FR2836828A1 - Maturation of dendritic cells in vitro comprises adding L-alpha-lysophosphatidylcholine to a culture medium containing immature dendritic cells - Google Patents

Maturation of dendritic cells in vitro comprises adding L-alpha-lysophosphatidylcholine to a culture medium containing immature dendritic cells Download PDF

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Abstract

Maturation of dendritic cells in vitro comprising adding L-alpha-lysophosphatidylcholine (I) to a culture medium containing immature dendritic cells, is new. Independent claims are also included for: (1) differentiation of monocytes into mature dendritic cells in vitro by inducing differentiation of monocytes into dendritic cells in a culture medium in the presence of a differentiation factor and adding (I) to the medium; (2) activation of T lymphocytes in vitro by producing mature dendritic cells as above, adding a biological agent to produce mature dendritic cells directed against the agent, and contacting the dendritic cells with T lymphocytes to produce T lymphocytes directed against the agent; (3) culture medium containing (I) and a differentiation factor for differentiating monocytes into dendritic cells; (4) vaccine comprising (I) and a biological agent; (5) use of (I) as an immune system activating agent for producing medicaments for treating or preventing bacterial, viral, fungal, parasite or yeast infections or cancer; (6) use of a L-alpha-lysophosphatidylcholine inhibitor to produce a medicament for preventing inflammation or combating an inflammatory or autoimmune disease, where the inhibitor is either a lipid emulsion comprising triglycerides, phospholipids and glycerol or a PPAR gamma agonist.

Description

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La présente invention concerne l'utilisation de L-a-lysophosphatidylcholine et/ou de composés équivalents de L-a-lysophosphatidylcholine pour la différenciation de monocytes en cellules dendritiques matures in vitro. La présente invention concerne également un procédé pour la différenciation de monocytes en cellules dendritriques matures selon lequel on dispose de monocytes dans un milieu approprié permettant leur différenciation et on additionne audit milieu le L-a-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de L a-lysophosphatidylcholine.  The present invention relates to the use of L-α-lysophosphatidylcholine and / or equivalent compounds of L-α-lysophosphatidylcholine for the differentiation of monocytes into mature dendritic cells in vitro. The present invention also relates to a method for the differentiation of monocytes into mature dendritic cells according to which monocytes are available in a suitable medium which allows their differentiation and to said medium is added La-lysophosphatidylcholine and / or at least one L-equivalent compound. lysophosphatidylcholine.

Les cellules dendritiques sont impliquées dans le développement d'une réponse immune et dans l'initiation d'une réponse lymphocytaire T spécifique par reconnaissance, capture et présentation des antigènes notamment des agents infectieux (Steinman et al. 1997, Immuno. Rev., 156 : 25-37 ; Cella et al. 1997, Curr. Opin.  Dendritic cells are involved in the development of an immune response and in the initiation of a specific T lymphocyte response by recognition, capture and presentation of antigens including infectious agents (Steinman et al., 1997, Immuno Rev., 156). : 25-37, Cella et al 1997, Curr Opin.

Immunol., 9 : 10-16). Si les cellules dendritiques immatures captent et digèrent les antigènes des agents infectieux de façon très efficace, certains signaux, comme les agents bactériens ou les cytokines inflammatoires, peuvent les activer en induisant un processus de maturation, qui est l'étape initiale du déclenchement de la réponse immunitaire adaptative. En effet, au cours de cette activation, les cellules dendritiques acquièrent la capacité à migrer vers les organes lymphoïdes où se trouvent les lymphocytes T et la capacité à transmettre des signaux de co-stimulation indispensables à l'activation des lymphocytes T naïfs. Lors de cette maturation, les cellules dendritiques subissent des modifications fonctionnelles et phénotypiques telles que : a une augmentation de molécules de surface impliquées dans l'activation des lymphocytes T (telles que CD40, CD80, CD83, CD86 et les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe 1 et II), e la production de cytokines proinflammatoires (telles que les interleukines
IL-12, IL-1 (3, TNFa et IL-6) 'la diminution de leur capacité à capter et à digérer l'antigène. Immunol., 9: 10-16). If immature dendritic cells capture and digest the antigens of infectious agents very effectively, some signals, such as bacterial agents or inflammatory cytokines, can activate them by inducing a maturation process, which is the initial step in triggering the disease. adaptive immune response. Indeed, during this activation, the dendritic cells acquire the ability to migrate to the lymphoid organs where T cells are located and the ability to transmit co-stimulatory signals essential for the activation of naive T lymphocytes. During this maturation, the dendritic cells undergo functional and phenotypic modifications such as: an increase in surface molecules involved in the activation of T lymphocytes (such as CD40, CD80, CD83, CD86 and the molecules of the major complex of histocompatibility (MHC) of class 1 and II), e production of proinflammatory cytokines (such as interleukins
IL-12, IL-1 (3, TNF? And IL-6) decreased their ability to capture and digest the antigen.

De part leurs capacités de développement d'une réponse immune et d'initiation d'une réponse lymphocytaire T spécifique, les cellules dendritiques matures présentent un intérêt thérapeutique particulier notamment dans les domaines de vaccination anti-  Because of their ability to develop an immune response and to initiate a specific T lymphocyte response, mature dendritic cells are of particular therapeutic interest, particularly in the areas of anti-tumor immunization.

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infectieuse et anti-tumorale et de l'immunothérapie (Austin. 1998, Curr. Opin.  infectious and anti-tumor and immunotherapy (Austin, 1998, Curr Opin.

Hematol. 5 : 3-15 ; Reise Sousa et al. 1999, Curr. Opin. Immunol. Il : 392-399). Hematol. 5: 3-15; Reise Sousa et al. 1999, Curr. Opin. Immunol. He: 392-399).

In vitro, des cellules dendritiques matures peuvent être obtenues à partir de monocytes en culture. Ces monocytes sont in vivo des cellules circulantes qui, en traversant notamment la paroi vasculaire endothéliale, entrent au contact de facteurs environnementaux influençant leur devenir d'une façon encore méconnue.  In vitro, mature dendritic cells can be obtained from monocytes in culture. These monocytes are in vivo circulating cells which, in particular through the endothelial vascular wall, come into contact with environmental factors influencing their fate in a still unknown way.

Schématiquement, on envisage alors trois possibilités pour ces monocytes :

Figure img00020001

* la sortie des tissus et le retour vers les ganglions lymphatiques, 'la différenciation en macrophages, 'la différenciation en cellules dendritiques immatures. La première étape pour obtenir des cellules dendritiques matures à partir de monocytes en culture, consiste alors à induire la différenciation des monocytes en cellules dendritiques immatures par notamment l'interleukine IL-4 et le facteur GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Stimulating factor). Au bout de 6 jours, 95% des cellules en culture sont des cellules dendritiques immatures. Schematically, we then consider three possibilities for these monocytes:
Figure img00020001

the exit of the tissues and the return to the lymph nodes, the differentiation into macrophages, the differentiation into immature dendritic cells. The first step to obtain mature dendritic cells from monocytes in culture then consists in inducing the differentiation of monocytes into immature dendritic cells, especially interleukin IL-4 and GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Stimulating factor). After 6 days, 95% of the cells in culture are immature dendritic cells.

La deuxième étape consiste ensuite en une activation de la maturation des cellules dendritiques immatures en cellules dendritiques matures par des agents exogènes, tels que des agents bactériens ou viraux. Ainsi, la protéine kpOmpA de Klebsiella pneumoniae est capable d'induire la maturation de ces cellules dendritiques immatures en cellules dendritiques matures (P. Jeannin et al., Nature Immunology, 2000,1 : 502- 509). Toutefois, l'utilisation de molécules exogènes dérivées d'agents infectieux induit des problèmes sécuritaires et financiers, (effets secondaires directs ou indirects in vivo ; nécessité de purification très importante selon des exigences légales ou réglementaires très strictes), rendant l'utilisation de ce type de molécules délicate dans le cadre de la vaccinologie et de l'immunothérapie. The second step then consists in activating the maturation of immature dendritic cells into mature dendritic cells by exogenous agents, such as bacterial or viral agents. Thus, the Klebsiella pneumoniae kpOmpA protein is capable of inducing the maturation of these immature dendritic cells into mature dendritic cells (P. Jeannin et al., Nature Immunology, 2000,1: 502-509). However, the use of exogenous molecules derived from infectious agents induces safety and financial problems, (direct or indirect side effects in vivo, need for very important purification according to very strict legal or regulatory requirements), making use of this type of delicate molecules in the context of vaccinology and immunotherapy.

Plus récemment, il a été décrit par Perrin-Cocon et al en 2001 (The Journal of Immunology, 167 : 3785-3891) que la production de cellules dendritiques matures à partir de monocytes en différenciation peut être induit par des molécules endogènes, telles que certaines lipoprotéines plasmatiques oxydées, et plus particulièrement les lipoprotéines de faible densité (LDL) oxydées. Toutefois, les LDL oxydés sont des More recently, it has been described by Perrin-Cocon et al in 2001 (The Journal of Immunology, 167: 3785-3891) that the production of mature dendritic cells from differentiating monocytes can be induced by endogenous molecules, such as certain oxidized plasma lipoproteins, and more particularly oxidized low density lipoproteins (LDL). However, oxidized LDLs are

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particules complexes, composées de protéines, de triacylglycérols, de phospholopides, de cholestérol libre et estérifié, et sont, de ce fait difficiles à synthétiser artificiellement.  complex particles composed of proteins, triacylglycerols, phospholopids, free and esterified cholesterol, and are therefore difficult to synthesize artificially.

Ainsi, la présente invention se propose de résoudre les inconvénients de l'état de la technique en présentant une molécule endogène, facile à synthétiser et peu coûteuse qui stimule la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures in vitro.  Thus, the present invention proposes to solve the drawbacks of the state of the art by presenting an endogenous, easy to synthesize and inexpensive molecule that stimulates the differentiation of monocytes into mature dendritic cells in vitro.

Une des molécules actives générées durant l'oxydation des LDL est le La-lysophosphatidylcholine, dénommé ci-après LPC. Toutefois, il a été montré que la fixation du LPC sur le récepteur G2A, qui est le récepteur de haute affinité du LPC, inhibe notamment la prolifération et l'activation des lymphocytes T, suggérant plutôt un rôle du LPC dans l'inhibition du déclenchement d'une réaction immunitaire (Carson & Lo, 2001, Science, 293 : 618-619). De plus, il a également été montré que de forte concentration de LPC (50ils) inhibe l'activité du facteur de transcription NF-KB (facteur KB nucléaire), connu pourtant pour être activé lors de la maturation des cellules dendritiques. De plus, le LPC est présent à forte concentration dans le plasma, suggérant qu'il ne serait pas actif dans le plasma, ce qui ne le prédispose pas à être choisi par l'homme du métier pour une utilisation thérapeutique.  One of the active molecules generated during the oxidation of LDL is La-lysophosphatidylcholine, hereinafter referred to as LPC. However, it has been shown that the binding of LPC to the G2A receptor, which is the high affinity LPC receptor, notably inhibits the proliferation and activation of T lymphocytes, suggesting instead a role of LPC in inhibiting the triggering an immune response (Carson & Lo, 2001, Science, 293: 618-619). In addition, it has also been shown that high concentration of LPC (50ils) inhibits the activity of transcription factor NF-KB (nuclear KB factor), known to be activated during the maturation of dendritic cells. In addition, the LPC is present at high concentrations in the plasma, suggesting that it would not be active in the plasma, which does not predispose it to be chosen by those skilled in the art for therapeutic use.

D'une façon surprenante, la présente invention concerne notamment l'utilisation de L-a-lysophosphatidylcholine pour la différenciation de monocytes en cellules dendritiques matures in vitro.  Surprisingly, the present invention relates in particular to the use of L-α-lysophosphatidylcholine for the differentiation of monocytes into mature dendritic cells in vitro.

Avant de continuer plus avant, les définitions suivantes permettront de mieux comprendre la suite de l'exposé de l'invention. Before continuing further, the following definitions will better understand the rest of the discussion of the invention.

Par composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine, on entend une molécule agissant selon les mêmes mécanismes d'action cellulaires que le La-lysophosphatidylcholine, c'est à dire par les mêmes récepteurs membranaires, notamment des récepteurs membranaires à protéines G, tels que les récepteurs G2A, GPR4, récepteur du PAF (platelet activating factor). Ce composé équivalent peut ainsi être notamment un agoniste des récepteurs précédemment cité (tel que notamment le 0methyl-PAF, le carbamyl-PAF), mais également le PAF. By equivalent compound of La-lysophosphatidylcholine is meant a molecule acting according to the same mechanisms of cellular action as La-lysophosphatidylcholine, that is to say by the same membrane receptors, in particular membrane receptors with G proteins, such as the receptors G2A, GPR4, PAF receptor (platelet activating factor). This equivalent compound can thus be in particular a previously mentioned receptor agonist (such as in particular 0methyl-PAF, carbamyl-PAF), but also PAF.

Par agent biologique, on entend une molécule (ou un ensemble de molécules) qui, introduite dans un organisme, doit être la cible d'une réponse immunitaire ou qui By biological agent is meant a molecule (or a set of molecules) which, introduced into an organism, must be the target of an immune response or which

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permet la synthèse de cette cible. Cet agent biologique peut ainsi être choisi parmi les antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons, les antigènes tumoraux, les lysats de cellules tumorales autologues et/ou héterologues. Cet agent biologique peut également être un acide nucléique qui code pour au moins un antigène choisi parmi les antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons, les antigènes tumoraux.  allows the synthesis of this target. This biological agent can thus be chosen from antigens of bacteria, viruses, yeasts, parasites, fungi, tumor antigens, autologous and / or heterologous tumor cell lysates. This biological agent may also be a nucleic acid which encodes at least one antigen selected from antigens of bacteria, viruses, yeasts, parasites, fungi, tumor antigens.

Par antigène tumoral, on entend un antigène issu de cellules tumorales, tel qu'un peptide tumoral, notamment un peptide interagissant avec les molécules de classe I et présenté aux lymphocytes T CD8+. On peut citer à titre non limitatif les antigènes tumoraux suivants : MAGE-2, MAGE-3, MART, MUC-1, MUC-2, HER-2, GD2, carcinoembryonic antigen (CEA), TAG-72, ovarian-associated antigens OV-TL3 et MOV18, TUAN, alpha-feto protein (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, renal tumor-associated antigen G250, EGP-40 (ou EpCAM), SI 00 (malignant meanomaassociated antigen), p53, prostate tumor-associated antigens (e. g., PSA et PSMA) et p21ras. By "tumor antigen" is meant an antigen derived from tumor cells, such as a tumor peptide, especially a peptide interacting with the class I molecules and presented to CD8 + T cells. The following tumor antigens may be mentioned without limitation: MAGE-2, MAGE-3, MART, MUC-1, MUC-2, HER-2, GD2, carcinoembryonic antigen (CEA), TAG-72, ovarian-associated antigens OV-TL3 and MOV18, TUAN, alpha-feto protein (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, renal tumor-associated antigen G250, EGP-40 (or EpCAM), SI 00 ( malignant meanomaassociated antigen), p53, prostate tumor-associated antigens (eg, PSA and PSMA) and p21ras.

Par cellules tumorales autologues, on entend des cellules de tumeurs appartenant au sujet qui reçoit un médicament déterminé. Les cellules tumorales peuvent être obtenues par prélèvement de tissus cancéreux, notamment une biopsie ou résection chirurgicale. By autologous tumor cells is meant tumor cells belonging to the subject receiving a particular drug. The tumor cells can be obtained by taking cancerous tissue, including a biopsy or surgical resection.

Par cellules tumorales hétérologues, on entend des cellules issues de tumeurs provenant d'un sujet différent de celui qui reçoit un médicament déterminé. L'utilisation de cellules hétérologues permet notamment d'obtenir un médicament permettant de traiter des patients atteints de cancer chez qui un prélèvement de cellules tumorales n'est pas possible. Cela permet aussi d'utiliser une source standard d'antigènes tumoraux. By heterologous tumor cells is meant cells derived from tumors from a subject different from that which receives a particular drug. The use of heterologous cells makes it possible in particular to obtain a medicament for treating cancer patients from whom tumor cell collection is not possible. This also allows the use of a standard source of tumor antigens.

Par lysat cellulaire, on entend un mélange d'antigènes intra-cellulaires et/ou membranaires, obtenu par une lyse de cellules selon un protocole connu de l'homme du métier, telle qu'une lyse mécanique, chimique ou enzymatique. By cell lysate is meant a mixture of intra-cellular and / or membrane antigens, obtained by lysis of cells according to a protocol known to those skilled in the art, such as mechanical, chemical or enzymatic lysis.

Par milieu de culture, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à la viabilité des cellules. On peut citer à titre d'exemple le milieu RPMI 1640 et ses dérivés. By culture medium is meant a medium comprising all the elements necessary for the viability of the cells. By way of example, mention may be made of RPMI 1640 medium and its derivatives.

Par agent d'activation, on entend une molécule qui, dans une composition pharmaceutique, induit les effets d'une médication ou renforce ou complète les effets By activating agent is meant a molecule which, in a pharmaceutical composition, induces the effects of a medication or enhances or supplements the effects

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de la médication principale. Dans le cas d'une composition vaccinale, l'agent d'activation est un adjuvant qui est préférentiellement une molécule qui stimule la réponse immunitaire de l'organisme hôte.  of the main medication. In the case of a vaccine composition, the activating agent is an adjuvant which is preferably a molecule that stimulates the immune response of the host organism.

Par inhibiteur de L-a-lysophosphatidylcholine, on entend une molécule (ou un ensemble de molécules) qui bloque l'activité inflammatoire de La-lysophosphatidylcholine, notamment en bloquant la différenciation des cellules dendritiques matures par le L-a-lysophosphatidylcholine. On peut citer à titre indicatif l'Intralipid, le lipoïd Erz De tels inhibiteurs pourraient ainsi in vivo être utilisés pour la fabrication d'un médicament pour diminuer une réponse inflammatoire, notamment articulaire, ou lors d'une greffe notamment.

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By La-lysophosphatidylcholine inhibitor is meant a molecule (or set of molecules) which blocks the inflammatory activity of Lysophosphatidylcholine, in particular by blocking the differentiation of mature dendritic cells by Lysophosphatidylcholine. Intralipid, lipoid Erz, may be mentioned as an indication. In vivo, such inhibitors could thus be used for the manufacture of a medicament for reducing an inflammatory response, in particular an articular response, or during a transplant, in particular.
Figure img00050001

Ainsi, l'invention concerne l'utilisation de L-a-lysophosphatidylcholine et/ou d'au moins un composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine pour la différenciation de monocytes en cellules dendritiques matures in vitro. Le La-lysophosphatidylcholine et/ou le composé équivalent peuvent être notamment sous la forme d'une émulsion lipidique ou sous la forme d'un liposome de synthèse. Thus, the invention relates to the use of L-α-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of L-α-lysophosphatidylcholine for the differentiation of monocytes into mature dendritic cells in vitro. The Lysophosphatidylcholine and / or the equivalent compound may in particular be in the form of a lipid emulsion or in the form of a synthetic liposome.

Selon un mode particulier de l'invention, le composé équivalent est le PAF.

Figure img00050002
According to a particular embodiment of the invention, the equivalent compound is PAF.
Figure img00050002

L'invention concerne également l'utilisation de L-a-lysophosphatidylcholine et/ou d'au moins un composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine pour la fabrication d'un médicament pour le traitement et/ou la prévention d'une infection d'origine bactérienne, virale, fongique, parasitaire ou provoquée par une levure et/ou pour la fabrication d'un médicament pour le traitement et/ou la prévention des cancers. The invention also relates to the use of La-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of La-lysophosphatidylcholine for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of an infection of bacterial origin, viral, fungal, parasitic or caused by yeast and / or for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of cancers.

Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne l'une des utilisations telles que définies précédemment caractérisée en ce qu'elle comprend également au moins un agent biologique. Selon un mode préféré, l'agent biologique est choisi parmi les antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons, les antigènes tumoraux, les lysats de cellules tumorales autologues et/ou héterologues. According to a particular embodiment, the invention relates to one of the uses as defined above characterized in that it also comprises at least one biological agent. According to a preferred embodiment, the biological agent is chosen from antigens of bacteria, viruses, yeasts, parasites, fungi, tumor antigens, autologous tumor cell lysates and / or heterologous.

Selon un autre mode préféré de l'invention, l'agent biologique est un acide nucléique qui code pour au moins un antigène choisi parmi les antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons, les antigènes tumoraux. According to another preferred embodiment of the invention, the biological agent is a nucleic acid which encodes at least one antigen selected from the antigens of bacteria, viruses, yeasts, parasites, fungi and tumor antigens.

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L'invention concerne également un procédé pour la différenciation in vitro de monocytes en cellules dendritriques matures selon lequel on dispose de monocytes dans un milieu de culture permettant leur différenciation et on additionne audit milieu de La-lysophosphatidylcholine et/ou d'au moins un composé équivalent de a-lysophosphatidylcholine. The invention also relates to a method for the in vitro differentiation of monocytes into mature dendritic cells according to which monocytes are available in a culture medium which makes it possible to differentiate them and to add L-lysophosphatidylcholine and / or at least one compound to said medium. equivalent of α-lysophosphatidylcholine.

Selon un mode particulier de l'invention, le composé équivalent est le PAF. According to a particular embodiment of the invention, the equivalent compound is PAF.

Selon un mode préféré de réalisation, le L-a-lysophosphatidylcholine est additionné audit milieu à une concentration finale dans le milieu comprise entre environ 10 et

Figure img00060001

80 ! lM, préférentiellement entre environ 20 et 60 uM et avantageusement entre 30 et 50 u. M. According to a preferred embodiment, La-lysophosphatidylcholine is added to said medium at a final concentration in the medium of between about 10 and
Figure img00060001

80! 1M, preferably between about 20 and 60 μM and advantageously between 30 and 50 μ. Mr.

Selon un autre mode préféré de réalisation, le L-a-lysophosphatidylcholine est ajouté dans ledit milieu entre le 3ème et 6ème jour de différenciation des monocytes, préférentiellement entre le 4ème et le sème jour de différenciation des monocytes. According to another preferred embodiment, the L-α-lysophosphatidylcholine is added to said medium between the 3rd and 6th day of differentiation of the monocytes, preferably between the 4th and the 3rd day of differentiation of the monocytes.

Selon un autre mode préféré de réalisation, on ajoute dans le milieu de culture un agent biologique. According to another preferred embodiment, a biological agent is added to the culture medium.

L'invention concerne également les cellules dendritiques matures susceptibles d'être obtenues selon l'un des procédés tels que définis ci dessus. The invention also relates to mature dendritic cells that can be obtained according to one of the processes as defined above.

L'invention concerne également un milieu de culture pour la différenciation de monocytes en cellules dendritiques matures, caractérisé en ce qu'il comprend du La-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de La-lysophosphatidylcholine. The invention also relates to a culture medium for the differentiation of monocytes into mature dendritic cells, characterized in that it comprises Lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of La-lysophosphatidylcholine.

Selon un mode préféré de réalisation, le L-a-lysophosphatidylcholine est à une concentration finale dans ledit milieu comprise entre environ 10 et 801lM, préférentiellement entre environ 20 et 60 uM et avantageusement entre 30 et 50 uM. According to a preferred embodiment, L-α-lysophosphatidylcholine is at a final concentration in said medium of between approximately 10 and 80 μM, preferably between approximately 20 and 60 μM and advantageously between 30 and 50 μM.

Selon un autre mode préféré de réalisation, le composé équivalent est le PAF. According to another preferred embodiment, the equivalent compound is PAF.

Selon un autre mode de réalisation, le milieu de culture comprend un agent biologique. According to another embodiment, the culture medium comprises a biological agent.

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L'invention concerne également un agent d'activation pour la différenciation de monocytes en cellules dendritiques matures caractérisé en ce qu'il comprend du La-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de La-lysophosphatidylcholine.  The invention also relates to an activating agent for the differentiation of monocytes into mature dendritic cells, characterized in that it comprises La-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of La-lysophosphatidylcholine.

Selon un mode particulier de réalisation, le composé équivalent est le PAF. According to a particular embodiment, the equivalent compound is PAF.

L'invention concerne également l'utilisation de L-a-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine comme agent d'activation pour la fabrication d'un médicament pour le traitement et/ou la prévention d'une infection d'origine bactérienne, virale, fongique, parasitaire ou provoquée par une levure ; pour la fabrication d'un médicament pour le traitement et/ou la prévention des cancers. The invention also relates to the use of La-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of La-lysophosphatidylcholine as an activating agent for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of an infection of bacterial, viral, fungal, parasitic or yeast-induced; for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of cancers.

Selon un mode préféré de l'invention, le composé équivalent est le PAF. According to a preferred embodiment of the invention, the equivalent compound is PAF.

L'invention concerne également le L-a-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine pour utilisation comme médicament. The invention also relates to L-α-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of L-α-lysophosphatidylcholine for use as a medicament.

L'invention concerne également le L-a-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine et au moins un agent biologique pour utilisation comme médicament. The invention also relates to L-α-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of L-α-lysophosphatidylcholine and at least one biological agent for use as a medicament.

L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant de La-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de La-lysophosphatidylcholine. The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising La-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of La-lysophosphatidylcholine.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un inhibiteur de La-lysophosphatidylcholine pour la fabrication d'un médicament pour la prévention d'une inflammation. The invention also relates to the use of at least one Lysophosphatidylcholine inhibitor for the manufacture of a medicament for the prevention of inflammation.

Les exemples qui suivent sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.  The examples which follow are given for explanatory purposes and are in no way limiting. They will help to better understand the invention.

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Figure img00080001
Figure img00080001

Exemple 1-Différenciation de monocytes en culture en cellules dendritiques en présence ou en l'absence de LPC Isolement, mise en culture et initiation de la différenciation des monocytes - Les monocytes sont isolés de sang périphérique humain par une première centrifugation suivant le gradient de densité (400g ; 20 minutes) dans du Ficoll-Hypaque, suivie d'une deuxième centrifugation (400g ; 20 minutes) dans une solution à 50% en Percoll. Les monocytes sont ensuite purifiés par déplétion immunomagnétique (Dynal, Oslo, Norway), en utilisant un cocktail d'anticorps monoclonaux anti CD 19 (hybridome 4G7) (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA), anti-CD3 (OKT3, American Type Culture Collection, Rockeville, MD) et anti-CD56 (NKH1, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Les monocytes ainsi obtenus sont alors purifiés à au moins 90%, comme montré par l'absence des marqueurs CD1a et la présence du marqueur CD14. La différenciation des monocytes en cellules dendritiques est initiée par 40ng/ml de GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor) humain recombiné et 250U/ml d'interleukine IL-4 humain recombiné. Example 1-Differentiation of Monocytes in Culture to Dendritic Cells in the Presence or Absence of LPC Isolation, Culture and Initiation of Monocyte Differentiation - Monocytes are Isolated from Human Peripheral Blood by First Centrifugation According to the Density Gradient (400g, 20min) in Ficoll-Hypaque, followed by a second centrifugation (400g, 20min) in a 50% Percoll solution. The monocytes are then purified by immunomagnetic depletion (Dynal, Oslo, Norway), using a cocktail of monoclonal antibodies against CD19 (hybridoma 4G7) (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA), anti-CD3 (OKT3, American Type Culture Collection, Rockeville, MD) and anti-CD56 (NKH1, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). The monocytes thus obtained are then purified to at least 90%, as shown by the absence of the CD1a markers and the presence of the CD14 marker. The differentiation of monocytes into dendritic cells is initiated by 40 ng / ml of recombinant human Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor (GM-CSF) and 250 μl / ml of recombinant human IL-4 interleukin.

Les monocytes sont mis en culture dans le milieu RPMI 1640 (Life technologies, Rockeville, MD, USA) enrichi par 2mM de glutamine (Life technologies), 10mM d'Hepes (Life Technologies), 40ng/ml de gentamycine (Life technologies) et 10% de sérum de veau foetal dépourvu de lipoprotéines (LPDS, Sigma, St Quentin-Fallavier, France).  The monocytes are cultured in RPMI 1640 medium (Life Technologies, Rockeville, MD, USA) enriched with 2 mM glutamine (Life Technologies), 10 mM Hepes (Life Technologies), 40 ng / ml gentamycin (Life Technologies) and 10% fetal calf serum devoid of lipoproteins (LPDS, Sigma, St Quentin-Fallavier, France).

Notons que le milieu de culture présenté dans cet exemple est un milieu de culture LPDS. Des résultats comparables peuvent être obtenus par l'utilisation d'autres milieux de culture, tel qu'un milieu FCS, c'est à dire un milieu contenant 10% de sérum de veau foetal non dépourvu de lipoprotéines, ou pourraient être obtenus par l'utilisation de tout milieu de culture synthétique connus de l'homme du métier.  Note that the culture medium presented in this example is an LPDS culture medium. Comparable results can be obtained by the use of other culture media, such as FCS medium, ie a medium containing 10% fetal calf serum not free of lipoproteins, or could be obtained by use of any synthetic culture medium known to those skilled in the art.

Traitement des monocytes par le LPC - 5 jours après le début de la différenciation des monocytes sont ajoutés dans le milieu de culture 40 AM de LPC pendant 24 heures (L-a-lysophosphatidylcholine ; Sigma ; St Quentin Fallavier, France). Des cellules contrôles sont également obtenues en l'absence de LPC dans le milieu de culture.  Treatment of monocytes with LPC - 5 days after the start of differentiation of monocytes are added in the 40 AM LPC culture medium for 24 hours (L-α-lysophosphatidylcholine, Sigma, St Quentin Fallavier, France). Control cells are also obtained in the absence of LPC in the culture medium.

On obtient alors des cellules dites"contrôles"et des cellules dites"LPC".  We then obtain cells called "controls" and cells called "LPC".

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Exemple 2-Phénotype des cellules obtenues selon l'exemple 1
Les cellules utilisées dans cette analyse sont celles obtenues au 6ème jours de différenciation selon le protocole décrit dans l'exemple 1. Example 2-Phenotype of the cells obtained according to Example 1
The cells used in this analysis are those obtained at the 6th day of differentiation according to the protocol described in Example 1.

Le phénotype des cellules"contrôle"et"LPC"est analysé par cytométrie de flux sur un FACSCalibur (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA) par l'utilisation de conjugué FITC (isothiocyanate de fluorosceine) anti-CD14, anti-HLADR, anti-CD80 et conjugué PE (phycoerythrine) anti-CDla, anti-CD83, anti-CD86, anti-CD40 (Beckman Coulter). Selon l'état de la technique, les monocytes ont préférentiellement un phénotype CD14+ CD la-, les cellules dendritiques immatures ont

Figure img00090001

préférentiellement un phénotype CD 14-CDla+ CD86-, les cellules dendritiques matures ont préférentiellement un phénotype CD 14-CD la intermédiaire-CD86+. The phenotype of the "control" and "LPC" cells is analyzed by flow cytometry on a FACSCalibur (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA) by the use of conjugate FITC (fluorosceine isothiocyanate) anti-CD14, anti-HLADR , anti-CD80 and PE conjugate (phycoerythrin) anti-CDla, anti-CD83, anti-CD86, anti-CD40 (Beckman Coulter). According to the state of the art, monocytes preferentially have a CD14 + CD la- phenotype, immature dendritic cells have
Figure img00090001

preferentially a CD14-CDla + CD86- phenotype, the mature dendritic cells preferentially have a CD14-CD intermediate-CD86 + phenotype.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1. The results obtained are shown in Table 1.

TABLEAU 1-Expression des marqueurs CD83, HLA-DR et CD86 en absence (contrôle) ou en présence de LPC

Figure img00090002
TABLE 1-Expression of CD83, HLA-DR and CD86 markers in absence (control) or in the presence of LPC
Figure img00090002

<tb>
<tb> CD83 <SEP> HLA-DR <SEP> CD86
<tb> Contrôle <SEP> 5, <SEP> 79 <SEP> 78, <SEP> 76 <SEP> 117, <SEP> 77
<tb> LPC <SEP> 11, <SEP> 74 <SEP> 146,31 <SEP> 759,69
<tb> <Tb>
<tb> CD83 <SEP> HLA-DR <SEP> CD86
<tb> Control <SEP> 5, <SEP> 79 <SEP> 78, <SEP> 76 <SEP> 117, <SEP> 77
<tb> LPC <SEP> 11, <SEP> 74 <SEP> 146.31 <SEP> 759.69
<Tb>

Figure img00090003

Les cellules" LPC" obtenues après l'initiation de la différenciation des monocytes en présence de LPC, présentent un phénotype comparables à celui de cellules dendritiques matures, tel que le démontre notamment l'induction des marqueurs CD86, et l'augmentation de HLA-DR par comparaison au phénotype des cellules" contrôles ".
Figure img00090003

The "LPC" cells obtained after the initiation of the differentiation of monocytes in the presence of LPC, have a phenotype comparable to that of mature dendritic cells, as demonstrated in particular by the induction of CD86 markers, and the increase in HLA- DR compared to the phenotype of "control" cells.

Exemple 3-Capacité d'internalisation des cellules obtenues selon l'exemple 1
Les cellules"contrôle"et"LPC"utilisées dans cette analyse sont celles obtenues après 6 jours de différenciation selon le protocole décrit dans l'exemple 1. Ces cellules sont incubées à 37 C : pendant 30 minutes avec lmg/ml de FITC-T70-Dextran (Sigma) afin d'estimer la capacité d'intemalisation de ces cellules par endocytose Example 3-Internalization capacity of the cells obtained according to Example 1
The "control" and "LPC" cells used in this analysis are those obtained after 6 days of differentiation according to the protocol described in Example 1. These cells are incubated at 37 ° C. for 30 minutes with 1 mg / ml of FITC-T70. -Dextran (Sigma) to estimate the intestinal capacity of these cells by endocytosis

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e pendant 30 minutes avec Img/ml de Lucifer Yellow (ref. L0259, Sigma, St Quentin-Fallavier, France) afin d'estimer la capacité d'intemalisation de ces cellules par pinocytose pendant 3 heures avec carboxylate-modified yellow-green FluoSpheres (nom commercial, 0,45 m, Molecular Probes, Leiden, The Netherlands) afin d'estimer la capacité d'intemalisation de ces cellules par macropinocytose.  e for 30 minutes with Img / ml of Lucifer Yellow (ref L0259, Sigma, St Quentin-Fallavier, France) in order to estimate the capacity of intemalization of these cells by pinocytosis for 3 hours with carboxylate-modified yellow-green FluoSpheres (commercial name, 0.45 m, Molecular Probes, Leiden, The Netherlands) to estimate the ability of intemalization of these cells by macropinocytosis.

L'intemalisation est stoppée sur glace par un tampon PBS froid contenant 0, 1 % de BSA (Bovine serum Albumin, albumine sérique bovine) et 0,05% de NaN3. Les cellules "contrôle"et"LPC"sont lavées 3 fois à 4 C dans ce même tampon et la fluorescence est quantifiée par FACScalibur (nom commercial, Becton Dickinson). The internalization is stopped on ice with a cold PBS buffer containing 0.1% BSA (Bovine serum albumin, bovine serum albumin) and 0.05% NaN3. The "control" and "LPC" cells are washed 3 times at 4 C in the same buffer and the fluorescence is quantified by FACScalibur (trade name, Becton Dickinson).

Comme le montre le tableau 2, les capacités d'intemalisation par endocytose, pinocytose et macropinocytose sont fortement diminuées par l'ajout de LPC dans le milieu de culture au 5ème jour de différenciation des monocytes par rapport aux cellules contrôles différenciées en l'absence de LPC.  As shown in Table 2, the intemalization capacities by endocytosis, pinocytosis and macropinocytosis are greatly reduced by the addition of LPC in the culture medium at the 5th day of differentiation of monocytes compared to the differentiated control cells in the absence of LPC.

TABLEAU 2 - Capacité d'intemalisation par endocytose, pinocytose et macropinocytose des monocytes différenciés en absence (contrôle) ou en présence de
LPC

Figure img00100001
TABLE 2 - Absorption capacity by endocytosis, pinocytosis and macropinocytosis of differentiated monocytes in the absence (control) or in the presence of
LPC
Figure img00100001

<tb>
<tb> Endocytose <SEP> Pinocytose <SEP> Macropinocytose
<tb> Contrôle <SEP> 100% <SEP> 100% <SEP> 100%
<tb> LPC <SEP> 53% <SEP> 49% <SEP> 66%
<tb> <Tb>
<tb> Endocytosis <SEP> Pinocytosis <SEP> Macropinocytosis
<tb> Control <SEP> 100% <SEP> 100% <SEP> 100%
<tb> LPC <SEP> 53% <SEP> 49% <SEP> 66%
<Tb>

La réduction des capacités d'internalisation est une des caractéristiques des cellules dendritiques matures. Ces résultats montrent que en présence de LPC, les monocytes ont une forte tendance à se différencier en cellules dendritique matures. The reduction of internalization capacity is one of the characteristics of mature dendritic cells. These results show that in the presence of LPC, monocytes have a strong tendency to differentiate into mature dendritic cells.

Exemple 4-Capacité des cellules obtenues selon l'exemple 1 à stimuler les lymphocytes T
Les cellules"contrôle"et"LPC"utilisées dans cette analyse sont celles obtenues après 6 jours de différenciation selon le protocole décrit dans l'exemple 1. Example 4-Capacity of the cells obtained according to Example 1 to stimulate T lymphocytes
The "control" and "LPC" cells used in this analysis are those obtained after 6 days of differentiation according to the protocol described in Example 1.

Les lymphocytes T allogéniques naïfs sont isolés de sang périphérique humain.  Naïve allogeneic T cells are isolated from human peripheral blood.

Les cellules mononuclées du sang périphérique sont isolées par centrifugation (400g, 20 The mononuclear cells of the peripheral blood are isolated by centrifugation (400 g, 20

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minutes) selon le gradient de densité en présence de Ficoll-Hypaque. Après élimination des monocytes sur gradient de Percoll, les lymphocytes du sang périphérique se situent dans la fraction dense. Les lymphocytes T sont purifiés par déplétion immunomagnétique par l'utilisation d'un cocktail d'anticorps monoclonaux anti-CD19 (anticorps 4G7) (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA), anti-CD16 (anticorps 3G8), anti-CD56 (anticorps NKH1), anti-glycophorin A (anticorps llE4B7. 6) et antiCD14 (anticorps RMP052), commercialisés par Beckman Coulter.  minutes) according to the density gradient in the presence of Ficoll-Hypaque. After removal of Percoll gradient monocytes, the peripheral blood lymphocytes are in the dense fraction. The T lymphocytes are purified by immunomagnetic depletion by the use of a cocktail of monoclonal antibodies anti-CD19 (4G7 antibody) (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA), anti-CD16 (anti-CD56 antibody), anti-CD56 (NKH1 antibody), anti-glycophorin A (11E4B7.6 antibody) and antiCD14 (RMP052 antibody), marketed by Beckman Coulter.

Les lymphocytes T purifiés sont cultivés dans des plaques de culture de 96 puits à fond plat avec les cellules"contrôle"ou"LPC".

Figure img00110001
Purified T cells are cultured in flat-bottomed 96-well culture plates with "control" or "LPC" cells.
Figure img00110001

2x105 cellules T sont cultivées dans 2001. 11 de milieu de culture selon un rapport de 1 : 5, 1 : 10 ou 1 : 20 monocytes différenciés en présence ou non de LPC/cellules T (ratio DC/LT). Après 4 jours, 50gel du surnageant de culture sont utilisés pour déterminer la sécrétion d'IL-2 (interleukine 2) et d'IFNy (interféron gamma) par un kit ELISA (Endogen, Wobum, MA, USA). 2x105 T cells are cultured in 2001. 11 culture medium in a ratio of 1: 5, 1:10 or 1: 20 monocytes differentiated in the presence or absence of LPC / T cells (ratio DC / LT). After 4 days, 50 μg of the culture supernatant is used to determine the secretion of IL-2 (interleukin 2) and IFNγ (interferon gamma) by an ELISA kit (Endogen, Wobum, MA, USA).

Comme le présente le tableau 3, la sécrétion d'IL2 et d'IFNy par les lymphocytes T, exprimée classiquement selon le ratio cellules dendritiques/lymphocyte T, (ratio DC/LT) est fortement stimulée par les cellules provenant de la différenciation de monocytes en présence de LPC ajoutée 5 jours après l'initiation de la différenciation des monocytes (cellules"LPC"), par comparaison aux résultats contrôles (cellules "contrôles").  As shown in Table 3, the secretion of IL2 and IFNγ by T lymphocytes, conventionally expressed according to the ratio of dendritic cells / T lymphocytes, (DC / LT ratio) is strongly stimulated by the cells originating from the differentiation of monocytes. in the presence of LPC added 5 days after the initiation of the differentiation of monocytes ("LPC" cells), compared with the control results ("control" cells).

TABLEAU 3-Stimulation de la sécrétion d'IL2 et d'IFNypar lymphocytes
T induite par les monocytes différenciés en absence (contrôle) ou en présence de
LPC

Figure img00110002
TABLE 3-Stimulation of Secretion of IL2 and IFNypar Lymphocytes
T-induced differentiated monocytes in absence (control) or in the presence of
LPC
Figure img00110002

<tb>
<tb> Ratio <SEP> DC/LT <SEP> 0 <SEP> 0,05 <SEP> 0,1 <SEP> 0,2
<tb> Contrôle <SEP> IL-2 <SEP> 0 <SEP> 68 <SEP> 156 <SEP> 3511
<tb> IFNy041 <SEP> 1451 <SEP> 41199
<tb> LPC <SEP> IL-2 <SEP> 0 <SEP> 23 <SEP> 1 <SEP> 47 <SEP> 26 <SEP> 173 <SEP> : <SEP> t <SEP> 31
<tb> IFNy073 <SEP> 47 <SEP> 439108 <SEP> 795 <SEP> : <SEP> t <SEP> 19
<tb> <Tb>
<tb> Ratio <SEP> DC / LT <SEP> 0 <SEP> 0.05 <SEP> 0.1 <SEP> 0.2
<tb> Control <SEP> IL-2 <SEP> 0 <SEP> 68 <SEP> 156 <SEP> 3511
<tb> IFNy041 <SEP> 1451 <SEP> 41199
<tb> LPC <SEP> IL-2 <SEP> 0 <SEP> 23 <SEP> 1 <SEP> 47 <SEP> 26 <SEP> 173 <SEP>: <SEP> t <SEP> 31
<tb> IFNy073 <SEP> 47 <SEP> 439108 <SEP> 795 <SEP>: <SEP> t <SEP> 19
<Tb>

<Desc/Clms Page number 12> <Desc / Clms Page number 12>

Figure img00120001

Ces résultats montrent une augmentation des capacités des monocytes différenciés en présence de LPC à stimuler les lymphocytes T allogéniques, ce qui est une caractéristique des cellules dendritiques matures. A titre indicatif, des résultats comparables sont obtenus que le LPC soit dissous dans l'éthanol ou sous forme d'émulsion lipidique.
Figure img00120001

These results show an increase in the ability of differentiated monocytes in the presence of LPC to stimulate allogeneic T cells, which is a characteristic of mature dendritic cells. As an indication, comparable results are obtained that the LPC is dissolved in ethanol or in the form of a lipid emulsion.

Exemple 5-Propriétés des cellules obtenues selon l'exemple 1 : comparaison avec des cellules dendritiques matures obtenues par différenciation de monocytes en présence de LDL oxydés
L'objectif de cet exemple est de démontrer que les mécanismes d'action mis en jeu lors la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures en présence de LPC pourraient être différents de ceux mis en jeu lors de la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures en présence de LDL oxydés (Perrin-Cocon et al. The Journal of Immunology, 167 : 3785-3891,2001). Example 5-Properties of the cells obtained according to Example 1: Comparison with mature dendritic cells obtained by differentiation of monocytes in the presence of oxidized LDL
The objective of this example is to demonstrate that the mechanisms of action involved in the differentiation of monocytes into mature dendritic cells in the presence of LPC could be different from those involved in the differentiation of monocytes into mature dendritic cells. presence of oxidized LDL (Perrin-Cocon et al., The Journal of Immunology, 167: 3785-3891, 2001).

Dans cet exemple sont utilisées des cellules"contrôle"et"LPC"telles qu'obtenues dans l'exemple 1, ainsi que des cellules"LDLox", obtenues tel que décrit dans la publication scientifique (Perrin-Cocon et al. The Journal of Immunology, 167 : 3785-3891,2001), c'est à dire après différenciation de monocytes en culture en présence de LDL oxydés ajoutés dans le milieu 5 jours après l'initiation de la différenciation.  In this example are used "control" and "LPC" cells as obtained in Example 1, as well as "LDLox" cells, obtained as described in the scientific publication (Perrin-Cocon et al., The Journal of Immunology, 167: 3785-3891,2001), ie after differentiation of monocytes in culture in the presence of oxidized LDL added in the medium 5 days after the initiation of the differentiation.

Les inventeurs ont recherché si les inhibiteurs de l'action des LDL oxydés sur la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures inhibaient également l'action du LPC sur la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures.  The inventors have investigated whether inhibitors of the action of oxidized LDLs on the differentiation of monocytes into mature dendritic cells also inhibited the action of LPC on the differentiation of monocytes into mature dendritic cells.

Ainsi, une solution d'Intralipid&commat; (50gIml de phospholipides, Fresenius Kabi, Sèvres, France), ou une solution de molécules synthétiques de nature lipidique (lipoïd Erz Lipoïd Ag, Ludwigshafen, Allemagne, 50 Ilglml de phospholipides) ont été ajoutées dans le milieu de culture au 5ème jour de différenciation. L'expression de CD86 des cellules"LPC"et"LDLox"en présence de ces inhibiteurs est analysée selon le protocole décrit dans l'exemple 2, et les résultats sont présentés dans le tableau 4. Thus, a solution of Intralipid &commat; (50 μg of phospholipids, Fresenius Kabi, Sèvres, France), or a solution of synthetic molecules of lipid nature (lipoid Erz Lipoid Ag, Ludwigshafen, Germany, 50 μg / ml of phospholipids) were added to the culture medium on the 5th day of differentiation . The CD86 expression of the "LPC" and "LDLox" cells in the presence of these inhibitors is analyzed according to the protocol described in Example 2, and the results are presented in Table 4.

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TABLEAU 4-Inhibition (en %) de l'expression de CD86 des cellules LPC et LDLox par l'Intralipide et le lipoïd E-80

Figure img00130001
TABLE 4-Inhibition (in%) of CD86 expression of LPC and LDLox cells by Intralipid and lipoid E-80
Figure img00130001

<tb>
<tb> Intralipide <SEP> Lipoïd <SEP> E-80
<tb> LDLox <SEP> 88% <SEP> 10 <SEP> 81% <SEP> 14
<tb> LPC86% <SEP> 1224% <SEP> 19
<tb>
L'ajout d'Intralipid inhibe la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures par les LDL oxydés et par le LPC d'une façon comparable (inhibition de l'ordre de 80%). <Tb>
<tb> Intralipid <SEP> Lipoid <SEP> E-80
<tb> LDLox <SEP> 88% <SEP> 10 <SEP> 81% <SEP> 14
<tb> LPC86% <SEP> 1224% <SEP> 19
<Tb>
The addition of Intralipid inhibits the differentiation of monocytes into mature dendritic cells by oxidized LDL and LPC in a comparable manner (80% inhibition).

Par contre, d'une façon surprenante, l'ajout de lipoïd E-80 induit une inhibition de l'expression des CD86 de 81% lorsque les monocytes sont cultivés en présence de LDLoxydés, alors que cette inhibition est de seulement 24% lorsque les monocytes sont cultivés en présence de LPC. On the other hand, surprisingly, the addition of lipoid E-80 induces a 81% inhibition of the expression of CD86 when the monocytes are cultured in the presence of LDLoxydes, whereas this inhibition is only 24% when the Monocytes are cultured in the presence of LPC.

Ces résultats suggèrent que les mécanismes d'action du LPC pour la différenciation

Figure img00130002

des monocytes en cellules dendritiques matures seraient différents des mécanismes d'action des LDL oxydés. These results suggest that the mechanisms of action of LPC for differentiation
Figure img00130002

monocytes in mature dendritic cells would be different mechanisms of action of oxidized LDL.

Exemple 6-Mécanismes cellulaires impliqués dans la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures en présence de LPC
Afin d'aller plus avant dans la recherche des mécanismes cellulaires de l'action du LPC dans la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures, les inventeurs ont recherché quels récepteurs pouvaient être impliqués. Example 6-Cell Mechanisms Involved in the Differentiation of Monocytes to Mature Dendritic Cells in the Presence of LPC
In order to go further in the search for the cellular mechanisms of the action of LPC in the differentiation of monocytes into mature dendritic cells, the inventors have investigated which receptors could be involved.

Dans un premier temps, afin de déterminer si les récepteurs impliqués dans l'action du LPC lors de la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures appartenaient à la famille des récepteurs couplés à une protéine G, du PTX (toxine pertussis ; lOOng/ml), connu pour bloquer les protéines Gi est ajouté pendant 3 heures dans le milieu de culture. Le milieu de culture est ensuite changé et le LPC est ajouté tel que décrit dans l'exemple 1. First, in order to determine whether the receptors involved in the action of LPC during the differentiation of monocytes into mature dendritic cells belonged to the family of G protein-coupled receptors, PTX (pertussis toxin, 100 ng / ml) , known to block the Gi proteins is added for 3 hours in the culture medium. The culture medium is then changed and the LPC is added as described in Example 1.

Les résultats présentés dans le tableau 5 montrent que la préincubation des monocytes par le PTX bloque l'augmentation de CD86 induite par le LPC, suggérant que l'action du LPC implique des récepteurs à protéines Gi. The results presented in Table 5 show that preincubation of monocytes by PTX blocks the increase of CD86 induced by LPC, suggesting that the action of LPC involves Gi protein receptors.

<Desc/Clms Page number 14> <Desc / Clms Page number 14>

TABLEAU 5-Inhibition de l'expression de CD86 des cellules"LPC"par le PTX

Figure img00140001
TABLE 5-Inhibition of CD86 expression of "LPC" cells by PTX
Figure img00140001

<tb>
<tb> Induction <SEP> de <SEP> CD86
<tb> LPC <SEP> 100%
<tb> LPC <SEP> + <SEP> PTX <SEP> 10%
<tb>
ces récepteurs pourraient être notamment les récepteurs suivants : récepteur G2A (G2A-R) : il a été démontré récemment que le LPC était un ligand de forte affinité pour la protéine G2A, une protéine G couplé à un récepteur exprimé dans les lymphocytes. De plus, la stimulation de
G2A par le LPC induit la phosphorylation d'une kinase extracellulaire (ERK1/2 : extracellular signal-related kinases). Cette phosphorylation peut d'ailleurs être observée lors de l'ajout de LPC dans le milieu de culture suggérant l'implication du récepteur G2A dans les différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures par le
LPC. <Tb>
<tb> Induction <SEP> of <SEP> CD86
<tb> LPC <SEP> 100%
<tb> LPC <SEP> + <SEP> PTX <SEP> 10%
<Tb>
these receptors could be notably the following receptors: G2A receptor (G2A-R): LPC has recently been shown to be a high affinity ligand for the G2A protein, a G protein coupled to a receptor expressed in lymphocytes. In addition, the stimulation of
G2A by LPC induces phosphorylation of extracellular kinase (ERK1 / 2: extracellular signal-related kinases). This phosphorylation can moreover be observed during the addition of LPC in the culture medium suggesting the involvement of the G2A receptor in the differentiation of monocytes into mature dendritic cells by the
LPC.

'récepteur PAF (PAF-R) comme décrit précédemment, certains effets du
LPC pourraient impliquer le récepteur du PAF dans divers types de cellules * récepteur GPR4 : le LPC est également un ligand de la protéine GPR4, une autre protéine G couplé à un récepteur ayant une forte affinité pour le sphingosylphosphorylcholine Exemple 7-Différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures en présence de composés équivalents au LPC
Les inventeurs ont déterminé si des composés équivalents au LPC, c'est à dire impliquant les mêmes mécanismes d'action cellulaires via les mêmes récepteurs membranaires, pouvait également induire la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures. PAF receptor (PAF-R) as previously described, certain effects of the
LPC could involve the PAF receptor in various types of GPR4 receptor cells: LPC is also a ligand of the GPR4 protein, another G protein coupled to a receptor with high affinity for sphingosylphosphorylcholine Example 7-Differentiation of monocytes into cells mature dendritic in the presence of compounds equivalent to LPC
The inventors have determined whether compounds equivalent to the LPC, ie involving the same mechanisms of cellular action via the same membrane receptors, could also induce the differentiation of monocytes into mature dendritic cells.

<Desc/Clms Page number 15><Desc / Clms Page number 15>

Pour cela, les inventeurs ont recherché si l'ajout de PAF dans le milieu de culture pouvait augmenter l'action du LPC sur la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures.  For this, the inventors have investigated whether the addition of PAF in the culture medium could increase the action of LPC on the differentiation of monocytes into mature dendritic cells.

Ainsi, une solution de PAF (Sigma, 5uM) a été ajoutée dans le milieu de culture au 5ème jour de différenciation des monocytes. L'expression de CD86 des cellules"contrôle", et des cellules"LPC", obtenues en présence ou en absence de PAF, est analysée selon le protocole décrit dans l'exemple 2, et les résultats sont présentés dans le tableau 6. Thus, a solution of PAF (Sigma, 5uM) was added in the culture medium at the 5th day of monocyte differentiation. CD86 expression of "control" cells, and "LPC" cells, obtained in the presence or absence of PAF, is analyzed according to the protocol described in Example 2, and the results are shown in Table 6.

TABLEAU 6-Expression du marqueur CD86 (intensité moyenne de fluorescence) des cellules"contrôles"et"LPC"en présence ou en absence de
PAF

Figure img00150001
TABLE 6-Expression of the CD86 marker (mean fluorescence intensity) of the "control" and "LPC" cells in the presence or absence of
PAF
Figure img00150001

<tb>
<tb> CD86
<tb> Contrôle <SEP> 49,02
<tb> PAF <SEP> 102, <SEP> 88
<tb> LPC <SEP> 287, <SEP> 11
<tb> LPC+PAF <SEP> 676, <SEP> 88
<tb>
Ces résultats suggèrent que le PAF seul induit une légère surexpression de CD86

Figure img00150002

contrairement au LPC qui induit une augmentation de l'expression de CD 86 de 470%. Par contre, il est important de noter que le PAF agit en synergie avec le LPC, puisque l'action des deux composés induit une augmentation de l'expression de CD86 de plus de 1200%. <Tb>
<tb> CD86
<tb> Control <SEP> 49.02
<tb> PAF <SEP> 102, <SEP> 88
<tb> LPC <SEP> 287, <SEP> 11
<tb> LPC + PAF <SEP> 676, <SEP> 88
<Tb>
These results suggest that PAF alone induces a slight overexpression of CD86
Figure img00150002

unlike the LPC which induces an increase in the expression of CD 86 of 470%. On the other hand, it is important to note that PAF acts in synergy with LPC, since the action of the two compounds induces an increase in CD86 expression of more than 1200%.

Afin de renforcer l'implication du récepteur au PAF, les inventeurs ont étudié l'action d'un antagoniste de ce récepteur sur la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures par le LPC. In order to reinforce the involvement of the PAF receptor, the inventors have studied the action of an antagonist of this receptor on the differentiation of monocytes into mature dendritic cells by LPC.

Ainsi, une solution de l'antagoniste BN52021 du PAF (Biomol, Plymouth Meeting, USA, lOOuM) a été ajoutée dans le milieu de culture au 56mue jour de différenciation des monocytes. L'expression de CD86 des cellules"contrôles"et"LPC", obtenues en présence ou en absence de BN52021, est analysée selon le protocole décrit dans l'exemple 2, et les résultats sont présentés dans le tableau 7. Thus, a solution of the BN52021 PAF antagonist (Biomol, Plymouth Meeting, USA, 100 μM) was added to the culture medium at day 56 of monocyte differentiation. The CD86 expression of the "control" and "LPC" cells, obtained in the presence or absence of BN52021, is analyzed according to the protocol described in Example 2, and the results are shown in Table 7.

<Desc/Clms Page number 16> <Desc / Clms Page number 16>

Figure img00160001

TABLEAU 7-Expression de CD86 des cellules"contrôle"et"LPC"en présence de l'antagoniste BN52021
Figure img00160002
Figure img00160001

TABLE 7-CD86 Expression of "Control" and "LPC" Cells in the Presence of the BN52021 Antagonist
Figure img00160002

<tb>
<tb> CD86
<tb> LPC <SEP> 100%
<tb> LPC <SEP> + <SEP> BN52021 <SEP> 54%
<tb> <Tb>
<tb> CD86
<tb> LPC <SEP> 100%
<tb> LPC <SEP> + <SEP> BN52021 <SEP> 54%
<Tb>

Figure img00160003

Ces résultats suggèrent que l'action du LPC implique bien le récepteur du PAF mais suggèrent également que l'action du LPC pourrait impliquer d'autres récepteurs.
Figure img00160003

These results suggest that the action of LPC does implicate the PAF receptor but also suggest that the action of LPC could involve other receptors.

A titre indicatif, les inventeurs ont également démontré que l'antagoniste BN52021 ajouté dans le milieu de culture au sème jour de différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures par des LDL oxydés induisait une inhibition de 100 % de l'action des LDL oxydés, suggérant la encore, que les mécanismes d'action du LPC et des LDL oxydés seraient différents.By way of indication, the inventors have also demonstrated that the BN52021 antagonist added to the culture medium on the third day of differentiation of monocytes into mature dendritic cells by oxidized LDLs induced a 100% inhibition of the action of oxidized LDLs, suggesting again, that the mechanisms of action of LPC and oxidized LDL would be different.

Claims (20)

REVENDICATIONS 1. Utilisation de L-a-lysophosphatidylcholine et/ou d'au moins un composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine pour la différenciation de monocytes en cellules dendritiques matures in vitro. 1. Use of L-α-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of L-α-lysophosphatidylcholine for the differentiation of monocytes into mature dendritic cells in vitro. 2. Utilisation de L-a-lysophosphatidylcholine et/ou d'au moins un composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine pour la fabrication d'un médicament pour le traitement et/ou la prévention d'une infection d'origine bactérienne, virale, fongique, parasitaire ou provoquée par une levure. 2. Use of La-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of La-lysophosphatidylcholine for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of an infection of bacterial, viral, fungal, parasitic origin or caused by yeast. 3. Utilisation de L-a-lysophosphatidylcholine et/ou d'au moins un composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine pour la fabrication d'un médicament pour le traitement et/ou la prévention des cancers3. Use of L-α-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of L-α-lysophosphatidylcholine for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of cancers 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle comprend également au moins un agent biologique. 4. Use according to any one of claims 1 to 3 characterized in that it also comprises at least one biological agent. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'agent biologique est choisi parmi les antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons, les antigènes tumoraux, les lysats de cellules tumorales autologues et/ou héterologues. 5. Use according to claim 4, characterized in that the biological agent is selected from antigens of bacteria, viruses, yeasts, parasites, fungi, tumor antigens, autologous tumor cell lysates and / or heterologous . 6. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'agent biologique est un acide nucléique qui code pour au moins un antigène choisi parmi les antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons, les antigènes tumoraux. 6. Use according to claim 4, characterized in that the biological agent is a nucleic acid which encodes at least one antigen selected from antigens of bacteria, viruses, yeasts, parasites, fungi, tumor antigens. <Desc/Clms Page number 18> <Desc / Clms Page number 18> 7. Procédé pour la différenciation in vitro de monocytes en cellules dendritriques matures selon lequel on dispose de monocytes dans un milieu de culture permettant leur différenciation et on additionne audit milieu de L-a-lysophosphatidylcholine et/ou d'au moins un composé équivalent de a-lysophosphatidylcholine. 7. Process for the in vitro differentiation of monocytes into mature dendritic cells according to which monocytes are available in a culture medium which makes it possible to differentiate them, and to said medium is added La-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of lysophosphatidylcholine. 8. Procédé selon la revendication 7, selon lequel le L-a-lysophosphatidylcholine est additionnée (s) audit milieu à une concentration finale dans le milieu comprise entre environ 10 et 80uM, préférentiellement entre environ 20 et 60 uM et avantageusement entre 30 et 50 uM. 8. The method of claim 7, wherein L-α-lysophosphatidylcholine is added (s) to said medium to a final concentration in the medium of between about 10 and 80uM, preferably between about 20 and 60 uM and preferably between 30 and 50 uM.
Figure img00180001
Figure img00180001
 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, selon lequel le La-lysophosphatidylcholine est ajoutée dans ledit milieu entre le 3ème et 6ème jour de différenciation des monocytes, préférentiellement entre le 4ème et le 5ème jour de différenciation des monocytes. 9. A method according to any one of claims 7 or 8, wherein the L-lysophosphatidylcholine is added to said medium between the 3rd and 6th day of differentiation of monocytes, preferably between the 4th and 5th day of differentiation of monocytes. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 ou 9 caractérisé en ce qu'on ajoute dans le milieu de culture un agent biologique. 10. Method according to any one of claims 7 or 9 characterized in that added in the culture medium a biological agent. 11. Cellules dendritiques matures susceptibles d'être obtenues selon le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 7 à 10. 11. Dendritic mature cells obtainable by the process as defined in any one of claims 7 to 10. 12. Milieu de culture pour la différenciation de monocytes en cellules dendritiques 12. Culture medium for the differentiation of monocytes into dendritic cells
Figure img00180002
Figure img00180002
 matures, caractérisé en ce qu'il comprend du L-a-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine.  mature compounds, characterized in that it comprises L-α-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of L-α-lysophosphatidylcholine. 13. Milieu de culture selon la revendication 12 caractérisé en ce que le La-lysophosphatidylcholine est à une concentration finale dans le milieu comprise entre environ 10 et 80uM, préférentiellement entre environ 20 et 60 uM et avantageusement entre 30 et 50 u. M. 13. Culture medium according to claim 12 characterized in that the L-lysophosphatidylcholine is at a final concentration in the medium of between about 10 and 80uM, preferably between about 20 and 60 uM and preferably between 30 and 50 u. Mr. <Desc/Clms Page number 19><Desc / Clms Page number 19> 14. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 12 à 13 caractérisé en ce qu'il comprend un agent biologique.  14. Culture medium according to any one of claims 12 to 13 characterized in that it comprises a biological agent. 15. Agent d'activation pour la différenciation de monocytes en cellules dendritiques matures caractérisé en ce qu'il comprend du L-a-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine. 15. Activating agent for the differentiation of monocytes into mature dendritic cells, characterized in that it comprises L-α-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of L-α-lysophosphatidylcholine. 16. Utilisation de L-a-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine comme agent d'activation pour la fabrication d'un médicament pour le traitement et/ou la prévention d'une infection d'origine bactérienne, virale, fongique, parasitaire ou provoquée par une levure. 16. Use of La-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of La-lysophosphatidylcholine as an activating agent for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of an infection of bacterial, viral origin, fungal, parasitic or caused by yeast. 17. Utilisation de L-a-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine comme agent d'activation pour la fabrication d'un médicament pour le traitement et/ou la prévention des cancers. 17. Use of L-α-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of L-α-lysophosphatidylcholine as an activating agent for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of cancers. 18. L-a-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de L- a-lysophosphatidylcholine pour utilisation comme médicament18. L-α-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of L-α-lysophosphatidylcholine for use as a medicament 19. L-a-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de L- a-lysophosphatidylcholine et au moins un agent biologique pour utilisation comme médicament. 19. L-α-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of L-α-lysophosphatidylcholine and at least one biological agent for use as a medicament. 20. Composition pharmaceutique comprenant de L-a-lysophosphatidylcholine et/ou au moins un composé équivalent de L-a-lysophosphatidylcholine. 20. A pharmaceutical composition comprising L-α-lysophosphatidylcholine and / or at least one equivalent compound of L-α-lysophosphatidylcholine.
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