratio, and thus to determine the best effective concentration.

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Selon un mode de réalisation préféré, la souche [PSI+] utilisée dans le kit selon l'invention porte une inactivation du gène ERG6. According to a preferred embodiment, the strain [PSI +] used in the kit according to the invention carries an inactivation of the ERG6 gene.

En effet, les levures sont naturellement assez peu perméables. Indeed, yeasts are naturally not very permeable.

En particulier, la levure préférée pour la mise en #uvre de l'invention, Saccharomyces cerevisiae, présente une imperméabilité telle que la réalisation d'un criblage s'avère particulièrement peu efficace sans cette inactivation. In particular, the preferred yeast for implementing the invention, Saccharomyces cerevisiae, is impermeable such that carrying out a screening proves to be particularly ineffective without this inactivation.

La méthode d'analyse du crible selon l'invention est visuelle. The screen analysis method according to the invention is visual.

Selon l'activité anti-prion de la molécule testée, les colonies de cellules auront une coloration rouge, rosée ou blanche. Le choix de la souche de levure peut permettre d'améliorer le contraste entre les colonies. En effet, certaines souches dites Strong facilitent l'analyse visuelle du crible. De telles souches possèdent un fort niveau d'agrégation des formes prions. A contrario, la souche sera dite Weak . Les souches préférées pour la mise en #uvre de l'invention sont donc les souches de type Strong . Depending on the anti-prion activity of the molecule tested, the cell colonies will have a red, pink or white coloration. The choice of the yeast strain can improve the contrast between the colonies. Indeed, certain so-called Strong strains facilitate visual analysis of the screen. Such strains have a high level of aggregation of prion forms. Conversely, the strain will be called Weak. The preferred strains for implementing the invention are therefore strains of the Strong type.

D'autres levures peuvent également être utilisées. On citera à titre d'exemples : Kluyveromyces lactis, Pichia methanolica, Saccharomyces ludwigii, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Zygosaccharomyces roux!, Schizosaccharomyces pombe. Other yeasts can also be used. Examples that may be mentioned are: Kluyveromyces lactis, Pichia methanolica, Saccharomyces ludwigii, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Zygosaccharomyces roux !, Schizosaccharomyces pombe.

Etant donné la létalité synthétique observée entre l'inactivation du gène ERG6 et l'inactivation du gène TRP1, le gène ERG6 pourra être délété en utilisant le gène TRP1 comme marqueur de délétion. Given the synthetic lethality observed between the inactivation of the ERG6 gene and the inactivation of the TRP1 gene, the ERG6 gene can be deleted using the TRP1 gene as a deletion marker.

Avantageusement, le kit comporte en outre un agent de curage des prions à doses sub-efficaces. Advantageously, the kit also comprises an agent for cleaning prions in sub-effective doses.

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Par curage, on entend une élimination des formes prions dans les cellules de levure. Cette élimination peut être temporaire ou définitive. By cleaning, we mean an elimination of the prion forms in the yeast cells. This elimination can be temporary or permanent.

A titre d'exemple, un agent de curage pour le prion peut être l'eau oxygénée ou préférentiellement, le chlorure de guanidium. By way of example, a cleaning agent for the prion can be hydrogen peroxide or preferably, guanidium chloride.

Par doses sub-efficaces, on entend des doses qui utilisées seules ne suffiraient pas à curer les prions des levures. Les valeurs de telles doses sont données, dans les exemples qui suivent, pour le chlorure de guanidium. By sub-effective doses is meant doses which used alone would not be enough to cure the prions of yeasts. The values of such doses are given, in the examples which follow, for guanidium chloride.

Les intérêts de la présence d'un agent de curage à des doses sub-efficaces sont de renforcer la sensibilité du crible et d'obtenir un meilleur contraste. The advantages of the presence of a cleaning agent in sub-effective doses are to reinforce the sensitivity of the screen and to obtain a better contrast.

Le kit selon l'invention peut être mis en #uvre dans une méthode de criblage de molécules à activité anti-prion. Cette méthode de criblage, également visée par l'invention, est caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre la levure de phénotype [PSI+] et comporte les étapes suivantes : a. réalisation d'un tapis de cellules in vitro b. dépôt des composés à tester selon la méthode de l'antibiogramme, c. incubation pendant environ 2-4 jours à environ 20-25 C, et, d. analyse de la coloration des colonies cellulaires. The kit according to the invention can be used in a method for screening molecules with anti-prion activity. This screening method, also targeted by the invention, is characterized in that it employs the yeast of phenotype [PSI +] and comprises the following steps: a. creation of a cell mat in vitro b. deposit of the compounds to be tested according to the antibiogram method, c. incubation for approximately 2-4 days at approximately 20-25 C, and, d. analysis of the coloration of the cell colonies.

Cette méthode possède des avantages analogues à ceux du kit selon l'invention. Il s'agit d'un test visuel, très facile à analyser. Sa mise en #uvre est très simple et peu onéreuse. Les précautions relatives à la sécurité sont celles d'un laboratoire classique de biologie moléculaire. Elle permet le This method has advantages similar to those of the kit according to the invention. It is a visual test, very easy to analyze. Its implementation is very simple and inexpensive. The safety precautions are those of a conventional molecular biology laboratory. It allows the

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criblage massif : une personne seule peut cribler manuellement plus de 400 produits par jour. Un criblage de très haut débit serait possible par automatisation de la méthode. Le résultat du crible est révélé au bout de 7 jours, sans qu'il soit nécessaire de recourir à des manipulations lourdes entre le jour J et le jour J+7 (éventuellement un changement de température de l'incubateur). Enfin, cette méthode est particulièrement économique.  massive screening: a single person can manually screen more than 400 products per day. Very high throughput screening would be possible by automating the method. The result of the screen is revealed after 7 days, without the need for heavy manipulations between D-day and D-day + 7 (possibly a change in temperature of the incubator). Finally, this method is particularly economical.

Selon un mode de réalisation préféré, la méthode de criblage selon l'invention est caractérisée en ce que le gène ERG6 de la levure est inactivé. Une des levures préférées pour la mise en #uvre de cette méthode est Saccharomyces cerevisiae. According to a preferred embodiment, the screening method according to the invention is characterized in that the yeast ERG6 gene is inactivated. One of the preferred yeasts for implementing this method is Saccharomyces cerevisiae.

Avantageusement, l'étape a. de la méthode de criblage comporte en outre l'ajout d'une dose sub-efficace de chlorure de guanidium. Advantageously, step a. of the screening method further includes the addition of a sub-effective dose of guanidium chloride.

La méthode peut également comporter les étapes suivantes : e. incubation pendant environ 2-4 jours à environ 2-6 C, et/ou, f. réalisation d'un test de criblage secondaire. The method can also include the following steps: e. incubation for approximately 2-4 days at approximately 2-6 C, and / or, f. performing a secondary screening test.

L'incubation à 2-6 C permet d'accentuer le contraste des colorations des colonies. Incubation at 2-6 C makes it possible to accentuate the contrast of the coloration of the colonies.

Préférentiellement, le test de criblage secondaire pourra comporter les étapes suivantes : - construction d'une souche de levure dans laquelle le gène ADE2 est sous le contrôle du promoteur du gène
DAL5 - réalisation des étapes a. à e. de la méthode de criblage selon l'invention, l'étape a. comportant en Preferably, the secondary screening test may include the following steps: - construction of a yeast strain in which the ADE2 gene is under the control of the gene promoter
DAL5 - completion of steps a. to e. of the screening method according to the invention, step a. comprising in

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outre l'ajout d'une dose sub-efficace de chlorure de guanidium.  in addition to adding a sub-effective dose of guanidium chloride.

Un tel crible secondaire permet de tester très rapidement si les molécules isolées lors du crible primaire peuvent avoir un effet général sur les prions chez la levure. En effet, les gènes SUP35 (responsable du prion [PSI+]) et URE2 (responsable du prion [URE3]) codent pour des enzymes ayant des fonctions totalement différentes et dont les séquences primaires sont très éloignées. Such a secondary screen makes it possible to test very quickly whether the molecules isolated during the primary screen can have a general effect on prions in yeast. Indeed, the genes SUP35 (responsible for the prion [PSI +]) and URE2 (responsible for the prion [URE3]) encode enzymes with completely different functions and whose primary sequences are very far apart.

L'invention couvre également les molécules isolées par la méthode de criblage selon l'invention. The invention also covers the molecules isolated by the screening method according to the invention.

En particulier, la méthode de criblage a permis d'isoler des agents anti-prion ayant la formule (I) suivante :

Figure img00090001

dans laquelle R1 est un groupement H, NH2, NHR2, où R2est une chaîne alkyle ou alkylaminoalkyle de 1 à 10 carbones, ramifiée ou non,
X représente F, Cl, Br, I, CF3, SR3, OR3, OH, NO2,
COR3, CONH2, COOH, COOR3, où R3 est un groupement alkyl de 1 à 4 carbones, de préférence CH3. p et n, identiques ou différents, égalent 0,1 ou
2, q égale 0 ou 1. In particular, the screening method made it possible to isolate anti-prion agents having the following formula (I):
Figure img00090001

in which R1 is a group H, NH2, NHR2, where R2is an alkyl or alkylaminoalkyl chain of 1 to 10 carbons, branched or not,
X represents F, Cl, Br, I, CF3, SR3, OR3, OH, NO2,
COR3, CONH2, COOH, COOR3, where R3 is an alkyl group of 1 to 4 carbons, preferably CH3. p and n, identical or different, equal 0.1 or
2, q equals 0 or 1.

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Elle vise plus particulièrement les agents anti-prion de formule (II) :

Figure img00100001

dans laquelle R1 représente un groupement H, NH2, NH-(CH2)3-
N ( CH3 ) 2 , NH-CH(CH3)-(CH2)3-N(CH2-CH3)2,
X représente F, Cl, p et n, identiques ou différents, égalent 0,1 ou
2. It relates more particularly to the anti-prion agents of formula (II):
Figure img00100001

in which R1 represents a group H, NH2, NH- (CH2) 3-
N (CH3) 2, NH-CH (CH3) - (CH2) 3-N (CH2-CH3) 2,
X represents F, Cl, p and n, identical or different, equal 0.1 or
2.

Certains composés de cette famille sont particulièrement actifs. Il s'agit de la phénanthridine et de la 6aminophénanthridine, ainsi que de leurs dérivés chlorés, en particulier lorsque le chlore est placé en position 8,9, 10, de préférence, en position 10 (voir dans les exemples qui suivent). Certain compounds of this family are particularly active. These are phenanthridine and 6 aminophenanthridine, as well as their chlorinated derivatives, in particular when the chlorine is placed in position 8, 9, 10, preferably in position 10 (see in the examples which follow).

L'invention couvre en particulier les agents anti-prion de formule (III) :

Figure img00100002
The invention covers in particular the anti-prion agents of formula (III):
Figure img00100002

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dans laquelle R1 représente un groupement H, NH2, NH-(CH2)3- N(CH3)2, NH-CH(CH3)-(CH2)3-N(CH2-CH3)2,
X représente F, Cl, p et n, identiques ou différents, égalent 0,1 ou
2. in which R1 represents a group H, NH2, NH- (CH2) 3- N (CH3) 2, NH-CH (CH3) - (CH2) 3-N (CH2-CH3) 2,
X represents F, Cl, p and n, identical or different, equal 0.1 or
2.

Cette famille de molécules, appelée Kastellpaolitines par les inventeurs, possède à un degré plus ou moins fort l'activité anti-prion recherchée. En particulier, les dérivés chlorés de cette famille sont particulièrement efficaces. Les meilleures efficacités sont obtenues lorsque le chlore est placé en position 2,3, 4, de préférence, en position 4 (voir KP1 dans les exemples qui suivent). This family of molecules, called Kastellpaolitines by the inventors, has to a greater or lesser degree the desired anti-prion activity. In particular, the chlorinated derivatives of this family are particularly effective. The best efficiencies are obtained when the chlorine is placed in position 2,3, 4, preferably in position 4 (see KP1 in the examples which follow).

Les agents anti-prion selon l'invention sont particulièrement utiles pour l'obtention d'un médicament destiné à prévenir et/ou à traiter les maladies neurodégénératives, en particulier de type à agrégation de protéines, telle que les encéphalopathies spongiformes, les maladies d'Alzheimer et de Hungtinton... Ces médicaments peuvent être à visée humaine ou vétérinaire, en particulier pour des animaux domestiques (vaches, moutons, ...) ou sauvages (lynx, cervidés tels que biches, élans, ...) D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples ci-dessous et en se référant aux figures suivantes: la figure 1 se rapporte à la faisabilité du crible, la figure 2 illustre le protocole de criblage, la figure 3 est relative à l'isolement des
Kastellpaolitines, de la phénanthridine et à leur relation structure/activité, - la figure 4 se rapporte à la détermination de l'activité de la 6-aminophénanthridine, The anti-prion agents according to the invention are particularly useful for obtaining a medicament intended for preventing and / or treating neurodegenerative diseases, in particular of the protein aggregation type, such as spongiform encephalopathies, diseases of 'Alzheimer's and Hungtinton ... These drugs can be for human or veterinary use, in particular for domestic animals (cows, sheep, ...) or wild animals (lynx, deer such as hinds, elk, ...) D other characteristics and advantages of the invention will appear in the examples below and with reference to the following figures: FIG. 1 relates to the feasibility of the screen, FIG. 2 illustrates the screening protocol, FIG. 3 relates to the isolation of
Kastellpaolitines, phenanthridine and their structure / activity relationship, - Figure 4 relates to the determination of the activity of 6-aminophenanthridine,

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la figure 5 présente les résultats des tests de cure liquide, la figure 6 se rapporte au crible secondaire basé sur le prion [URE3], et, la figure 7 démontre la validation du test avec la chlorpromazine et la quinacrine.  FIG. 5 presents the results of the liquid cure tests, FIG. 6 relates to the secondary screen based on the prion [URE3], and, FIG. 7 demonstrates the validation of the test with chlorpromazine and quinacrine.

Exemple 1 : Réalisation du crible. Example 1: Realization of the screen.

1. Matériel et méthodes Organismes (Saccharomyces cerevisiae) et milieux de culture La souche de levure haploïde [PSI+] 74-D694 (Mat a, adel-14, trpl-289, his3-A200, ura3-52, leu2-3,112) a été utilisée dans la mise au point de la méthode de criblage. La souche utilisée est dite Strong car elle présente un phénotype bien marqué lorsque le facteur de terminaison de la traduction Sup35p est sous une forme prion ou agrégée.  1. Material and methods Organisms (Saccharomyces cerevisiae) and culture media The haploid yeast strain [PSI +] 74-D694 (Mat a, adel-14, trpl-289, his3-A200, ura3-52, leu2-3,112) a was used in the development of the screening method. The strain used is called Strong because it has a well-marked phenotype when the termination factor of translation Sup35p is in a prion or aggregated form.

Afin d'augmenter la pénétration des inhibiteurs, les inventeurs ont modifié génétiquement cette souche en y introduisant une mutation du gène ERG6. Ce gène intervient dans la biosynthèse de l'ergostérol, composant de la paroi cellulaire des levures. La mutation a été réalisée par insertion au niveau du site chromosomique du gène ERG6 d'une cassette de délétion correspondant au gène marqueur TRP1 flanqué par des séquences en ADN se trouvant en amont et en aval de la phase codante du gène ERG6. Cette cassette a été produite par PCR en utilisant le plasmide pFA6a-kanMX6 comme matrice et les oligonucléotides oBM1060 (5') et oBM1061 (3') comme amorces. Les cellules de levure 74-D694 Strong ayant intégré la cassette de délétion (souche appelée STRg6, déposée à la CNCM le 10 octobre 2002 sous le numéro 1-2943) sont celles qui se développent sur milieux minimum dépourvu en In order to increase the penetration of the inhibitors, the inventors genetically modified this strain by introducing into it a mutation of the ERG6 gene. This gene is involved in the biosynthesis of ergosterol, a component of the yeast cell wall. The mutation was carried out by insertion at the chromosomal site of the ERG6 gene of a deletion cassette corresponding to the marker gene TRP1 flanked by DNA sequences located upstream and downstream of the coding phase of the ERG6 gene. This cassette was produced by PCR using the plasmid pFA6a-kanMX6 as template and the oligonucleotides oBM1060 (5 ') and oBM1061 (3') as primers. The 74-D694 Strong yeast cells which have integrated the deletion cassette (strain called STRg6, deposited at the CNCM on October 10, 2002 under the number 1-2943) are those which grow on minimum media lacking in

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tryptophane. La mutation #erg6 : : TRP1 a ensuite été vérifiée par PCR en utilisant l'ADN génomique de la souche STRg6 comme matrice et les oligonucléotides oBM1030 (5') et oBM1063 (3') comme amorces.  tryptophan. The mutation # erg6:: TRP1 was then verified by PCR using the genomic DNA of the strain STRg6 as template and the oligonucleotides oBM1030 (5 ') and oBM1063 (3') as primers.

Les amorces PCR utilisées présentent les séquences en nucléotides suivantes : oBM1060 5' CGATTTAAGTTTTACATAATTTAAAAAAACAAGAATAAAATAATAATATAG TAGGCAGCATAAGCGGATCCCCGGGTTAATTAA 3' (SEQ ID N 1) oBM1061 5' CTGCATATATAGGAAAATAGGTATATATCGTGCGCTTTATTTGAATCTTAT TGATCTAGTGAATGAATTCGAGCTCGTTTAAAC 3' (SEQ ID N 2) oBM1030 5' GGTACCTCGTTCCCGTAC 3' (SEQ ID N 3) oBM1063 5' CAGTCAGAAATCGAGTTCCA 3' (SEQ ID N 4) Sauf indication du contraire, les souches de levure sont cultivées à 30 C dans du milieu riche (YPD#) ou dans du milieu minimum. Lorsque ce n'est pas explicitement spécifié, les pourcentages correspondent à un rapport masse/volume. La forme gélosée est obtenue par ajout d'agar à 2%. The PCR used primers have the sequences following nucleotides: oBM1060 5 'CGATTTAAGTTTTACATAATTTAAAAAAACAAGAATAAAATAATAATATAG TAGGCAGCATAAGCGGATCCCCGGGTTAATTAA 3' (SEQ ID NO 1) oBM1061 5 'CTGCATATATAGGAAAATAGGTATATATCGTGCGCTTTATTTGAATCTTAT TGATCTAGTGAATGAATTCGAGCTCGTTTAAAC 3' (SEQ ID NO 2) oBM1030 5 'GGTACCTCGTTCCCGTAC 3' (SEQ ID N 3) oBM1063 5 'CAGTCAGAAATCGAGTTCCA 3' (SEQ ID N 4) Unless otherwise indicated, the yeast strains are cultivated at 30 ° C. in rich medium (YPD #) or in minimum medium. When not explicitly specified, the percentages correspond to a mass / volume ratio. The agar form is obtained by adding 2% agar.

YPD# : 1% d' extrait de levure (FISHER@), 2% de peptone A(GIBCO#) et 2% de glucose ; Milieu minimum : 0,175% de yeast nitrogen base without amino acid and ammonium sulfate (DIFCO#), 0,75% de sulfate d'ammonium et 2% de glucose. Ce milieu est amené à pH 6. Afin de compenser les éventuelles auxotrophies, ce milieu peut être complété, après stérilisation, par ajout d'acides aminés (0,002% de L-Histidine et/ou 0,004% de L-Leucine et/ou 0,003% de L-Tryptophane) ou de bases azotées (0,0025% d'Uracile et/ou 0,008% d'Adénine).  YPD #: 1% yeast extract (FISHER @), 2% peptone A (GIBCO #) and 2% glucose; Minimum medium: 0.175% yeast nitrogen base without amino acid and ammonium sulfate (DIFCO #), 0.75% ammonium sulfate and 2% glucose. This medium is brought to pH 6. In order to compensate for any auxotrophies, this medium can be supplemented, after sterilization, by addition of amino acids (0.002% L-Histidine and / or 0.004% L-Leucine and / or 0.003 % L-Tryptophan) or nitrogen bases (0.0025% Uracile and / or 0.008% Adenine).

Méthode de criblage de substances à activité anti-prionesque ( Prion Halo Assay ) La méthode de criblage élaborée est basée sur le principe de l'antibiogramme. En effet, les composés à tester sont déposés Screening method for substances with anti-prionesque activity (Prion Halo Assay) The screening method developed is based on the principle of the antibiogram. Indeed, the compounds to be tested are deposited

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sur un disque en papier filtre stérile, lui-même déposé sur une boîte de milieu YPD# solide contenant 0,2 mM de chlorure de guanidium préalablement ensemencée avec environ 106 cellules de la souche STRg6 afin de réaliser un tapis de levure.  on a sterile filter paper disc, itself deposited on a box of solid YPD # medium containing 0.2 mM guanidium chloride previously seeded with approximately 106 cells of the STRg6 strain in order to produce a yeast mat.

L'ajout d'une faible quantité de chlorure de guanidium (0,2 mM), dose sub-efficace pour curer les prions chez la levure (la dose efficace étant de l'ordre de 3 à 5 mM) permet d'augmenter la sensibilité du test (voir la partie Résultats). The addition of a small amount of guanidium chloride (0.2 mM), a sub-effective dose for cleaning prions in yeast (the effective dose being of the order of 3 to 5 mM) makes it possible to increase the sensitivity of the test (see the Results section).

Les boîtes carrées de 12 cm de côté sont ensuite incubées 3 jours à 23,5 C pour permettre l'apparition et la croissance des colonies de levures. Ces boîtes sont ensuite stockées 3 jours à 4 C afin d'accentuer le coloration rouge présente autour des disques imbibés de substances actives sur la forme prion de la protéine Sup35p. La comparaison avec les témoins négatifs (dépôt du solvant des inhibiteurs testés) et positif (dépôt d'une solution de chlorure de guanidium à 300 mM, provoquant une élimination efficace des protéines Sup35p sous une forme prion) permet de juger de l'efficacité d'un composé. The 12 cm square dishes are then incubated for 3 days at 23.5 C to allow the appearance and growth of yeast colonies. These boxes are then stored for 3 days at 4 ° C. in order to accentuate the red coloration present around the discs soaked with active substances on the prion form of the protein Sup35p. The comparison with the negative controls (deposition of the solvent of the inhibitors tested) and positive (deposition of a solution of guanidium chloride at 300 mM, causing an effective elimination of the proteins Sup35p in a prion form) makes it possible to judge the effectiveness of 'a compound.

La figure 2 illustre le protocole de la méthode de criblage : (1) Culture de la souche STRg6 ; (2) Dépôt et étalement avec des billes de verre stériles de 3 & 4 mm de diamètre, d'environ 106 cellules en phase exponentielle de croissance sur une boîte de milieu solide YPD# contenant 0,2 mM de chlorure de guanidium : constitution du "tapis" de cellules ; (3) Dépôt des disques de papier filtre stériles selon un quadrillage permettant l'analyse de 32 composés (témoins inclus) et dépôt de 20 l maximum de chacun des produits à tester ; (4) Incubation ; (5) Numérisation du résultat obtenu ; (6) Exemple présentant l'isolement d'un composé présentant une forte activité anti-prion. FIG. 2 illustrates the protocol of the screening method: (1) Culture of the STRg6 strain; (2) Depositing and spreading with sterile glass beads 3 & 4 mm in diameter, of approximately 106 cells in exponential growth phase on a box of YPD # solid medium containing 0.2 mM guanidium chloride: constitution of the cell "carpet"; (3) Depositing sterile filter paper discs in a grid allowing the analysis of 32 compounds (including controls) and depositing a maximum of 20 l of each of the products to be tested; (4) Incubation; (5) Digitization of the result obtained; (6) Example showing the isolation of a compound having a strong anti-prion activity.

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Synthèse de 11-aminodibenzo[b,f] [1,4] thiazépines et de la 6aminophénanthridine Les 11-aminodibenzo [b, f] [1, 4] thiazépines, appelés encore Kastellpaolitines, peuvent être préparés en une seule étape. Synthesis of 11-aminodibenzo [b, f] [1,4] thiazepines and 6 aminophenanthridine The 11-aminodibenzo [b, f] [1, 4] thiazepines, also called Kastellpaolitines, can be prepared in a single step.

La synthèse de ces produits a déjà été décrite dans la publication de Mettey et al., 1997. The synthesis of these products has already been described in the publication of Mettey et al., 1997.

2. Résultats Principe et faisabilité du crible Le chlorure de guanidium, le seul produit connu pour curer efficacement les prions chez la levure Saccharomyces cerevisiae, a servi non seulement de témoin positif tout au long du criblage, mais aussi pour étudier la faisabilité de la méthode ainsi que pour la mettre au point. Le chlorure de guanidium cure efficacement les différents prions de levure à une dose comprise entre 3 et 5 mM (Fernandez-Bellot et Cullin, 2001). Dans ces conditions, la cure nécessite une présence constante de ce produit pendant six à dix générations en phase exponentielle de croissance compromettant la faisabilité du crible sur boîte tel que les inventeurs souhaitaient le réaliser.  2. Results Principle and feasibility of the screen Guanidium chloride, the only product known to effectively cure prions in the yeast Saccharomyces cerevisiae, served not only as a positive control throughout the screening, but also to study the feasibility of the method as well as to develop it. Guanidium chloride effectively cures the various yeast prions at a dose of between 3 and 5 mM (Fernandez-Bellot and Cullin, 2001). Under these conditions, the cure requires a constant presence of this product for six to ten generations in the exponential growth phase, compromising the feasibility of the screen on a box as the inventors wished to make it.

La figure 1 montre la faisabilité du crible. Figure 1 shows the feasibility of the screen.

Les trois panneaux de gauche : une souche [PSI+] est cultivée pendant 48H en présence de chlorure de guanidium à 5 mM (avec 0,2% DMSO final) ou, comme contrôle avec seulement 0,2% DMSO final. A T = 0, puis toutes les 24H, une goutte de 10 L (environ 104 cellules) est déposée sur une boîte de milieu riche. La cure au chlorure de guanidium commence à avoir un effet après 24H de traitement, soit après 6 générations environ (une coloration rosée commence à apparaître). Au bout de 48H, soit après 12 générations environ, la goutte de The three panels on the left: a strain [PSI +] is cultured for 48 hours in the presence of guanidium chloride at 5 mM (with 0.2% final DMSO) or, as a control with only 0.2% final DMSO. At T = 0, then every 24 hours, a 10 L drop (approximately 104 cells) is deposited on a box of rich medium. The cure with guanidium chloride begins to have an effect after 24 hours of treatment, that is to say after approximately 6 generations (a pink coloration begins to appear). After 48 hours, or after approximately 12 generations, the drop of

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cellules présente une coloration nettement rouge, signe d'une cure complète des cellules [PSI+].  cells show a marked red coloration, sign of a complete cure of the cells [PSI +].

Le panneau du milieu : quelques cellules sont prélevées à T = 48H et sont striées sur un milieu frais. Elles forment presque toutes des colonies rouges dans le cas de la cure au chlorure de guanidium. The middle panel: some cells are removed at T = 48H and are striated on a fresh medium. They almost all form red colonies in the case of the cure with guanidium chloride.

Le panneau de droite : ces même cellules sont culottées au fond d'un tube Eppendorf après culture liquide. Dans le cas de la cure au chlorure de guanidium, elles forment un culot rouge. The right panel: these same cells are pelletized at the bottom of an Eppendorf tube after liquid culture. In the case of the cure with guanidium chloride, they form a red pellet.

La première étape a donc consisté à déterminer si le chlorure de guanidium pouvait avoir un effet visualisable sur boîte sur des cellules [PSI+] avec le système de pastilles à antibiogramme. Une fois cette étape réalisée, les inventeurs ont mis au point les conditions optimales de température, de milieu, de densité ainsi que de type cellulaire à utiliser (figure 2). La souche présentant la meilleure sensibilité est la souche STRg6 cultivée à 23,5 C et en présence de 200 M de chlorure de guanidium. En effet, l'introduction d'une dose sub-efficace de chlorure de guanidium dans le milieu permet d'augmenter la sensibilité du test. The first step therefore consisted in determining if guanidium chloride could have a viewable effect on dishes on [PSI +] cells with the antibiogram tablet system. Once this step has been carried out, the inventors have developed the optimum conditions for temperature, medium, density and also the cell type to be used (FIG. 2). The strain with the best sensitivity is the STRg6 strain cultivated at 23.5 ° C. and in the presence of 200 M of guanidium chloride. Indeed, the introduction of a sub-effective dose of guanidium chloride into the medium makes it possible to increase the sensitivity of the test.

Criblage d'une chimiothèque Des composés (environ 1000) ont été passés au crible en utilisant les conditions optimisées par les inventeurs (figure 2). Sur chaque boîte, 15 [il de DMSO sont déposés sur le filtre en haut à gauche (témoin négatif) et 15 l d'une solution de chlorure de guanidium en solution à 300 mM dans le DMSO (témoin positif) sont déposés sur le filtre en bas à droite. Screening of a chemical library Compounds (approximately 1000) were screened using the conditions optimized by the inventors (FIG. 2). On each dish, 15 μl of DMSO are deposited on the filter at the top left (negative control) and 15 l of a solution of guanidium chloride in solution at 300 mM in DMSO (positive control) are deposited on the filter at the bottom right.

Le même volume (15 l) de chacun des produits de la banque (tous en solution à 10 mM dans le DMSO) est déposé sur les filtres restants (trente par grande boîte de Pétri carrée). Un signal positif (visualisation d'un halo rouge autour du disque The same volume (15 l) of each of the bank's products (all in 10 mM solution in DMSO) is deposited on the remaining filters (thirty per large square Petri dish). A positive signal (visualization of a red halo around the disc

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de papier filtre stérile sur lequel le produit est déposé) a été obtenu pour cinq produits. Ces produits correspondent à quatre molécules d'une même famille, appelées Kastellpaolitines par les inventeurs, et à une cinquième bien connue : la phénanthridine.  sterile filter paper on which the product is deposited) was obtained for five products. These products correspond to four molecules of the same family, called Kastellpaolitines by the inventors, and to a fifth well known: phenanthridine.

Exemple 2 Identification des Kastellpaolitines et de la phénanthridine. Example 2 Identification of Kastellpaolitins and phenanthridine.

Les structures chimiques des Kastellpaolitines et de la phénanthridine sont présentées dans la figure 3B. Le panneau 3A montre une analyse comparative de la taille des halos rouges obtenus respectivement avec l'ensemble de ces molécules (toutes déposées en quantité équivalentes : 15 l d'une solution à 10 mM dans le DMSO). Cette expérience permet de comparer l'activité relative de chacun de ces produits. Le plus actif est la Kastellpaolitine 1 (ou KP1) suivi par la phénanthridine. The chemical structures of Kastellpaolitines and phenanthridine are presented in Figure 3B. Panel 3A shows a comparative analysis of the size of the red halos obtained respectively with all of these molecules (all deposited in equivalent quantities: 15 l of a 10 mM solution in DMSO). This experience makes it possible to compare the relative activity of each of these products. The most active is Kastellpaolitin 1 (or KP1) followed by phenanthridine.

Synthèse et test de la 6-aminophénanthridine Une analyse comparative de la phénanthridine d'une part, et des Kastellpaolitines d'autre part montre plusieurs points communs entre ces deux groupes de molécules (figure 3). Les différentes molécules y sont classées de la moins active à la plus active et leurs formules respectives indiquées. Toutes sont tri-cycliques, le cycle central contenant dans tous les cas un azote en double liaison avec un carbone adjacent. Par contre, chez toutes les Kastellpaolitines, le carbone du cycle central qui est en double liaison avec cette azote porte un groupement amino, ce qui n'est pas le cas pour la phénanthridine. Cette observation a conduit les inventeurs à vouloir tester la 6-aminophénanthridine. Synthesis and test of 6-aminophenanthridine A comparative analysis of phenanthridine on the one hand, and of Kastellpaolitins on the other hand shows several points in common between these two groups of molecules (Figure 3). The different molecules are classified there from the least active to the most active and their respective formulas indicated. All are tri-cyclic, the central cycle containing in all cases a nitrogen in double bond with an adjacent carbon. On the other hand, in all Kastellpaolitines, the carbon of the central cycle which is in double bond with this nitrogen carries an amino group, which is not the case for phenanthridine. This observation led the inventors to want to test 6-aminophenanthridine.

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La 6-aminophénanthridine peut être préparé selon le mode opératoire mis au point par Kessar et al, 1969.  6-Aminophenanthridine can be prepared according to the procedure developed by Kessar et al, 1969.

La 6-aminophénanthridine a donc été passée au crible selon l'invention, en comparaison avec les Kastellpaolitines 1 (KP1) et 5 (KP5) ainsi qu'avec la phénanthridine. Le résultat est très net : la 6-aminophénanthridine est encore plus active que les Kastellpaolitines et que la phénanthridine. 6-aminophenanthridine was therefore screened according to the invention, in comparison with Kastellpaolitins 1 (KP1) and 5 (KP5) as well as with phenanthridine. The result is very clear: 6-aminophenanthridine is even more active than Kastellpaolitines and than phenanthridine.

La figure 4 illustre les résultats de cette comparaison : l'activité de la 6-aminophénanthridine a été déterminée sur boîte et comparée à celle des KP1 et 5 et de la phénanthridine. Pour les quatre molécules, la même quantité est déposée (10 l d'une solution à 10 mM). Dans le cas du témoin positif (chlorure de guanidium), la solution utilisée était à 300 mM. Figure 4 illustrates the results of this comparison: the activity of 6-aminophenanthridine was determined on a dish and compared with that of KP1 and 5 and phenanthridine. For the four molecules, the same amount is deposited (10 l of a 10 mM solution). In the case of the positive control (guanidium chloride), the solution used was 300 mM.

Par conséquent, en greffant ce groupement amino, caractéristique des Kastellpaolitines sur la phénanthridine, on a augmenté fortement l'activité de cette dernière. Consequently, by grafting this amino group, characteristic of Kastellpaolitines on phenanthridine, the activity of the latter was greatly increased.

Exemple 3 : Synergie entre les produits isolés à l'aide du crible et le chlorure de guanidium Toutes les molécules actives ont été isolées dans un milieu contenant une faible dose de chlorure de guanidium (200 M / dose efficace = 4 mM). Ce parti pris établi lors de la mise au point du crible répondait au souci d'augmenter la sensibilité (et donc le seuil de détection de la méthode). L'effet des molécules dans des milieux contenant plus (500 M) de chlorure de guanidium ou n'en contenant pas, a par la suite été observé. La phénanthridine est toujours active sur un milieu sans chlorure de guanidium, mais son activité augmente fortement en fonction de la quantité de chlorure de guanidium Example 3: Synergy between the products isolated using the screen and guanidium chloride All the active molecules were isolated in a medium containing a low dose of guanidium chloride (200 M / effective dose = 4 mM). This bias established during the development of the screen responded to the concern to increase the sensitivity (and therefore the detection threshold of the method). The effect of the molecules in media containing more (500 M) guanidium chloride or not containing it, was subsequently observed. Phenanthridine is always active on a medium without guanidium chloride, but its activity increases strongly depending on the amount of guanidium chloride

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(pourtant en dose nettement sub-efficace) dans le milieu. Ce résultat indique une synergie d'action entre le chlorure de guanidium et la phénanthridine. Le même résultat a été obtenu pour toutes les autres molécules isolées par les inventeurs (les Kastellpaolitines et la 6-aminophénanthridine).  (yet in a clearly sub-effective dose) in the environment. This result indicates a synergy of action between guanidium chloride and phenanthridine. The same result was obtained for all the other molecules isolated by the inventors (Kastellpaolitines and 6-aminophenanthridine).

Exemple 4 : Vérification de la cure en milieu liquide Les inventeurs ont ensuite voulu déterminer si les halos rouges observés dans le test levure correspondaient bien à de la cure du prion [PSI+] et non pas à un artéfact (par exemple ces halos rouges pourraient être dus à une inhibition directe de la chaîne de biosynthèse de l'adénine par ces molécules, ce qui conduirait à une accumulation de l'AIR). Si ces molécules curent efficacement le prion [PSI+], un traitement en culture liquide de cellules [PSI+] suivi d'un lavage desdites cellules doit leur permettre de former des colonies rouges sur un milieu gélosé ne contenant plus les molécules. Ces tests ont été réalisés avec la 6-aminophénanthridine sur la souche strong sauvage 74-D694. Example 4: Verification of the cure in liquid medium The inventors then wanted to determine whether the red halos observed in the yeast test corresponded well to the prion cure [PSI +] and not to an artefact (for example these red halos could be due to direct inhibition of the adenine biosynthesis chain by these molecules, which would lead to an accumulation of AIR). If these molecules effectively cure the [PSI +] prion, treatment in liquid culture of [PSI +] cells followed by washing of said cells must allow them to form red colonies on an agar medium no longer containing the molecules. These tests were carried out with 6-aminophenanthridine on the strong wild strain 74-D694.

Les conditions de cure en milieu liquide sont les suivantes : une souche [PSI+] est cultivée pendant 5 jours en milieu liquide en présence des quantités indiquées des différents produits (voir figure 5). Toutes les 24H, une fraction aliquote est lavée en milieu vierge de tout produit et déposée sur un milieu gélosé solide (lui aussi vierge de tout produit) qui est traité ensuite comme indiqué en figure 2. The curing conditions in liquid medium are as follows: a strain [PSI +] is cultivated for 5 days in liquid medium in the presence of the indicated quantities of the various products (see FIG. 5). Every 24 hours, an aliquot fraction is washed in a medium free of any product and deposited on a solid agar medium (also free of any product) which is then treated as indicated in FIG. 2.

Comme montré dans la figure 5, la 6-aminophénanthridine est capable de curer partiellement le prion [PSI+] dans un nombre significatif de cellules. L'efficacité de cure peut être As shown in Figure 5, 6-aminophenanthridine is able to partially cure the [PSI +] prion in a significant number of cells. The effectiveness of treatment can be

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notablement augmentée en rajoutant une dose sub-efficace (100 M) de chlorure de guanidium dans le milieu de culture. Dans une telle cure liquide, le même effet synergique que celui observé dans le test sur boîte est également retrouvé.  significantly increased by adding a sub-effective dose (100 M) of guanidium chloride in the culture medium. In such a liquid cure, the same synergistic effect as that observed in the box test is also found.

Exemple 5 . Mise au point et utilisation d'un crible colorimétrique secondaire basé sur l'utilisation de [URE3], un autre prion de levure Un autre test rapide sur boîte a été réalisé, basé sur un autre prion de levure : [URE3]. Ce test constitue un crible secondaire qui permet de généraliser l'effet des produits isolés lors du crible primaire à un autre prion de levure. De la sorte, il est possible d'écarter les molécules actives uniquement contre le prion [PSI+] et donc moins intéressantes car d'un effet non général. Example 5. Development and use of a secondary colorimetric screen based on the use of [URE3], another yeast prion Another rapid box test was carried out, based on another yeast prion: [URE3]. This test constitutes a secondary screen which makes it possible to generalize the effect of the products isolated during the primary screen to another yeast prion. In this way, it is possible to exclude active molecules only against the prion [PSI +] and therefore less interesting because of a non-general effect.

Pour le prion [URE3] la souche haploïde utilisée est CC34 (Mat a, trpl-1, ade2-1, leu2-3,112, his3-ll,15, ura2::HIS3). For the prion [URE3] the haploid strain used is CC34 (Mat a, trpl-1, ade2-1, leu2-3,112, his3-ll, 15, ura2 :: HIS3).

La souche NT34 qui a servi pour le crible secondaire a été construite à partir de CC34, souche dans laquelle la phase codante du gène DAL5 a été remplacée par celle du gène ADE2 en utilisant la même méthode que celle utilisée pour la construction de la souche STRg6. Pour cela une cassette de délétion correspondant au gène ADE2 flanqué par des séquences en ADN se trouvant en amont et en aval de la phase codante du gène DAL5 a été produite par PCR en utilisant de l'ADN génomique de la souche haploïde BY4742 (Mat a, his3Al, leu2#0, lys2#0, ura3#0) comme matrice et les oligonucléotides : ACAACAAAACAAGGATAATCAAATAGTGTAAAAAAAAAAATTCAAGATGGATTCTAGAACAG TTGG (SEQ ID N 5) (51), et, The strain NT34 which was used for the secondary screen was constructed from CC34, strain in which the coding phase of the DAL5 gene was replaced by that of the ADE2 gene using the same method as that used for the construction of the STRg6 strain. . For this, a deletion cassette corresponding to the ADE2 gene flanked by DNA sequences located upstream and downstream of the coding phase of the DAL5 gene was produced by PCR using genomic DNA from the haploid strain BY4742 (Mat a , his3Al, leu2 # 0, lys2 # 0, ura3 # 0) as matrix and the oligonucleotides: ACAACAAAACAAGGATAATCAAATAGTGTAAAAAAAAAAATTCAAGATGGATTCTAGAACAG TTGG (SEQ ID N 5) (51), and,

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TATATTCTTCTCTGATAACAATAATGTCAGTGTATCTCACCACTATTATTACTTGTTTTCTA GATAAGC (SEQ ID N 6) (3') comme amorces.  TATATTCTTCTCTGATAACAATAATGTCAGTGTATCTCACCACTATTATTACTTGTTTTCTA GATAAGC (SEQ ID N 6) (3 ') as primers.

La mutation dal5::ADE2 a ensuite été vérifiée par PCR en utilisant l'ADN génomique de la souche NT34 comme matrice et les oligonucléotides : ATAGTCTCTGCTCATAG (SEQ ID N 7) (5'), et, GCTTACAGAAATTCTAC (SEQ ID N 8) (3') comme amorces. The dal5 :: ADE2 mutation was then verified by PCR using the genomic DNA of the strain NT34 as template and the oligonucleotides: ATAGTCTCTGCTCATAG (SEQ ID N 7) (5 '), and, GCTTACAGAAATTCTAC (SEQ ID N 8) ( 3 ') as primers.

La souche NT34 (Mat a, trpl-1, ade2-1, leu2-3, 112, his3-11,15, ura2 : : HIS3, da15::ADE2) a été déposée à la CNCM le 10 octobre 2002 sous le numéro 1-2942. The strain NT34 (Mat a, trpl-1, ade2-1, leu2-3, 112, his3-11,15, ura2:: HIS3, da15 :: ADE2) was deposited at the CNCM on October 10, 2002 under the number 1-2942.

Ce crible est basé sur le même système colorimétrique que le crible primaire. Dans la souche de levure NT34, le gène ADE2 n'est plus sous contrôle de son propre promoteur, mais sous celui du gène DAL5. Lorsque la protéine Ure2p est sous forme prion ([URE3]), la transcription à partir du promoteur du gène DAL5 est activée donc le gène ADE2 est exprimé, donc les souches sont blanches et autotrophes pour l'adénine. Lorsque la protéine Ure2p est sous forme normale ([ure3-0]), la transcription à partir du promoteur du gène DAL5 est réprimée donc le gène ADE2 n'est pas exprimé, donc les souches sont rouges et auxotrophes pour l'adénine. Lorsque la souche NT34 est traitée avec 5mM de chlorure de guanidium pendant une dizaine de générations, elle forme des colonies rouges (comme attendu et comme le ferait la souche [PSI+] utilisée pour le criblage primaire). Comme on peut l'observer sur la figure 6, la phénanthridine et la 6-aminophénanthridine provoquent l'apparition d'un halo rouge lorsqu'elles sont déposées sur le petit filtre lui-même déposé sur le tapis de cellules préalablement étalées sur le milieu nutritif gélosé (même procédé que pour le crible primaire, voir figure 2). Ce résultat suggère que ces produits sont également actifs sur le prion [URE3]. Il est à noter, toutefois, que ce crible secondaire est nettement moins sensible que le crible This screen is based on the same color system as the primary screen. In the yeast strain NT34, the ADE2 gene is no longer under the control of its own promoter, but under that of the DAL5 gene. When the protein Ure2p is in prion form ([URE3]), transcription from the promoter of the DAL5 gene is activated, therefore the ADE2 gene is expressed, therefore the strains are white and autotrophic for adenine. When the protein Ure2p is in normal form ([ure3-0]), transcription from the promoter of the DAL5 gene is suppressed therefore the ADE2 gene is not expressed, therefore the strains are red and auxotrophic for adenine. When the strain NT34 is treated with 5 mM of guanidium chloride for ten generations, it forms red colonies (as expected and as the strain [PSI +] used for the primary screening). As can be seen in Figure 6, phenanthridine and 6-aminophenanthridine cause the appearance of a red halo when they are deposited on the small filter itself deposited on the carpet of cells previously spread on the medium nutritious agar (same process as for the primary screen, see figure 2). This result suggests that these products are also active on the prion [URE3]. It should be noted, however, that this secondary screen is much less sensitive than the screen.

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primaire. Il est donc très utile pour observer rapidement si l'effet des molécules isolées lors du premier crible est généralisable à d'autres prions de levure mais en aucun cas il ne saurait se substituer au crible primaire.  primary. It is therefore very useful to quickly observe whether the effect of the molecules isolated during the first screen can be generalized to other yeast prions but in no case should it be a substitute for the primary screen.

Exemple 6 . Véri fication de la cure de [URE3] en milieu liquide Deux types d'expériences ont été menés afin de vérifier que l'effet observé sur boîte avec la souche NT34 correspond bien à de la cure. Tout d'abord, des cellules dans les zones environnant les filtres ont été récupérées pour le témoin négatif (DMSO), positif (chlorure de guanidium) pour la phénanthridine et pour la 6-aminophénanthridine. Ces cellules ont ensuite été striées sur un milieu frais exempt de toutes ces molécules. Les cellules récupérées autour des filtres forment toutes des colonies rouges, à l'exception de celles récoltées autour du témoin négatif. Ce résultat montre que la coloration rouge observée sur boîte pour la souche NT34 correspond bien à une cure et non à un artéfact lié à une inhibition d'une enzyme de la voie de biosynthèse de l'adénine (dans ce cas, la coloration rouge serait perdue sur un milieu sans inhibiteur). L'effet de cure de la phénanthridine et de la 6-aminophénanthridine a également été vérifié directement sur le prion [URE3]. Des cellules [URE3] de la souche CC34 poussent sur un milieu appelé USA alors que des cellules curées ([ure3-0]) sont incapables de pousser sur ce milieu.  Example 6. Verification of the cure of [URE3] in a liquid medium Two types of experiments were carried out in order to verify that the effect observed on a dish with the strain NT34 corresponds indeed to the cure. First, cells in the areas surrounding the filters were recovered for the negative control (DMSO), positive (guanidium chloride) for phenanthridine and for 6-aminophenanthridine. These cells were then striated on a fresh medium free of all these molecules. The cells recovered around the filters all form red colonies, with the exception of those harvested around the negative control. This result shows that the red coloration observed on box for the strain NT34 corresponds well to a cure and not to an artefact linked to an inhibition of an enzyme of the pathway of adenine biosynthesis (in this case, the red coloration would be lost on a medium without inhibitor). The curing effect of phenanthridine and 6-aminophenanthridine was also verified directly on the prion [URE3]. Cells [URE3] of the CC34 strain grow on a medium called USA while cured cells ([ure3-0]) are unable to grow on this medium.

Les inventeurs ont examiné la capacité de cellules [URE3] traitées par 200 M de chlorure de guanidium (témoin négatif), par 5 mM de chlorure de guanidium (témoin positif) ou par différentes doses de 6-aminophénanthridine (seule ou en combinaison avec 200 M de chlorure de guanidium) à pousser sur un milieu USA. La 6-aminophénanthridine est capable de curer le prion [URE3] de façon significative et, tout comme pour le prion [PSI+], cet effet est accentué par une faible dose de The inventors examined the capacity of cells [URE3] treated with 200 M of guanidium chloride (negative control), with 5 mM of guanidium chloride (positive control) or with different doses of 6-aminophenanthridine (alone or in combination with 200 M guanidium chloride) to grow on a USA medium. 6-aminophenanthridine is able to cure the prion [URE3] significantly and, as for the prion [PSI +], this effect is accentuated by a low dose of

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chlorure de guanidium (200 M). Ces résultats, outre le fait qu'ils valident le crible secondaire avec la souche NT34, suggèrent que l'effet des inhibiteurs mis en évidence par ledit crible devrait être général sur tous les prions de levure.  guanidium chloride (200 M). These results, in addition to the fact that they validate the secondary screen with the strain NT34, suggest that the effect of the inhibitors demonstrated by said screen should be general on all yeast prions.

Exemple 7 : Validation du crible avec deux molécules actives sur le prion des mammifères PrP . la chlorpromazine et la quinacrine Le laboratoire de Stanley Prusiner, père de l'hypothèse protéine seule et prix Nobel en 1997, a isolé un certain nombre de molécules actives sur le prion de mammifère PrP grâce à un système de cellules murines (neuroblastomes) chroniquement infectées par le prion PrPsc (Korth et al., 2001). Ce système, de par sa lourdeur et sa complexité, ne permet pas un criblage massif comme celui mis au point par les inventeurs. Aussi l'approche du groupe de Stanley Prusiner at-elle été de tester une à une, parmi les molécules déjà utilisées comme médicaments, toutes celles qui passent la barrière hémato-encéphalique. Certaines molécules, comme notamment la quinacrine (utilisée comme anti-paludéen depuis longtemps) ou la chlorpromazine (un anti-dépresseur) présentent une activité notable dans leur système. De façon à valider le crible, les inventeurs ont donc testé la chlorpromazine et la quinacrine dans leur système levure. Example 7: Validation of the screen with two molecules active on the prion of PrP mammals. chlorpromazine and quinacrine The laboratory of Stanley Prusiner, father of the protein-only hypothesis and Nobel Prize winner in 1997, isolated a number of molecules active on the mammalian prion PrP using a system of chronically infected murine cells (neuroblastomas) by the prion PrPsc (Korth et al., 2001). This system, by its heaviness and its complexity, does not allow a massive screening like that developed by the inventors. So the approach of Stanley Prusiner's group was to test one by one, among the molecules already used as drugs, all those which pass the blood-brain barrier. Certain molecules, such as quinacrine in particular (used as an anti-malarial for a long time) or chlorpromazine (an anti-depressant) have notable activity in their system. In order to validate the screen, the inventors therefore tested chlorpromazine and quinacrine in their yeast system.

Comme montré dans la figure 7, ces deux molécules présentent une certaine activité contre le prion [PSI+]. Il faut toutefois noter que leurs activités sont nettement inférieures à celle de la 6-aminophénanthridine. On peut également relever que la chlorpromazine et la quinacrine, tout comme l'ensemble des molécules mis en évidence par l'invention, présentent une forte synergie d'action avec le chlorure de guanidium (Sur la figure 7, le milieu utilisé contient 200M de chlorure de guanidium). Ce dernier résultat suggère que ces deux molécules As shown in Figure 7, these two molecules have some activity against the [PSI +] prion. However, it should be noted that their activities are much lower than that of 6-aminophenanthridine. It can also be noted that chlorpromazine and quinacrine, like all of the molecules highlighted by the invention, exhibit a strong synergy of action with guanidium chloride (In FIG. 7, the medium used contains 200M of guanidium chloride). This last result suggests that these two molecules

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agissent sur la même voie biochimique que les molécules isolées selon l'invention.  act on the same biochemical path as the molecules isolated according to the invention.

Par ailleurs, il est intéressant de noter que la quinacrine, dont l'activité est environ dix fois supérieure à celle de la chlopromazine dans le test du Pr. Prusiner, présente également une activité nettement supérieure à celle-ci dans le crible mis au point par les inventeurs. En outre, tout comme dans le test du Pr. Prusiner, la chlorpromazine et la quinacrine nécessitent un traitement prolongé (au moins 6 jours dans le cas du test du Pr. Prusiner, au moins deux à trois jours dans le cas du crible selon l'invention) avant de déceler une activité. Furthermore, it is interesting to note that quinacrine, whose activity is approximately ten times greater than that of chlopromazine in the Pr. Prusiner test, also exhibits activity clearly greater than this in the screen developed. by the inventors. In addition, as in the Pr. Prusiner test, chlorpromazine and quinacrine require prolonged treatment (at least 6 days in the case of the Pr. Prusiner test, at least two to three days in the case of the sieve according to the 'invention) before detecting an activity.

Toutes ces corrélations entre l'activité de la quinacrine et de la chlorpromazine selon le test ou le crible utilisé permettent de valider l'utilisation de la méthode selon l'invention pour réaliser des criblages haut débit en vue d'isoler des molécules susceptibles de constituer des médicaments efficaces (sur les mammifères et en particulier sur l'homme) contre des maladies neurodégénératives impliquant des agrégats protéiques, de type encéphalopathies spongiformes, maladies d'Alzheimer, de Hungtinton... All these correlations between the activity of quinacrine and chlorpromazine according to the test or the screen used make it possible to validate the use of the method according to the invention for carrying out high-throughput screening in order to isolate molecules capable of constituting drugs effective (on mammals and in particular on humans) against neurodegenerative diseases involving protein aggregates, such as spongiform encephalopathies, Alzheimer's, Hungtinton's diseases ...

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Références bibliographiques Fernandez-Bellot et al., "The protein-only theory and the yeast
Saccharomyces cerevisiae: the prions and the propagons", CMLS, 2001,58:1857-1878. Bibliographic references Fernandez-Bellot et al., "The protein-only theory and the yeast
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PNAS, 2001, 98(17):9836-9841. Korth C. et al., "Acridine and phenothiazine derivatives as pharmacotherapeutics for prion disease",
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Heterocyclic Chem., 1997,34:465-467.  Heterocyclic Chem., 1997,34: 465-467.

Kessar S. V. et al., Tetrahedron Letters, 1969,1151. Kessar S. V. et al., Tetrahedron Letters, 1969, 1151.

Claims (16)

Revendications 1. Kit de criblage de molécules à activité anti-prion, caractérisé en ce qu'il comporte en combinaison une levure de phénotype [PSI+] avec un antibiogramme.  Claims 1. Kit for screening molecules with anti-prion activity, characterized in that it comprises in combination a yeast of phenotype [PSI +] with an antibiogram. 2. Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène ERG6 de la souche [PSI+] est inactivé. 2. Kit according to claim 1, characterized in that the ERG6 gene of the strain [PSI +] is inactivated. 3. Kit selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la levure est Saccharomyces cerevisiae. 3. Kit according to claim 1 or 2, characterized in that the yeast is Saccharomyces cerevisiae. 4. Kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un agent de curage des prions à doses sub-efficaces. 4. Kit according to any one of claims 1 to 3, characterized in that it further comprises a prion cleaning agent in sub-effective doses. 5. Kit selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent de curage des prions est le chlorure de guanidium. 5. Kit according to claim 4, characterized in that the prion cleaning agent is guanidium chloride. 6. Méthode de criblage de molécules à activité anti-prion, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre la levure de phénotype [PSI+] et comporte les étapes suivantes : a. réalisation d'un tapis de cellules in vitro b. dépôt des composés à tester selon la méthode de l'antibiogramme, c. incubation pendant environ 2-4 jours à environ 20-25 C, et, d. analyse de la coloration des colonies cellulaires. 6. Method for screening molecules with anti-prion activity, characterized in that it implements the yeast of phenotype [PSI +] and comprises the following steps: a. creation of a cell mat in vitro b. deposit of the compounds to be tested according to the antibiogram method, c. incubation for approximately 2-4 days at approximately 20-25 C, and, d. analysis of the coloration of the cell colonies. 7. Méthode de criblage selon la revendication 6, caractérisée en ce que le gène ERG6 de la levure est inactivé. 7. Screening method according to claim 6, characterized in that the yeast ERG6 gene is inactivated. 8. Méthode de criblage selon la revendication 6, caractérisée en ce que la levure est Saccharomyces cerevisiae. 8. Screening method according to claim 6, characterized in that the yeast is Saccharomyces cerevisiae. <Desc/Clms Page number 27> <Desc / Clms Page number 27> 9. Méthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que l'étape a. comporte en outre l'ajout d'une dose sub-efficace de chlorure de guanidium. 9. Screening method according to any one of claims 6 to 8, characterized in that step a. additionally involves the addition of a sub-effective dose of guanidium chloride. 10. Méthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre les étapes suivantes : e. incubation pendant environ 2-4 jours à environ 2-6 C, et/ou, f. réalisation d'un test de criblage secondaire. 10. Screening method according to any one of claims 6 to 9, characterized in that it further comprises the following steps: e. incubation for approximately 2-4 days at approximately 2-6 C, and / or, f. performing a secondary screening test. 11. Méthode de criblage selon la revendication 10, caractérisée en ce que le test de criblage secondaire comporte les étapes suivantes : construction d'une souche de levure dans laquelle le gène ADE2 est sous le contrôle du promoteur du gène11. Screening method according to claim 10, characterized in that the secondary screening test comprises the following steps: construction of a yeast strain in which the ADE2 gene is under the control of the gene promoter DAL5 réalisation des étapes a. à e. des méthodes selon les revendications 6 et 10, l'étape a. comportant en outre l'ajout d'une dose sub-efficace de chlorure de guanidium. DAL5 carrying out steps a. to e. methods according to claims 6 and 10, step a. further comprising the addition of a sub-effective dose of guanidium chloride. 12. Agents anti-prion de formule (I) 12. Anti-prion agents of formula (I)
Figure img00270001
Figure img00270001
 <Desc/Clms Page number 28><Desc / Clms Page number 28> 2, q égale 0 ou 1. 2, q equals 0 or 1. X représente F, Cl, Br, I, CF3, SCH3, OCH3, OH, N02, COCH3, CONH2, COOH, COOR3 , où R3 est un groupement alkyl de 1 à 4 carbones, p et n, identiques ou différents, égalent 0,1 ouX represents F, Cl, Br, I, CF3, SCH3, OCH3, OH, NO2, COCH3, CONH2, COOH, COOR3, where R3 is an alkyl group of 1 to 4 carbons, p and n, identical or different, equal 0 , 1 or dans laquelle R' est un groupement H, NH2, NHR2, où R2est une chaîne alkyle ou alkylaminoalkyle de 1 à 10 carbones, ramifiée ou non, in which R ′ is a group H, NH2, NHR2, where R2 is an alkyl or alkylaminoalkyl chain of 1 to 10 carbons, branched or not, 13. Agents anti-prion selon la revendication 12, de formule (II) dans laquelle : 13. Anti-prion agents according to claim 12, of formula (II) in which:
Figure img00280001
Figure img00280001
 2. 2. X représente F, Cl, p et n, identiques ou différents, égalent 0,1 ouX represents F, Cl, p and n, identical or different, equal 0.1 or N(CH3)2, NH-CH(CH3)-(CH2)3-N(CH2-CH3)2, N (CH3) 2, NH-CH (CH3) - (CH2) 3-N (CH2-CH3) 2, R' représente un groupement H, NH2, NH-(CH2)3- R 'represents a group H, NH2, NH- (CH2) 3- 14. Agents anti-prion selon la revendication 12, de formule (III) dans laquelle : 14. Anti-prion agents according to claim 12, of formula (III) in which: <Desc/Clms Page number 29> <Desc / Clms Page number 29>
Figure img00290001
Figure img00290001
 2. 2. X représente F, Cl, p et n, identiques ou différents, égalent 0,1 ouX represents F, Cl, p and n, identical or different, equal 0.1 or R' représente un groupement H, NH2, NH-(CH2)3- N(CH3)2, NH-CH(CH3)-(CH2)3-N(CH2-CH3)2,R ′ represents a group H, NH2, NH- (CH2) 3- N (CH3) 2, NH-CH (CH3) - (CH2) 3-N (CH2-CH3) 2, 15. Utilisation des agents anti-prion selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, pour l'obtention d'un médicament destiné à traiter les maladies neurodégénératives impliquant des agrégats protéiques. 15. Use of the anti-prion agents according to any one of claims 12 to 14, for obtaining a medicament intended for treating neurodegenerative diseases involving protein aggregates. 16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que les maladies sont les encéphalopathies spongiformes, les maladies d'Alzheimer et de Huntington.16. Use according to claim 15, characterized in that the diseases are spongiform encephalopathies, Alzheimer's and Huntington's diseases.
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