FR2836145A1 - New levulinyl phosphoramidite derivatives used for synthesis of oligonucleotides - Google Patents
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Abstract
Description
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La présente invention a pour objet des précurseurs de phosphoramidites, leur procédé de préparation, les phosphoramidites obtenus et leur utilisation dans la synthèse d'oligonucléotides renfermant spécifiquement des lésions photochimiques en position définie. The present invention relates to phosphoramidite precursors, to a process for their preparation, to the phosphoramidites obtained and to their use in the synthesis of oligonucleotides that specifically contain photochemical lesions in a defined position.
L'exposition de l'ADN cellulaire aux ultraviolets provoque des lésions qui se forment au niveau de deux pyrimidine adjacentes et qui se traduisent à l'échelle moléculaire par l'obtention de dimères cyclobutaniques et d'adduits de type pyrimidine (6-4 pyrimidinone) qui peuvent s'isomériser en adduits de type Dewar. The exposure of cellular DNA to ultraviolet light causes lesions that form at the level of two adjacent pyrimidines and which are translated at the molecular level by obtaining cyclobutanic dimers and pyrimidine-type adducts (6-4 pyrimidinone). ) that can be isomerized to Dewar adducts.
En absence de réparation et lors de la réplication de l'ADN endommagé, ces lésions peuvent entraîner des erreurs de lecture des polymérases et donc être mutagènes. In the absence of repair and during the replication of the damaged DNA, these lesions can lead to errors in reading the polymerases and therefore be mutagenic.
Elles peuvent également induire une réponse immunosuppressive qui joue un rôle important dans le développement du processus de carcinogénèse. Ces lésions sont responsables chez l'homme de la plupart des cancers de la peau. Ceci représente dans le monde actuel un problème majeur de santé publique. They can also induce an immunosuppressive response that plays an important role in the development of the carcinogenesis process. These lesions are responsible in humans for most skin cancers. This represents in the world today a major problem of public health.
Exacerbée par la diminution de la couche d'ozone, on peut s'attendre à ce que l'augmentation du rayonnement UVB capable de traverser l'atmosphère entraîne également sur d'autres organismes vivants des répercussions incontrôlables qui pourraient modifier dramatiquement l'équilibre de nombreux écosystèmes. Exacerbated by the depletion of the ozone layer, it can be expected that the increase in UVB radiation capable of crossing the atmosphere will also have other uncontrollable impacts on other living organisms that could dramatically alter the balance of the ozone layer. many ecosystems.
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C'est pourquoi les inventeurs se sont intéressés à des composés synthétiques contenant spécifiquement ce type de lésions en position définie et qui permettent d'étudier ces dommages. This is why the inventors are interested in synthetic compounds specifically containing this type of lesions in a defined position and which make it possible to study this damage.
Actuellement, il existe trois voies de synthèse de phosphoramidites qui permettent d'obtenir, sur un support solide, des oligo-nucléotides renfermant spécifiquement et en position définie l'adduit cyclobutanique cis-syn de thymine (Taylor J. S, Brockie I. R., O'Day C. L.,"A building block for the sequence-specific introduction of cis-syn thymine divers into oligonucleotides", Solidphase synthesis of TpT [c, s] pTpT. J. Am. Chem. Soc. Currently, there are three phosphoramidite synthesis routes which make it possible to obtain, on a solid support, oligonucleotides containing specifically and in a defined position the cis-syn cyclobutanic adduct of thymine (Taylor J. S, Brockie IR, O). A CLASS BLOCK FOR THE SEQUENCE-SPECIFIC INTRODUCTION OF cis-syn thymine various into oligonucleotides, Solidphase synthesis of TpT [c, s] pTpT, J. Am Chem Soc.
(1987), 109,6735-6742 ; Murata T., Iwai S, Ohtsuka E, "Synthesis and characterization of a substrate for T4 endonuclease V containing a phosphorodithioate linkage at the thymine dimer site", Nucleic Acids Res. (1990), 18, 7279-7286 ; Kosmoski J. V., Smerdon M. J.,"Synthesis and nucleosome structure of DNA containing a UV photoproduct at a specific site", Biochemistry (1999), 38,9485-9494 ; Tommasi S., Swiderski P. M., Tu Y, Kaplan B. E., Pfeifer G. P.,"Inhibition of transcription factor binding by ultraviolet-induced pyrimidine divers", Biochemistry (1996), 35,15693-15703). (1987), 109, 6735-6742; Murata T., Iwai S, Ohtsuka E, "Synthesis and characterization of a substrate for T4 endonuclease V containing a phosphorodithioate linkage at the thymine dimer site", Nucleic Acids Res. (1990), 18, 7279-7286; Kosmoski, J.V., Smerdon M.J., "Synthesis and nucleosome structure of DNA containing a UV photoproduct at a specific site", Biochemistry (1999), 38, 9485-9494; Tommasi S., Swiderski P.M., Tu Y, Kaplan B.E., Pfeifer G.P., "Inhibition of various transcription factor binding by ultraviolet-induced pyrimidine", Biochemistry (1996), 35, 15693-15703).
Les synthèses conduisant à ces phopshoramidites suivent toutes la stratégie développée initialement par Taylor J. S et repose sur l'emploi, avant l'étape photochimique, d'un dinucléotide dont les fonctions phosphodiester et hydroxyle en 3'sont protégées. The syntheses leading to these phopshoramidites all follow the strategy initially developed by Taylor J. S and is based on the use, before the photochemical step, of a dinucleotide whose phosphodiester and hydroxyl functions in 3 'are protected.
Les différences entre ces synthèses portent sur le choix des groupements protecteurs, le groupement The differences between these syntheses relate to the choice of protective groups, the grouping
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protecteur de la fonction phosphate pouvant être un méthyle ou un cyanoéthyle, la fonction hydroxyle en 3' étant protégée soit sous forme d'éther de silyle, soit sous forme d'ester d'acide lévulinique. Phosphate protecting agent which may be methyl or cyanoethyl, the 3 'hydroxyl function being protected either in the form of silyl ether or in the form of levulinic acid ester.
Le schéma 1 de ces synthèses est le suivant :
Figure 1 of these summaries is as follows:
Schéma 1
La photolyse de 8 conduit au dimère de thymine CisSyn 9 avec un rendement de 41% pour 9a et de 42% pour 9b. La fonction hydroxyle en 5'du composé 9 est protégée par le groupement diméthoxytrityle (étape i ; rendement : 60% et 76%), puis la fonction hydroxyle en 3'est déprotégée (étape ii ; rendement : 73% et 78%) puis fonctionnalisée en phosphoramidite (étape iii ; rendement : 53% et 54%). Diagram 1
Photolysis of 8 leads to CisSyn 9 thymine dimer with a yield of 41% for 9a and 42% for 9b. The hydroxyl function at 5 'of compound 9 is protected by the dimethoxytrityl group (step i, yield: 60% and 76%), then the hydroxyl function at 3 is deprotected (step ii, yield: 73% and 78%) and functionalized to phosphoramidite (step iii, yield: 53% and 54%).
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L'ordre des étapes de protection en 5'et déprotection en 3'peut être inversé (étape iv et i). The order of protection steps in 5 'and deprotection in 3' can be reversed (step iv and i).
Le composé 8 est obtenu selon les voies illustrées par le schéma 2. Par la voie des phosphoramidites (8a-b) dans le sens 3'- > 5', on condense un dérivé diméthoxytritylé en 5'et phosphoramidite en 3'de la thymidine (10a-b) et un dérivé protégé en 3'de la thymidine (lla décrit par Taylor J. S ; llb décrit par Murata T. ) ; par la voie des chlorophosphites (8a) dans le sens 5'- > 3', on condense le dérivé tritylé en 5'de la thymidine (10c) avec le dérivé chlorophosphite en 5'de la thymidine protégée en 3' (llc décrit par Kosmoski J. V. ). Le phosphite triester est ensuite oxydé en phosphate triester et la fonction hydroxyle en 5' détritylée pour conduire à 8a.
Compound 8 is obtained according to the routes illustrated in Scheme 2. By means of the phosphoramidites (8a-b) in the 3'-> 5 'direction, a dimethoxytrityl derivative is condensed in 5' and phosphoramidite in 3 'of thymidine (10a-b) and a 3'-protected derivative of thymidine (11a described by Taylor J. S, 11b described by Murata T.); Chlorophosphites (8a) in the 5'-> 3 'direction are condensed to the 5'-trityl derivative of thymidine (10c) with the 5'-chlorophosphite derivative of the 3' protected thymidine (IIc described by Kosmoski JV). The phosphite triester is then oxidized to phosphate triester and the 5 'hydroxyl function detritylated to yield 8a.
Schéma 2
L'inconvénient majeur de cette voie générale de synthèse, lié au fait que le groupement diméthoxytrityle Figure 2
The major disadvantage of this general route of synthesis, related to the fact that the dimethoxytrityl group
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n'est pas compatible avec l'étape d'irradiation photochimique, est de déprotéger la fonction hydroxyle en 5'du précurseur de 8 (Schéma 2, étape iii et il) puis de reprotéger cette fonction au niveau de 9 pour obtenir le phosphoramidite 7 (Schéma 1, étape i). Ces différentes étapes entraînent une perte de rendement d'au moins 44%. De plus, l'adduit photochimique 9 doit être déprotégé en 3'pour obtenir le phosphoramidite 7, ce qui représente une perte supplémentaire d'au moins 22% du photoproduit. is not compatible with the photochemical irradiation step, is to deprotect the 5 'hydroxyl function of the precursor of 8 (Scheme 2, step iii and II) and then to reprotect this function at 9 to obtain phosphoramidite 7 (Diagram 1, step i). These different stages result in a yield loss of at least 44%. In addition, the photochemical adduct 9 must be deprotected at 3 'to obtain phosphoramidite 7, which represents an additional loss of at least 22% of the photoproduct.
La demande de brevet EP 0 787 740 décrit un procédé de préparation d'un photoproduit (6-4) à partir d'un dimère de thymidine de formule (II)
dans laquelle Rs représente un groupe méthyle ou cyanoéthyle et R7 représente un groupe lévulinyle, ou tert-butyldiméthylsilyle. Patent Application EP 0 787 740 describes a process for preparing a photoproduct (6-4) from a thymidine dimer of formula (II)
wherein Rs is methyl or cyanoethyl and R7 is levulinyl, or tert-butyldimethylsilyl.
Ce procédé de préparation comprend :
une étape d'irradiation du composé de formule II, une étape de protection du groupe 5'OH, - une étape de déprotection du groupe 3'OH, puis - la réaction du produit obtenu avec, par exemple, un dérivé phosphochloré, pour obtenir le phosphoramidite attendu de formule (I) This preparation process comprises:
a step of irradiation of the compound of formula II, a step of protecting the 5'OH group, a step of deprotection of the 3'OH group, then the reaction of the product obtained with, for example, a phosphochlorine derivative, to obtain the expected phosphoramidite of formula (I)
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Bien que ce procédé pallie les inconvénients des procédés connus de l'état antérieur de la technique, il comprend encore quatre étapes, dont plusieurs étapes de protection et de déprotection successives qui nuisent au bon rendement du procédé. Although this method overcomes the disadvantages of the known methods of the prior art, it still comprises four steps, including several successive protection and deprotection steps that affect the good performance of the process.
Or, les inventeurs ont découvert que, si l'on protégeait l'hydroxyle en position 5'par un groupe lévulinyle, il n'était pas nécessaire de supprimer ce groupe avant l'étape d'irradiation photochimique. Ce groupe s'est avéré à la fois stable aux conditions d'irradiation et compatible avec les conditions de synthèse sur support solide. However, the inventors have discovered that, if the hydroxyl at the 5 'position was protected by a levulinyl group, it was not necessary to remove this group before the photochemical irradiation step. This group was found to be both stable at the irradiation conditions and compatible with the solid support synthesis conditions.
La présente invention a en conséquence pour objet des dérivés répondant à la formule (1)
dans laquelle The subject of the present invention is therefore derivatives having the formula (1)
in which
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A et B représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un substituant choisi dans le groupe constitué par la cytosine, l'uracile et la thymine,
Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle. A and B are each independently of one another a substituent selected from the group consisting of cytosine, uracil and thymine,
R 1 represents a methyl, 2-cyanoethyl group,
2-silylethyl or allyl, and
Lev represents a levulinyl group.
Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, A et B représentent chacun une thymine et le dérivé
correspond au O-cyanoéthyle phosphate de la 5'-0lévulinylthymidilyl (3'-5') thymidine.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des composés de formule (2)
dans laquelle - C représente un substituant choisi parmi
et
In a preferred embodiment of the invention, A and B each represent a thymine and the derivative
corresponds to O-cyanoethyl phosphate of 5'-levulinylthymidilyl (3'-5 ') thymidine.
The subject of the present invention is also a process for the preparation of the compounds of formula (2)
in which - C represents a substituent chosen from
and
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dans lesquelles Xi, Xs Rs et R6 sont définis comme illustrés au tableau suivant :
in which X 1, X 5 R 5 and R 6 are defined as illustrated in the following table:
<tb>
<tb> X1 <SEP> X2 <SEP> R5 <SEP> R6
<tb> O <SEP> O <SEP> H <SEP> H
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> CH3 <SEP> H
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> H <SEP> CH3
<tb> O <SEP> NH <SEP> H <SEP> H
<tb> NH <SEP> 0 <SEP> H <SEP> H
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> CH3 <SEP> CH3
<tb> 0 <SEP> NH <SEP> CH3 <SEP> H
<tb> NH <SEP> 0 <SEP> H <SEP> CH3
<tb> NH <SEP> NH <SEP> H <SEP> H
<tb> <Tb>
<tb> X1 <SEP> X2 <SEP> R5 <SEP> R6
<tb> O <SEP> O <SEP> H <SEP> H
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> CH3 <SEP> H
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> H <SEP> CH3
<tb> O <SEP> NH <SEP> H <SEP> H
<tb> NH <SEP> 0 <SEP> H <SEP> H
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> CH3 <SEP> CH3
<tb> 0 <SEP> NH <SEP> CH3 <SEP> H
<tb> NH <SEP> 0 <SEP> H <SEP> CH3
<tb> NH <SEP> NH <SEP> H <SEP> H
<Tb>
Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle, par irradiation d'un composé de formule (1). R 1 represents a methyl, 2-cyanoethyl group,
2-silylethyl or allyl, and
Lev represents a levulinyl group, by irradiation of a compound of formula (1).
Les composés de formule (2a), dans laquelle - C représente un substituant (a) tel que défini précédemment,
Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle ; et les composés de formule (2b) dans laquelle - C représente un substituant (b) tel que défini précédemment,
Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle, font également partie de l'invention. The compounds of formula (2a), in which - C represents a substituent (a) as defined above,
R 1 represents a methyl, 2-cyanoethyl group,
2-silylethyl or allyl, and
Lev is a levulinyl group; and compounds of formula (2b) in which - C represents a substituent (b) as defined above,
R 1 represents a methyl, 2-cyanoethyl group,
2-silylethyl or allyl, and
Lev represents a levulinyl group, are also part of the invention.
Les composés de formule (2b) peuvent se présenter sous forme cis-syn, trans-syn 1 ou trans-syn 2. The compounds of formula (2b) can be in cis-syn, trans-syn 1 or trans-syn 2 form.
Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, C représente un substituant (bl) In a preferred embodiment of the invention, C represents a substituent (b1)
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La présente invention a également pour objet des composés de formule (3)
dans laquelle - C représente un substituant choisi parmi (a) et (b) tels que définis précédemment, Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et - R2 représente un groupe (X3) ou (X4)'
où R3 représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle, 2-silyléthyle ou allyle, et R4 représente un substituant
choisi parmi les groupes-NR'R, morpholino, N-pyrrolidinyle et 2, 2, 6, 6, -tétraméthyl-N-pipéridyle, R' et R" étant chacun un groupe (CI-C4) alkyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle, notamment le composé de formule The subject of the present invention is also compounds of formula (3)
in which - C represents a substituent chosen from (a) and (b) as defined above, R 1 represents a methyl, 2-cyanoethyl group,
2-silylethyl or allyl, and - R2 represents a group (X3) or (X4)
where R3 is methyl, 2-cyanoethyl, 2-silylethyl or allyl, and R4 is a substituent
selected from the groups -NR'R, morpholino, N-pyrrolidinyl and 2,2,6,6-tetramethyl-N-piperidyl, R 'and R "each being a (C 1 -C 4) alkyl group, and
Lev represents a levulinyl group, especially the compound of formula
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Les composés de formule (3) peuvent être préparés par un procédé comprenant les étapes suivantes : - irradiation du composé de formule (1) pour obtenir un composé de formule (2), - réaction du composé de formule (2) avec un composé de formule (4)
dans laquelle - R3 représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et - R4 représente un groupe choisi parmi les groupes
- NR'R", morpholino, N-pyrrolidinyle et 2, 2, 6, 6,-tétraméthyl-N-pipéridyle, R'et R"étant chacun un groupe (CI-C4) alkyle pour obtenir le composé de formule (3). The compounds of formula (3) may be prepared by a process comprising the following steps: - irradiation of the compound of formula (1) to obtain a compound of formula (2), - reaction of the compound of formula (2) with a compound of formula (4)
in which - R3 represents a methyl, 2-cyanoethyl group,
2-silylethyl or allyl, and - R4 represents a group selected from groups
- NR'R ", morpholino, N-pyrrolidinyl and 2,2,6,6-tetramethyl-N-piperidyl, R 'and R" each being a (C 1 -C 4) alkyl group to obtain the compound of formula (3 ).
Pour obtenir un composé de formule (2a), on peut réaliser l'irradiation du composé de formule (1) par un To obtain a compound of formula (2a), it is possible to irradiate the compound of formula (1) with a
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rayonnement UV à 254 nm dans une solution aqueuse d'acétonitrile, à une température comprise entre 0 et 20 C. UV radiation at 254 nm in an aqueous solution of acetonitrile, at a temperature between 0 and 20 C.
Pour la préparation des composés de formule (2b), on peut réaliser l'irradiation dans des conditions classiques connues de l'homme du métier, notamment à une longueur d'onde supérieure à 290 nm dans une solution aqueuse d'acétonitrile en présence d'acétone. For the preparation of the compounds of formula (2b), the irradiation can be carried out under standard conditions known to those skilled in the art, especially at a wavelength greater than 290 nm in an aqueous acetonitrile solution in the presence of 'acetone.
La préparation des composés de formule (3) à partir des composés de formule (2) et de formule (4) est réalisée par des méthodes connues de l'homme du métier. The preparation of the compounds of formula (3) from the compounds of formula (2) and formula (4) is carried out by methods known to those skilled in the art.
Les composés de formule (3) peuvent être utilisés pour la préparation d'ADN contenant des lésions photochimiques de formule (a) et (b) en utilisant un synthétiseur d'ADN selon des méthodes classiques connues de l'homme du métier. The compounds of formula (3) can be used for the preparation of DNA containing photochemical lesions of formula (a) and (b) using a DNA synthesizer according to conventional methods known to those skilled in the art.
Les exemples qui suivent illustrent l'invention. The following examples illustrate the invention.
Exemple 1 : Synthèse du O-cyanoéthyle phosphate 5'-0- lévulinyl-P- (2-cyanoéthyl)-T (cis-syn) T-3'- (2-cyanoéthyl) - N, N-diisopropylphosphoramidite : 1.1. Synthèse du O-cyanoéthyle phosphate de la 5'-0- lévulinylthymidilyl (3'-5') thymidine. Example 1 Synthesis of O-cyanoethyl phosphate 5'-O-levulinyl-P- (2-cyanoethyl) -T (cis-syn) T -3'- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite: 1.1. Synthesis of O-cyanoethyl phosphate of 5'-O-levulinylthymidilyl (3'-5 ') thymidine.
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A une solution de 3'-0- (4, 4'diméthoxytrityl) thymidine préparée selon la méthode décrite par Wagner T. et coll., Nucleosides and Nucleotides (1997), 16,1657-1660 (168 mg ; 0,31 mmole) dans l'acétonitrile anhydre (20 ml) sont additionnées par canulation, une solution de tétrazole (71 mg ; 1,023 mmole ; 3,3 eq) dans l'acétonitrile anhydre (10 ml) puis une solution de 5'-0-lévulinylthymidine-3'- (2- cyanoéthyl)-N, N-diisopropylphosphoramidite (ChemGenes Corp., Ashland, MA, USA) (250 mg ; 0,46 mmole ; 1,5 eq) dans l'acétonitrile anhydre (20 ml). Le mélange réactionnel, placé sous atmosphère d'argon, est agité à température ambiante pendant 30 minutes. Une solution d'iode 0,36 M (2,5 ml) dans le mélange tétrahydrofurane/eau/lutidine (50/25/25) est ensuite ajoutée. Après 20 minutes d'agitation, la solution est concentrée sous vide à température ambiante et reprise par du dichlorométhane puis une solution saturée de sodium thiosulfate est ajoutée goutte à goutte jusqu'à décoloration de la phase organique. Après addition d'eau jusqu'à égalisation des deux phases, la phase organique To a solution of 3'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) thymidine prepared according to the method described by Wagner T. et al., Nucleosides and Nucleotides (1997), 16, 1657-1660 (168 mg, 0.31 mmol). ) in anhydrous acetonitrile (20 ml) are added by cannulation, a solution of tetrazole (71 mg, 1.023 mmol, 3.3 eq) in anhydrous acetonitrile (10 ml) and then a solution of 5'-O-levulinylthymidine -3'- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite (ChemGenes Corp., Ashland, MA, USA) (250 mg, 0.46 mmol, 1.5 eq) in anhydrous acetonitrile (20 mL). The reaction mixture, placed under an argon atmosphere, is stirred at room temperature for 30 minutes. A solution of 0.36 M iodine (2.5 ml) in tetrahydrofuran / water / lutidine (50/25/25) is then added. After stirring for 20 minutes, the solution is concentrated under vacuum at room temperature and taken up in dichloromethane and then a saturated solution of sodium thiosulfate is added dropwise until the organic phase is decolorized. After addition of water until the two phases are equalized, the organic phase
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est lavée puis séchée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée à sec. Le résidu obtenu est repris par 2,5 ml d'une solution à 3% d'acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane anhydre et la solution est agitée pendant 10 minutes. Après trois coévaporations successives avec du méthanol, le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice. L'élution est effectuée par un gradient croissant de méthanol (0-10 %) dans le dichlorométhane. Le composé attendu est obtenu sous forme d'une mousse blanche avec un rendement global de 87 % (194 mg ; 0,27 mmole).
is washed and then dried over anhydrous sodium sulphate and concentrated to dryness. The residue obtained is taken up in 2.5 ml of a 3% solution of trifluoroacetic acid in anhydrous dichloromethane and the solution is stirred for 10 minutes. After three successive coevaporations with methanol, the residue is purified by chromatography on silica gel. Elution is carried out by increasing gradient of methanol (0-10%) in dichloromethane. The expected compound is obtained in the form of a white foam with an overall yield of 87% (194 mg, 0.27 mmol).
RMN IH (0, ppm ; J, Hz) (CD30D, 300 MHz) 7, 53 et 7, 51 (1H, sl, H6 Tpa) ; 7, 47 (1H, s, H6 pTa) ; 6, 26 (1H, t, J=6, 8, Hl'pT) ; 6, 23 (1H, t, J=7, 0, Hl'Tp) ; 5, 12 (1H, m, H3'Tp) ; 4, 49-4, 25 (8H, m, H3'pT, H4'Tpb, H5'H5"pT, H5'H5"Tp, OCH2 CH2CN) ; 4, 08 (1H, s, H4'pTb) ; 2, 93 (2H, m, OCH2CH2CN) ; 2, 82 (2H, m, OCOCHsCHsCOMe) ; 2, 70-2, 80 (3H, m, OCOCH2CH2COMe, H2'pTc) ; 2, 47 (1H, m, H2" Top') ; 2, 29 (2H, m, H2'H2"pT) ; 2,16 (3H, s, OCOCH2CH2COMe) ; 1,89 (3H, s, Me pTd) ; 1.88 (3H, s, Me Tpd). RMN 13C (#, ppm) (CD30D, 75 MHz)
209, 6 (OCOCH2CH2COMe) ; 174, 3 (OCOCHCOMe) ; 166, 4 (C4 Tp, C4 pT) ; 152, 4 (C2 Tpa) ; 152, 3 (C2 pTa) 138, 0 (C6 Tpb) ; 137, 6 (C6 pTb) ; 118, 0 (CN) ; 112, 2 (C5 Tp, C5 pT) ; 86, 7 (C1'Tp, C1'pT) ; 86, 1 (C4'pTc) ; 84, 2 (C4'Tpc) ; 80,1 (C3'Tp) ; 71,8 (C3'pT) ; 69,5 (C5'pT) ; 64,7 (C5'Tp, OCH2CH2CN) ; 40,5 (C2'pT) ; 39,1 (C2'Tp) ; 38,8 (COCH2CH2COMe) ; 29,9 (OCOCH2CH2COMe) 28,9 (OCOCH2CH2COMe) ; 20,4 (OCH2CH2CN) ; 12,7 (CH3 pT, CH3 Tp). 1 H NMR (0, ppm, J, Hz) (CD 30 D, 300 MHz) δ, 53 and 7.11 (1H, ss, H 6 Tpa); 7, 47 (1H, s, H6 pTa); 6, 26 (1H, t, J = 6.8, H1'pT); 6, 23 (1H, t, J = 7.0, H1'Tp); 5, 12 (1H, m, H3'Tp); 4.49-4.4 (8H, m, H3'pT, H4'Tpb, H5'H5 "pT, H5'H5" Tp, OCH2 CH2CN); 4. 08 (1H, s, H4'pTb); 2.93 (2H, m, OCH2CH2CN); 2.82 (2H, m, OCOCHsCHsCOMe); 2.70-2.80 (3H, m, OCOCH2CH2COMe, H2'pTc); 2.47 (1H, m, H2 "Top"); 2.29 (2H, m, H2'H2 "pT); 2.16 (3H, s, OCOCH2CH2COMe); 1.89 (3H, s, Me pTd); 1.88 (3H, s, Me Tpd). 13C NMR (#, ppm) (CD30D, 75 MHz)
209, 6 (OCOCH2CH2COMe); 174, 3 (OCOCHCOMe); 166.4 (C4 Tp, C4 pT); 152, 4 (C2 Tpa); 152, 3 (C2 pTa) 138.0 (C6 Tbp); 137.6 (C6 pTb); 118.0 (CN); 112, 2 (C5 Tp, C5 pT); 86, 7 (C1'Tp, C1'pT); 86.1 (C4'pTc); 84.2 (C4'Tpc); 80.1 (C3'Tp); 71.8 (C3'pT); 69.5 (C5'pT); 64.7 (C5'Tp, OCH2CH2CN); 40.5 (C2'pT); 39.1 (C2'Tp); 38.8 (COCH2CH2COMe); 29.9 (OCOCH2CH2COMe) 28.9 (OCOCH2CH2COMe); 20.4 (OCH 2 CH 2 CN); 12.7 (CH3 pT, CH3 Tp).
RMN 31p (0, ppm) :-1, 65 (CD30D, 121 MHz) NMR 31p (0, ppm): -1.65 (CD30D, 121 MHz)
<Desc/Clms Page number 14><Desc / Clms Page number 14>
SM HR (FAB) : (M+H) + calculé pour C2sH37014NsP 698,2074, trouvé 698,2092. MS HR (FAB): (M + H) + calcd for C28H17014NsP 698.2074, found 698.2092.
1.2. Synthèse de
1.2. Synthesis of
Une solution 0,7 mM du composé obtenu à l'étape précédente (400 ml) dans un mélange eau/acétonitrile (70 : 30) est placée dans réacteur en pyrex de contenance 500 ml. Après bullage d'argon pendant 30 minutes, 20 ml d'acétone sont ajoutés. L'irradiation ultraviolette est réalisée à l'aide d'une lampe à mercure haute pression (Hanau Q81 ; 80 watts) munie d'une enveloppe réfrigérée en pyrex, et positionnée à l'intérieur du réacteur. La durée de l'irradiation est de 4 heures. Le photolysat est ensuite concentré puis purifié par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse. A 0.7 mM solution of the compound obtained in the preceding step (400 ml) in a water / acetonitrile mixture (70:30) is placed in a 500 ml Pyrex reactor. After bubbling argon for 30 minutes, 20 ml of acetone are added. The ultraviolet irradiation is carried out using a high-pressure mercury lamp (Hanau Q81, 80 watts) equipped with a refrigerated Pyrex envelope, and positioned inside the reactor. The duration of the irradiation is 4 hours. The photolysate is then concentrated and then purified by reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC).
- Colonne préparative : Waters Preppak Cartrige, bondapak
C18, 125 (15-20 pm), 47x300 mm. - Preparative column: Waters Preppak Cartrige, bondapak
C18, 125 (15-20 μm), 47x300 mm.
- Conditions : Détection : 230 nm, Débit : 50 ml/minutes - Conditions: Detection: 230 nm, Flow: 50 ml / minutes
<Desc/Clms Page number 15><Desc / Clms Page number 15>
Table du gradient
Gradient table
<tb>
<tb> Éluant
<tb> Temps <SEP> H2O/CH3CN <SEP> H2O/CH3CN
<tb> (minutes) <SEP> 90 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> 50 <SEP> : <SEP> 50
<tb> Initial <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> 65 <SEP> 87 <SEP> 13
<tb> 90 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> <Tb>
<tb> Eluent
<tb> Time <SEP> H2O / CH3CN <SEP> H2O / CH3CN
<tb> (minutes) <SEP> 90 <SEP>: <SEP> 10 <SEP> 50 <SEP>: <SEP> 50
<tb> Initial <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> 65 <SEP> 87 <SEP> 13
<tb> 90 <SEP> 0 <SEP> 100
<Tb>
La fraction de temps de rétention 54 minutes, obtenue avec un rendement de 30%, correspond au composé attendu. Elle est constituée d'un mélange équimoléculaire des deux diastéréoisomères de l'isomère Cis-Syn. The fraction of retention time 54 minutes, obtained with a yield of 30%, corresponds to the expected compound. It consists of an equimolecular mixture of the two diastereoisomers of the Cis-Syn isomer.
RMN 1H (0, ppm ; J, Hz) (D20, 400 MHz) 6,25 (0,5H, t, J=6,5, Hl'pT) ; 6,06 (0,5H, m, Hl'pT) ; 5,74 (0,5H, dd, J = 10, 4 ; 4,2 Hl'Tp) ; 5,38 (0,5H, dd, J = 10,2 ; 4,2, Hl'Tp), 5, 11 ; 5,07 (1H, sl, H3'Tp) ; 1,61 (3H, s, CH3 Tp*) ; 1, 54 (3H, s, CH3 pT*). 1 H NMR (O, ppm, J, Hz) (D 2 O, 400 MHz) 6.25 (0.5H, t, J = 6.5, HCl); 6.06 (0.5H, m, H, Pt); 5.74 (0.5H, dd, J = 10.4; 4.2H! Tp); 5.38 (0.5H, dd, J = 10.2, 4.2, H1'Tp), 5, 11; 5.07 (1H, ss, H3'Tp); 1.61 (3H, s, CH3 Tp *); 1, 54 (3H, s, CH3 pT *).
RMN 31p (8, ppm) : -4, 02 ;-4, 52 (D2O, 243 MHz) SM HR (FAB) : (M+H) + calculé pour C28H37014NsP 698,2074, trouvé 698, 2076. 31 P NMR (8 ppm): -4.02; -4.52 (D2O, 243 MHz) MS HR (FAB): (M + H) + calcd for C28H37014NsP 698.2074, found 698, 2076.
La fraction de temps de rétention 54 minutes est traitée par une solution aqueuse ammoniacale à 32% pendant une nuit à température ambiante. L'analyse du spectre de RMN H du brut réactionnel montre la présence d'un seul composé. Celui-ci est identifié au dimère cyclobutanique Cis-Syn du dinucléotide de thymine de formule The fraction of retention time 54 minutes is treated with a 32% aqueous ammonia solution overnight at room temperature. Analysis of the 1 H NMR spectrum of the reaction crude shows the presence of a single compound. This is identified with the cyclobutanic dimer Cis-Syn of the thymine dinucleotide of formula
<Desc/Clms Page number 16> <Desc / Clms Page number 16>
par comparaison avec les données de RMN du proton de la littérature ( (a) Kemmink J., Boelens R., Kaptein R., "Eur. Biophys. J" (1987), 14,293-299. (b) Koning T. M. G., Van Soest J. J. G., Kaptein R.,"Eur. J. Biochem." (1991), 195,29-40). Le composé obtenu correspond effectivement au mélange diastéréoisomérique de l'isomère Cis-Syn.
by comparison with proton NMR data from the literature ((a) Kemmink J., Boelens R., Kaptein R., Eur. Biophys J (1987), 14,293-299. (b) Koning TMG, Van Soest JJG, Kaptein R., "Eur J. Biochem." (1991), 195, 29-40). The compound obtained corresponds effectively to the diastereoisomeric mixture of the Cis-Syn isomer.
RMN IH (8, ppm ; J, Hz) (D20, 300 MHz) 5,98 (1H, dd, J=5,7 et 8,8, Hl'pT) ; 5,66 (1H, dd, J = 5,3 ; 8,6, H1'Tp) ; 4,65 (1H, m, H3'Tp) ; 4,33 (2H, m, H6 pT, H3'pT) ; 4,25 (1H, d, J=5,9, H6 Tp) ; 4,19-3, 89 (4H, m, H4'Tp, H4'pT, H5'H5"pT) ; 3, 70 (2H, m, H5'H5"Tp) ; 2,61 (1H, ddd, J=13,8 ; 8, 6 ; 5,3, H2'Tp) ; 2,43-2, 25 (2H, m, H2"Tp, H2'pT) ; 2,09 (1H, ddd, J=13, 6 ; 5, 7 ; 3,5 H2"
1. 3. Synthèse de 5'-O-lévulinyl-P- (2-cyanoéthyl) -T (cissyn) T-3'- (2-cyanoéthyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite. 1 H NMR (8 ppm, J, Hz) (D 2 O, 300 MHz) 5.98 (1H, dd, J = 5.7 and 8.8, HCl); 5.66 (1H, dd, J = 5.3, 8.6, H1'Tp); 4.65 (1H, m, H3'Tp); 4.33 (2H, m, H6 pT, H3'pT); 4.25 (1H, d, J = 5.9, H6 Tp); 4.19-3.89 (4H, m, H4'Tp, H4'pT, H5'H5 "pT); 3.10 (2H, m, H5'H5"Tp); 2.61 (1H, ddd, J = 13.8, 8.6, 5.3, H2'Tp); 2.43-2.25 (2H, m, H 2 Tp, H 2 Pt), 2.09 (1H, ddd, J = 13.6, 5.7, 3.5H 2 O.
1. 3. Synthesis of 5'-O-levulinyl-P- (2-cyanoethyl) -T (cissyn) T-3'- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite.
Le photoproduit obtenu à l'étape précédente (100 mg, 0,14 mmol), séché pendant une nuit sous vide dans un dessicateur contenant du pentoxyde de phosphore, est repris dans un mélange de tétrahydrofurane/acétonitrile (1/1) anhydre (2ml). Après avoir ajouté la The photoproduct obtained in the previous step (100 mg, 0.14 mmol), dried overnight under vacuum in a desiccator containing phosphorus pentoxide, is taken up in a mixture of anhydrous tetrahydrofuran / acetonitrile (1/1) (2 ml). ). After adding the
<Desc/Clms Page number 17><Desc / Clms Page number 17>
diisopropyléthylamine (100 gl, 0,57 mmol, 4 éq), la réaction est agitée 30 minutes à température ambiante, sous atmosphère d'argon. Le chloro- (2-cyanoéthyl)-bis- N, N'-diisopropylphosphoramidite (64 gl, 0.28 mmol, 2 éq) est additionné et la réaction agitée pendant 10 minutes. diisopropylethylamine (100 μl, 0.57 mmol, 4 eq), the reaction is stirred for 30 minutes at room temperature under an argon atmosphere. Chloro- (2-cyanoethyl) -bis-N, N'-diisopropylphosphoramidite (64 g, 0.28 mmol, 2 eq) is added and the reaction stirred for 10 minutes.
Le mélange réactionnel est ensuite concentré puis repris par du dichlorométhane et une solution saturée de bicarbonate de sodium. Après lavage, la phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre puis évaporée. The reaction mixture is then concentrated and then taken up in dichloromethane and a saturated solution of sodium bicarbonate. After washing, the organic phase is dried over anhydrous sodium sulphate and then evaporated.
Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice (granulométrie 6-35 microns) avec un gradient d'acétone dans l'acétate d'éthyle (0-40%). Le composé attendu est obtenu sous forme d'une laque translucide avec un rendement de 58 % (75 mg). The residue obtained is purified by chromatography on silica gel (particle size 6-35 microns) with a gradient of acetone in ethyl acetate (0-40%). The expected compound is obtained in the form of a translucent lacquer with a yield of 58% (75 mg).
RMN 31p (8, ppm) : 149,78 ; 149,63 ;-4, 06 (CD3CN, 243 MHz) Exemple 2 : Synthèse d'oligonucléotides 10 et 32 mères renfermant l'adduit cis-syn cyclobutanique de thymine
Le composé de l'exemple 1 (cs) a été employé pour synthétiser deux oligonucléotides 10 et 32 mères de séquence :
10 mère : CGCAT [cs] TACGC
32 mère : GATCTCGGCGACATCGGT [cs] TCCGTCCTAACTCG 2.1. Synthèse sur support solide. 31 P NMR (8 ppm): 149.78; 149.63; -4.06 (CD3CN, 243 MHz) Example 2 Synthesis of 10 and 32-mer oligonucleotides containing the cis-syn cyclobutanic adduct of thymine
The compound of Example 1 (cs) was used to synthesize two oligonucleotides 10 and 32 mothers of sequence:
10 mother: CGCAT [cs] TACGC
32 mother: GATCTCGGCGACATCGGT [cs] TCCGTCCTAACTCG 2.1. Synthesis on solid support.
Les synthèses ont été réalisées sur un synthétiseur d'ADN Applied Biosystems, 392 DNA/RNA Synthesizer à l'échelle micromolaire. The syntheses were performed on an Applied Biosystems DNA synthesizer, 392 DNA / RNA Synthesizer at the micromolar scale.
Les phosphoramidites standards ont été employés. Standard phosphoramidites have been employed.
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Le phosphoramidite de l'exemple 1 est utilisé à une concentration de 0,1 M dans un mélange tétrahydrofurane/acétonitrile (1/3). The phosphoramidite of Example 1 is used at a concentration of 0.1 M in a tetrahydrofuran / acetonitrile mixture (1/3).
Un cycle modifié a été utilisé lors du couplage de ce phosphoramidite. Les modifications par rapport au cycle standard comprennent : un temps de couplage rallongé à 20 minutes, un double coiffage (double capping), et un rinçage supplémentaire, - une suppression de l'étape de détritylation remplacée par une déprotection du groupement lévulinyle avec une solution de monohydrate d'hydrazine 0,5 M dans un mélange pyridine/acide acétique (3/2, v/v) en deux passages de 5 minutes suivie de cinq lavages de 30 secondes à l'acétonitrile. A modified cycle was used when coupling this phosphoramidite. The modifications with respect to the standard cycle include: a coupling time extended to 20 minutes, a double capping, and an additional rinse, a suppression of the detritylation step replaced by a deprotection of the levulinyl group with a solution of 0.5 M hydrazine monohydrate in a pyridine / acetic acid mixture (3/2, v / v) in two passages of 5 minutes followed by five washings of 30 seconds with acetonitrile.
Les rendements de couplages du phosphoramidite de l'exemple 1 ont été évalués par la mesure conductimétrique du cation Dmt+ libéré pour des couplages suivants par rapport à des couplages précédants l'incorporation dudit phosphoramidite. Dans le cas du 10 mère, le rendement de couplage pour le phosphoramidite utilisé (position 5) et le suivant (A6) par rapport à celui précédent le phosphoramidite modifié (A4) est de l'ordre de 87%. Dans le cas du 32 mère, le rendement de couplage pour le phosphoramidite utilisé (position 14), le précedent (C13) et les deux suivants (G15 et G16) par rapport à C12 est de l'ordre de 91%. The phosphoramidite coupling yields of Example 1 were evaluated by the conductimetric measurement of the Dmt + cation released for subsequent couplings with respect to couplings preceding the incorporation of said phosphoramidite. In the case of the mother, the coupling efficiency for the phosphoramidite used (position 5) and the following (A6) compared to that preceding the modified phosphoramidite (A4) is of the order of 87%. In the case of the mother, the coupling efficiency for the phosphoramidite used (position 14), the previous one (C13) and the next two (G15 and G16) with respect to C12 is of the order of 91%.
2.2. Déprotection et purification. 2.2. Deprotection and purification.
2.2. 1. Déprotection des bases nucléiques, du phosphate triester et décrochage du support 2.2. 1. Deprotection of nucleic bases, phosphate triester and support stall
<Desc/Clms Page number 19> <Desc / Clms Page number 19>
Les oligonucléotides sont déprotégés et"décrochés" du support par action d'une solution aqueuse ammoniacale à 32% pendant 24 h à température ambiante, à l'abri de la lumière. Après évaporation à sec, les oligonucléotides tritylés sont purifiés par CLHP en polarité de phase inverse. The oligonucleotides are deprotected and "unhooked" from the support by the action of a 32% aqueous ammonia solution for 24 hours at room temperature, protected from light. After evaporation to dryness, the tritylated oligonucleotides are purified by HPLC in reverse phase polarity.
Colonne semipréparative : Waters Prepak Delta-Pak C18 25 x 100 mm (15 pm, 300 ). Semi-preparative column: Waters Prepak Delta-Pak C18 25 x 100 mm (15 μm, 300).
Conditions : Détection à 260 nm, Débit 3 ml/minutes
Table de gradient
Conditions: Detection at 260 nm, Flow 3 ml / minutes
Gradient table
<tb>
<tb> Eluant
<tb> Temps <SEP> Acétate <SEP> de <SEP> TEA <SEP> CH3CN
<tb> (minutes) <SEP> 0,1 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 7
<tb> Initial <SEP> 95 <SEP> 5
<tb> 55 <SEP> 60 <SEP> 40
<tb>
Temps de rétention au lU mère : 41. minutes. <Tb>
<tb> Eluent
<tb> Time <SEP> Acetate <SEP> of <SEP> TEA <SEP> CH3CN
<tb> (minutes) <SEP> 0.1 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 7
<tb> Initial <SEP> 95 <SEP> 5
<tb> 55 <SEP> 60 <SEP> 40
<Tb>
Retention time in mother: 41 minutes.
Temps de rétention du 32 mère : 41 minutes. Retention time of 32 mother: 41 minutes.
2.2. 2. Détritylation des oligonucléotides. 2.2. 2. Detritylation of oligonucleotides.
Les oligonucléotides tritylés sont détritylés par traitement par une solution aqueuse d'acide acétique 40% pendant 2 heures puis purifiés par CLHP en polarité de phase inverse. The tritylated oligonucleotides are detitylated by treatment with a 40% aqueous acetic acid solution for 2 hours and then purified by HPLC in reverse phase polarity.
Colonne analytique : Waters Delta-Pak C18 3,9 x 150 mm (5Mm, 300 À). Analytical column: Waters Delta-Pak C18 3.9 x 150 mm (5Mm, 300 A).
Conditions : Détection à 260 nm, Débit 1 ml/minute
Table de gradient
Conditions: Detection at 260 nm, Flow 1 ml / minute
Gradient table
<tb>
<tb> Eluant
<tb> Temps <SEP> Acétate <SEP> de <SEP> TEA <SEP> CH3CN
<tb> (minutes) <SEP> 0,1 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 7
<tb> Initial <SEP> 95 <SEP> 5
<tb> 30 <SEP> 60 <SEP> 40
<tb>
Temps de rétention du 10 mère : 12,8 minutes. Temps de rétention du 32 mère : 11,9 minutes. <Tb>
<tb> Eluent
<tb> Time <SEP> Acetate <SEP> of <SEP> TEA <SEP> CH3CN
<tb> (minutes) <SEP> 0.1 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 7
<tb> Initial <SEP> 95 <SEP> 5
<tb> 30 <SEP> 60 <SEP> 40
<Tb>
Maternal retention time: 12.8 minutes. Retention time of 32 mother: 11.9 minutes.
<Desc/Clms Page number 20> <Desc / Clms Page number 20>
2. 2. 3. Caractérisation.
2. 2. 3. Characterization.
L'analyse en spectrométrie de masse MALDI (mode positif) des oligonucléotides 10 et 32 mères est la suivante :
10 mère Masse (M+H) + calculée 2988.005, mesurée 2988.7 +/-0, 5u
32 mère Masse (M+H) + calculée 9767.371, mesurée
9764.3 +/-5u. The MALDI (positive mode) mass spectrometry analysis of the 10 and 32-mer oligonucleotides is as follows:
10 mother Mass (M + H) + calcd 2988.005, measured 2988.7 +/- 0.5u
32 dam Mass (M + H) + calcd. 9767.371, measured
9764.3 +/- 5u.
Ainsi, l'utilisation de dérivés de formule (1) selon l'invention permet d'obtenir de manière rapide et économique des adduits de formule (3) qui peuvent être incorporés dans des oligonucléotides aptes à être utilisés par des biophysiciens et des physicochimistes pour des études structurales, par des biochimistes et des biologistes pour des études dans le domaine de la réparation de l'ADN, de la transcription et de son contrôle, dans le domaine immunitaire et dans le domaine de la transduction de signaux consécutifs à l'exposition cellulaire du rayonnement UV. Thus, the use of derivatives of formula (1) according to the invention makes it possible to obtain quickly and economically adducts of formula (3) which can be incorporated in oligonucleotides suitable for use by biophysicists and physicochemists for structural studies, by biochemists and biologists for studies in the field of DNA repair, transcription and its control, in the immune field and in the field of post-exposure signal transduction cellular UV radiation.
Claims (2)
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- 2003-02-20 AU AU2003222938A patent/AU2003222938A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
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EP0787740A2 (en) * | 1996-01-31 | 1997-08-06 | Biomolecular Engineering Research Institute | Coupling unit of (6-4)photoproduct, process for preparing the same, process for preparing oligonucleotide containing (6-4) photoproduct by using the same and process for preparing DNA containing (6-4) photoproduct by using the same |
Non-Patent Citations (4)
Title |
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