FR2840305A1 - METHODS OF OBTAINING OLIGO MANNURONATES AND GULURONATES, THE PRODUCTS OBTAINED AND THEIR USES - Google Patents
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-
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Abstract
L'invention concerne notamment un procédé d'obtention d'oligo-mannuronates saturés et/ ou insaturés, caractérisé par le fait qu'il consiste à mettre en oeuvre les étapes suivantes :a) disperser en milieu acide et à chaud des algues brunes, à un pH inférieur ou égal à 2;b) séparer, notamment par filtration, la fraction insoluble de la fraction soluble issues de l'étape a), cette fraction insoluble contenant notamment la cellulose algale des algues, et les blocs α -L-guluronique (G) et β -D-mannuronique (M); c) ajuster le pH de ladite fraction insoluble à environ 2, 8 par ajout d'une base;d) séparer, notamment par filtration, la fraction insoluble de la fraction soluble issues de l'étape c), la fraction soluble contenant des blocs d'acide ( β -D-mannuronique (M);e) soumettre ladite fraction soluble récupérée à l'étape d) à une dépolymérisation par voie acide, ou par voie enzymatique ou par voie mixte acide/ enzymatique, de manière à recueillir des oligo-mannuronates saturés et/ ou insaturés.The invention relates in particular to a process for obtaining saturated and / or unsaturated oligo-mannuronates, characterized in that it consists in carrying out the following stages: a) dispersing brown algae in an acidic medium, hot, at a pH less than or equal to 2; b) separate, in particular by filtration, the insoluble fraction from the soluble fraction resulting from step a), this insoluble fraction containing in particular the algal cellulose of the algae, and the α -L- blocks guluronic (G) and β -D-mannuronic (M); c) adjusting the pH of said insoluble fraction to approximately 2.8 by adding a base; d) separating, in particular by filtration, the insoluble fraction from the soluble fraction resulting from step c), the soluble fraction containing blocks of acid (β -D-mannuronic (M); e) subjecting said soluble fraction recovered in step d) to depolymerization by the acid route, or by the enzymatic route or by the mixed acid / enzymatic route, so as to collect saturated and / or unsaturated oligo-mannuronates.
Description
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La présente invention se rapporte à des procédés d'obtention d'oligomannuronates et d'oligo-guluronates. The present invention relates to processes for obtaining oligomannuronates and oligo-guluronates.
Elle concerne également les oligo-mannuronates et les oligoguluronates obtenus par la mise en #uvre de ce procédé. Elle se rapporte enfin à des utilisations de ces oligo-mannuronates et oligo-guluronates. It also relates to oligo-mannuronates and oligoguluronates obtained by the implementation of this process. Finally, it relates to uses of these oligo-mannuronates and oligo-guluronates.
Les alginates sont présents dans les parois des algues brunes ou Phéophycées. La biosynthèse d'alginate n'est pas seulement réalisée par les algues brunes mais aussi par des bactéries (Azotobacter sp et Pseudomonas sp) qui produisent des alginates acétylés dans le milieu extracellulaire. Alginates are present in the walls of brown algae or Phéophycées. The alginate biosynthesis is not only performed by brown algae but also by bacteria (Azotobacter sp and Pseudomonas sp) that produce acetylated alginates in the extracellular medium.
Les alginates sont extraits industriellement, principalement, à partir d'espèces appartenant aux ordres des laminariales et des fucales, répertoriées dans le tableau Ici-après:
TABLEAU
BOARD
<tb>
<tb> Ordre <SEP> Famille <SEP> Espèces
<tb> Durvillaelales <SEP> Durvilleaceae <SEP> Durvillea <SEP> antartica
<tb> Durvillea <SEP> potatorum
<tb> Laminariales <SEP> Alariaceae <SEP> Ecklonia <SEP> maxima
<tb> Ecklonia <SEP> cava
<tb> Ecklonia <SEP> radiata
<tb> Eisenia <SEP> bicyclis
<tb> Laminariaceae <SEP> Laminaria <SEP> japonica <SEP>
<tb> Laminaria <SEP> hyperborea
<tb> Laminaria <SEP> digitata
<tb> Laminaria <SEP> pallida
<tb> Laminaria <SEP> longicruris
<tb> Lessoniaceae <SEP> Lessonia <SEP> flavicans <SEP>
<tb> Lessonia <SEP> trabeculata
<tb> Lessonia <SEP> nigrescens
<tb> Macrocystis <SEP> pyrifera
<tb> Nereocystis <SEP> sp
<tb> Fucales <SEP> Fucaceae <SEP> Ascophyllum <SEP> nodosum
<tb> Fucus <SEP> serratus
<tb> Fucus <SEP> vesiculosus
<tb> Cystoseiraceae <SEP> Cystoseira <SEP> sp
<tb> Sargassaceae <SEP> Sargassum <SEP> wigtii
<tb> Sargassum <SEP> ilicifolium
<tb> Sargassum <SEP> myriocystum
<tb> Turbinaria <SEP> conoides
<tb> Turbinaria <SEP> ornata
<tb> Turbinaria <SEP> decurrens
<tb> <Tb>
<tb> Order <SEP> Family <SEP> Species
<tb> Durvillaelales <SEP> Durvilleaceae <SEP> Durvillea <SEP> antartica
<tb> Durvillea <SEP> potatorum
<tb> Laminariales <SEP> Alariaceae <SEP> Ecklonia <SEP> maxima
<tb> Ecklonia <SEP> cava
<tb> Ecklonia <SEP> radiata
<tb> Eisenia <SEP> Bicyclis
<tb> Laminariaceae <SEP> Laminaria <SEP> japonica <SEP>
<tb> Laminaria <SEP> hyperborea
<tb> Laminaria <SEP> digitata
<tb> Laminaria <SEP> pallida
<tb> Laminaria <SEP> longicruris
<tb> Lessoniaceae <SEP> Lessonia <SEP> flavicans <SEP>
<tb> Lessonia <SEP> trabeculata
<tb> Lessonia <SEP> nigrescens
<tb> Macrocystis <SEP> pyrifera
<tb> Nereocystis <SEP> sp
<tb> Fucales <SEP> Fucaceae <SEP> Ascophyllum <SEP> nodosum
<tb> Fucus <SEP> serratus
<tb> Fucus <SEP> vesiculosus
<tb> Cystoseiraceae <SEP> Cystoseira <SEP> sp
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<tb> Sargassum <SEP> ilicifolium
<tb> Sargassum <SEP> myriocystum
<tb> Turbinaria <SEP> conoides
<tb> Turbinaria <SEP> ornata
<tb> Turbinaria <SEP> decurrens
<Tb>
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Les principaux alginates commercialisés le sont sous forme de sels de sodium. Ils sont répartis entre alginates gélifiants et épaississants en fonction de leur structure chimique. La production mondiale annuelle s'élève à plus de 30 000 tonnes extraites à partir de 100 000 tonnes d'algues brunes (équivalent sec). Pour chaque type d'alginate, différents grades sont disponibles en fonction de leur viscosité. The main marketed alginates are in the form of sodium salts. They are divided between gelling alginates and thickeners according to their chemical structure. The annual world production amounts to more than 30,000 tons extracted from 100,000 tons of brown algae (dry equivalent). For each type of alginate, different grades are available depending on their viscosity.
Parallèlement aux alginates de sodium sont commercialisés des alginates de potassium, de magnésium, d'ammonium, de calcium, de sodium/ triéthanolamine, de propylène glycol et de l'acide alginique. Parallel to the sodium alginates are marketed alginates of potassium, magnesium, ammonium, calcium, sodium / triethanolamine, propylene glycol and alginic acid.
Ils sont utilisés principalement dans l'industrie agro-alimentaire pour leurs propriétés épaississantes, gélifiantes et stabilisantes mais également dans les secteurs de la pharmacie, de la cosmétique et du textile. They are used mainly in the food industry for their thickening, gelling and stabilizing properties but also in the pharmacy, cosmetics and textile sectors.
Le terme "alginates" est un terme générique désignant toute une famille de polysaccharides linéaires constitués d'unités d'acide a-L-guluronique (G) et d'acide P-D-mannuronique (M) liés en 1#4. Ces unités sont organisées le long de la macromolécule en zones homopolymériques des acides a-L-guluronique (G) et p-D-mannuronique (M) et en zone alternée de ces deux acides, comme le montre l'enchaînement suivant : ...MMMMMMMGGGGGGGGGMGMGMGMMGGMMMGMMMMGMG... The term "alginates" is a generic term for an entire family of linear polysaccharides consisting of α-L-guluronic acid (G) and P-D-mannuronic acid (M) units bound in 1 # 4. These units are organized along the macromolecule in homopolymeric zones of α-Guluronic acid (G) and pD-mannuronic acid (M) and in alternating zone of these two acids, as shown by the following sequence: MMMMMMMGGGGGGGGGMGMGMGMMGGMMMGMMMMGMG .. .
Chaque alginate est caractérisé non seulement par une proportion d'acide a-L-guluronique (G) et d'acide p-D-mannuronique (M) communément appelé le ratio M/G mais encore par la longueur des blocs homopolymériques et par la répartition de ces blocs le long de la macromolécule. Each alginate is characterized not only by a proportion of alpha-guluronic acid (G) and pD-mannuronic acid (M), commonly called the M / G ratio, but also by the length of the homopolymeric blocks and by the distribution of these blocks. along the macromolecule.
Cette structure est fonction de l'espèce, de l'âge de l'algue, du tissu considéré, de la période de récolte. Elle conditionne directement les propriétés de la macromolécule : gélification par le calcium, réaction avec les ions divalents ou multivalents, sensibilité à l'hydrolyse acide ou à la dépolymérisation enzymatique, volume hydrodynamique, propriétés biologiques. De ce fait, des blocs homopolymériques d'acide a-L-guluronique (G) et d'acide p-D-mannuronique (M) ont été produits à partir d'alginate afin d'exprimer des propriétés spécifiques. This structure is a function of the species, the age of the seaweed, the tissue considered, the period of harvest. It directly conditions the properties of the macromolecule: gelling by calcium, reaction with divalent or multivalent ions, sensitivity to acid hydrolysis or enzymatic depolymerization, hydrodynamic volume, biological properties. As a result, homopolymeric blocks of α-L-guluronic acid (G) and p-D-mannuronic acid (M) were produced from alginate to express specific properties.
La demande internationale WO-A-98/51710 décrit un procédé pour fractionner des alginates commerciaux en deux types de blocs homopolymériques ces fractions sont utilisées pour des applications spécifiques telles que des modulateurs de rhéologie, des stabilisants de systèmes colloïdaux et des stimulants du système immunitaire (blocs M). International application WO-A-98/51710 discloses a process for fractionating commercial alginates into two types of homopolymeric blocks. These fractions are used for specific applications such as rheology modulators, colloidal system stabilizers and immune system stimulants. (M blocks).
Cette technique s'inspire très largement des travaux de Haug et Smidsrod (1966). A. Haug and O. Smidsrod (1966, A study of the constitution of This technique is largely inspired by the work of Haug and Smidsrod (1966). A. Haug and O. Smidsrod (1966, A study of the constitution of
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alginic acid by partial hydrolysis Acta Chem Scand ; 20 183-190) et (A. Haug, B Larsen and O. Smidsrod (1967) Studies of the séquence of uronic acid residues in alginic acid Acta Chem Scand 21, 691-704). alginic acid by partial hydrolysis Acta Chem Scand; 183-190) and (A. Haug, B Larsen and O. Smidsrod (1967) Studies of the sequence of uronic acid residues in alginic acid Acta Chem Scand 21, 691-704).
Le protocole de préparation des blocs décrit les étapes suivantes :
1) l'acide alginique est hydrolysé en milieu hétérogène à 100 C pendant 3 à 5 heures avec pour conséquence la solubilisation des zones alternées et l'insolubilisation des blocs homopolymériques ;
2) les blocs insolubles sont séparés par filtration des zones alternées solubles ;
3) les blocs homopolymériques sont solubilisés par neutralisation jusqu'à un pH de 7 ;
4) les blocs d'acide a-L-guluronique (G) sont précipités spécifiquement en ajustant le pH entre 2. 4 et 2.8 ;
5) les blocs d'acide a-L-guluronique (G) insoluble sont séparés des blocs d'acide p-D-mannuronique (M) soluble par filtration ;
6) les blocs d'acide P-D-mannuronique (M) sont précipités pour faciliter leur récupération en abaissant le pH à 1.3. The block preparation protocol describes the following steps:
1) the alginic acid is hydrolysed in a heterogeneous medium at 100 ° C. for 3 to 5 hours, with consequent solubilization of the alternating zones and insolubilization of the homopolymeric blocks;
2) the insoluble blocks are separated by filtration from the soluble alternating zones;
3) the homopolymeric blocks are solubilized by neutralization to a pH of 7;
4) α-Guluronic acid (G) blocks are specifically precipitated by adjusting the pH between 2.4 and 2.8;
5) the insoluble α-Guluronic acid (G) blocks are separated from the soluble pD-Mannuronic acid (M) blocks by filtration;
6) The PD-mannuronic acid (M) blocks are precipitated to facilitate their recovery by lowering the pH to 1.3.
Le procédé mis en #uvre limite les dilutions importantes nécessaires pour la précipitation des blocs d'acide a-L-guluronique (G) en solubilisant directement les blocs d'acide p-D-mannuronique (M) après l'étape d'hydrolyse en ajustant le pH entre 2. 8 et 4. A ces pH, les blocs d'acide a-L-guluronique (G) demeurent insolubles et sont séparés des blocs d'acide p-D-mannuronique (M) solubles par séparation solide/liquide. The process employed limits the large dilutions necessary for the precipitation of the α-Guluronic acid (G) blocks by directly solubilizing the pD-mannuronic acid (M) blocks after the hydrolysis step by adjusting the pH. between 2. 8 and 4. At these pHs, the α-Guluronic acid (G) blocks remain insoluble and are separated from the soluble pD-Mannuronic acid (M) blocks by solid / liquid separation.
Les documents EP-A-0 987 272 et EP-A-1 035 136 proposent un autre procédé de fabrication. Ils se sont concentrés sur la production de bloc a-Lguluronique (G) de degré de polymérisation inférieur à 20 présentant : - des propriétés chélatantes du calcium pour des applications dans le traitement des effluents et la détergence ; - des propriétés de stabilisation de système colloïdaux pour des applications dans la stabilisation des encres d'imprimerie ; - des propriétés biologiques vis à vis des plantes (amélioration de la croissance racinaire). EP-A-0 987 272 and EP-A-1 035 136 provide another method of manufacture. They focused on the production of alpha-L-glucuronic block (G) with a degree of polymerization of less than 20 having: - chelating properties of calcium for applications in the treatment of effluents and detergency; colloidal system stabilizing properties for applications in the stabilization of printing inks; - biological properties with regard to plants (improvement of root growth).
Les procédés décrits dans ces documents diffèrent de celui cité plus haut par le choix d'une première étape d'hydrolyse homogène à un pH proche de la neutralité. Les blocs d'acide a-L-guluronique (G) sont précipités à un pH plus acide compris entre 3 et 3. 6. Les blocs d'acide a-L-guluronique (G) sont séparés des The processes described in these documents differ from the one mentioned above by the choice of a first step of homogeneous hydrolysis at a pH close to neutrality. The α-L-guluronic acid blocks (G) are precipitated at a more acidic pH of between 3 and 3. 6. The α-L-guluronic acid blocks (G) are separated from the
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zones alternées et des blocs d'acide p-D-mannuronique (M) par séparation solide/ liquide. De plus, le procédé décrit dans le EP-A-1 035 136 intercale une étape d'oxydation pour augmenter le caractère chélatant des blocs d'acide a-Lguluronique (G) en augmentant le nombre des fonctions carboxyliques. alternating zones and blocks of p-D-mannuronic acid (M) by solid / liquid separation. In addition, the process described in EP-A-1,035,136 intercalates an oxidation step to increase the chelating character of the α-L-glucuronic acid blocks (G) by increasing the number of carboxylic functions.
Or, de nombreuses publications et brevets décrivent les propriétés de mélange d'oligo-alginates saturés et insaturés, de degré de polymérisation inférieur ou égal à 20. However, many publications and patents describe the mixture properties of saturated and unsaturated oligo-alginates, with a degree of polymerization less than or equal to 20.
Les travaux de Yonemoto (YONEMOTO Y., TANAKA H., YAMASHITA T., KITABATAKE N., ISHIDA Y., KIMURA A.. et MURATA K., 1993a. Promotion of germination and shoot elongation of some plants by alginate oligomers prepared with bacterial alginate lyase. Journal of fermentation and bioengineering, 75(1) : 68-70. ) démontrent l'effet éliciteur d'oligo-alginates insaturés de degré de polymérisation moyen de 9. 5 obtenu par dépolymérisation enzymatique d'un alginate extrait d'Eisenia bicyclis. Le mélange obtenu accroît l'élongation de la tige de Brassica rapa, de riz et de calles de tabac. The work of Yonemoto (YONEMOTO Y., TANAKA H., YAMASHITA T., KITABATAKE N., ISHIDA Y., KIMURA A .. and MURATA K., 1993a.Promotion of germination and shoot elongation of some plants by alginate oligomers prepared with bacterial alginate lyase, Journal of fermentation and bioengineering, 75 (1): 68-70.) demonstrate the elicitor effect of unsaturated oligo-alginates with an average degree of polymerization of 9.5 obtained by enzymatic depolymerization of an alginate extracted from Eisenia bicyclis. The resulting mixture increases the elongation of the Brassica rapa stem, rice and tobacco calluses.
Plus spécifiquement, Natsume (NATSUME M, KAMO Y, HIRAYAMA M et ADACHI T., 1994. Isolation and characterization of alginatederivated oligosaccharides with root growth-promoting activities. Carbohydrate Research, 258:187-197.) démontre que des trimères insaturés de structure homogène des sels de sodium des acides a-L-guluronique (AGG) ou ss-Dmannuronique (M) (AMM) stimulent la croissance des racines d'orge. Les trimères ont été isolés par chromatographie à partir de blocs homopolymériques de degré de polymérisation de 10 dépolymérisés par voie enzymatique. More specifically, Natsume (NATSUME M, KAMO Y, HIRAYAMA M and ADACHI T., 1994. Isolation and Characterization of Alginatederivated Oligosaccharides with Root Growth-promoting Activities, Carbohydrate Research, 258: 187-197.) Demonstrates that unsaturated trimers of structure homogeneous sodium salts of α-Guluronic acid (AGG) or ss-Dmannuronic acid (M) (MA) stimulate barley root growth. The trimers were isolated by chromatography from homopolymeric blocks of degree of polymerization of enzymatically depolymerized.
Dans le secteur de la nutrition, Akiyama (AKIYAMA H., ENDO T., NAKAKITA R., MURATA K., YONEMOTO Y. et OKAYOMA K., 1992. Effect of depolymerized alginates on the growth of bifidobacteria. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 56 (2) : 355-356) a montré un effet positif d'oligoalginates insaturés sur la croissance de bifidobactéries . In the field of nutrition, Akiyama (AKIYAMA H., ENDO T., NAKAKITA R., MURATA K., YONEMOTO Y. and OKAYOMA K., 1992. Effect of depolymerized alginates on the growth of bifidobacteria.Bioscience, biotechnology, and Biochemistry, 56 (2): 355-356) showed a positive effect of unsaturated oligoalginates on the growth of bifidobacteria.
Les oligo-alginates produits servent d'intermédiaire de synthèse de nouvelles molécules. The oligo-alginates produced serve as an intermediate for the synthesis of new molecules.
Le brevet américain US-A-5 646 130 décrit des blocs riches en unité mannuronate de degré de polymérisation d'environ 20, estérifiés par du propanol, du 2-propanol et du méthanol. Les molécules synthétisées sont utilisées pour prévenir des thromboses. US-A-5,646,130 discloses mannuronate unit-rich blocks having a degree of polymerization of about 20, esterified with propanol, 2-propanol and methanol. The synthesized molecules are used to prevent thromboses.
Les oligo-mannuronates pourraient également servir de synthons pour la synthèse d'alkyl mannuronate d'alkyl et d'acide alkyl mannuronique Oligo-mannuronates could also serve as synthons for the synthesis of alkyl mannuronate alkyl and alkyl mannuronic acid
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utilisés pour leurs propriétés amphiphiles : pouvoir moussant, émulsionnant, dispersant, capacité à former des aggrégats supramoléculaires dans des milieux dilués, des cristaux liquides... used for their amphiphilic properties: foaming, emulsifying, dispersing ability, ability to form supramolecular aggregates in diluted media, liquid crystals, etc.
Les techniques décrites précédemment montrent l'intérêt des applications des oligo-alginates, saturés ou insaturés. Ils sont principalement produits à partir d'alginate par des voies acide et/ou enzymatique. Ils aboutissent à des mélanges complexes d'oligo-alginates alternés et homogènes. Des blocs homopolymériques de très faible degré de polymérisation (Degré de polymérisation de 10) ont également servi de matière première pour la production d'oligo-alginate homogène et insaturé. Toutefois le fait de devoir dépolymériser des blocs produits à partir d'alginate dont le coût est élevé limite leur développement industriel. Pour de nombreuses applications, il est en effet essentiel de mettre en #uvre des structures homogènes produites par des procédés simples. The techniques described above show the interest of the applications of oligo-alginates, saturated or unsaturated. They are mainly produced from alginate by acid and / or enzymatic routes. They result in complex mixtures of alternating and homogeneous oligo-alginates. Homopolymeric blocks of very low degree of polymerization (degree of polymerization of 10) were also used as raw material for the production of homogeneous and unsaturated oligo-alginate. However, the fact of having to depolymerize blocks produced from alginate whose cost is high limits their industrial development. For many applications, it is essential to implement homogeneous structures produced by simple processes.
La présente invention a pour but de pallier à ces inconvénients en proposant des procédés simples d'obtention d'oligo-mannuronates et d'oligoguluronates, qui permettent de se dispenser de l'achat coûteux d'alginates et d'obtenir des produits finaux de structure homogène (et non pas des mélanges de produits divers), ces oligo-mannuronates et oligo-guluronates présentant avantageusement des degrés de polymérisation relativement bas qui leur ouvrent des applications diverses et variées. The present invention aims to overcome these disadvantages by providing simple methods for obtaining oligo-mannuronates and oligoguluronates, which make it possible to dispense with the expensive purchase of alginates and to obtain end products of homogeneous structure (and not mixtures of various products), these oligo-mannuronates and oligo-guluronates advantageously having relatively low degrees of polymerization which open to them various and varied applications.
Par les termes "oligo-mannuronates" et "oligo-guluronates", on entend des sels obtenus à partir de blocs d'acide a-L-guluronique et ss-Dmannuronique au moins partiellement dépolymérisés. Cette définition est valable pour l'ensemble de la présente demande. By the terms "oligo-mannuronates" and "oligo-guluronates" are meant salts obtained from at least partially depolymerized α-L-guluronic acid and ss-Dmannuronic acid blocks. This definition is valid for the entire application.
Ainsi, le procédé d'obtention d'oligo-mannuronates selon l'invention consiste essentiellement à mettre en oeuvre les étapes suivantes : a) disperser en milieu acide et à chaud des algues brunes, à un pH inférieur ou égal à 2 ; b) séparer, notamment par filtration, la fraction insoluble de la fraction soluble issues de l'étape a), cette fraction insoluble contenant notamment la cellulose algale des algues, et les blocs a-L-guluronique (G) et P-D-mannuronique (M); c) ajuster le pH de ladite fraction insoluble à environ 2,8 par ajout d'une base ; Thus, the process for obtaining oligo-mannuronates according to the invention consists essentially of carrying out the following steps: a) dispersing, in an acid medium and at a temperature, brown algae, at a pH of less than or equal to 2; b) separating, in particular by filtration, the insoluble fraction of the soluble fraction resulting from step a), this insoluble fraction containing in particular the algal cellulose of the algae, and the α-guluronic (G) and PD-mannuronic (M) blocks; ; c) adjusting the pH of said insoluble fraction to about 2.8 by adding a base;
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d) séparer, notamment par filtration, la fraction insoluble de la fraction soluble issues de l'étape c), la fraction soluble contenant des blocs d'acide p-D-mannuronique (M) ; e) soumettre ladite fraction soluble récupérée à l'étape d) à une dépolymérisation par voie acide, ou par voie enzymatique ou par voie mixte acide/enzymatique, de manière à recueillir des oligo-mannuronates saturés et/ou insaturés. d) separating, in particular by filtration, the insoluble fraction of the soluble fraction from step c), the soluble fraction containing p-D-mannuronic acid blocks (M); e) subjecting said soluble fraction recovered in step d) to an acidic, enzymatic or mixed acid / enzymatic depolymerization, so as to collect saturated and / or unsaturated oligo-mannuronates.
Quant au procédé d'obtention d'oligo-guluronates selon l'invention, celui-ci consiste à mettre en #uvre les étapes suivantes : a) disperser en milieu acide et à chaud des algues brunes, à un pH inférieur ou égal à 2 ; b) séparer, notamment par filtration, la fraction insoluble de la fraction soluble issues de l'étape a), cette fraction insoluble contenant notamment la cellulose algale des algues, et les blocs a-L-guluronique (G) et (3-D-mannuronique (M); c) ajuster le pH de ladite fraction insoluble à environ 2,8 par ajout d'une base ; d) séparer, notamment par filtration, la fraction insoluble de la fraction soluble issues de l'étape c), la fraction insoluble notamment de la cellulose algale et les blocs a-L-guluroniques ; e') ajuster le pH de la fraction insoluble issue de d) à environ 4, par ajout d'une base ; f) séparer notamment par filtration, la fraction insoluble de la fraction soluble issue de l'étape e') la fraction soluble contenant des blocs d'acide aL-guluronique (G) ; g') soumettre la fraction soluble récupérée à l'étape f) à une dépolymérisation par voie acide, ou par voie enzymatique ou par voie mixte acide/enzymatique, de manière à recueillir des oligo-guluronates saturés et/ou insaturés. As for the process for obtaining oligo-guluronates according to the invention, it consists in carrying out the following steps: a) dispersing in an acid and hot medium brown algae, at a pH of less than or equal to 2 ; b) separating, in particular by filtration, the insoluble fraction of the soluble fraction resulting from step a), this insoluble fraction containing in particular the algal cellulose of the algae, and the alpha-guluronic (G) and (3-D-mannuronic) blocks; (M) c) adjusting the pH of said insoluble fraction to about 2.8 by adding a base; d) separating, in particular by filtration, the insoluble fraction of the soluble fraction resulting from stage c), the insoluble fraction, in particular of the algal cellulose and the α-L-guluronic blocks; e ') adjusting the pH of the insoluble fraction from d) to about 4, by adding a base; f) separating, in particular by filtration, the insoluble fraction of the soluble fraction resulting from step e ') the soluble fraction containing alpha-guluronic acid blocks (G); g ') subjecting the soluble fraction recovered in step f) to an acid depolymerization, or enzymatically or by mixed acid / enzymatic manner, so as to collect saturated and / or unsaturated oligogururates.
Finalement, le présent demandeur s'est rendu compte qu'il était possible d'obtenir de telles fractions d'alginate directement à partir d'algues brutes, en procédant dans une première étape à une hydrolyse acide particulièrement drastique, apte notamment à échanger les cations liés aux alginates par des protons, à hydrolyser les structures alternées de l'alginate et à solubiliser la majorité des molécules algales (mannitol, fucanes, protéines, peptides, acide aminés). Finally, the present applicant realized that it was possible to obtain such alginate fractions directly from raw algae, by proceeding in a first stage to a particularly drastic acid hydrolysis, able in particular to exchange the alginate-related cations with protons, hydrolysis of alternating structures of alginate and solubilizing the majority of algal molecules (mannitol, fucans, proteins, peptides, amino acids).
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On peut alors récupérer la phase insoluble contenant les blocs d'acide a-L-guluronique (G) et d'acide P-D-mannuronique (M) pour les traiter sélectivement dans des étapes ultérieures. The insoluble phase containing the α-L-guluronic acid (G) and P-D-mannuronic acid (M) blocks can then be recovered for selectively treating them in subsequent steps.
Selon d'autres caractéristiques avantageuses mais non limitatives de ces procédés : - à l'étape a) on disperse des algues brunes fraîches ou déshydratées ; - à l'étape a), on utilise une teneur en algue (en équivalent sec par rapport au poids total) d'environ 5 % ; - on utilise un acide minéral fort tel que l'acide sulfurique ; - la réaction est poursuivie environ 2 heures à 95 C ; -à l'étape b, on utilise une terre filtrante qui est conservée dans les fractions insolubles subséquentes ; - à l'étape c) et/ou à l'étape c'), on utilise de l'hydroxyde de sodium ; - lorsque l'on dépolymérise la phase soluble par voie acide, on chauffe celle-ci à environ 95 C et que l'on récupère des oligo-mannuronate saturés, respectivement des oligo-guluronates saturés après neutralisation ; - lorsque l'on dépolymérise la phase soluble par voie enzymatique, on utilise une alginate lyase obtenue par la mise en culture de la souche bactérienne de Pseudomonas alginovora déposée le 6 mars 1998 auprès de la CNCM sous le numéro d'enregistrement 1.1989. According to other advantageous but non-limiting characteristics of these processes: in step a), fresh or dehydrated brown algae are dispersed; in step a), an alga content (in dry equivalent relative to the total weight) of about 5% is used; a strong mineral acid such as sulfuric acid is used; the reaction is continued for approximately 2 hours at 95 ° C .; in step b, a filtering earth is used which is preserved in the subsequent insoluble fractions; in step c) and / or in step c '), sodium hydroxide is used; when the acid-soluble phase is depolymerized, it is heated to about 95 ° C. and saturated oligo-mannuronate or saturated oligo-guluronates are recovered after neutralization; when the soluble phase is depolymerized enzymatically, an alginate lyase obtained by culturing the bacterial strain of Pseudomonas alginovora deposited on March 6, 1998 with the CNCM under the registration number 1.1989 is used.
Enfin, la présente invention se rapporte également aux utilisations de ces oligo-mannuronates à titre d'agents éliciteurs de végétaux, de prébiotiques ou d'agents immunologiques, et de ces oligo-guluronates à titre de prébiotiques, d'agents immunologiques ou d'agents de chélation. Finally, the present invention also relates to the uses of these oligo-mannuronates as eliciting agents of plants, prebiotics or immunological agents, and of these oligoguluronates as prebiotics, immunological agents or chelating agents.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui va suivre :
La première étape a) des procédés consiste à disperser en milieu acide à chaud les algues sous forme fraîche ou déshydratée. L'objectif de cette étape est triple. Elle permet d'échanger les cations liés aux alginates par des protons, d'hydrolyser les structures alternées de l'alginate et de solubiliser la majorité des molécules algales : mannitol,fucanes, protéines, peptides, acides aminés. La teneur en algue (équivalent sec) est de l'ordre 5 %. Le pH est inférieur à 2 obtenu en acidifiant le milieu avec un acide, notamment un acide minéral fort tel que l'acide sulfurique. La teneur finale en acide sulfurique est de 1. 5 %. Le traitement acide dure 2 heures à 95 C. Other features and advantages of the invention will appear on reading the following detailed description:
The first step a) of the processes consists of dispersing the algae in fresh or dehydrated form in hot acid medium. The goal of this step is threefold. It makes it possible to exchange the alginate-related cations with protons, to hydrolyze the alternating structures of the alginate and to solubilize the majority of the algal molecules: mannitol, fucans, proteins, peptides, amino acids. The seaweed content (dry equivalent) is of the order of 5%. The pH is less than 2 obtained by acidifying the medium with an acid, especially a strong mineral acid such as sulfuric acid. The final sulfuric acid content is 1.5%. The acid treatment lasts 2 hours at 95 C.
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L'étape b) consiste à séparer la fraction insoluble contenant la cellulose algale, les blocs d'acides a-L-guluronique (G) et p-D-mannuronique (M) insolubles de la fraction soluble contenant les oligo-alginates de structure alternée, des cations et des molécules organiques comme les fucanes, les laminaranes, les protéines, peptides et acides aminés, le mannitol. Afin de faciliter la séparation solide/liquide on peut procéder par filtration, notamment avec de la terre filtrante ajoutée à la suspension. Step b) consists in separating the insoluble fraction containing the algal cellulose, the insoluble α-Guluronic acid (G) and pD-mannuronic acid (M) blocks of the soluble fraction containing the alternating structure oligo-alginates, cations. and organic molecules such as fucans, laminarans, proteins, peptides and amino acids, mannitol. In order to facilitate the solid / liquid separation, it is possible to proceed by filtration, especially with filtering earth added to the suspension.
L'étape c) consiste à ajuster le pH à environ 2. 8 afin de solubiliser spécifiquement les blocs mannuronates. Step c) is to adjust the pH to about 2.8 to specifically solubilize the mannuronate blocks.
L'étape d) consiste à séparer la fraction insoluble contenant la cellulose, les blocs d'acides a-L-guluronique (G) et la terre filtrante, de la fraction soluble contenant les blocs d'acide p-D-mannuronique (M). Step d) consists in separating the insoluble fraction containing the cellulose, the α-L-guluronic acid blocks (G) and the filtering earth from the soluble fraction containing the p-D-mannuronic acid blocks (M).
L'étape e) consiste à dépolymériser spécifiquement les blocs d'acide p-D-mannuronique (M) par voie acide, par voie enzymatique ou par voie mixte acide et enzymatique. Step e) consists of specifically depolymerizing the p-D-mannuronic acid blocks (M) acidically, enzymatically or by the mixed acid and enzymatic route.
L'hydrolyse acide en phase homogène peut se faire au pH initial de 2. 8, la solution de blocs est chauffée à 95 C. La durée du chauffage va conditionner la composition du mélange en terme de répartition des tailles des oligo-alginates produits. L'hydrolyse peut être réalisée à un pH supérieur à 2. 8 ou à une température inférieure à 95 C afin de mieux contrôler la cinétique d'hydrolyse. The acid hydrolysis in the homogeneous phase can be done at the initial pH of 2.8, the block solution is heated to 95 C. The duration of the heating will determine the composition of the mixture in terms of size distribution of the oligo-alginates produced. The hydrolysis may be carried out at a pH greater than 2.8 or at a temperature below 95 ° C to better control the kinetics of hydrolysis.
L'hydrolyse ultime conduit à l'acide p-D-mannuronique (M) et/ou à sa forme lactone. The ultimate hydrolysis leads to p-D-mannuronic acid (M) and / or its lactone form.
La dépolymérisation enzymatique se fait à un pH de 7. 5 à 22 C, par exemple en présence d'une alginate lyase produite par la souche de Pseudomonas alginovora (décrite dans le WO-A-98/40 511). Le taux d'enzyme va conditionner le degré de polymérisation moyen du mélange final. Le mélange ultime présente un degré de polymérisation moyen compris entre 3 et 4. On peut toutefois utiliser une autre lyase, sous réserve qu'il s'agisse d'une mannuronate-lyase. The enzymatic depolymerization is at a pH of 7.5 to 22 C, for example in the presence of an alginate lyase produced by the Pseudomonas alginovora strain (described in WO-A-98/40511). The level of enzyme will condition the average degree of polymerization of the final mixture. The ultimate mixture has an average degree of polymerization of between 3 and 4. However, another lyase can be used, provided that it is a mannuronate lyase.
La combinaison de ces deux voies de dépolymérisation conduit à des mélanges saturés et insaturés. L'ordre de mise en #uvre des deux étapes aura une influence sur la proportion des unités saturées et insaturées. The combination of these two depolymerization pathways leads to saturated and unsaturated mixtures. The order of implementation of the two steps will have an influence on the proportion of saturated and unsaturated units.
L'étape e') consiste à solubiliser les blocs d'acide a-L-guluronique (G) à un pH de 4. L'ajustement de pH se fait par exemple à l'aide d'hydroxyde de sodium. Step e ') consists in solubilizing the α-L-guluronic acid blocks (G) at a pH of 4. The pH adjustment is done for example using sodium hydroxide.
L'étape f) consiste à séparer la cellulose et la terre filtrante insoluble de la solution d'acide a-L-guluronique (G). Step f) consists in separating the cellulose and the insoluble filtering earth from the solution of α-L-guluronic acid (G).
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L'étape g') consiste à dépolymériser les blocs d'acide a-Lguluronique (G) par voie acide, par voie enzymatique ou par voie mixte acide et enzymatique. Step g ') consists in depolymerizing the α-Lululuronic acid (G) blocks by the acid route, the enzymatic route or the acidic and enzymatic mixed route.
L'hydrolyse acide en phase homogène peut se faire au pH initial de 4, la solution de blocs est chauffée à 95 C. La durée du chauffage va conditionner la composition du mélange en terme de répartition des tailles des oligo-alginates produits. Afin de produire des oligo-guluronates saturés de degré de polymérisation moyen le plus bas possible, l'hydrolyse acide se fait par étape successive en ajustant le pH de plus en plus bas. Après l'étape d'hydrolyse à pH 4, une deuxième étape à pH 3 permet de mieux hydrolyser les blocs guluronates. The acid hydrolysis in homogeneous phase can be done at the initial pH of 4, the block solution is heated to 95 C. The duration of the heating will condition the composition of the mixture in terms of size distribution of the oligo-alginates produced. In order to produce saturated oligo-guluronates with the lowest possible average degree of polymerization, the acid hydrolysis is carried out in successive stages by adjusting the pH to a lower and lower level. After the hydrolysis step at pH 4, a second step at pH 3 makes it possible to better hydrolyze the guluronate blocks.
La dépolymérisation enzymatique se fait à un pH de 7. 5 à 22 C en présence de l'alginate citée à la page précédente. Ici également, le taux d'enzyme va conditionner le degré de polymérisation moyen du mélange final. Le mélange ultime présente un degré de polymérisation compris entre 3 et 4. The enzymatic depolymerization is carried out at a pH of 7.5 at 22 ° C. in the presence of the alginate mentioned on the previous page. Here too, the level of enzyme will condition the average degree of polymerization of the final mixture. The ultimate mixture has a degree of polymerization of between 3 and 4.
La combinaison de ces deux voies de dépolymérisation conduit à des mélanges saturés et insaturés. L'ordre de mise en #uvre des deux étapes aura une influence sur la proportion des unités saturées et insaturées. The combination of these two depolymerization pathways leads to saturated and unsaturated mixtures. The order of implementation of the two steps will have an influence on the proportion of saturated and unsaturated units.
Finalement, les procédés décrits ont permis de fractionner la matière algale en produits spécifiques comme les oligo-mannuronates saturés et/ou insaturés, les oligo-guluronates saturés et/ou insaturés et en produits constitués des fractions solubles de l'algue en présence des oligo-alginates de structure alternée qui peuvent être également dépolymérisable par voie acide, par voie enzymatique ou par voie mixte, acide et enzymatique. Le co-produit du procédé est constitué de la cellulose algale, des lipides et de la terre filtrante. Finally, the processes described made it possible to split the algal material into specific products such as saturated and / or unsaturated oligo-mannuronates, saturated and / or unsaturated oligo-guluronates and products consisting of soluble fractions of the alga in the presence of oligo. alginates of alternating structure which may also be depolymerizable by the acidic route, enzymatically or by mixed route, acidic and enzymatic. The coproduct of the process consists of algal cellulose, lipids and filter soil.
Ces procédés peuvent être représentés de la manière apparaissant sur les figures annexées dans lesquelles la figure 1 est un diagramme relatif à la production d'oligo-mannuronates, tandis que la figure 2 est un diagramme relatif à la production d'oligo-guluronates. These processes can be represented in the manner appearing in the accompanying figures in which Figure 1 is a diagram relating to the production of oligo-mannuronates, while Figure 2 is a diagram relating to the production of oligo-guluronates.
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On décrira ci-après un exemple spécifique de réalisation à partir de farine micronisée de Laminaria digitata. Hereinafter, a specific embodiment will be described using micronized flour of Laminaria digitata.
Etape d'hydrolyse des zones alternées (étape a)
60 g de farine micronisée de Laminaria digitata à 95,2 % de matière sèche sont dispersés dans 1121. 4 g d'une solution d'acide sulfurique à 1. 55 % dans un ballon muni d'un réfrigérant pendant 3 heures sous agitation magnétique (18.58g d'acide sulfurique à 95% sont dilués dans 1102,8 g d'eau ultra-pure). Hydrolysis step of the alternating zones (step a)
60 g of micronized flour of Laminaria digitata with 95.2% dry matter are dispersed in 1121. 4 g of a sulfuric acid solution at 1. 55% in a flask equipped with a refrigerant for 3 hours under magnetic stirring (18.58 g of 95% sulfuric acid are diluted in 1102.8 g of ultrapure water).
Le ballon est chauffé dans un bain d'huile à 96 C pendant 2 heures. The flask is heated in an oil bath at 96 C for 2 hours.
La montée en température pour atteindre 96 C est de 30 minutes. The rise in temperature to reach 96 C is 30 minutes.
La réaction est stoppée par refroidissement du ballon dans de la glace. The reaction is stopped by cooling the flask in ice.
Séparation des blocs homopolymériques insolubles et des oligo-alginates alternés solubles (étape b). Separation of insoluble homopolymeric blocks and soluble alternating oligo-alginates (step b).
17. 90 g de terres filtrantes (Becoghur ref 1200) sont dispersés dans 1193. 5 g de suspension pendant 2 heures sous agitation magnétique (% de terre/suspension = 1.5 %). Le pH de la suspension est de 1.2. 17. 90 g of filtering grounds (Becoghur ref 1200) are dispersed in 1193. 5 g of suspension for 2 hours with magnetic stirring (% of soil / suspension = 1.5%). The pH of the suspension is 1.2.
La suspension est filtrée sur büchner avec un support en porcelaine et un filtre papier. 1029. 3 g de filtrat acide à 5.15% de matière sèche contenant les oligo-alginates alternés sont récupérés ainsi que 173. 7 g de gâteau de filtration. The suspension is filtered on a büchner with a porcelain support and a paper filter. 1029. 3 g of acid filtrate with 5.15% dry matter containing alternating oligo-alginates are recovered as well as 173. 7 g of filter cake.
Solubilisation des blocs homopolymériques d'acide ss- Dmannuronique (en partie sous forme de sel de sodium) (étape c). Solubilization of homopolymeric blocks of ss-Dmannuronic acid (partly in the form of sodium salt) (step c).
Le gâteau de filtration est dispersé dans 1026. 3 g d'eau ultra-pure pendant une heure sous agitation magnétique à température ambiante. Le pH de la suspension initialement de 1. 8 est ajusté à 2. 85 avec 4. 90 g d'hydroxyde de sodium à 30 % et maintenu pendant 1 heure sous agitation magnétique. The filter cake is dispersed in 1026. 3 g of ultrapure water for one hour with magnetic stirring at room temperature. The pH of the slurry initially of 1.8 was adjusted to 2.85 with 4.90 g of 30% sodium hydroxide and held for 1 hour with magnetic stirring.
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Séparation des blocs homopolymériques d'acide a -Lguluronique et des blocs homopolymériques d'acide ss- D-mannuronique (en partie sous forme de sel de sodium) (étape d). Separation of homopolymeric blocks of α-Luculonic acid and homopolymeric blocks of ss-D-mannuronic acid (partly as sodium salt) (step d).
1198. 85 g de suspension sont filtrés sur büchner avec un support en porcelaine et un filtre papier. 1198. 85 g of suspension are filtered on a büchner with a porcelain support and a paper filter.
1045. 7 g de solution contenant les blocs mannuronates sont récupérés. 1045. 7 g of solution containing the mannuronate blocks are recovered.
Le ratio M/G des blocs est de 13 ce qui correspond à une pureté en M de 94 %. The ratio M / G of the blocks is 13 which corresponds to a purity in M of 94%.
L'analyse a été réalisée par RMN du proton. The analysis was carried out by proton NMR.
La matière sèche du filtrat est de 0. 74 %. Le rendement de récupération des blocs est de 13. 5 % par rapport à la masse sèche d'algue. The dry matter of the filtrate is 0. 74%. The recovery yield of the blocks is 13. 5% with respect to the dry mass of seaweed.
La masse de gâteau de filtration est de 147. 82 g. The mass of filter cake is 147. 82 g.
Dépolymérisation enzymatique des blocs de ss-D- mannuronate (étape e)
Le pH de 480. 24 g de solution de blocs d'acide p-D-mannuronique est ajusté à 7. 5 avec 0. 84 g d'hydroxyde de sodium à 30 %. 0. 746 g de lyophilisat enzymatique sont ajoutés à la solution. Le ratio d'enzyme par rapport au bloc est de 5%. Enzymatic depolymerization of ss-D-mannuronate blocks (step e)
The pH of 480. 24 g of pD-mannuronic acid block solution is adjusted to 7. with 0.84 g of 30% sodium hydroxide. 0.746 g of enzyme lyophilizate is added to the solution. The ratio of enzyme to block is 5%.
La température est maintenue à 22 C dans une enceinte thermostatée et la solution agitée mécaniquement pendant 24 h. Le pH est contrôlé et maintenu à 7. 5 si nécessaire. La répartition des différents oligo-mannuronates insaturés est déterminée à partir des résultats obtenus par chromatographie liquide basse pression sur un Bio-Gel P6. L'éluant est une solution de nitrate de sodium à 0.05 moles/1 avec 1 g/1 d'azoture de sodium. Le débit d'élution est de 0.5 ml/mn. La température est de 30 C. La détection se fait par réfractométrie.
<tb>
<tb> <Tb>
<Tb>
Degré <SEP> de
<tb> polymérisation <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> Proportion <SEP> en <SEP> %
<tb> des <SEP> oligo-alginates <SEP> 14. <SEP> 3 <SEP> 43. <SEP> 0 <SEP> 31. <SEP> 3 <SEP> 11.4
<tb> Degree <SEP> of
<tb> polymerization <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> Proportion <SEP> in <SEP>%
<tb><SEP> oligo-alginates <SEP> 14. <SEP> 3 <SEP> 43. <SEP> 0 <SEP> 31. <SEP> 3 <SEP> 11.4
<Tb>
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Hydrolyse acide des blocs d'acide ss-D mannuronique (étape e)
Le pH de 485. 22 g de solution est ajusté à 3 avec 1 g d'hydroxyde de sodium M. Acid hydrolysis of ss-D mannuronic acid blocks (step e)
The pH of 485. 22 g of solution is adjusted to 3 with 1 g of sodium hydroxide M.
La solution est chauffée et agitée dans un ballon muni d'un réfrigérant à l'aide d'un bain d'huile placé sur une plaque chauffante magnétique.. The solution is heated and stirred in a flask equipped with a coolant using an oil bath placed on a magnetic hot plate.
La température de 96 C est atteinte en 30 minutes et la solution maintenue à cette température pendant 8 h à reflux. La solution est refroidie et neutralisée à un pH de 7,5. La répartition des différents oligo-mannuronates saturés est déterminée à partir des résultats obtenus par chromatographie liquide basse pression sur un Bio-Gel P6. L'éluant est une solution de nitrate de sodium à 0.05 moles/1 avec 1 g/1 d'azoture de sodium. Le débit d'élution est de 0. 5 ml/mn. La température est de 30 C. La détection se fait par réfractométrie.
<tb>
<tb> <Tb>
<Tb>
Degré <SEP> de <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> >6
<tb> polymérisation
<tb> Proportion <SEP> en <SEP> % <SEP> des <SEP> 21. <SEP> 4 <SEP> 11. <SEP> 7 <SEP> 10. <SEP> 6 <SEP> 10. <SEP> 7 <SEP> 8.5 <SEP> 7.5 <SEP> 29.6
<tb> oligo-alginates
<tb> Degree <SEP> of <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP>> 6
<tb> polymerization
<tb> Proportion <SEP> in <SEP>% <SEP> of <SEP> 21. <SEP> 4 <SEP> 11. <SEP> 7 <SEP> 10. <SEP> 6 <SEP> 10. <SEP > 7 <SEP> 8.5 <SEP> 7.5 <SEP> 29.6
<tb> oligo-alginates
<Tb>
Solubilisation des blocs homopolymériques d'acide a-L- 2uluronique(en partie sous forme de sel de sodium) (étape e'). Solubilization of homopolymeric blocks of α-L-uluronic acid (partly as sodium salt) (step e ').
147. 82 g de gâteau de filtration sont dispersés dans 452. 18 g d'eau ultra-pure pendant une heure sous agitation magnétique à température ambiante. Le pH de la suspension initialement de 2. 8 est ajusté à 4. 0 avec 26. 3 g d'hydroxyde de sodium à 1 mole/1 et maintenu pendant 1 heure sous agitation magnétique. 147. 82 g of filter cake are dispersed in 452. 18 g of ultrapure water for one hour with magnetic stirring at room temperature. The pH of the slurry initially of 2.8 was adjusted to 4. 0 with 26.3 g of sodium hydroxide at 1 mol / l and held for 1 hour with magnetic stirring.
Séparation des blocs homopolymériques d'acide [alpha]-L- 2uluronique solubles de la fraction insoluble (terre filtrante, cellulose et fraction lipidique) (étape f')
643. 4 g de suspension sont filtrées sur büchner avec un support en porcelaine et un filtre papier. Separation of soluble [alpha] -L-2-ururonic acid homopolymeric blocks from the insoluble fraction (filtering ground, cellulose and lipid fraction) (step f ')
643. 4 g of suspension are filtered on a büchner with a porcelain support and a paper filter.
467. 0 g de solution contenant les blocs guluronates sont récupérés. 467. 0 g of solution containing the guluronate blocks are recovered.
Le ratio M/G des blocs est de 0.1ce qui correspond à une teneur en G des blocs de 91 %. The M / G ratio of the blocks is 0.1ce which corresponds to a G content of the blocks of 91%.
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L'analyse a été réalisée par RMN du proton. The analysis was carried out by proton NMR.
La matière sèche du filtrat est de 1. 25 %. Le rendement de récupération des blocs guluronate est de 10,2 % par rapport à la masse sèche d'algue. Le filtrat est dilué pour obtenir 557. 12 g de solution à une concentration de 1 % de blocs. The dry matter of the filtrate is 1.25%. The recovery yield of guluronate blocks is 10.2% relative to the dry weight of seaweed. The filtrate is diluted to obtain 557. 12 g of solution at a concentration of 1% of blocks.
La masse de gâteau de filtration est de 167. 33 g avec une matière sèche de 17.2 %
Dépolymérisation enzymatique des blocs d'[alpha]-L-guluronate (étape g')
A 213. 02 g de solution de blocs d'acide a-L-guluronique sont ajoutés 0. 801 g de chlorure de magnésium hexahydraté. Le pH est ajusté à 7. 5 avec 1.18 g d'hydroxyde de sodium à 1 mole/1. 0.1065 g de lyophilisat enzymatique sont ajoutés à la solution. Le ratio d'enzyme par rapport au bloc est de 5 %. The mass of filter cake is 167. 33 g with a dry matter of 17.2%
Enzymatic depolymerization of [alpha] -L-guluronate blocks (step g ')
To 213. 02 g of solution of alpha-guluronic acid blocks are added. 801 g of magnesium chloride hexahydrate. The pH is adjusted to 7. with 1.18 g of sodium hydroxide at 1 mol / l. 0.1065 g of enzyme lyophilizate is added to the solution. The ratio of enzyme to block is 5%.
La température est maintenue à 22 C dans une enceinte thermostatée et la solution agitée mécaniquement pendant 24 h. Le pH est contrôlé et maintenu à 7. 5 si nécessaire. La répartition des différents oligo-guluronates insaturés est déterminée à partir des résultats obtenus par chromatographie liquide basse pression sur un Bio-Gel P6. L'éluant est une solution de nitrate de sodium à 0.05 moles/1 avec 1 g/1 d'azoture de sodium. Le débit d'élution est de 0.5 ml/mn. La température est de 30 C. La détection se fait par réfractométrie.
<tb>
<tb> <Tb>
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Degré <SEP> de <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> polymérisation
<tb> Proportion <SEP> en <SEP> % <SEP> des <SEP> 9.7 <SEP> 40.6 <SEP> 34.2 <SEP> 12.7 <SEP> 2.9
<tb> oligo-alginates
<tb> Degree <SEP> of <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> polymerization
<tb> Proportion <SEP> in <SEP>% <SEP> of <SEP> 9.7 <SEP> 40.6 <SEP> 34.2 <SE> 12.7 <SEP> 2.9
<tb> oligo-alginates
<Tb>
Hydrolyse acide des blocs d'acide a-L- guluronique (étape g')
La solution à pH de 4 est chauffée et agitée dans un ballon muni d'un réfrigérant à l'aide d'un bain d'huile placé sur une plaque chauffante magnétique. Acid hydrolysis of the aggluronic acid blocks (step g ')
The pH 4 solution is heated and stirred in a flask equipped with a coolant using an oil bath placed on a magnetic hot plate.
La température de 96 C est atteinte en 30 minutes et la solution maintenue à cette température pendant 8 h à reflux. The temperature of 96 ° C. is reached in 30 minutes and the solution maintained at this temperature for 8 hours under reflux.
Après 8 h à pH 4, la solution est ajustée à pH 3 avec 0. 93 g d'acide chlorhydrique à 30 % et maintenue sous agitation à 96 C pendant 8 h. La solution est refroidie et neutralisée à pH 7. 5 avec 1.54 g d'hydroxyde de sodium à 30 %. After 8 h at pH 4, the solution is adjusted to pH 3 with 0.93 g of 30% hydrochloric acid and stirred at 96 ° C. for 8 h. The solution is cooled and neutralized to pH 7.5 with 1.54 g of 30% sodium hydroxide.
<Desc/Clms Page number 14> <Desc / Clms Page number 14>
La solution est refroidie et neutralisée à un pH de 7,5. La répartition des différents oligo-guluronates saturés est déterminée à partir des résultats obtenus par chromatographie liquide basse pression sur un Bio-Gel P6. The solution is cooled and neutralized to pH 7.5. The distribution of the various saturated oligo-guluronates is determined from the results obtained by low pressure liquid chromatography on a Bio-Gel P6.
L'éluant est une solution de nitrate de sodium à 0.05 moles/1 avec 1 g/1 d'azoture de sodium. Le débit d'élution est de 0.5 ml/mn. La température est de 30 C. La détection se fait par réfractométrie.
<tb>
<tb> <Tb>
<Tb>
Degré <SEP> de <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> >6
<tb> polymérisation
<tb> Proportion <SEP> en <SEP> % <SEP> des <SEP> 17.4 <SEP> 13. <SEP> 0 <SEP> 10. <SEP> 8 <SEP> 7.8 <SEP> 51.0
<tb> oligo-alginates
<tb> Degree <SEP> of <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP>> 6
<tb> polymerization
<tb> Proportion <SEP> in <SEP>% <SEP> of <SEP> 17.4 <SEP> 13. <SEP> 0 <SEP> 10. <SEP> 8 <SEP> 7.8 <SEP> 51.0
<tb> oligo-alginates
<Tb>
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