FR2845604A1 - Use of cDNA encoding a mutant 5-HT4 receptor for treatment or prevention of diseases associated with dysfunctional synthesis of cyclic adenosine monophosphate, e.g. neurodegeneration or asthma - Google Patents
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Abstract
Description
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COMPOSITION PHARMACEUTIQUE COMPRENANT UN RECEPTEUR 5-HT4D100A, ET SES APPLICATIONS THERAPEUTIQUES. PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING A 5-HT4D100A RECEPTOR, AND THERAPEUTIC USES THEREOF
La présente invention appartient au domaine des pathologies liées à des défaillances dans la synthèse intracellulaire d'adénosine-monophosphate cyclique (AMPc), et en particulier à l'utilisation de compositions pharmaceutiques utiles dans la prévention et/ou le traitement de pathologies liées à une défaillance dans la synthèse d'AMPc, en particulier de pathologies neurodégénératives et de pathologies respiratoires. The present invention belongs to the field of pathologies related to failures in the intracellular synthesis of cyclic adenosine monophosphate (cAMP), and in particular to the use of pharmaceutical compositions useful in the prevention and / or treatment of pathologies related to a failure in cAMP synthesis, particularly neurodegenerative pathologies and respiratory pathologies.
Parmi les maladies neurodégénératives ayant une incidence importante dans la santé humaine, on connaît, notamment, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, ou la chorée de Huntington. Among the neurodegenerative diseases that have a significant impact on human health, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, or Huntington's chorea are known, among others.
La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui se traduit par des difficultés de déclenchement du mouvement volontaire. Cette maladie est due à la dégénérescence des neurones dopaminergiques situés dans la substance noire. La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative progressive du cerveau qui entraîne la sénilité et la démence. L'accumulation de la protéine beta-amyloïde est à l'origine de l'apparition des premiers symptômes de cette maladie. La Chorée de Huntington qui se caractérise par un trouble du mouvement associé à une démence progressive est due à l'altération des neurones du striatum. Parkinson's disease is a neurodegenerative disease that results in difficulties triggering voluntary movement. This disease is due to the degeneration of dopaminergic neurons located in the substantia nigra. Alzheimer's disease is a progressive neurodegenerative disease of the brain that causes senility and dementia. The accumulation of the beta-amyloid protein is at the origin of the appearance of the first symptoms of this disease. Huntington's chorea, which is characterized by a movement disorder associated with progressive dementia, is due to the alteration of the striatal neurons.
La plupart des maladies neurodégénératives ne sont diagnostiquées qu'à l'apparition des symptômes, à un moment où la dégénérescence neuronale est déjà très Most neurodegenerative diseases are diagnosed only at the onset of symptoms, at a time when neuronal degeneration is already very
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avancée, les traitements sont et seront pour longtemps symptomatiques. advanced, the treatments are and will be for a long time symptomatic.
Dans le cas de la maladie de Parkinson, les traitements consistent à administrer de la L-dopa, un précurseur de la dopamine, afin d'augmenter sa synthèse dans les neurones encore en vie. Ces traitements ont des effets indésirables (dyskinésies) qui surviennent après quelques années. Dans les cas les plus sévères on peut utiliser la mise en place chirurgicale d'un appareillage de stimulation à haute fréquence du noyau subtalamique. In the case of Parkinson's disease, the treatments consist of administering L-dopa, a precursor of dopamine, to increase its synthesis in neurons still alive. These treatments have adverse effects (dyskinesias) that occur after a few years. In the most severe cases, the surgical placement of high frequency stimulation equipment of the subtalamic nucleus can be used.
Dans le cas de la maladie d'Alzheimer, les traitements pharmacologiques sont en cours selon trois approches qui agissent sur le système cholinergique. In the case of Alzheimer's disease, pharmacological treatments are ongoing according to three approaches that affect the cholinergic system.
Administrer des précurseurs de l'acétylcholine, telle la lécithine-choline. Administrer des médicaments majorant la libération de l'acétylcholine comme l'hydergine, administrer des inhibiteurs de la cholinestérase tels que la tacrine et la velnacrine, cependant les bénéfices cliniques demeurent en général modestes avec beaucoup d'effets indésirables. Administer precursors of acetylcholine, such as lecithin-choline. Administering drugs that increase the release of acetylcholine such as hydergine, administering cholinesterase inhibitors such as tacrine and velnacrine, however, the clinical benefits generally remain modest with many adverse effects.
Les traitements de la chorée d'Huntington mettent en #uvre des médicaments qui réduisent l'activité dopaminergique. Leurs principaux effets indésirables sont l'agitation et le parkinsonisme. Huntington's chorea treatments use drugs that reduce dopaminergic activity. Their main undesirable effects are agitation and parkinsonism.
Aucun de ces traitements donne satisfaction d'un point de vue thérapeutique car, en aucun cas, ces processus ne peuvent être reversés par les traitements actuels mentionnés ci-dessus. None of these treatments is satisfactory from a therapeutic point of view because, in any case, these processes can not be reversed by the current treatments mentioned above.
Les traitements existants qui sont uniquement symptomatiques n'empêchent en aucun cas la dégénérescence neuronale, ils ont uniquement pour but de stimuler davantage les quelques neurones en survie provisoire. L'issue par ces traitements est de toute Existing treatments that are only symptomatic do not in any way prevent neuronal degeneration, they are only intended to further stimulate the few neurons in temporary survival. The outcome by these treatments is of any
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façon fatale, seule la prolongation de quelques fonctions neuronales renforcées est envisageable par les traitements actuels. fatal way, only the prolongation of some reinforced neuronal functions is possible by the current treatments.
Ainsi, pour pallier ces inconvénients, la demanderesse a mis au point une nouvelle composition thérapeutique capable d'accroître localement la concentration intracellulaire d'un composé protecteur : l'AMPc. Thus, to overcome these drawbacks, the Applicant has developed a novel therapeutic composition capable of locally increasing the intracellular concentration of a protective compound: cAMP.
Dans le cadre de pathologies neurodégénératives, grâce à son effet neuroprotecteur, l'AMPc peut sauver de la mort des neurones en cours de dégénérescence. Il évite ainsi la mort programmée du neurone et permet par conséquent de maintenir et/ou de recouvrer partiellement ou totalement son activité. De ce fait, la maladie sera traitée à ses origines. Les régions du cerveau concernées sont celles où les neurones dégénèrent. In the context of neurodegenerative pathologies, thanks to its neuroprotective effect, cAMP can save dying neurons from death. It thus avoids the programmed death of the neuron and consequently makes it possible to maintain and / or recover partially or totally its activity. As a result, the disease will be treated at its origins. The regions of the brain involved are those where the neurons degenerate.
On connaît que, outre les maladies neurodégénératives ci-dessus mentionnées, d'autres pathologies, comme les maladies respiratoires, et notamment l'asthme et la mucoviscidose, sont liées à une anomalie dans la synthèse d'AMPc. It is known that, in addition to the neurodegenerative diseases mentioned above, other pathologies, such as respiratory diseases, and in particular asthma and cystic fibrosis, are related to an abnormality in the synthesis of cAMP.
Il est aujourd'hui reconnu que l'asthme est une maladie inflammatoire d'où l'importance des médicaments anti-inflammatoires dans le traitement quotidien de l'asthme et pour guérir les crises aiguës. De nombreuses recherches fondamentales dans ce domaine ont démontré que les processus d'inflammation peuvent être régulés par l'AMPc via l'inhibition des phosphodiestérases afin d'augmenter la concentration intracellulaire d'AMPc (Trifilieff,A. et al. J.Pharmacol.Exp.Ther. (2002) 301 : 241-248) ou via l'activation des récepteurs béta2 adrénergiques couplés positivement à l'adénylate cyclase It is now recognized that asthma is an inflammatory disease hence the importance of anti-inflammatory drugs in the daily treatment of asthma and for curing acute attacks. Numerous basic research in this field has demonstrated that inflammation processes can be regulated by cAMP via inhibition of phosphodiesterases in order to increase the intracellular concentration of cAMP (Trifilieff, A. et al., J. Pharmacol. Exp.Ther. (2002) 301: 241-248) or via activation of beta2-adrenergic receptors positively coupled to adenylate cyclase
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(Aksoy MO. J Allergy Clin. immunol.(2002) 109:491-497 ; Gao H. et al. Chin. Med. J (2001) 114: 1317-1319). Dans ces deux études, il a été clairement démontré que l'augmentation de la concentration intracellulaire en AMPc conduit à des effets bénéfiques dans le traitement de l'asthme. L'AMPc est considéré comme un bronchodilatateur pour diminuer la réponse inflammatoire dans le cas de l'asthme mais aussi le cas de la mucoviscidose où l'on sait que le gène de la protéine cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ou (CFTR) code pour une protéine dont l'une des fonctions est d'être un canal chlore régulé par l'AMPc, (Andersson C. et al. (Aksoy MO, J Allergy Clin Immunol (2002) 109: 491-497, Gao H. et al., Chin Med J (2001) 114: 1317-1319). In both studies, it has been clearly demonstrated that increasing the intracellular cAMP concentration leads to beneficial effects in the treatment of asthma. CAMP is considered a bronchodilator to decrease the inflammatory response in the case of asthma but also the case of cystic fibrosis where it is known that the gene of the protein cystic fibrosis transmembrane conductance regulator or (CFTR) codes for a a protein whose function is to be a cAMP regulated chlorine channel, (Andersson, C. et al.
Clin Sci (2002) 103 : 417-424;J. Gen. Physiol. (2002) 120 : 407-418 ; Bebok Z. J. Biol. Chem. (2002) in press). Clin Sci (2002) 103: 417-424; Gen. Physiol. (2002) 120: 407-418; Bebok Z. J. Biol. Chem. (2002) in press).
L'augmentation locale de la concentration d'AMPc est obtenue, dans le cadre de la présente invention, au moyen d'une composition pharmaceutique induisant une augmentation locale et spécifique de l'expression, dans un tissu ciblé, d'un récepteur 5-HT4 muté, de telle manière qu'il est activé par un ligand synthétique mais pas par son ligand naturel
Ledit récepteur est ensuite activé seulement par des ligands spécifiques synthétiques pour induire localement la synthèse de l'AMPc protecteur des cellules et notamment des cellules neuronales et des cellules épithéliales. The local increase in cAMP concentration is obtained, within the framework of the present invention, by means of a pharmaceutical composition inducing a local and specific increase in the expression, in a targeted tissue, of a receptor. HT4 mutated, so that it is activated by a synthetic ligand but not by its natural ligand
Said receptor is then activated only by specific synthetic ligands to locally induce the synthesis of cAMP protecting the cells and in particular neuronal cells and epithelial cells.
On connaît le cas des neurones dopaminergiques de la substance noire, dans le cas de la maladie de Parkinson par exemple (Jellinger, K. (1990) Adv Neurol 53 : 1-16). Plusieurs effets bénéfiques de la production d'AMPc par le récepteur 5-HT4-D100A dans les neurones dopaminergiques sont attendus : l'augmentation de la survie neuronale 2) la stimulation de la transcription The case of dopaminergic neurons of the substantia nigra is known, in the case of Parkinson's disease, for example (Jellinger, K. (1990) Adv Neurol 53: 1-16). Several beneficial effects of cAMP production by the 5-HT4-D100A receptor in dopaminergic neurons are expected: increased neuronal survival 2) transcriptional stimulation
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codant pour la tyrosine hydroxylase (donc une augmentation de la synthèse de dopamine) 3) la stimulation de dopamine 4) un effet anti-inflammatoire. coding for tyrosine hydroxylase (thus an increase in dopamine synthesis) 3) dopamine stimulation 4) an anti-inflammatory effect.
Dans le cas de la maladie d'Alzheimer, une augmentation locale d'AMPc favoriserait la sécrétion de la forme soluble du précurseur de la protéine bêta amyloïde, forme non amyloïdogénique (Robert, S. J., Zugaza, J. L., Fischmeister, R., Gardier, A. M., and Lezoualc'h, F. (2001) J Biol Chem. 276 : Dans le cas de la Chorée de Huntington une augmentation locale d'AMPc sauverait ainsi les neurones du putamen de la mort programmée (Mantamadiotis, T., Lemberger, T., Bleckmann, S. C., Kern, H., Kretz, 0., Martin Villalba, A., Tronche, F., Kellendonk, C., Gau, D., Kapfhammer, J., Otto, C., Schmid, W., and Schutz, G. In the case of Alzheimer's disease, a local increase of cAMP would promote the secretion of the soluble form of the precursor of amyloid beta protein, a non-amyloidogenic form (Robert, SJ, Zugaza, JL, Fischmeister, R., Gardier, AM, and Lezoualc'h, F. (2001) J Biol Chem 276: In the case of Huntington's Chorea a local increase in cAMP would save the putamen neurons from programmed death (Mantamadiotis, T., Lemberger, T., Bleckmann, SC, Kern, H., Kretz, O., Martin Villalba, A., Tronche, F., Kellendonk, C., Gau, D., Kapfhammer, J., Otto, C., Schmid, W., and Schutz, G.
(2002) Nat Genet 31 : 47-54. ). (2002) Nat Genet 31: 47-54. ).
La composition pharmaceutique de l'invention, ouvre aussi la voie à une nouvelle forme de thérapie génique pour le traitement des maladies nécessitant une régulation de la concentration intracellulaire d'AMPc en utilisant un récepteur couplé aux protéines Galpha s' un RASSL 5-HT4 muté, comme moyen de régulation de la concentration intracellulaire d'AMPc. The pharmaceutical composition of the invention also opens the way to a novel form of gene therapy for the treatment of diseases requiring regulation of intracellular cAMP concentration using a Galpha-coupled protein receptor or a mutated RASSL 5-HT4. as a means of regulating the intracellular concentration of cAMP.
Des compositions pharmaceutiques comprenant lesdits récepteurs mutés silencieux 5-HT4-D100A constituent des outils qui modulent les voies de transduction et permettent, de ce fait, de corriger des pathologies liées à la survie cellulaire, notamment neuronales, dépendant de la concentration intracellulaire d'AMPc. Pharmaceutical compositions comprising said mutated 5-HT4-D100A mutant receptors constitute tools that modulate the transduction pathways and thus make it possible to correct pathologies related to cell survival, in particular neuronal, depending on the intracellular concentration of cAMP. .
L'effet neuroprotecteur de l'AMPc sur les neurones du système nerveux central, permet de mettre en The neuroprotective effect of cAMP on the neurons of the central nervous system makes it possible to
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#uvre une nouvelle forme de thérapie génique comprenant l'expression du récepteur muté, producteur d'AMPc, dans les régions du cerveau où les neurones dégénèrent. is a new form of gene therapy that involves the expression of the cAMP-producing mutated receptor in brain regions where neurons are degenerating.
Dans les trois exemples de maladies neurodégénératives ci-dessus mentionnés, l'augmentation de la concentration intracellulaire en AMPc peut réduire fortement la dégénérescence neuronale (Jellinger, K. In the three examples of neurodegenerative diseases mentioned above, increasing the intracellular cAMP concentration can strongly reduce neuronal degeneration (Jellinger, K.
(1990) Adv Neurol 53 : 1-16 ; Robert, S. J., Zugaza, J. (1990) Adv Neurol 53: 1-16; Robert, S.J., Zugaza, J.
L., Fischmeister, R., Gardier, A. M., and Lezoualc'h, F. L., Fischmeister, R., Gardier, A. M., and Lezoualc'h, F.
(2001) J.Biol.Chem. 276: 44881-44888 ; Mantamadiotis, T., Lemberger, T., Bleckmann, S. C., Kern, H., Kretz, O., Martin Villalba, A., Tronche, F., Kellendonk, C., Gau, D., Kapfhammer, J., Otto, C., Schmid, W., and Schutz, G. (2002) Nat.Genet. 31 : 47-54)
Les compositions pharmaceutiques objet de la présente invention ont pour but de reverser les processus cellulaires qui, une fois enclenchés, conduisent au développement des maladies neurodégénératives. (2001) J. Biol. Chem. 276: 44881-44888; Mantamadiotis, T., Lemberger, T., Bleckmann, SC, Kern, H., Kretz, O., Martin Villalba, A., Tronche, F., Kellendonk, C., Gau, D., Kapfhammer, J., Otto, C., Schmid, W., and Schutz, G. (2002) Nat.Genet. 31: 47-54)
The object of the present invention is to reverse the cellular processes which, once switched on, lead to the development of neurodegenerative diseases.
Cette nouvelle composition thérapeutique comprend un récepteur qui, avantageusement, a été rendu silencieux à son ligand endogène, par une simple mutation, mais qui reste toujours activable uniquement par des ligands exogènes. This novel therapeutic composition comprises a receptor which, advantageously, has been rendered silent to its endogenous ligand by a simple mutation, but which remains always activatable solely by exogenous ligands.
L'intérêt de ces récepteurs appelés RASSL Receptor Activated Solely by Synthetic Ligands a été pour la première fois mentionné par Conklin en 1998 (Coward P. et al. (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 352-35). Les exemples de récepteurs qui par une ou plusieurs mutations deviennent totalement silencieux en présence de leur agoniste naturel tout en gardant la The interest of these receptors called RASSL Receptor Activated Solely by Synthetic Ligands was first mentioned by Conklin in 1998 (Coward P. et al (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 352-35). . Examples of receptors that by one or more mutations become completely silent in the presence of their natural agonist while keeping the
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faculté d'être stimulés par des agonistes synthétiques sont encore très rares. Le seul exemple connu à ce jour est le récepteur kappa des opiacés, couplé négativement à l'adénylate cyclase. Ainsi, l'expression de ce récepteur exprimé dans le c#ur, a la capacité de moduler le rythme cardiaque en diminuant, dans ce cas, la concentration intracellulaire d'AMPc (Redfern C.H. et al.(2000) Proc. Natl.Acad.Sci. USA 97 : Dans le cadre de la présente invention on entend par : - Agoniste: toute molécule capable d'engendrer par sa liaison à ses récepteurs, une réponse biologique semblable à un médiateur endogène. ability to be stimulated by synthetic agonists are still very rare. The only known example to date is the opiate kappa receptor, which is negatively coupled to adenylate cyclase. Thus, expression of this receptor expressed in the heart, has the ability to modulate the heart rate by decreasing, in this case, the intracellular concentration of cAMP (Redfern CH et al (2000) Proc Natl.Acad USA 97: In the context of the present invention is meant by: - Agonist: any molecule capable of generating by its binding to its receptors, a biological response similar to an endogenous mediator.
- Antagoniste : toute molécule capable de bloquer l'action des agonistes. - Antagonist: any molecule capable of blocking the action of agonists.
Agoniste inverse : Un agoniste capable d'engendrer une réponse biologique inverse à celle des agonistes normaux. Inverse agonist: An agonist capable of generating a reverse biological response to that of normal agonists.
La présente invention met en oeuvre un récepteur silencieux particulier, un récepteur 5-HT4 dans lequel l'acide aspartique D100 occupant la position 100 a été muté en Alanine (5-HT4D100A). Ce récepteur muté ne répond plus à la sérotonine qui est son ligand endogène, mais reste toujours activable par des composés spécifiques de ce récepteur qui traversent très bien la barrière hématoencéphalique. The present invention uses a particular silencing receptor, a 5-HT4 receptor in which the D100 aspartic acid occupying position 100 has been mutated to Alanine (5-HT4D100A). This mutated receptor no longer responds to the serotonin which is its endogenous ligand, but is still activatable by specific compounds of this receptor that cross the blood-brain barrier very well.
Ce type de "RASSL" que la demanderesse a obtenu pour le récepteur 5-HT4 par une simple mutation est unique. En effet, le 5-HT4-D100A est le premier "RASSL" qui devient totalement non activable par son ligand endogène, ce qui n'est pas le cas du récepteur kappa aux opiacés (Coward P. et al. (1998)Proc. Natl. Acad. This type of "RASSL" that the plaintiff obtained for the 5-HT4 receptor by a simple mutation is unique. Indeed, 5-HT4-D100A is the first "RASSL" that becomes totally non-activatable by its endogenous ligand, which is not the case of the opiate kappa receptor (Coward P. et al. (1998) Proc. Natl Acad.
Sci.USA 95 : 352-35). Sci. USA 95: 352-35).
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Le récepteur 5-HT4-D100A est totalement stimulé par un très grand nombre de drogues totalement différentes du point de leur structure et de leur bio stabilité. The 5-HT4-D100A receptor is totally stimulated by a very large number of drugs totally different in structure and bio stability.
Certains composés hautement sélectifs du récepteur 5-HT4, qui font partie de la classe des arylcétones se comportent comme des agonistes partiels du récepteur natif et deviennent des agonistes totaux du récepteur muté 5-HT4-D100A. Ils présentent également l'avantage d'être très hydrophobes et de passer très facilement la barrière hémato-encéphalique. Certain highly selective 5-HT4 receptor compounds in the arylketone class behave as partial agonists of the native receptor and become total agonists of the mutated 5-HT4-D100A receptor. They also have the advantage of being very hydrophobic and very easily pass the blood-brain barrier.
Plus précisément, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant une séquence d'ADN (acide déxoxyribonucléique double brin) codant pour un récepteur muté 5-HT4-D100A pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou la prévention d'une pathologie provoquée par un disfonctionnement dans la synthèse d'AMPc. More specifically, the subject of the present invention is a pharmaceutical composition comprising a DNA sequence (double-stranded deoxyribonucleic acid) encoding a mutated 5-HT4-D100A receptor for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of a pathology caused by dysfunction in cAMP synthesis.
A titre d'exemple, parmi les ADN qui peuvent être utilisés dans la composition thérapeutique de l'invention, on peut citer l'ADN dont la séquence est identifié par la SEQ ID No. : 1 dans la liste de séquences en annexe. By way of example, among the DNAs which may be used in the therapeutic composition of the invention, mention may be made of the DNA whose sequence is identified by SEQ ID No. 1 in the attached sequence listing.
Cette séquence est la forme mutée d'un récepteur 5-HT4 sauvage, (dont la séquence est identifiée sous le numéro SEQ ID N 3 dans la liste de séquences en annexe et dont le N accession dans la base de séquences GENBANK est Y09586) où le codon GAC en position 297-300 codant pour l'acide aspartique a été remplacé par le codon GCT codant pour l'alanine. This sequence is the mutated form of a wild-type 5-HT4 receptor (the sequence of which is identified under the number SEQ ID No. 3 in the attached sequence listing and whose N accession in the GENBANK sequence base is Y09586) where the GAC codon at position 297-300 coding for aspartic acid has been replaced by the GCT codon encoding alanine.
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Ce type de récepteur est incapable de se lier à
la 5-HT lorsque l'aspartateloo, du domaine transmembranaire III, hautement conservé au cours de l'évolution, est muté en alanine. This type of receiver is unable to bind to
5-HT when the aspartateloo, transmembrane domain III, highly conserved during evolution, is mutated to alanine.
L'aspartate situé dans la poche de liaison du récepteur constitue un ancrage indispensable à la sérotonine pour que celle-ci se lie sur le récepteur. Le récepteur reste, par contre, totalement activable par de nombreux agonistes synthétiques et spécifiques du récepteur 5-HT4 comme les dérivés benzimidazolones (BIMU- 8), les dérivés benzamines (cisapride, renzapride) et benzoates (Ml 10302, ML 10375) ou les dérivés arylcétones (RS 66333) (Bockaert, J., Fagni, L., and Dumuis, A. (1997) in Handbook of expérimental pharmacology: Serotoninergic neurons and 5-HT receptors in the CNS (Baumgarten, H. G., and Gôthert, M., eds) Vol. 129 : 439-465,Spinger-Verlag, Berlin Heidelberg New York). Ces molécules ont une structure très volumineuse et l'aspartate100 n' est pas utile à leur liaison sur le récepteur. Aspartate in the receptor binding pocket is an essential anchor for serotonin to bind to the receptor. The receptor remains, on the other hand, fully activatable by numerous synthetic agonists and specific for the 5-HT4 receptor, such as the benzimidazolone derivatives (BIMU-8), the benzamine derivatives (cisapride, renzapride) and benzoates (Ml 10302, ML 10375) or the arylketone derivatives (RS 66333) (Bockaert, J., Fagni, L., and Dumuis, A. (1997) in Handbook of Experimental Pharmacology: Serotoninergic Neurons and 5-HT Receptors in the CNS (Baumgarten, HG, and Gôthert, M ., eds) 129: 439-465, Spinger-Verlag, Berlin Heidelberg New York). These molecules have a very large structure and aspartate100 is not useful for their binding on the receptor.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par récepteur silencieux 5-HT4, tout récepteur 5-HT4 silencieux fonctionnel, c'est à dire qui présente la mutation du résidu aspartique du domaine transmembranaire III du récepteur sauvage correspondant en alanine et conserve sa capacité de liaison pour des ligands synthétiques. In the context of the present invention, the term "silent 5-HT4 receptor" is intended to mean any functional 5-HT4 receptor that is silent, that is to say which has the mutation of the aspartic residue of the transmembrane domain III of the corresponding wild-type receptor in alanine and retains its binding capacity for synthetic ligands.
Ainsi, la composition pharmaceutique peut comprendre toute séquence d'ADNc codant pour des récepteurs 5-HT4D100A, de quelque espèce que ce soit, notamment humains, murins ou de rat, ayant une identité d'au moins 90% avec ladite séquence SEQ ID No : 1, et Thus, the pharmaceutical composition may comprise any cDNA sequence coding for 5-HT4D100A receptors of any species, in particular human, murine or rat, having an identity of at least 90% with said sequence SEQ ID No. : 1, and
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dans lesquelles la mutation GCT/GAC, ci-dessus décrite, a été introduite. in which the GCT / GAC mutation, described above, was introduced.
Il peut s'agir du récepteur identifié par la séquence SEQ ID No : 1 dans la liste de séquences en annexe mais, également, la préparation pharmaceutique de l'invention peut comprendre des séquences d'ADNc codant pour des récepteurs 5-HT4D100A tronqués qui conservent leur capacité de liaison pour leurs ligands synthétiques et notamment des récepteurs 5-HT4-D100A dans lesquels le domaine C-terminal est absent, ou encore des récepteurs 5-HT4-D100A présentant une ou plusieurs mutations ponctuelles. It may be the receptor identified by the sequence SEQ ID No. 1 in the attached sequence listing, but also the pharmaceutical preparation of the invention may comprise cDNA sequences coding for truncated 5-HT4D100A receptors which retain their binding capacity for their synthetic ligands and in particular 5-HT4-D100A receptors in which the C-terminal domain is absent, or else 5-HT4-D100A receptors exhibiting one or more point mutations.
Avantageusement ces derniers récepteurs tronqués ou mutés sont exprimés de manière constitutive. Advantageously, these last truncated or mutated receptors are expressed constitutively.
De tels récepteurs mutés silencieux 5-HT4-D100A peuvent être obtenus par mutagenèse dirigée (Mialet. J et al. Br.J.Pharmacol. (2000) 130:527-38; Joubert L. et al. J.Biol.Chem. (2002) 277 : 25502-25511). Such silent 5-HT4-D100A mutant receptors can be obtained by site-directed mutagenesis (Mialet, J et al., Br.J.Pharmacol (2000) 130: 527-38, Joubert L. et al., J.Biol.Chem. (2002) 277: 25502-25511).
Af in d'exprimer ce récepteur muté 5-HT4-D100A, dans les régions du cerveau où les neurones dégénèrent on peut envisager l'utilisation de vecteurs de transfert, tels que des vecteurs non-viraux ou viraux contenant la séquence d'ADNc codant pour ledit récepteur muté 5-HT4-D100A. In order to express this mutated 5-HT4-D100A receptor, in regions of the brain where neurons degenerate, the use of transfer vectors, such as non-viral or viral vectors containing the coding cDNA sequence, can be envisaged. for said mutated 5-HT4-D100A receptor.
Parmi les vecteurs viraux, on peut citer, les vecteurs du type adénovirus (Eur. cytokine Netw 2002; 13 (3) : 324-30, les vecteurs issus des virus associés aux adénovirus de type 2 (AAV) (J Virol 2002 Jan;76(2):791- 801) (Curr.Opin.Mol.Ther. 2002:4 (4) :349-58) , des vecteurs lentivirus avec différents pseudo-types
(Mol.Ther.(2002) 6(3):349 ; (Curr.Opin.Mol.Ther. Among the viral vectors, mention may be made of adenovirus-type vectors (Eur cytokine Netw 2002; 13 (3): 324-30, vectors derived from viruses associated with adenovirus type 2 (AAV) (J Virol 2002 Jan; 76 (2): 791-801) (Curr.Opin.Mol.Ther 2002: 4 (4): 349-58), lentivirus vectors with different pseudo-types
(Mol.Ther. (2002) 6 (3): 349; (Curr.Opin.Mol.Ther.
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(2002) 4 (4) :349-58 ; (Basic.Res. Cardiol. (2002) 97 (5) : 348-58), des vecteurs issus des virus de l'immunodéficience féline (J.Virol. (2002) ;76(19) :9624- 34) ou encore des vecteurs issus du Foamy virus (FV) (Mol. Ther. (2002) 6 (3) :321) . (2002) 4 (4): 349-58; (Basic.Res., Cardiol. (2002) 97 (5): 348-58), vectors derived from feline immunodeficiency viruses (J.Virol. (2002); 76 (19): 9624-34); vectors derived from Foamy virus (FV) (Mol Ther (2002) 6 (3): 321).
Ces vecteurs viraux sont débarrassés de tout effet pathogène et toxique. Ils sont particulièrement efficaces pour transfecter les neurones et l'expression des protéines est très stable. These viral vectors are free of any pathogenic and toxic effects. They are particularly effective for transfecting neurons and protein expression is very stable.
Ces vecteurs sont utilisés avec des promoteurs adéquats, en fonction du tissu cible. Pour les cellules neuronale de la substance noire ou neurones dopaminergiques, il s'agit du promoteur du transporteur de la dopamine. These vectors are used with suitable promoters, depending on the target tissue. For neuronal cells of the substantia nigra or dopaminergic neurons, it is the promoter of the dopamine transporter.
Pour la transfection ciblée d'autres tissus, de promoteurs spécifiques peuvent être utilisés, par exemple pour des vecteurs de type VIH et une transfection ciblée dans les neurones on peut utiliser les promoteurs décrits dans : 272 : (1996) ; PNAS 93 : 11382 (1996) ; J. Virol. 71: 6641 (1997) ; Hum. Gene Ther. 11 : 179(2000) ; Nature Biotech. 19: 446 (2001) ; Hum. Gene Ther. 13 : (2002)
Pour la transfection des cellules de l'épithélium des voies aériennes avec des vecteurs viraux de type VIH, des promoteurs adéquats sont indiqués dans les publications suivantes : Hum. Gene Ther. 8 : (1997) ; J. Virol. 75 : (2001). For targeted transfection of other tissues, specific promoters can be used, for example for HIV-like vectors and targeted transfection into neurons the promoters described in: 272: (1996); PNAS 93: 11382 (1996); J. Virol. 71: 6641 (1997); Hmm. Gene Ther. 11: 179 (2000); Nature Biotech. 19: 446 (2001); Hmm. Gene Ther. 13: (2002)
For transfection of airway epithelial cells with HIV-like viral vectors, suitable promoters are indicated in the following publications: Hum. Gene Ther. 8: (1997); J. Virol. 75: (2001).
D'autres exemples de promoteurs que l'on peut utiliser dans le cadre de la présente invention sont également ceux cités dans : Blood 95 : 2499(2000) et dans Gene Ther. 7 : 20(2000). Other examples of promoters that can be used in the context of the present invention are also those cited in: Blood 95: 2499 (2000) and in Gene Ther. 7:20 (2000).
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Pour exemple, selon un mode particulier de mise en oeuvre, dans la composition thérapeutique de l'invention, le plasmide contient le génome complet du AAV (psub201) et le plasmide d'empaquetage (pAAV/Ad). Le
vecteur PAAV-CAG-5-HT4-DlooA-HA est construit dans une cassette contenant un promoteur fort (P-actine/enhancer cytomégalovirus ou promoteur CAG) selon le protocole décrit par Kapplit et al. (Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. For example, according to a particular mode of implementation, in the therapeutic composition of the invention, the plasmid contains the complete genome of AAV (psub201) and the packaging plasmid (pAAV / Ad). The
PAAV-CAG-5-HT4-DlooA-HA vector is constructed in a cassette containing a strong promoter (P-actin / cytomegalovirus enhancer or CAG promoter) according to the protocol described by Kapplit et al. (Kaplitt, MG, Leone, P., Samulski, RJ, Xiao, X., Pfaff, DW, O'Malley, K.
L., and During, M. J. (1994) Nat Genet 8 (2), 148-54. ). L., and During, M.J. (1994) Nat Genet 8 (2), 148-54. ).
Selon un autre mode de réalisation, les compositions pharmaceutiques destinées à la préparation d'un médicament pour le traitement d'une maladie respiratoire comprendront l'ADN du récepteur 5-HT4-D100A introduit dans un vecteur recombinant du virus associé aux adénovirus (AAV) ou du lentivirus placé derrière une cassette contenant un promoteur fort CMV et un promoteur spécifique du tissu dans lequel on souhaite exprimer ledit récepteur, à titre d'exemple d'un tel promoteur, on peut citer celui de la Cytokératine K18 (Lusky M. et al. J Virol (1999);73:8308-19)
Avantageusement, la composition pharmaceutique de l'invention sera administrée par injection. En particulier, les patients seront injectés avec les particules virales comprenant l'acide nucléique codant pour le récepteur 5-HT4D100A, sous contrôle stéréotaxique, pour le traitement des maladies neurodégénératives cette injection pourra être effectuée au niveau des zones du cerveau en injections successives, pouvant aller de 2 à 10, de préférence de 3 à 5, espacées de 24 h chacune. According to another embodiment, the pharmaceutical compositions for the preparation of a medicament for the treatment of a respiratory disease will comprise the DNA of the 5-HT4-D100A receptor introduced into a recombinant vector of the adenovirus-associated virus (AAV) or lentivirus placed behind a cassette containing a strong CMV promoter and a tissue-specific promoter in which it is desired to express said receptor, as an example of such a promoter, mention may be made of Cytokeratin K18 (Lusky M. and J Virol (1999) 73: 8308-19)
Advantageously, the pharmaceutical composition of the invention will be administered by injection. In particular, the patients will be injected with the viral particles comprising the nucleic acid encoding the 5-HT4D100A receptor, under stereotactic control, for the treatment of neurodegenerative diseases this injection may be performed at the level of the brain areas in successive injections, which may be from 2 to 10, preferably from 3 to 5, spaced 24 hours each.
Des agonistes synthétiques du récepteur 5-HT4 seront ensuite administrés aux temps définis Synthetic agonists of the 5-HT4 receptor will then be administered at defined times
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précédemment. Ces composés traversent la barrière hématoencéphalique, sont très actifs et présentent une grande bio stabilité in vivo. previously. These compounds cross the blood-brain barrier, are very active and exhibit high bio-stability in vivo.
Une augmentation de la concentration intracellulaire d'AMPc peut être obtenue par une activation du récepteur muté 5-HT4-D100A, exprimé spécifiquement, au moyen de la composition pharmaceutique de l'invention, dans les neurones dopaminergiques de la substance noire, dans les neurones d'hippocampe ou les neurones du striatum selon les protocoles décrits dans les exemples ci-après. An increase in the intracellular cAMP concentration can be obtained by activation of the mutated 5-HT4-D100A receptor, expressed specifically, by means of the pharmaceutical composition of the invention, in the dopaminergic neurons of the substantia nigra, in neurons. hippocampus or neurons of the striatum according to the protocols described in the examples below.
Cette activation du récepteur muté 5-HT4-D100A, peut-être effectuée, par exemple, avec des agonistes synthétiques, dont on peut citer, à titre d'exemple, les composés BIMU8 et RS 66333, lors de l'apparition des premiers signes cliniques de la maladie. This activation of the mutated 5-HT4-D100A receptor may be carried out, for example, with synthetic agonists, examples of which include BIMU8 and RS 66333 compounds, when the first signs appear. clinical disease.
On pourra utiliser également d'autres agonistes du récepteur 5-HT4-D100A ne se fixant pas sur le récepteur natif. Other 5-HT4-D100A receptor agonists that do not bind to the native receptor can also be used.
Un autre objet de l'invention, concerne un procédé de criblage de ligands du récepteur 5HT4 muté. Another subject of the invention relates to a method for screening ligands of the mutated 5HT4 receptor.
Un tel procédé de criblage est mis en #uvre, par exemple in vitro , il comprend la mise en contact dudit récepteur avec ledit composé chimique, dans des conditions permettant leur liaison, suivie de la détection de cette liaison. Such a screening method is used, for example in vitro, it comprises bringing said receptor into contact with said chemical compound, under conditions permitting their binding, followed by the detection of this bond.
Il peut s'agir du récepteur isolé, purifié ou partiellement purifié, comprenant le fragment de la séquence du récepteur contenant la mutation D100, fixé sur des supports solides, selon des techniques bien connues de l' homme du métier, par exemple et de manière It can be the isolated, purified or partially purified receptor comprising the fragment of the sequence of the receptor containing the D100 mutation, fixed on solid supports, according to techniques well known to those skilled in the art, for example and
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non-limitative, on peut citer des tests par compétition, des tests au moyen de biocapteurs ou encore au moyen de fragments membranaires extraits de cellules exprimant ledit récepteur. non-limiting, one can quote tests by competition, tests by means of biosensors or by means of membrane fragments extracted from cells expressing said receiver.
Un tel procédé de criblage peut également être mis en #uvre in vivo , sur des cellules isolées génétiquement modifiées pour exprimer ledit récepteur 5HT4D100A. Ce procédé comprend alors la mise en contact de cellules génétiquement modifiées exprimant ledit récepteur muté 5-HT4D100A avec ledit composé chimique, dans des conditions permettant leur liaison et la détection de l'activité dudit récepteur. Such a screening method may also be carried out in vivo on isolated cells genetically modified to express said 5HT4D100A receptor. This method then comprises contacting genetically modified cells expressing said mutated 5-HT4D100A receptor with said chemical compound, under conditions permitting their binding and the detection of the activity of said receptor.
Ce dernier procédé de criblage est particulièrement adapté pour l'identification de composés agonistes du récepteur 5-HT4D100A. Dans ce mode de réalisation particulier, l'on met en contact des cellules isolées, génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur 5-HT4D100A avec ledit composé chimique à tester, dans des conditions permettant l'activation dudit récepteur et l'on détecte une éventuelle augmentation de l'activité dudit récepteur. This latter method of screening is particularly suitable for the identification of agonist compounds of the 5-HT4D100A receptor. In this particular embodiment, isolated cells, genetically modified to express the 5-HT4D100A receptor, are contacted with said chemical compound to be tested, under conditions allowing the activation of said receptor, and a possible increase is detected. the activity of said receiver.
De même, ce procédé de criblage est particulièrement adapté pour l'identification de composés antagonistes du récepteur 5-HT4D100A. Dans ce mode de réalisation particulier, on met en contact des cellules isolées, génétiquement modifiées pour exprimer ledit récepteur 5-HT4D100A avec ledit composé chimique à tester, dans des conditions permettant l'activation dudit récepteur et l'on détecte une éventuelle diminution de l'activité dudit récepteur. Likewise, this screening method is particularly suitable for the identification of antagonist compounds of the 5-HT4D100A receptor. In this particular embodiment, isolated cells, genetically modified to bring said 5-HT4D100A receptor into contact with said chemical compound to be tested, are brought into contact under conditions allowing the activation of said receptor and a possible decrease in activity of said receiver.
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Enfin l'invention a également pour objet un support solide sur lequel est fixé un récepteur 5-HT4D100A selon l'invention ou un fragment fonctionnel de celuici. Finally, the subject of the invention is also a solid support on which is fixed a 5-HT4D100A receptor according to the invention or a functional fragment thereof.
Selon un mode particulier de mise en oeuvre, sur le support solide de l'invention est fixé un récepteur 5-HT4D100A dont la séquence polypeptidique est identifiée en annexe sous le numéro SEQ ID No : 2. According to a particular mode of implementation, on the solid support of the invention is fixed a 5-HT4D100A receptor whose polypeptide sequence is identified in the appendix under the number SEQ ID No: 2.
Selon un mode de réalisation préféré, le récepteur est fixé sur ledit support solide par des liaisons covalentes ou non covalentes. According to a preferred embodiment, the receptor is fixed on said solid support by covalent or non-covalent bonds.
De préférence, le support solide selon l'invention est choisi parmi le groupe de supports comprenant les supports inorganiques tels que le métal, le verre, le silicium et les supports organiques à base de polymères ou de co-polymères tels que le polystyrène, le polyéthylène, le polycarbonate, la polyacrylamide, le nylon ou le latex. Preferably, the solid support according to the invention is selected from the group of supports comprising inorganic supports such as metal, glass, silicon and organic supports based on polymers or co-polymers such as polystyrene, polyethylene, polycarbonate, polyacrylamide, nylon or latex.
L'invention concerne aussi une cellule génétiquement modifiée par transfection avec un vecteur d'expression comportant la séquence d'un ADN comprenant un ADN codant pour le récepteur 5-HT4D100A. The invention also relates to a cell genetically modified by transfection with an expression vector comprising the sequence of a DNA comprising a DNA encoding the 5-HT4D100A receptor.
De préférence, la cellule selon l'invention est choisie parmi des cellules neuronales et/ou épithéliales. Preferably, the cell according to the invention is chosen from neuronal and / or epithelial cells.
L'invention concerne également un modèle animal non-humain comprenant des cellules génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur 5-HT4D100A. The invention also relates to a non-human animal model comprising cells genetically modified to express the 5-HT4D100A receptor.
Avantageusement, lesdites cellules expriment le récepteur de manière constitutive. Advantageously, said cells express the receptor constitutively.
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L'invention concerne également un procédé d'identification de composés actifs pour traiter ou prévenir une maladie liée à une défaillance dans la synthèse d'AMPc, du type mettant en oeuvre un modèle animal non-humain comprenant des cellules génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur muté récepteur 5HT4D100A, dans lequel: a) on administre à un animal non-humain mutant dont les cellules ont été génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur muté 5-HT4D100A ledit composé chimique, dans des conditions permettant la liaison dudit composé au récepteur muté et b) on détermine par tout moyen approprié l'action dudit composé sur la synthèse d'AMPc. The invention also relates to a method for identifying active compounds for treating or preventing a disease related to a failure in cAMP synthesis, of the type using a non-human animal model comprising cells genetically modified to express the receptor mutant 5HT4D100A receptor, wherein: a) a non-human mutant animal whose cells have been genetically engineered to express the mutated 5-HT4D100A receptor is administered with said chemical compound, under conditions permitting binding of said compound to the mutated receptor and b the action of said compound on cAMP synthesis is determined by any suitable means.
L'invention se rapporte également à une méthode de traitement thérapeutique d'un patient atteint d'une pathologie affectant la synthèse d'AMPc, tel qu'une pathologie neurodégénérative, ou une pathologie respiratoire, notamment l'asthme ou la mucoviscidose comprenant d'abord l'administration audit patient, de la composition thérapeutique de l'invention, pour induire une surexpression du récepteur muté silencieux 5-HT4-D100A dans les tissus dudit patient, en particulier dans le tissu neuronal pour les pathologies neurodégénératives ou dans le tissu épithélial pour les pathologies respiratoires. The invention also relates to a method for the therapeutic treatment of a patient suffering from a pathology affecting cAMP synthesis, such as a neurodegenerative pathology, or a respiratory pathology, in particular asthma or cystic fibrosis comprising first administration to said patient, of the therapeutic composition of the invention, to induce overexpression of the mutated 5-HT4-D100A silent receptor in the tissues of said patient, in particular in the neuronal tissue for neurodegenerative pathologies or in the epithelial tissue for respiratory diseases.
Une fois que cette surexpression a été obtenue, on stimule éventuellement ces récepteurs endogènes par les agonistes synthétiques dudit récepteur. Once this overexpression has been obtained, these endogenous receptors are optionally stimulated by the synthetic agonists of said receptor.
De tels agonistes 5-HT4 (le métoclopramide ou
Primperanm, le cisapride ou Prépulside# et le Tégazérode-HTF919 ou Zelmac) sont commercialisés ou Such 5-HT4 agonists (metoclopramide or
Primperanm, cisapride or Prepulside # and Tegazerode-HTF919 or Zelmac) are commercially available or
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utilisés en clinique pour augmenter le transit gastrointestinal, sans que l'on ait observé de problèmes centraux. Les agonistes 5-HT4 auraient également un effet pro-mnésique, ce qui n'est pas nécessairement un désavantage dans le cas d'une pathologie de la personne âgée. used clinically to increase gastrointestinal transit, without any central problems. The 5-HT4 agonists would also have a pro-mnemic effect, which is not necessarily a disadvantage in the case of a pathology of the elderly person.
Avantageusement, d'autres ligands synthétiques, qui seraient agonistes du récepteur muté et antagonistes du récepteur natif, pourraient être utilisés. Des ligands présentant ces propriétés seraient particulièrement utiles, car ces propriétés permettront de limiter l'apparition éventuelle d'effets centraux indésirables. Advantageously, other synthetic ligands, which would be mutated receptor agonists and native receptor antagonists, could be used. Ligands having these properties would be particularly useful because these properties will limit the possible occurrence of undesirable central effects.
Aussi, des ligands synthétiques qui seraient agonistes partiels du récepteur 5-HT4 natif, et agonistes totaux du récepteur 5-HT4-D100A pourraient être utilisés, lors de la phase d'activation du récepteur, en vue d'obtenir une augmentation de la synthèse d'AMPc. Also, synthetic ligands that would be partial agonists of the native 5-HT4 receptor, and total agonists of the 5-HT4-D100A receptor could be used, during the activation phase of the receptor, to obtain an increase of the synthesis. cAMP.
De manière surprenante, l'expression du récepteur muté selon la technique exposée est un phénomène relativement stable qui ne demande pas beaucoup d'injections dans les régions ciblées sous contrôle stéréotaxique. Surprisingly, the expression of the mutated receptor according to the technique disclosed is a relatively stable phenomenon that does not require many injections in the targeted regions under stereotactic control.
Il est possible, en utilisant lesdits récepteurs, d'induire une augmentation de la concentration intracellulaire et une synthèse d'AMPc totalement contrôlable en intensité et dans le temps, puisqu'ils ne répondent plus à leur ligand endogène mais seulement à des ligands exogènes spécifiques. It is possible, by using said receptors, to induce an increase in the intracellular concentration and cAMP synthesis that is completely controllable in intensity and in time, since they no longer respond to their endogenous ligand but only to specific exogenous ligands. .
La demanderesse a prouvé que des tels récepteurs, ayant une mutation ponctuelle, par exemple 5-HT4A258L ou The Applicant has proved that such receptors, having a point mutation, for example 5-HT4A258L or
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obtenus par troncation du domaine C-terminal sont constitutivement actifs et ont une aptitude naturelle à stimuler l'adénylate cyclase en absence de tout agoniste (Claeysen et al. Mol.Pharm. 58 : 136-144) (2000) ; Claeysen et al EMBO reports 21:61-67 (2001). obtained by truncation of the C-terminal domain are constitutively active and have a natural ability to stimulate adenylate cyclase in the absence of any agonist (Claeysen et al Mol.Pharm 58: 136-144) (2000); Claeysen et al EMBO reports 21: 61-67 (2001).
L'invention sera mieux comprise à l'aide des travaux expérimentaux conduits par la Demanderesse dans le cadre de la présente invention ainsi que des figures jointes en annexe dans lesquelles : - Les figures 1A à 1D montrent que les agonistes ayant une similitude de structure avec la sérotonine sont incapables de stimuler le récepteur RASSL D100 (3 , 32) A. The invention will be better understood with the aid of the experimental work conducted by the Applicant in the context of the present invention as well as the appended figures in which: FIGS. 1A to 1D show that the agonists having a similarity of structure with serotonin are unable to stimulate the RASSL D100 receptor (3, 32) A.
- les figures 1A et 1B montrent les courbes doseréponse pour les récepteurs sauvages et mutés D100(3,32)A exposés à des dérivés tryptaminiques (5MeOT, 5CT, HTF919 et 5-HT). La production d'AMPc est mesurée dans les cellules COS-7 exprimant de manière transitoire, soit le récepteur natif 5-HT4a, soit le récepteur muté D100(3,32)A, à des niveaux de 1500 230 et 1450 160 fmol/mg protéine respectivement. FIGS. 1A and 1B show the doseresponse curves for the wild-type and mutated D100 (3.32) A receptors exposed to tryptaminic derivatives (5MeOT, 5CT, HTF919 and 5-HT). CAMP production is measured in transiently expressing COS-7 cells, either the native 5-HT4a receptor or the mutated D100 (3.32) A receptor, at levels of 1500 230 and 1450 160 fmol / mg protein respectively.
La production d'AMPc est mesurée durant 15 minutes et est exprimée en tant que pourcentage de formation d'AMPc par rapport à des cellules contrôles (Cellules transfectées avec le vecteur sans l' ADN codant pour le récepteur). Dans les cellules contrôle les pourcentages de conversion de [3H]ATP en [3H]AMPc est égale à 0,120,04%. The production of cAMP is measured for 15 minutes and is expressed as a percentage of cAMP formation relative to control cells (cells transfected with the vector without the DNA encoding the receptor). In the control cells the conversion percentages of [3H] ATP to [3H] cAMP is 0.120.04%.
Les données représentent les valeurs moyennes de quatre expériences réalisées par triplicata. The data represent the average values of four experiments performed by triplicate.
- La Figure 1C illustre les tests de liaison par compétition, effectués pour la 5-HT en présence de 0,24 nM de [3H] GR113808 . Figure 1C illustrates the competitive binding assays performed for 5-HT in the presence of 0.24 nM [3H] GR113808.
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Les expériences ont été effectuées sur des membranes (8 g protéine) extraites de cellules COS-7 exprimant des niveaux similaires de récepteurs sauvages (WT) ou mutés D100A (3500 fmol/mg protéine) . The experiments were performed on membranes (8 g protein) extracted from COS-7 cells expressing similar levels of wild-type (WT) or mutated D100A receptors (3500 fmol / mg protein).
- La figure 1D illustre la représentation Scatchard des expériences de saturation de la liaison du composé [3H]GR113808 (0,048 à 0,51 nM) sur les récepteurs 5-HT4a et 5-HT4D100(3,32)A exprimées dans des cellules COS- 7. le composé RS 1000235 (10 M) a été utilisé pour déterminer la liaison non-spécifique. FIG. 1D illustrates the Scatchard representation of the saturation experiments of the binding of the [3H] GR113808 compound (0.048 to 0.51 nM) on the 5-HT4a and 5-HT4D100 (3.32) A receptors expressed in COS cells. 7. RS 1000235 (10 M) was used to determine non-specific binding.
- Les Figures 2A et 2B montrent que la mutation du résidu conservé D100(3,32) en alanine (A) n' empêche pas la réponse, ni la liaison, d'un agoniste synthétique du récepteur 5-HT4-R, le composé BIMU 8. FIGS. 2A and 2B show that the mutation of the conserved residue D100 (3.32) in alanine (A) does not prevent the response or the binding of a synthetic agonist of the 5-HT4-R receptor, the compound BIMU 8.
- la Figure 2A illustre les effets d'une gamme de concentrations du composé BIMU 8 sur les niveaux intracellulaires d'AMPc qui ont été mesurés dans des cellules COS-7 exprimant les récepteurs 5-HT4(a) ou D100A à des niveaux équivalents (1350 60 et 1580 110 fmol/mg protéine respectivement). FIG. 2A illustrates the effects of a range of concentrations of compound BIMU 8 on the intracellular levels of cAMP that were measured in COS-7 cells expressing the 5-HT4 (a) or D100A receptors at equivalent levels (FIG. 1350 60 and 1580 110 fmol / mg protein respectively).
- La Figure 2B illustre la compétition du composé BIMU 8 avec le composé [3H]GR113808. Les conditions sont identiques à celles utilisées pour les expériences de la figure 2A). FIG. 2B illustrates the competition of compound BIMU 8 with compound [3H] GR113808. The conditions are identical to those used for the experiments of Figure 2A).
Les Figures 3A et 3B montrent que la mutation D100(3,22)A conduit à des changements de propriétés des ligands, un antagoniste sur récepteur sauvage devient en agoniste sur le récepteur muté. Figures 3A and 3B show that the D100 (3,22) A mutation leads to changes in ligand properties, a wild-type antagonist becomes an agonist on the mutated receptor.
- les Figures 3A et 3B montrent les activités des composés ML10375 (A) et GR113808 (B), deux antagonistes puissants et spécifiques du récepteur 5-HT4(a). Ces deux ligands ont été testés dans des cellules COS-7 exprimant FIGS. 3A and 3B show the activities of compounds ML10375 (A) and GR113808 (B), two potent and specific antagonists of the 5-HT4 (a) receptor. These two ligands were tested in COS-7 cells expressing
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le récepteur sauvage 5-HT4(a) (2700 320 fmol/mg de protéine) ou le récepteur muté (2500 280 fmol/mg de protéine). the wild-type 5-HT4 (a) receptor (2700 320 fmol / mg protein) or the mutated receptor (2500 280 fmol / mg protein).
- la Figure 3C montre l'accumulation d'AMPc mesurée dans des cellules COS-7 exprimant de manière transitoire les récepteurs sauvages et mutés D100(3,32)A à des densités similaires à celles utilisées en absence (Figure 3A) et en présence (Figure 3B) de 3x10-8 M BIMU 8. FIG. 3C shows the cAMP accumulation measured in COS-7 cells transiently expressing the wild-type and mutated D100 (3.32) A receptors at densities similar to those used in the absence (FIG. 3A) and in the presence (Figure 3B) 3x10-8 M BIMU 8.
La capacité du composé ML 10375 (10-5 M) pour inhiber l'accumulation de l'AMPc induite par le BIMU 8 a été testée sur les mêmes cellules COS-7. The ability of ML 10375 (10-5 M) to inhibit BIMU 8-induced cAMP accumulation was tested on the same COS-7 cells.
- La figure 4 est un schéma représentant les effets, dans les neurones, de l'AMPc induit après utilisation du récepteur silencieux (RASSL) comme outil de thérapie génique, en particulier pour le traitement de la maladie de Parkinson. FIG. 4 is a diagram showing the effects, in neurons, of cAMP induced after use of the silent receptor (RASSL) as a gene therapy tool, in particular for the treatment of Parkinson's disease.
TRAVAUX EXPERIMENTAUX
1- Construction de l'ADN du récepteur muté m5HT4a. EXPERIMENTAL WORK
1- Construction of the m5HT4a mutated receptor DNA.
Le récepteur mutant a été généré en échangeant le résidu endogène, acide aspartique (D) par le résidu alanine (A) dans la séquence ADNc du 5-HT-4(a)R par mutagenèse dirigée grâce à l'utilisation d'un Kit commercial (Quick Change Site-Directed Mutagenesis) de la société Stratagene. The mutant receptor was generated by exchanging the endogenous, aspartic acid (D) residue by the alanine (A) residue in the cDNA sequence of 5-HT-4 (a) R by site-directed mutagenesis through the use of a kit. Quick Change Site-Directed Mutagenesis of Stratagene.
L'amorce sens utilisée était: D100A - 5'-ACC TCT CTG GCT GTC CTA CTC ACC-3' The sense primer used was: D100A - 5'-ACC TCT CTG GCT GTC CTA CTC ACC-3 '
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2- Culture cellulaire et transfection
Les ADNc, sous-clonés dans le plasmide pRK5, ont été introduits dans des cellules COS-7 par électroporation. 2- Cell culture and transfection
The cDNAs, subcloned into plasmid pRK5, were introduced into COS-7 cells by electroporation.
Les cellules ont été trypsinisées, centrifugées et remises en suspension dans du tampon suivant (50 mM
KZHP04 , 20 mM CH3Co2K, 2 0 mM KOH, 26,7 mM MgS04 ; pH 7,4) avec 25-2000 ng d'ADNc du récepteur identifié par la SEQ ID No. : 1 dans la liste de séquences en annexe. La quantité totale d'ADN a été maintenue constante à 15 g par transfection avec le vecteur pRK5 vide, comme entraîneur. Après 15 minutes à température ambiante, 300 l de la suspension cellulaire (107 cellules) ont été transférés à une cuvette d'électroporation de 0,4 cm (Bio-Rad, Ivry sur Seine, France) et les cellules ont reçu un choc électrique au moyen d'un appareil de pulsation de gènes (réglé à 1000 pF , 580 V). Les cellules ont été ensuite diluées dans du milieu d'Eagle modifié selon Dulbecco (DMEM, 106 cellules/ml) contenant 10% de sérum de veau f#tal décomplémenté et filtré (dSVF) et placées dans des boîtes de Pétri pour culture de cellules (15cm de diamètre) ou dans des plaques de 12 puits, à la densité souhaitée. The cells were trypsinized, centrifuged and resuspended in the next buffer (50 mM
KZHPO4, 20mM CH3Co2K, 20mM KOH, 26.7mM MgSO4; pH 7.4) with 25-2000 ng cDNA of the receptor identified by SEQ ID No. 1 in the attached sequence listing. The total amount of DNA was kept constant at 15 g by transfection with the empty pRK5 vector as a trainer. After 15 minutes at room temperature, 300 l of the cell suspension (107 cells) were transferred to a 0.4 cm electroporation cuvette (Bio-Rad, Ivry sur Seine, France) and the cells were shocked by means of a gene pulsation apparatus (set at 1000 pF, 580 V). The cells were then diluted in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, 106 cells / ml) containing 10% decomplemented and filtered fetal calf serum (dSVF) and placed in cell culture plates. (15cm in diameter) or in 12-well plates, at the desired density.
3- Détermination de la production d'AMP cyclique (AMPc) dans les cellules intactes. 3- Determination of cyclic AMP production (cAMP) in intact cells.
Après six heures de transfection, le milieu dans lequel se trouvent les cellules a été remplacé par du DMEM sans dSVF contenant de l'adénine tritiée (2 uCi/ml) afin de marquer le pool d'ATP, et incubé durant la nuit. After six hours of transfection, the medium in which the cells are found was replaced with dSVF-free DMEM containing tritiated adenine (2 μCi / ml) to label the ATP pool, and incubated overnight.
Le taux d'AMPc formé a été mesuré selon la méthode décrite préalablement (Dumuis A. Bouhelal R., Sebben M., The level of cAMP formed was measured according to the method previously described (Dumuis A. Bouhelal R., Sebben M.,
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Cory R. and Bockaert J. (1998) Mol.Pharmacol.34: 880- 887) . Cory R. and Bockaert J. (1998) Mol. Pharmacol. 34: 880-887).
4- Préparation des membranes et essai de liaison du ligand radiomarqué. 4- Preparation of the membranes and binding assay of the radiolabelled ligand.
Les membranes ont été préparées à partir de cellules transfectées de manière transitoire, déposées dans des boîtes de pétri pour culture de 15 cm de diamètre, contenant du DMEM et 10% dSVF, ceci durant six heures et ensuite elles sont incubées pendant 20 heures dans du DMEM sans dSVF. Les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS, grattées avec une spatule en caoutchouc, remises dans du PBS et centrifugées à 4 C (200 g durant 4 minutes). The membranes were prepared from transiently transfected cells, plated in 15 cm diameter culture dishes, containing DMEM and 10% dSVF, for six hours and then incubated for 20 hours in patients. DMEM without dSVF. The cells were washed twice in PBS, scraped with a rubber spatula, put back into PBS and centrifuged at 4 ° C. (200 g for 4 minutes).
Le culot a été remis en suspension dans du tampon contenant 10 mM HEPES (pH 7,4), 5 mM EGTA, lmM EDTA et 0,32 M de sucrose et homogénéisé avec un poter en verreTeflon à 4 C. L'homogénat a été centrifugé à 20. 000 g, 20 minutes et le culot membranaire a été remis en suspension dans 50 mM de tampon HEPES (pH 7,4 à raison de 5mg/ml de protéine) et conservé à -80 C jusqu'à son utilisation. The pellet was resuspended in buffer containing 10 mM HEPES (pH 7.4), 5 mM EGTA, 1 mM EDTA and 0.32 M sucrose and homogenized with a Teflon glass poter at 4 C. The homogenate was centrifuged at 20.000 g, 20 minutes and the membrane pellet was resuspended in 50 mM HEPES buffer (pH 7.4 at 5 mg / ml protein) and stored at -80 ° C until used.
Des expériences de saturation ont été effectuées en utilisant un ligand spécifique radiomarqué au tritium, 3[H]GR113808 à des concentrations allant de 0,048 nM à 1 nM. Saturation experiments were performed using a specific tritiated radiolabeled ligand, 3 [H] GR113808 at concentrations ranging from 0.048 nM to 1 nM.
Les densités du récepteur 5-HT4 ont été estimées avec du 3[H]GR113808 à des concentrations de saturation (0,5 nM) selon décrit préalablement (Ansanay,H., Sebben,M.,Bockaert,J. and Dumuis A. (1996) Eur.J.Pharmacol. 298 :165-174). The densities of the 5-HT4 receptor were estimated with 3 [H] GR113808 at saturation concentrations (0.5 nM) according to previously described (Ansanay, H., Sebben, M., Bockaert, J. and Dumuis A. (1996) Eur.J.Pharmacol 298: 165-174).
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La liaison non-spécifique a été définie en utilisant soit La 5-HT (5x10-5 M) soit le composé RS 100235 (10-7 M) . Les concentrations de protéines ont été déterminées en utilisant un essai de quantification de protéines commercial (Bio-Rad). Nonspecific binding was defined using either 5-HT (5x10-5 M) or RS 100235 (10-7 M). Protein concentrations were determined using a commercial protein quantitation assay (Bio-Rad).
5- Analyse des données
Les expériences de compétition et de saturation ont été analysées par des calculs de régression nonlinéaires en utilisant le programme d'ordinateur LIGAND (Munson P. J., and Rodbard, D. (1980) Anal.Biochem.l07: 220-39). Les expériences de saturation ont été également analysées selon la représentation de Scatchard. Les valeurs d' IC50 nécessaires pour le déplacement de 50% de la liaison du, 3[H] GR113808 ont été convertis en valeurs
Kd selon l'équation Kd=IC,0/1+S/KDs (Cheng,Y ., and Prussof,W.H. (1973) Biochem.Pharmacol.22 (23) ,3099-108) où S est la concentration de 3 [H] GR113808 et K la constante d' équilibre de 3 [H] GR113808 . 5- Data analysis
Competition and saturation experiments were analyzed by nonlinear regression calculations using the LIGAND computer program (Munson PJ, and Rodbard, D. (1980) Anal. Biochem. 107: 220-39). The saturation experiments were also analyzed according to the Scatchard representation. The IC50 values required for the displacement of 50% of the linkage of the, 3 [H] GR113808 have been converted into values
Kd according to the equation Kd = 1C, O / 1 + S / KDs (Cheng, Y., and Prussof, WH (1973) Biochem.Pharmacol.22 (23), 3099-108) where S is the concentration of 3 [ H] GR113808 and K the equilibrium constant of 3 [H] GR113808.
En utilisant un programme Kaleidagraph, les courbes dose/réponses ont été calibrées selon
l'équation : Y= ( (Ymax-Ymin) /1 + (x/EC)1*) ) +ymin où EC50 (ou EC50inv) est la concentration de l'agoniste (ou de l'agoniste inverse), qui induit la moitié de la réponse maximale. ymax et ymin correspondent respectivement aux réponses maximales et minimales et nH est le coefficient de Hill. Les différences statistiques ont été examinées avec le programme Star-View Student (Abacus Concepts, Berkeley, Californie) avec les tests t. Using a Kaleidagraph program, the dose / response curves were calibrated according to
the equation: Y = ((Ymax-Ymin) / 1 + (x / EC) 1 *)) + ymin where EC50 (or EC50inv) is the concentration of the agonist (or inverse agonist), which induces half of the maximum response. ymax and ymin correspond respectively to the maximum and minimum responses and nH is the Hill coefficient. The statistical differences were examined with the Star-View Student program (Abacus Concepts, Berkeley, California) with the t tests.
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<tb>
<tb> Composés
<tb> <Tb>
<tb> Compounds
<Tb>
GR 113308 1[2-méthylsulfonylamino)éthyll-4-
GR 113308 1 [2-methylsulfonylamino) ethyl-4-
<tb>
<tb> pipéridinyl <SEP> 1-méthyl-indole-3-carboxylate
<tb> HTF <SEP> 919 <SEP> 5-méthoxy-indole-3-carboxyaldhéhyde <SEP> 4pentyl-iminosemicarbazone
<tb> BIMU <SEP> Endo- <SEP> N-(8-méthyl-8-azabicyclo[3.2.1]oct-
<tb> 3-yl)-2-oxo-3-isopropyl-2,3-dihydro-lH
<tb> benzimidazole-1-carboxamise.
<tb> <Tb>
<tb> piperidinyl <SEP> 1-methyl-indole-3-carboxylate
<tb> HTF <SEP> 919 <SEP> 5-methoxy-indole-3-carboxyaldehyde <SEP> 4pentyl-iminosemicarbazone
<tb> BIMU <SEP> Endo- <SEP> N- (8-methyl-8-azabicyclo [3.2.1] oct-
<tb> 3-yl) -2-oxo-3-isopropyl-2,3-dihydro-1H
<tb> Benzimidazole-1-carboxamise.
<Tb>
(S)-Zacopride <SEP> (S)-N-(l- <SEP> azabicyclo <SEP> [2.2.2]oct-3-yl)-4amino-5-cholro-2-méthoxy-benzamide
<tb> monohydrochloride
<tb> (S) -Zacopride <SEP> (S) -N- (1-SEP) azabicyclo [SEP] [2.2.2] oct-3-yl) -4-amino-5-cholo-2-methoxybenzamide
<tb> monohydrochloride
<Tb>
Cisapride Cis N- [1- [3- (4-fluorophenoxy)propyl] -3-
Cispride Cis N- [1- [3- (4-fluorophenoxy) propyl] -3-
<tb>
<tb> méthoxy-4-piperidinyl]-4-amino-5-chloro-
<tb> 2-méthoxy-benzamide
<tb> Metoclopramide <SEP> N-(2-diméthylamino)éthyl)-4-amino-5cholro-2-méthoxy-benzamide
<tb> Renzapride <SEP> () <SEP> endo-N-(l-azabicyclo <SEP> [3.3.1] <SEP> non-4yl)-4-amino-5-chloro-2-méthoxy-benzamide
<tb> monohydrochloride
<tb> SB <SEP> 204070 <SEP> (1-butyl-4-pipéridinyl)méthyl <SEP> 8-amino-7chloro-1,4-benzodioxane-5-carboxylate
<tb> <Tb>
<tb> methoxy-4-piperidinyl] -4-amino-5-chloro
<tb> 2-methoxybenzamide
<tb> Metoclopramide <SEP> N- (2-dimethylamino) ethyl) -4-amino-5-chloro-2-methoxy-benzamide
<tb> Renzapride <SEP> () <SEP> endo-N- (1-azabicyclo [SEP] [3.3.1] <SEP> non-4yl) -4-amino-5-chloro-2-methoxy-benzamide
<tb> monohydrochloride
<tb> SB <SEP> 204070 <SEP> (1-butyl-4-piperidinyl) methyl <SEP> 8-amino-7-chloro-1,4-benzodioxane-5-carboxylate
<Tb>
ML 10302 2-(l-pipéridinyl)éthyl 4-amino-5-chloro-
ML 10302 2- (1-piperidinyl) ethyl 4-amino-5-chloro
<tb>
<tb> 2-méthoxy-benzoate
<tb> ML <SEP> 10735 <SEP> 2-(cis-3,5-diméthyl-1-pipéridinyl)éthyl4amino-5-chloro-2-méthoxybenzoate
<tb> RS <SEP> 67333 <SEP> 1-(4-amino-5-chloro-2-méthoxy-phényl)-3-
<tb> <Tb>
<tb> 2-methoxybenzoate
<tb> ML <SEP> 10735 <SEP> 2- (cis-3,5-dimethyl-1-piperidinyl) ethyl4amino-5-chloro-2-methoxybenzoate
<tb> RS <SEP> 67333 <SEP> 1- (4-amino-5-chloro-2-methoxy-phenyl) -3-
<Tb>
(1-butyl-4-pipéridinyl)-1-propanone RS 100350 N-[2-[4-[3-(8-amino-7-chloro-l,4-
(1-Butyl-4-piperidinyl) -1-propanone RS 100350 N- [2- [4- [3- (8-amino-7-chloro-1,4)
<tb>
<tb> benzodioxan-5-yl)-3-oxo-propyl]lpiperidinyl]éthyl]-4-méthoxybenzenesulfonamide
<tb> RS <SEP> 124523 <SEP> 1-(4-amino-5-chloro-2-méthoxy-phényl)-3-
<tb> <Tb>
benzodioxan-5-yl) -3-oxo-propyl] -piperidinyl] ethyl] -4-methoxybenzenesulfonamide
<tb> RS <SEP> 124523 <SEP> 1- (4-amino-5-chloro-2-methoxy-phenyl) -3-
<Tb>
[1- [3-4-fluorophényl)propyl] -4-
[1- [3-4-fluorophenyl) propyl] -4-
<tb>
<tb> pipéridinyl]-1-propanone
<tb> RS <SEP> 47431 <SEP> 1-(4-amino-5-chloro-2-méthoxy-phényl)3-
<tb> <Tb>
<tb> piperidinyl] -1-propanone
<tb> RS <SEP> 47431 <SEP> 1- (4-amino-5-chloro-2-methoxy-phenyl) 3-
<Tb>
[1-[3-(3,4-diméthoxyphényl)propyll-4-
[1- [3- (3,4-dimethoxyphenyl) propyll-4-
<tb>
<tb> pipéridinyl]-1-propanone
<tb> RS <SEP> 100235 <SEP> 1-(8-amino-7-vhloro-1,4-benzodioxan-5yl) <SEP> -3- <SEP> [1- <SEP> [3-3,4-diméthoxyphényl)propyl] <SEP> - <SEP>
<tb> <Tb>
<tb> piperidinyl] -1-propanone
<tb> RS <SEP> 100235 <SEP> 1- (8-Amino-7-chloro-1,4-benzodioxan-5-yl) <SEP> -3- <SEP> [1- <SEP> [3-3, 4-dimethoxyphenyl) propyl] <SEP> - <SEP>
<Tb>
4-pipéridinyl]-1-propanone
RESULTATS ET DISCUSSION
Les résultats ci-dessus illustrent pour la première fois l'activation d'un récepteur 5-HT4, connu
4-piperidinyl] -1-propanone
RESULTS AND DISCUSSION
The above results illustrate for the first time the activation of a known 5-HT4 receptor
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pour son insensibilité à son ligand endogène (Mialet J. et al British journal of Pharmacol (2000) 130 :527- 538), par des agonistes synthétiques non-amine primaires. for its insensitivity to its endogenous ligand (Mialet J. et al British Journal of Pharmacol (2000) 130: 527-538), by synthetic non-primary amine agonists.
Sur la base des travaux de Strader concernant les récepteurs (3-adrénergiques et d'autres récepteurs d'amines biogéniques (Straders,C., Fong,T.T. Tota, M., Underwood,D. and Dixon,R. (1994) Annu.Rev.Biochem. Based on Strader's work on (3-adrenergic and other biogenic amine receptors (Straders, C., Fong, TT Tota, M., Underwood, D. and Dixon, R. (1994) Annu .Rev.Biochem.
63,101-132), il a été observé que l'interaction clé entre ces récepteurs et le ligand se fait au niveau du résidu acide aspartique du TM III, hautement conservé dans toute la famille de récepteurs aux amines biogéniques. 63, 101-132), it has been observed that the key interaction between these receptors and the ligand is at the level of the TM III aspartic acid residue, highly conserved throughout the family of biogenic amine receptors.
Dans le cas du récepteur 5-HT4 il s'agit de
l'aspartate, en position 100 dans le TM-III (Dloo (3 . 32 ) . In the case of the 5-HT4 receptor it is
aspartate, at position 100 in the TM-III (Dloo (3, 32).
Ce résidu semble intervenir dans une interaction ionique entre son groupe carboxylate chargé négativement et l'azote chargé positivement de l'amine protonée du neurotransmetteur (5-HT et dérivés tryptamines). This residue appears to intervene in an ionic interaction between its negatively charged carboxylate group and the positively charged nitrogen of the protonated amine of the neurotransmitter (5-HT and tryptamine derivatives).
La Demanderesse a maintenant prouvé que la mutation du D100(3.32) en alanine dans le récepteur 5-HT4 non stimulable par la 5-HT ne l'est également pas par d'autres tryptamines dont la structure est très proche de celle de la 5-HT (5-CT ou 5-MeOT) ou par un dérivé carbazimidamide indole substitué (HTF-919) (Buchheit KH, Gamse,R, Giger,R, Hoyer, D, Klein,F, Kloppner, E., Pfannkuche,H.J. and Mattes H. J.Med.Chem. (1995) 38(13):2326-30), (Figures 1A, 1B). The Applicant has now proved that the mutation of D100 (3.32) in alanine in the 5-HT4 receptor which is not stimulable by 5-HT is also not by other tryptamines whose structure is very close to that of the 5 -HT (5-CT or 5-MeOT) or by a substituted indolated carbazimidamide derivative (HTF-919) (Buchheit KH, Gamse, R, Giger, R, Hoyer, D, Klein, F, Kloppner, E., Pfannkuche, HJ and Mattes HJMed.Chem (1995) 38 (13): 2326-30), (Figures 1A, 1B).
Des mutations d'une large série d'autres résidus, hautement conservés, dans la famille des récepteurs aux amines biogéniques impliqués dans la poche de liaison de Mutations of a wide range of other, highly conserved residues in the family of biogenic amine receptors involved in the
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la 5-HT (S197(5,43), W275(6,48) et F275(6,51)) ont également été réalisées. Toutefois, aucune de ces mutations n'a conduit à supprimer complètement les réponses aussi bien de la 5-HT que des autres dérivés tryptamines. Les récepteurs mutés F275A, le W2722A et le S197A, ont seulement une affinité réduite de 50 à 5000 fois pour la 5-HT et ses dérivés, sans changement dans le maximum de stimulation (données non-montrées). 5-HT (S197 (5.43), W275 (6.48) and F275 (6.51)) were also performed. However, none of these mutations led to completely removing the responses of both 5-HT and other tryptamine derivatives. The mutated F275A receptors, W2722A and S197A, have only a reduced affinity of 50 to 5000-fold for 5-HT and its derivatives, with no change in the stimulation maximum (data not shown).
A l'inverse, la mutation du résidu D100(3,32) hautement conservé, dans le récepteur 5-HT4 n'affecte que très modestement la liaison du ligand spécifique radiomarqué 3[H]GR113808 lorsque cet acide aminé est muté en alanine(Kd= 0,17 0,008 nM et 0,38 0,09 nM respectivement, dans le récepteur natif et muté
Dloo (3 .32) A, (Figure 1D) . Conversely, the mutation of the highly conserved D100 residue (3.32) in the 5-HT4 receptor only very slightly affects the binding of the radiolabelled specific ligand 3 [H] GR113808 when this amino acid is mutated to alanine ( Kd = 0.17 0.008 nM and 0.38 0.09 nM respectively, in the native and mutated receptor
Dloo (3 .32) A, (Figure 1D).
En utilisant le ligand 3[H]GR113808, la Demanderesse a vérifié que le ligand 5-HT est incapable de se lier au récepteur muté D100(3.32)A (Figure 1C). Using the ligand 3 [H] GR113808, the Applicant verified that the 5-HT ligand is unable to bind to the mutated D100 (3.32) A receptor (Figure 1C).
La liaison de 3[H]GR113808 maintenue sur le récepteur muté a été la première observation qui indiquait que la présence d'un azote basique dans le cycle aromatique de la chaîne latérale, associée à une augmentation de la distance entre ledit azote basique et le noyau aromatique supprimait la nécessité de la présence du groupe carboxylique du D100(3.32) pour la liaison avec son ligand. The binding of 3 [H] GR113808 maintained on the mutated receptor was the first observation which indicated that the presence of a basic nitrogen in the aromatic ring of the side chain, associated with an increase in the distance between said basic nitrogen and the The aromatic ring removed the need for the presence of the carboxylic group of D100 (3.32) for binding with its ligand.
Ceci a été confirmé lorsque la Demanderesse a procédé au criblage de la plupart des agonistes nontryptaminiques du récepteur 5-HT4 pour leur capacité à activer le récepteur 5-HT4D100A. This was confirmed when the Applicant screened most nontryptaminic 5-HT4 receptor agonists for their ability to activate the 5-HT4D100A receptor.
Il a été démontré que le composé BIMU 8, appartenant à la classe des azabicycloalyl The compound BIMU 8, belonging to the class of azabicycloalyl, has been demonstrated
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benzymidazolones (Dumuis A, Sebben M, Monferini E, Nicola M, Turconi M, Ladinsky H, Bockaert J. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.(1991)343:245-51) très structurallement différent de la 5-HT, est un très bon agoniste des récepteurs 5-HT4
Comme le montre la figure 2, ce composé demeure complètement actif, avec la même efficacité, sur le récepteur mutant D100A que sur le récepteur 5-HT4 sauvage. benzymidazolones (Dumuis A, Sebben M, Monferini E, Nicola M, Turconi M, Ladinsky H, Bockaert J. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol (1991) 343: 245-51) very structurally different from 5-HT, is a very good 5-HT4 receptor agonist
As shown in Figure 2, this compound remains fully active, with the same efficiency, on the mutant D100A receptor as on the wild-type 5-HT4 receptor.
Les valeurs EC50 pour la stimulation de l'AMPc ont été respectivement de 4 1,5 nM et de 1 0,5 nM pour le récepteur sauvage et muté,(Figure 2A). EC50 values for stimulation of cAMP were 4 1.5 nM and 1 0.5 nM, respectively, for the wild-type and mutated receptor (Figure 2A).
L'affinité du composé BIMU 8 pour le récepteur 5HT4 est également meilleure sur le récepteur mutant D100A que sur le récepteur sauvage. Les valeurs de Kd pour le composé BIMU 8, mesurées par compétition avec le ligand radiomarqué 3[H]GR 113808 sont respectivement, de 30 11 nM et de 6, 5 3 nM pour le récepteur sauvage et le mutant (D100A) (Figure 2B) . The affinity of BIMU compound 8 for the 5HT4 receptor is also better on the D100A mutant receptor than on the wild-type receptor. The Kd values for compound BIMU 8, measured by competition with radiolabelled ligand 3 [H] GR 113808, are, respectively, 11 nM and 6, 3 nM for the wild-type receptor and the mutant (D100A) (FIG. 2B). ).
D'une manière similaire, les benzamides portant la substitution 2-méthoxy-4-amino-5-chloro, tel que les composés Renzapride, S-zacopride ou cisapride, se montrent équivalents du point de vue de leur efficacité sur le récepteur sauvage et sur le récepteur muté (D100(3,32)A (Tableau I) avec des affinités nanomolaires, seule une faible diminution de leur affinité pour le récepteur muté D100A est observée. In a similar manner, the benzamides bearing the 2-methoxy-4-amino-5-chloro substitution, such as the compounds Renzapride, S-zacopride or cisapride, are equivalent in terms of their efficacy on the wild-type receptor and on the mutated receptor (D100 (3.32) A (Table I) with nanomolar affinities, only a small decrease in their affinity for the mutated D100A receptor is observed.
Le tableau I ci-dessous montre l'efficacité des ligands du récepteur 5-HT4 sur le récepteur sauvage et le
récepteur 5-HT4 muté Dloo (3 , 32 ) A. Table I below shows the efficacy of 5-HT4 receptor ligands on the wild-type receptor and the
5-HT4 mutated Dloo receptor (3, 32) A.
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TABLEAU I
TABLE I
<tb>
<tb> Drogues <SEP> 5-HT4(a) <SEP> 5-HT4-RD100A
<tb> ( M) <SEP> % <SEP> delaréponse <SEP> % <SEP> de <SEP> la <SEP> réponse
<tb> 5-HT <SEP> BIMU8
<tb> <Tb>
<tb> Drugs <SEP> 5-HT4 (a) <SEP> 5-HT4-RD100A
<tb> (M) <SEP>% <SEP> Answer <SEP>% <SEP> of <SEP> The <SEP> Answer
<tb> 5-HT <SEP> BIMU8
<Tb>
.. BIMU8 o"T f 5-HT 100 ""on.-. "ï Bimu 8 90 10 100 :n:ifC5:\:';;::>:': rir≥o i1;;:}:i>:':;:;:,,:t,r:,:;::'::;;rca:, ,5-met ::t: H'rF9 imJh 5-Meot 90 10 HTF919 eJ >:::;;;<;0;:;:,', HTF 919 66 15 Metoclopramide 20 10 20 10
## EQU1 ## where: ## EQU1 ## where: ## EQU1 ## ## EQU00006 ##, ## STR2 ## : Metoclopramide 20 10 10
<tb>
<tb> Cisapride <SEP> #N#O# <SEP> Renzapride <SEP> 85 <SEP> 8 <SEP> 100 <SEP>
<tb> @ <SEP> ##NH# <SEP> S-Zacopride <SEP> 100 <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP> 5
<tb> H2N#OMe <SEP> Cisapride <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> ML <SEP> 10302 <SEP> 57 <SEP> 9 <SEP> 100 <SEP> 6 <SEP>
<tb> SB <SEP> 204070 <SEP> 20 <SEP> 3 <SEP> 100 <SEP> 5
<tb> RS <SEP> 100350 <SEP> 17 <SEP> 5 <SEP> 70 <SEP> 10
<tb> <Tb>
<tb> Cisapride <SEP># N # O # <SEP> Renzapride <SEP> 85 <SEP> 8 <SEP> 100 <SEP>
<tb> @ <SEP>## NH # <SEP> S-Zacopride <SEP> 100 <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP> 5
<tb> H2N # OMe <SEP> Cisapride <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> ML <SEP> 10302 <SEP> 57 <SEP> 9 <SEP> 100 <SEP> 6 <SEP>
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<tb> RS <SEP> 100350 <SEP> 17 <SEP> 5 <SEP> 70 <SEP> 10
<Tb>
RS67333 -a>fV RS 124523 21 6 75 5
RS67333 -a> fV RS 124523 21 6 75 5
<tb>
<tb> H2N#OMe <SEP> N-Bu-n <SEP> RS <SEP> 67333 <SEP> 28 <SEP> 6 <SEP> 85 <SEP> 12
<tb> RS <SEP> 47431 <SEP> 30 <SEP> ~ <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP> ~ <SEP> 7
<tb> <Tb>
<tb> H2N # OMe <SEP> N-Bu-n <SEP> RS <SEP> 67333 <SEP> 28 <SEP> 6 <SEP> 85 <SEP> 12
<tb> RS <SEP> 47431 <SEP> 30 <SEP> ~ <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP> ~ <SEP> 7
<Tb>
V ",,/,'/,',,,,',',',"///;>0'; GR 113808 10 9 78 10
V ",, /, '/,' ,,,, ',', ',"//;;>0'; GR 113808 10 9 78 10
<tb>
<tb> GR113808 <SEP> ##N
<tb> ML <SEP> 10375 <SEP> Cl#O#N# <SEP> ML <SEP> 10375 <SEP> 5 <SEP> ~ <SEP> 4 <SEP> 80 <SEP> 15 <SEP>
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<tb> GR113808 <SEP>## N
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<Tb>
Eï::;[@iht:ft!1Jjj: :t::t:
EI ::; [@ iht: ft! 1Jjj:: t :: t:
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Les mesures d'efficacité ont été déterminées dans des expériences d'accumulation d'AMPc dans des cellules COS-7 exprimant de manière transitoire, soit les récepteurs 5-HT4a, soit le récepteur muté D100A à la même densité de récepteurs (environ 2500fmol/mg de protéine). Pour le récepteur sauvage les résultats sont exprimés en pourcentage de l'accumulation d'AMPc induit par la 5-HT.
Pour le récepteur muté 5-HT4-D1 (3, 32)A, les résultats sont exprimés en pourcentage de l'accumulation d'AMPc induit par le composé BIMU8. Efficacy measurements were determined in cAMP accumulation experiments in transiently expressing COS-7 cells, either the 5-HT4a receptors or the mutated D100A receptor at the same receptor density (about 2500fmol / mg of protein). For the wild-type receptor the results are expressed as a percentage of the 5-HT induced cAMP accumulation.
For the mutated 5-HT4-D1 (3, 32) A receptor, the results are expressed as a percentage of the BIMU8 compound-induced cAMP accumulation.
Ces données suggèrent que le récepteur muté D100(3,32)A peut être autant activé que le récepteur sauvage si le composé peut se lier au récepteur. Les niveaux d'expression des récepteurs sauvages et mutés ne sont pas significativement différents. Par contre, le récepteur mutant W272(6,51)A présentait un niveau d'expression anormalement bas. Le niveau d'expression maximal de protéine était de 600 fmol/mg de protéine quelle que soit la quantité d'ADN transfecté (Roth B. L., Shoham, M. Choudhary,M.S., Khan,N. These data suggest that the mutated D100 (3.32) A receptor can be as activated as the wild-type receptor if the compound can bind to the receptor. Expression levels of wild and mutated receptors are not significantly different. In contrast, the mutant W272 (6.51) A receptor had an abnormally low level of expression. The maximum level of protein expression was 600 fmol / mg protein regardless of the amount of transfected DNA (Roth B. L., Shoham, M. Choudhary, M.S., Khan, N.
Mol.Pharmacol.(1997) 52 :259-66). Mol.Pharmacol (1997) 52: 259-66).
Deux médicaments sont antagonistes du récepteur sauvage , alors qu'ils sont agonistes du récepteur muté (D100(3,32)A). Two drugs are antagonists of the wild-type receptor, whereas they are mutated receptor agonists (D100 (3.32) A).
Les dérivés du benzoate portant la substitution 2-méthoxy-4-amino-5-chloro- (tel que ML10302) (Langlois,M., Zhang,L., Yang, D., Brémont,B., Shen,S., Manara,L. and Croci,T. (1994) Bioorg.Med.Chem.Lett. 4 : 1433-1436) et les arylcétones correspondantes (tels que RS67333, RS124523, RS1000350, RS47431) (Clark,R.D.(1998) In 5-HT4 receptors in the brain and periphery. The benzoate derivatives bearing the 2-methoxy-4-amino-5-chloro substitution (such as ML10302) (Langlois, M., Zhang, L., Yang, D., Bremont, B., Shen, S., Manara, L. and Croci, T. (1994) Bioorg.Med.Chem.Lett.4: 1433-1436) and the corresponding aryl ketones (such as RS67333, RS124523, RS1000350, RS47431) (Clark, RD (1998) In 5 -HT4 receptors in the brain and periphery.
(Eglen,R.M., ed pp.1-48, Springer), sont des agonistes partiels des récepteurs 5-HT4sauvages. (Eglen, R.M., ed pp.1-48, Springer), are partial agonists of 5-HT4 receptors.
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Comme il est montré sur le tableau I, ils sont plus efficaces sur les récepteurs mutés D100(3,32)A que sur le récepteur sauvage. As shown in Table I, they are more effective on the mutated D100 (3.32) A receptors than on the wild-type receptor.
De manière tout à fait intéressante, un autre dérivé benzoate, connu pour être un antagoniste hautement spécifique du ligand 5-HT4 (ML 10375) (Yang,D, Soulier,JL., Sicsic,S., Mathe-Allainmat,M., Brémont,B., Croci, T., Cardamone,R., Aureggi,G. and Langlois,M. J.Med.Chem.(1997) 40 :608-21) ou un agoniste inverse du récepteur 5-HT4 (Blondel,0., Gastineau,M., Langlois,M., Fischmeister, R. Br.J.Pharmacol. (1998)125:595-7.19), s'avère être un agoniste total du récepteur 5-HT4 muté D100(3,32)A (ECso = 1 0, 6 nM) , (Figures 3A et 3C) . Most interestingly, another benzoate derivative, known to be a highly specific 5-HT4 ligand antagonist (ML 10375) (Yang, D, Soulier, JL., Sicsic, S., Mathe-Allainmat, M., Bremont, B., Croci, T., Cardamone, R., Aureggi, G. and Langlois, MJMed.Chem (1997) 40: 608-21) or a 5-HT4 receptor inverse agonist (Blondel, O.). , Gastineau, M., Langlois, M., Fischmeister, R. Br.J.Pharmacol. (1998) 125: 595-7.19), proves to be a total agonist of the mutated 5-HT4 receptor D100 (3.32). A (ECso = 1.06 nM), (Figures 3A and 3C).
Ces résultats ont conduit la Demanderesse à cribler les propriétés d'agonistes putatifs d'une série d'antagonistes du récepteur 5-HT4. Il a été trouvé que l'antagoniste 3[H]GR 113808 qui est l'antagoniste radiomarqué le plus habituellement utilisé (Figure 3C) pour les études sur le récepteur 5-HT4 (Grossman,C.J., Kilpatrick,G.J., Bunce,K.T. Br.J.Pharmacol. These results led the Applicant to screen the properties of putative agonists of a series of 5-HT4 receptor antagonists. The most commonly used radiolabelled antagonist 3 [H] GR 113808 has been found to be the most commonly used radiolabelled antagonist (Figure 3C) for 5-HT4 receptor studies (Grossman, CJ, Kilpatrick, GJ, Bunce, KT Br .J.Pharmacol.
(1993) 109:618-24) est un puissant et efficace agoniste (EC50 = 0,17 0,04 nM) vis-à-vis du récepteur muté D100(3,32)A (Figure 3B) . (1993) 109: 618-24) is a potent and effective agonist (EC50 = 0.17 0.04 nM) against the mutated D100 (3.32) A receptor (Figure 3B).
Les résultats ci-dessus montrent que le récepteur 5-HT4 muté D100(3,32)A est un récepteur de type RASSL, unique sur la base de plusieurs caractéristiques :
1) Il est généré par une mutation unique. The above results show that the mutated 5-HT4 receptor D100 (3.32) A is a RASSL-type receptor, unique on the basis of several characteristics:
1) It is generated by a single mutation.
2) Il est complètement insensible à son unique agoniste naturel endogène : 5-HT. 2) It is completely insensitive to its unique endogenous natural agonist: 5-HT.
3) Il peut être stimulé par une longue série d'agonistes synthétiques de différentes classes chimiques. 3) It can be stimulated by a long series of synthetic agonists of different chemical classes.
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4) Nombre de ces ligands synthétiques présentent une affinité nanomolaire pour le RASSL 5-HT4 et certains parmi eux sont disponibles pour une administration par voie orale, comme le Cisapride. 4) Many of these synthetic ligands have nanomolar affinity for RASSL 5-HT4 and some of them are available for oral administration, such as Cisapride.
Le Cisapride ou PrépulsideTM a été utilisé pendant de nombreuses années pour le traitement de la dyspepsie et principalement le reflux gastro-#sophagique chez l'enfant. Ce composé a été retiré du marché à cause de quelques arythmies provoquées via l'activation des canaux potassiques (K+) (Kii, Y., Ito,T. Cisapride or PrepulsideTM has been used for many years for the treatment of dyspepsia and mainly gastro-oesophageal reflux in children. This compound was withdrawn from the market because of some arrhythmias caused by activation of potassium channels (K +) (Kii, Y., Ito, T.
J.Cardiovasc.Pharmacol. (1997) 29:670-5). D'autres benzamides sont toujours en développement et seront certainement disponibles pour leur administration chez l'homme. J.Cardiovasc.Pharmacol. (1997) 29: 670-5). Other benzamides are still in development and will certainly be available for administration to humans.
De manière intéressante, il a été démontré que le composé RS 67333 est un autre agoniste puissant du RASSL 5-HT4. Ce composé possède en outre, une grande faculté à traverser la barrière hématoencéphalique. Interestingly, RS 67333 has been shown to be another potent agonist of RASSL 5-HT4. This compound also has a great ability to cross the blood-brain barrier.
5) Des composés (ML 10375 et GR 113808) sont des antagonistes hautement spécifiques du récepteur natif et deviennent des agonistes du récepteur RASSL 5-HT4. Le composé GR 113808 traverse également la barrière hématoencéphalique ce qui le rend particulièrement intéressant pour une utilisation putative du récepteur in vivo. 5) Compounds (ML 10375 and GR 113808) are highly specific antagonists of the native receptor and become agonists of the RASSL 5-HT4 receptor. The compound GR 113808 also crosses the blood-brain barrier which makes it particularly interesting for putative use of the receptor in vivo.
Ainsi, avec ces composés (ML 10375 et GR 113808), il est possible de maintenir silencieux les récepteurs natifs tout en activant le récepteur RASSL 5-HT4, y compris lorsqu'ils sont exprimés par ingénierie génétique chez les souris. Thus, with these compounds (ML 10375 and GR 113808), it is possible to keep the native receptors silent while activating the RASSL 5-HT4 receptor, including when expressed by genetic engineering in mice.
Par comparaison avec les récepteurs bétaadrénergiques RASSL couplés à des protéines G Compared with beta-adrenergic RASSL receptors coupled to G proteins
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préalablement décrits, le récepteur RASSL 5-HT4 présente l'avantage d'être stimulé par des composés synthétiques d'une bien plus haute affinité : nM pour le récepteur RASSL 5-HT4 alors que l'affinité n'est que M pour le récepteur RASSL béta2-adrenergique (Small KM, Brown KM, Forbes SL, Liggett SB. J. Biol . Chem. (2001) 276(34):31596-601). previously described, the RASSL 5-HT4 receptor has the advantage of being stimulated by synthetic compounds of a much higher affinity: nM for the RASSL 5-HT4 receptor whereas the affinity is only M for the receptor Beta2-adrenergic RASSL (Small KM, Brown KM, Forbes SL, Liggett SB, J. Biol Chem (2001) 276 (34): 31596-601).
Les analyses structurales des ligands du récepteur 5-HT4, utilisés dans cette étude, sont en accord avec un rapport récent sur la cartographie comparative des sites de liaison du récepteur 5-HT4 (Lopez-Rodriguez, M.L., Murcia,M., Benhamu,B., Viso, A., Campillo,M. and Pardo,L. Bioorg.Med.Chem.Lett. (2001) 11(21):2807-11.22). Structural analyzes of 5-HT4 receptor ligands, used in this study, are consistent with a recent report on comparative mapping of 5-HT4 receptor binding sites (Lopez-Rodriguez, ML, Murcia, M., Benhamu, B., Viso, A., Campillo, M. and Pardo, L. Bioorg.Med.Chem.Lett (2001) 11 (21): 2807-11.22).
Les caractéristiques structurales qui définissent les ligands du récepteur 5-HT4 sont constituées une partie aromatique, d'un carbonyle coplanaire, d'une fonction carboxylique ou cétone et d'un atome d'azote basique. The structural features that define the 5-HT4 receptor ligands are an aromatic moiety, a coplanar carbonyl, a carboxylic or ketone moiety, and a basic nitrogen atom.
Le substituant de l'azote basique doit être volumineux (comme dans tous les médicaments actifs pour le récepteur RASSL 5-HT4 décrit) afin de se stabiliser dans une poche hydrophobe du récepteur, sans nécessiter la présence du groupement carboxylate de l'aspartate D100. The basic nitrogen substituent must be bulky (as in all active drugs for the described RASSL 5-HT4 receptor) in order to stabilize in a hydrophobic pocket of the receptor, without requiring the presence of the carboxylate group of aspartate D100.
La taille du substituant, jusqu'à un certain degré, améliore la sélectivité et l'affinité du ligand pour son récepteur. The size of the substituent, to some degree, improves the selectivity and affinity of the ligand for its receptor.
Une des hypothèses de la demanderesse est que l'azote basique de ces médicaments interagit avec ladite poche hydrophobe avec une charge négative, mais pas avec l'aspartate D1003,32. One of the assumption of the applicant is that the basic nitrogen of these drugs interacts with said hydrophobic pocket with a negative charge, but not with the aspartate D1003,32.
Ce résidu Asp est, par contre, nécessaire pour la liaison avec l'amine protonée présente dans les dérivés This Asp residue is, on the other hand, necessary for binding with the protonated amine present in the derivatives
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tryptamines proche de la 5-HT. Ces composés sont donc inactifs sur le récepteur RASSL 5-HT4 décrit. tryptamines close to 5-HT. These compounds are therefore inactive on the RASSL 5-HT4 receptor described.
On peut donc supposer que l'interaction de l'azoté basique n'est pas essentielle. L'affinité des ligands ayant des substituants volumineux pour le récepteur RASSL 5-HT4 (Structures dans le tableau 1) dépendra des interactions entre leur cycle hydrophobe et la poche hydrophobe définie par les résidus aromatiques hautement conservés des TMVI et VII (W6,48, F6,51 et Y7,43) (16, 23, 24).s
Ce récepteur RASSL 5-HT4 constitue par conséquent un modèle très utile pour déterminer les effets physiologiques de l'expression d'un récepteur couplé aux protéines Gs et pour contrôler, par exemple dans des modèles de souris transgéniques la transduction du signal liée aux protéines Gs in vivo (Scearce-Levie,K., Coward, P., Redfern,C.H., Conklin,B.R. Methods Enzymol. It can therefore be assumed that the interaction of basic nitrogen is not essential. The affinity of ligands with bulky substituents for the RASSL 5-HT4 receptor (Structures in Table 1) will depend on the interactions between their hydrophobic cycle and the hydrophobic pocket defined by the highly conserved aromatic residues of TMVI and VII (W6,48, F6.51 and Y7.43) (16, 23, 24) .s
This RASSL 5-HT4 receptor therefore constitutes a very useful model for determining the physiological effects of the expression of a Gs-protein coupled receptor and for controlling, for example in transgenic mouse models, the signal transduction linked to Gs proteins. in vivo (Scearce-Levie, K., Coward, P., Redfern, CH, Conklin, BR Methods Enzymol.
(2002) 232-48. (2002) 232-48.
Lorsque ledit récepteur est exprimé, il est fonctionnellement silencieux jusqu'au moment de l'administration du ligand synthétique. When said receptor is expressed, it is functionally silent until the time of administration of the synthetic ligand.
Un tel récepteur est particulièrement utile pour réguler des nombreuses réponses physiologiques qui nécessitent l'activation de la voie couplée à Gs. Such a receptor is particularly useful for regulating numerous physiological responses that require activation of the Gs-coupled pathway.
A titre d'exemple, on peut proposer l'expression d'un récepteur RASSL 5-HT4 dans le coeur d'une souris, qui n'exprime pas de récepteur 5-HT4, contrairement au c#ur humain (Kaumann,A.J., Lynham,J.A., Brown,A.M. By way of example, it is possible to propose the expression of a RASSL 5-HT4 receptor in the heart of a mouse, which does not express a 5-HT4 receptor, unlike the human heart (Kaumann, AJ, Lynham, JA, Brown, AM
Naunyn. Schmiedebergs. Arch. Pharmacol. (1996) 353(5):592-5). Ce modèle permettrait de tester l'activation chronique ou aiguë de la voie Gs, en Naunyn. Schmiedebergs. Arch. Pharmacol. (1996) 353 (5): 592-5). This model would test the chronic or acute activation of the Gs path, in
<Desc/Clms Page number 34><Desc / Clms Page number 34>
absence de stimulation d'autres cibles périphériques, en incluant des tissus vasculaires. no stimulation of other peripheral targets, including vascular tissue.
Au niveau central, le récepteur RASSL 5-HT4, exprimé dans la substance noire pourra être stimulé et la production d'AMPc dans des neurones dopaminergiques conduira à leur survie et à leur protection lorsqu' ils seront traités par une drogue neurotoxique, le MPP+(1méthyl-4-phénylpyridinium) le métabolite actif du MPTP (1-méthyl-4-phényl-1, 2,3, 6-tétrahysropyridine). At the central level, the RASSL 5-HT4 receptor, expressed in the substantia nigra can be stimulated and the production of cAMP in dopaminergic neurons will lead to their survival and protection when they are treated by a neurotoxic drug, the MPP + ( 1-methyl-4-phenylpyridinium) the active metabolite of MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine).
Il est connu que la production d'AMPc in vivo, permet une telle protection. De telles expériences fournissent une base pour une thérapie génique de la maladie de Parkinson. It is known that the production of cAMP in vivo, allows such protection. Such experiments provide a basis for gene therapy for Parkinson's disease.
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