FR2843199A1

FR2843199A1 - Measuring progesterone concentration in milk colorimetrically, useful in assisting in breeding of dairy cattle, comprises an immuno-enzymatic reaction

Info

Publication number: FR2843199A1
Application number: FR0209714A
Authority: FR
Inventors: Christine Roguez; Eric Sellal
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-07-31
Filing date: 2002-07-31
Publication date: 2004-02-06

Abstract

The milk (1) sample being tested and its progesterone (4) are incubated with the anti-progesterone (2) antibody. It is placed in direct competition with a progesterone conjugated with an enzyme (5). Development produces a color by addition of a substrate (7) for the enzyme. A colorimetric reading is taken, using a fixed threshold in the colorimeter. The milk (1) sample being tested and its progesterone (4) are incubated with the anti-progesterone (2) antibody. It is placed in direct competition with a progesterone conjugated with an enzyme (5). Development produces a color by addition of a substrate (7) for the enzyme. A colorimetric reading is taken, using a fixed threshold in the colorimeter. This serves as a reference for the reading, which is of a semi-quantitative type with several reading levels. The reference threshold for the reading, corresponds by standardization with a progesterone concentration in the sample to be tested below 2 ng/ml.

Description

1/ Domaine technique d'intervention: La présente invention concerne une1 / Technical field of intervention: The present invention relates to a

méthode de dosage de la Progestérone dans le lait spécialement conçu pour être réalisé par l'éleveur dans sa ferme pour l'aider dans la gestion de la reproduction de son troupeau de vaches laitières. Pour bénéficier du progrès génétique et sanitaire apporté par l'insémination artificielle, l'éleveur laitier doit repérer les vaches en chaleurs du troupeau pour les faire inséminer. Ce repérage se fait en observant le comportement d'oestrus des vaches en chaleurs, ce qui ne manque pas d'amener à des situations method for measuring progesterone in milk specially designed to be carried out by the farmer on his farm to help him manage the reproduction of his herd of dairy cows. To benefit from the genetic and sanitary progress brought by artificial insemination, the dairy farmer must identify the cows in heat of the herd to have them inseminated. This location is done by observing the estrus behavior of cows in heat, which does not fail to lead to situations

de doute.doubt.

Certaines vaches ont des comportements ambigus ou mal interprétés qui amènent une Some cows have ambiguous or misinterpreted behaviors that lead to

insémination à un mauvais moment, abaissant ainsi la fécondité du troupeau. insemination at a bad time, thereby lowering the fertility of the herd.

D'autres vaches gestantes manifestent des comportements également ambigus, laissant croire qu'elles sont en chaleurs, et sont donc inséminées, ce qui met en danger la survie de leur Other pregnant cows exhibit equally ambiguous behavior, suggesting that they are in heat, and are therefore inseminated, which endangers the survival of their

embryon, car l'acte d'insémination se fait en traversant le col de l'utérus. embryo, because the act of insemination is done by crossing the cervix.

Devant ces situations douteuses, l'éleveur a besoin pour connaître l'état sexuel de sa vache et prendre la bonne décision, d'un test d'aide à la décision, d'un cot abordable, praticable à la Faced with these doubtful situations, the breeder needs to know the sexual status of his cow and make the right decision, a decision-making test, at an affordable cost, practicable for

ferme, et donnant immédiatement un résultat clair. firm, and immediately giving a clear result.

2/ Etat actuel des techniques disponibles:11 existe des techniques qui aident au repérage du comportement de chaleurs, spécialement en repérant le chevauchement,par un dispositif placé sur la croupe de la vache. EP0995408A1 décrit un dispositif ou l'alerte est donnée par des signaux lumineux. Ces dispositifs ne répondent pas totalement aux problèmes posés par la 2 / Current state of available techniques: There are techniques which help to identify the behavior of heat, especially by identifying overlap, by a device placed on the rump of the cow. EP0995408A1 describes a device where the alert is given by light signals. These devices do not fully respond to the problems posed by the

surveillance du comportement oestral. monitoring of estral behavior.

Il existe des dosages de progestérone dans le lait:EP0031926 décrit un procédé radioimmunologique utilisant un isotope de l'iode,qui n'est donc utilisable qu'en laboratoire spécialisé.GB2354069 décrit un procédé utilisant le dosage de la progestérone dans du lait prélevé 4 à 6 jours après l'insémination,quelque soit la méthode de dosage utilisée,pour prédire une gestation ou améliorer les taux de gestation par un traitement progestagène.WOO1 14887 décrit un procédé automatisé de dosage de la progestérone du lait destiné à être couplé à un robot de traite et à 1 'ordinateur rassemblant les données du troupeau. Les dosages sont réalisés automatiquement tout au long du cycle oestral de la vache;ledit dosage est réalisé en ajoutant des anticorps anti-progestérone dans le récipient contenant l'échantillon de lait,ledit récipient ayant ses parois tapissées de progestérone. La lecture se fait en se fondant sur la différence de poids entre la progestérone et les anticorps utilisés. Les dosages répétés permettent de situer la vache dans son cycle oestral. EP0857974 décrit un test Elisa dosant la progestérone dont l'étape There are assays of progesterone in milk: EP0031926 describes a radioimmunological method using an iodine isotope, which can therefore only be used in a specialized laboratory. GB2354069 describes a method using the assay of progesterone in milk taken 4 at 6 days after insemination, whatever the dosing method used, to predict gestation or improve gestation rates by progestagen treatment.WOO1 14887 describes an automated method for dosing progesterone from milk intended to be coupled to a milking robot and computer gathering herd data. The assays are carried out automatically throughout the oestral cycle of the cow; said assay is carried out by adding anti-progesterone antibodies to the container containing the milk sample, said container having its walls lined with progesterone. The reading is done based on the weight difference between the progesterone and the antibodies used. Repeated dosages make it possible to locate the cow in its estral cycle. EP0857974 describes an Elisa test measuring progesterone, the step of which

de révélation colorée est caractérisée par un préchauffage à la température de 330Celsius. of color development is characterized by preheating to the temperature of 330Celsius.

US5063151 décrit un procédé utilisant un anticorps anti-progestérone combiné avec la protéine A de la bactérie Staphylococcus aureus pour constituer un complexe immobilisé dans une matière poreuse;le dosage est réalisé en déposant l'échantillon de liquide à doser sur un disque poreux et en faisant apparaître une coloration par un procédé de type Elisa; la lecture se fait à l'oeil nu.US4720455 décrit un procédé de dosage de la progestérone de type Elisa utilisant un bâtonnet sensibilisé par des anticorps monoclonaux Jle procédé demande 7 étapes avant l'étape de lecture et utilise comme référence deux échantillons calibrés lors de chaque dosage. La lecture se fait à l'oeil nu en comparant la couleur obtenue par l'échantillon à doser à la couleur des 2 échantillons de référence.W08902076 décrit un dosage prévu pour être réalisé à la ferme utilisant une technique immuno-enzymatique caractérisée en ce que: -le procédé est réalisé en 6 étapes de remplissage ou de vidanges avant la lecture -le prélèvement du lait est réalisé dans un tube sensibilisé devant être conservé dans un US5063151 describes a method using an anti-progesterone antibody combined with protein A of the bacterium Staphylococcus aureus to constitute a complex immobilized in a porous material; the assay is carried out by depositing the sample of liquid to be assayed on a porous disc and making appear a coloration by an Elisa type process; the reading is done with the naked eye. US4720455 describes a method for assaying progesterone of the Elisa type using a rod sensitized by monoclonal antibodies. The method requires 7 steps before the reading step and uses as reference two samples calibrated during each dosage. The reading is done with the naked eye by comparing the color obtained by the sample to be dosed with the color of the 2 reference samples. WO 08902076 describes an assay intended to be carried out on the farm using an immunoenzymatic technique characterized in that : -the process is carried out in 6 stages of filling or emptying before reading -the milk is sampled in a sensitized tube which must be kept in a

réfrigérateur qui est rarement disponible près de la salle de traite des vaches. refrigerator that is rarely available near the cow milking parlor.

-la lecture est réalisée par un colorimètre en comparant la couleur de l'échantillon à tester à celle -the reading is carried out by a colorimeter by comparing the color of the test sample to that

obtenue avec une solution de référence. obtained with a reference solution.

-ladite solution de référence se comporte comme un lait contenant 5ng/ml à 1 Ong/ml de progestérone,c'est à dire un seuil élevé par rapport à la concentration en progestérone du lait de vaches en chaleurs. Ce seuil de référence élevé fait que des vaches ayant un taux de progestérone compris entre 2ng/ml et 5ng/ml vont être classées " en chaleurs " par ce test. Si on se réfère aux travaux de Henriksen et coll(seminaire à Freising, septembre30-octobre2,1981,p.277281,1982/Martinus Nijhoff-The Hague, Netherlands),les vaches dans cette situation ne sont pas -said reference solution behaves like a milk containing 5ng / ml to 1 Ong / ml of progesterone, that is to say a high threshold compared to the concentration of progesterone in the milk of cows in heat. This high reference threshold means that cows with a progesterone level between 2ng / ml and 5ng / ml will be classified "in heat" by this test. If we refer to the work of Henriksen et al (seminar at Freising, September 30-October 2.1981, p.277281.1982 / Martinus Nijhoff-The Hague, Netherlands), cows in this situation are not

en chaleurs et montrent une mauvaise fécondité si on les insémine ce jourlà. in heat and show poor fertility if they are inseminated that day.

Il existe donc des dosages de progestérone dans le lait de la vache construits pour être utilisés à la ferme, mais leur exécution à la ferme par l'éleveur, pose un ou plusieurs des problèmes suivants: -Le prélèvement de lait doit se faire dans un tube spécial à conserver dans un réfrigérateur There are therefore dosages of progesterone in cow's milk built to be used on the farm, but their execution on the farm by the breeder, poses one or more of the following problems: -The milk sample must be done in a special tube to keep in a refrigerator

rarement disponible prés de l'étable. rarely available near the barn.

-Le test nécessite un tube- témoin dans lequel il faut conduire les mêmes opérations que pour l'échantillon à tester, doublant ainsi les cots et les manipulations lorsque l'on teste un seul -The test requires a control tube in which the same operations must be carried out as for the sample to be tested, thus doubling the costs and handling when testing a single

échantillon.sample.

-Il faut réaliser, avant l'étape de lecture, plus de 4 opérations de remplissage ou de vidange, avec plus de deux réactifs dans le matériel et le test demande souvent plus de 10 minutes pour l'effectuer. Le résultat du test est lu en comparant les couleurs de l'échantillon testé à celle du témoin, à -It is necessary to carry out, before the reading step, more than 4 filling or emptying operations, with more than two reagents in the equipment and the test often requires more than 10 minutes to perform it. The test result is read by comparing the colors of the test sample to that of the control, at

l'oeil nu, ce qui mène beaucoup d'erreurs de lecture ou des résultats jugés douteux pour l'éleveur. the naked eye, which leads to many reading errors or results deemed questionable by the breeder.

Beaucoup de tests sont bâtis pour réaliser un diagnostic de gestation et leur seuil est élevé(supérieur à 3ng/ml), ce qui ne permet pas de l'utiliser valablement pour la confirmation Many tests are built to carry out a pregnancy diagnosis and their threshold is high (greater than 3ng / ml), which does not allow it to be used validly for confirmation.

d'oestrus avec comportements douteux. estrus with questionable behavior.

Il manquait donc un test de dosage de la progestérone dans le lait évitant tous les écueils It therefore lacked a progesterone test in milk avoiding all pitfalls

précédemment évoqués::Le prélèvement doit se faire dans un tube conservé près de l'étable. previously mentioned: The sample must be taken in a tube kept near the stable.

Supprimer le tube témoin simplifie les manipulations et baisser les cots. Le test doit être réalisable en 4 opérations avec seulement 2 réactifs avant l'étape de lecture. Le test doit être lu par un colorimètre qui donne une réponse de type oui ou non. Le test doit être bâti avec un seuil bas ( <2 ng /ml), si on veut l'utiliser valablement pour repérer les vaches en oestrus lors de Removing the control tube simplifies handling and lowering costs. The test must be possible in 4 operations with only 2 reagents before the reading step. The test must be read by a colorimeter which gives a yes or no answer. The test must be constructed with a low threshold (<2 ng / ml), if it is to be used validly to identify cows in estrus during

comportements de chaleurs équivoques. equivocal heat behavior.

3/ Exposé de l'invention 3/1 Principe du dosage =Le procédé de dosage utilise une réaction immuno-enzymatique de type Elisa par compétition dont les principales étapes sont illustrées dans les figures 1 et 2: Le lait à 3 / Presentation of the invention 3/1 Principle of the assay = The assay method uses an immuno-enzymatic reaction of the Elisa type by competition, the main steps of which are illustrated in FIGS. 1 and 2:

tester peut être riche en progestérone ( Figure 1) ou pauvre en progestérone. ( Figure 2). testing can be rich in progesterone (Figure 1) or low in progesterone. (Figure 2).

Etape 1 ( Figure 1-let figure 2-1):Une première incubation de l'échantillon de lait (1) dans le tube met la progestérone (4) de l'échantillon en présence d'anticorps anti-progestérone(2),fixés Step 1 (Figure 1-let Figure 2-1): A first incubation of the milk sample (1) in the tube puts the progesterone (4) of the sample in the presence of anti-progesterone antibodies (2), fixed

au tube-test (3).Cette première incubation dure 2 minutes. in the test tube (3). This first incubation lasts 2 minutes.

Etape 2 ( Figure 1-2 et figure2-2):On ajoute dans le tube une progestérone marquée (5), en Step 2 (Figure 1-2 and Figure2-2): A labeled progesterone (5) is added to the tube,

quantité fixe, qui va aller se fixer sur les sites anticorps restés libres après la 1 ère incubation. fixed amount, which will bind to the antibody sites which remain free after the 1st incubation.

Ces sites anticorps restés libres sont peu nombreux si l'échantillon à tester était riche en progestérone (Figure 1-2), ils sont nombreux si l'échantillon à tester était pauvre en progestérone These antibody sites remained free are few if the test sample was rich in progesterone (Figure 1-2), they are numerous if the test sample was poor in progesterone

(Figure 2 -2).Cette deuxième incubation dure 2 minutes. (Figure 2-2) This second incubation lasts 2 minutes.

Etape 3 (Figure 1-3et figure 2-3): Des vidanges (6) à l'eau, suivies de rinçages successifs, libèrent complètement le tube de la progestérone marquée restée en suspension car non fixée aux Step 3 (Figure 1-3 and Figure 2-3): Drains (6) with water, followed by successive rinses, completely release the tube of the marked progesterone which remains in suspension because it is not attached to the

anticorps sur la paroi.antibody on the wall.

Etape 4(Figl-4 ET 2-4):On ajoute dans le tube un substrat (7), qui vient spécifiquement réagir avec la progestérone marquée liée aux anticorps (2) attachés à la paroi du tube;cette étape 4 Step 4 (Figl-4 AND 2-4): A substrate (7) is added to the tube, which specifically reacts with the labeled progesterone linked to the antibodies (2) attached to the wall of the tube; this step 4

dure 2 minutes.lasts 2 minutes.

Si le substrat (7)trouve peu de progestérone marquée, il se produira peu de couleur. Cela indique que l'échantillon (4)à tester est riche en progestérone (Fig 1-1).Si le substrat (7) trouve beaucoup de progestérone marquée, il y aura beaucoup de couleur. Cela indique que l'échantillon(l) à If the substrate (7) finds little marked progesterone, there will be little color. This indicates that the sample (4) to be tested is rich in progesterone (Fig 1-1). If the substrate (7) finds a lot of marked progesterone, there will be a lot of color. This indicates that the sample (l) to

tester était pauvre en progestérone (Fig2-1). test was poor in progesterone (Fig2-1).

3/2Caractéristiques techniques propres à l'invention: L'invention réunit plusieurs procédés qui s'adaptent bien à l'objectif fixé au dosage: Le prélèvement se fait dans un tube ordinaire qui peut être conservé près de l'étable, en dehors Technical characteristics specific to the invention: The invention combines several processes which adapt well to the objective set for the dosage: The sample is taken in an ordinary tube which can be kept near the stable, outside

du réfrigérateur.from the refrigerator.

Un seul tube est utilisé par dosage ( pas de tube témoin) car la concentration des réactifs, les quantités de lait, les quantités de réactifs et les temps d'incubation sont calibrés pour s'en référer Only one tube is used per assay (no control tube) because the concentration of reagents, the quantities of milk, the quantities of reagents and the incubation times are calibrated to refer to

1 0 à une couleur -- "seuil" mesurée par le colorimètre. 1 0 to a color - "threshold" measured by the colorimeter.

Les étapes l et 2 se succèdent sans vidange entre elles. Steps l and 2 follow one another without draining them.

L' étape 4 se fait avec un seul réactif. Step 4 is done with a single reagent.

Le colorimètre fourni utilise une source lumineuse de longueur d'onde définie couplée à une The colorimeter supplied uses a light source of defined wavelength coupled to a

photodiode réceptrice spécifique de cette longueur d'onde. specific receiving photodiode of this wavelength.

Le colorimètre fourni, contient une résistance qui joue un rôle de seuil, calibré pour correspondre au seuil de progestérone visé, lui permettant de donner une réponse claire, sans résultat ininterprétable.Le seuil de progestérone a été fixé suffisamment bas pour caractériser spécifiquement les vaches en chaleurs en période oestrale en dessous de ce seuil, excluant ainsi The colorimeter supplied contains a resistance which acts as a threshold, calibrated to correspond to the target progesterone threshold, allowing it to give a clear response, without uninterpretable results. The progesterone threshold has been set low enough to specifically characterize cows in heat in the eastern period below this threshold, thus excluding

les vaches cyclées en phase lutéale ou les vaches gestantes. cows cycled in luteal phase or pregnant cows.

3/3 Description détaillée:L'invention produit tout le nécessaire à la réalisation d'un dosage de 3/3 Detailed description: The invention produces everything necessary for carrying out a dosage of

progestérone en dehors d'un laboratoire. progesterone outside a laboratory.

3/3/1/Les tubes de prélèvements:Jl s'agit de tubes en plastique munis d'un bouchon dont l'ouverture est suffisamment large pour prélever quelques jets de lait à la mamelle avant la traite. 3/3/2/ Les tubes- tests sont choisis pour permettre une bonne adhésion des anticorps 3/3/1 / Sampling tubes: These are plastic tubes fitted with a stopper, the opening of which is wide enough to draw a few jets of milk from the udder before milking. 3/3/2 / The test tubes are chosen to allow good adhesion of the antibodies

monoclonaux. Nous avons préféré utiliser les tubes Nunc Startube Maxisorp à ailettes. monoclonal. We preferred to use the Nunc Startube Maxisorp finned tubes.

Ces tubes ont la particularité de posséder 6 ailettes obtenues par moulage. These tubes have the distinction of having 6 fins obtained by molding.

Ces ailettes confèrent 3 avantages: - La surface disponible pour la fixation des immunoglobulines est plus importante et permet de travailler avec des volumes faibles (inférieure à l ml) avec une sensibilité élevée. - La présence des ailettes correspond à une diminution importante des distances moyennes " molécules- parois ", autorisant pour des résultats identiques, une réduction sensible These fins confer 3 advantages: - The surface available for the fixation of immunoglobulins is larger and allows to work with low volumes (less than 1 ml) with high sensitivity. - The presence of the fins corresponds to a significant reduction in the average distances "molecules - walls", allowing for identical results, a significant reduction

des temps d'incubation.incubation times.

- Si l'on agite doucement les tubes, les ailettes provoquent un brassage doux qui permet - If the tubes are gently shaken, the fins cause gentle mixing which allows

une diminution des temps d'incubation en élevant parallèlement la reproductibilité. a reduction in incubation times by increasing reproducibility at the same time.

3/3/3/ Les anticorps monoclonaux sont fixés à la paroi intérieure du tubetest:Nous avons sélectionné de préférences les anticorps monoclonaux dirigés contre la progestérone -1 la-HMS5 BSA, clone BGN/6-5E-3F (IgGl) fourni par Biogenesis (UK) La concentration utilisée doit permettre une sensibilité de détection avec un seuil de l'ordre de 2 ng/ml de progestérone naturelle. 3/3/4/ La mesure des volumes de lait et de réactif:Le volume de lait à introduire dans le tube est 3/3/3 / The monoclonal antibodies are attached to the inner wall of the tubetest: We have preferably selected the monoclonal antibodies directed against progesterone -1 la-HMS5 BSA, clone BGN / 6-5E-3F (IgGl) supplied by Biogenesis (UK) The concentration used must allow detection sensitivity with a threshold of the order of 2 ng / ml of natural progesterone. 3/3/4 / Measuring the volumes of milk and reagent: The volume of milk to be introduced into the tube is

de 0,5 ml et il doit être mesuré avec une précision de +/- 0,05 ml (50 ffl). 0.5 ml and must be measured with an accuracy of +/- 0.05 ml (50 ffl).

Les réactifs nl ( Progestérone marquée), et le réactif n02 ( substrat), sont utilisés respectivement avec un volume de 0,5 ml et de 1 ml, qui doit être mesuré avec une précision de The reagents nl (labeled progesterone), and the reagent n02 (substrate), are used respectively with a volume of 0.5 ml and 1 ml, which must be measured with an accuracy of

+/- 0,05 ml (50 ffl).+/- 0.05 ml (50 ffl).

Nous avons sélectionné de préférence les flacons Nalgène avec compte goutte calibré (Précision 50 gil) We preferably selected Nalgene bottles with calibrated dropper (Precision 50 gil)

3/3/5/ La progestérone marquée:Nous avons sélectionné de préférence la progestéronel 1 marquée à la peroxydase. L'activité enzymatique est de 300 unités/mg (pyrogallol). 3/3/5 / Labeled progesterone: We preferably selected progesterone 1 labeled with peroxidase. The enzymatic activity is 300 units / mg (pyrogallol).

La concentration utilisée doit permettre une sensibilité de détection avec un seuil de l'ordre de 2 The concentration used must allow detection sensitivity with a threshold of the order of 2

ng/ml de progestérone naturelle.ng / ml of natural progesterone.

3/3/6/ Le substrat:Nous avons sélectionné de préférence le Tétraméthyl benzidine utilisable en 3/3/6 / The substrate: We preferably selected Tetramethyl Benzidine usable in

un seul temps.one time.

3/3/7/Le colorimètre = Le colorimètre fonctionne selon le schéma de la figure 3:Une source lumineuse ( 1),constituée par une photodiode, envoie un pinceau lumineux sur un tube (3) et son échantillon(4) à évaluer. Une cellule détectrice (2),constituée par une photo résistance, placée de l'autre côté du tube par rapport à la source (1), mesure le flux lumineux reçu. La longueur d'onde de la source (1) est choisie de façon à correspondre exactement à la longueur d'onde absorbée par l'échantillon (4) de façon à avoir une sensibilité maximale avec le détecteur:Cette longueur d'onde a été choisie entre 600et 620nm. Après étalonnage, le flux lumineux mesuré dépend de l'absorption de la solution et donc de la concentration en progestérone de l'échantillon(4): Plus le taux de progestérone de l'échantillon à tester est élevé, plus la quantité de progestérone marquée restant dans le tube après vidange-rinçage est faible, moins la solution 3/3/7 / The colorimeter = The colorimeter works according to the diagram in Figure 3: A light source (1), consisting of a photodiode, sends a light brush onto a tube (3) and its sample (4) to be evaluated . A detector cell (2), constituted by a photo resistance, placed on the other side of the tube with respect to the source (1), measures the light flux received. The wavelength of the source (1) is chosen so as to correspond exactly to the wavelength absorbed by the sample (4) so as to have a maximum sensitivity with the detector: This wavelength has been chosen between 600 and 620nm. After calibration, the measured luminous flux depends on the absorption of the solution and therefore on the concentration of progesterone in the sample (4): The higher the progesterone level in the test sample, the higher the quantity of progesterone marked remains in the tube after drain-rinse is low, minus the solution

est absorbante.is absorbent.

3/3/8/ Un minuteur préréglé permet de mesurer les 3 temps d'incubation. 3/3/8 / A preset timer allows you to measure the 3 incubation times.

Claims

1 / Immuno-enzymatic type method allowing the measurement of the progesterone concentration in mammalian milk carried out in 4 stages before the calorimetric reading, without reference sample, characterized in that it comprises: -Stage -: A first incubation milk to be tested with anti-progesterone antibodies, -Step2 Direct competition of the milk to be tested with an progesterone conjugated to an enzyme, -Step3 a rinse-drain step, -Step4: A revelation producing color by addition of a substrate of said enzyme, a reading carried out by a colorimeter using a threshold, fixed in the colorimeter, serving as a reference for the reading which is of semi-quantitative type with several reading levels, - said reference threshold for reading corresponds by calibration to a concentration of progesterone

in the test sample less than 2ng / ml.

2 / A method according to claim 1) characterized in that the first 2 steps consist of mixing

in a test tube the sample of milk to be tested and the labeled progesterone.

3 / A method according to claims 2) characterized in that the test tube has a bottom whose surface

internal, is provided with fins facilitating the immunoenzymatic reaction.

4) Method according to claim 1) characterized in that the 4th step of the dosage is done by the addition

in the test tube of a single reagent which alone allows the appearance of the colored reaction.

) Method according to claims 1), 2) and 4) characterized in that steps 1, 2 and 4 of the method

each last less than 2.5 minutes.

6) Method according to claim 1) characterized in that the colorimetric reading implements a

photodiode emitting a light source with a wavelength between 600 and 620 min.

7) Method according to claim 6) characterized in that the measurement of the light flux transmitted by the

test substance is made by a photo resistance.

8) Method according to claim 1) characterized in that several reading levels are predefined by

a system of electrical resistance bridges.