FR2835848A1 - COMBINATIONS OF VECTORS AND THEIR HOSTS FOR PROPAGATING AND EXPRESSING RECOMBINANT GENES WITHOUT USING ANTIBIOTICS - Google Patents
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Abstract
L'invention se rapporte à de nouveaux systèmes eubactériens d'expression de protéines, utilisant le gène dapA comme marqueur de sélection, ainsi qu'à leur utilisation pour la production de protéines recombinantes.The invention relates to novel eubacterial protein expression systems, using the dapA gene as a selection marker, as well as to their use for the production of recombinant proteins.
Description
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L'invention se rapporte à de nouveaux systèmes eubactériens d'expression de protéines, permettant de ne pas utiliser d'antibiotiques, ainsi qu'à leur utilisation pour la production de protéines recombinantes. The present invention relates to novel eubacterial protein expression systems for not using antibiotics and their use for the production of recombinant proteins.
La production de protéines recombinantes dans des hôtes eubactériens s'effectue actuellement en utilisant des plasmides portant des gènes de résistance aux antibiotiques en tant que marqueurs de sélection positive. On transforme les microorganismes avec ces plasmides portant le gène codant pour la protéine d'intérêt, sous le contrôle d'un promoteur approprié (constitutif ou inductible selon le but recherché), et on sélectionne les transformants, par leur aptitude à proliférer dans un milieu contenant l'antibiotique marqueur de sélection. The production of recombinant proteins in eubacterial hosts is currently carried out using plasmids carrying antibiotic resistance genes as positive selection markers. The microorganisms are transformed with these plasmids carrying the gene coding for the protein of interest, under the control of an appropriate promoter (constitutive or inducible according to the desired objective), and the transformants are selected by their ability to proliferate in a medium. containing the antibiotic selection marker.
On utilise en général l'ampicilline, la tétracycline, la kanamycine ou le chloramphénicol pour la sélection. Parmi ces antibiotiques utilisés pour la sélection, ceux dont l'activité est bactéricide sont généralement préférés à ceux dont l'activité est bactériostatique. Ampicillin, tetracycline, kanamycin or chloramphenicol are generally used for selection. Among these antibiotics used for selection, those whose activity is bactericidal are generally preferred to those whose activity is bacteriostatic.
Toutefois, de tels systèmes d'expression, s'ils peuvent éventuellement être adaptés à la production de protéines dans les laboratoires scientifiques, ne sont pas souhaitable pour la production de protéines à grande échelle. En particulier, les plasmides portant les gènes de résistance à un antibiotique peuvent être échangés entre des microorganismes, ce qui peut donner lieu à une dissémination du gène de résistance dans des organismes sauvages. Par ailleurs, il peut rester des traces d'antibiotiques dans les préparations de protéines, ce qui est rédhibitoire lorsque la protéine recombinante doit obtenir un agrément de la part d'autorités réglementaires. However, such expression systems, while potentially suitable for protein production in scientific laboratories, are not desirable for large scale protein production. In particular, plasmids carrying the antibiotic resistance genes can be exchanged between microorganisms, which can lead to dissemination of the resistance gene in wild organisms. In addition, there may be traces of antibiotics in the protein preparations, which is unacceptable when the recombinant protein must obtain approval from regulatory authorities.
Il convient donc de mettre au point de nouveaux systèmes d'expression de protéines, dont la propagation ne requiert pas l'emploi d'antibiotiques pour produire la protéine d'intérêt. New protein expression systems, the spread of which does not require the use of antibiotics to produce the protein of interest, need to be developed.
On peut définir la stabilité d'un plasmide dans son hôte comme étant la propriété de maintenir une expression de la (ou des) protéine (s) d'intérêt, tout en maintenant l'activité détectable de la protéine, après propagation de l'hôte, pendant The stability of a plasmid in its host can be defined as the property of maintaining an expression of the protein (s) of interest, while maintaining the detectable activity of the protein, after propagation of the host, during
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un nombre de génération supérieur à 40 générations, de préférence, supérieur à 50 générations, de façon plus préférée supérieur à 60 générations. a generation number greater than 40 generations, preferably greater than 50 generations, more preferably greater than 60 generations.
Une méthode de propagation de l'hôte consiste à ensemencer au millième un milieu de culture avec un aliquote provenant d'une culture stationnaire
(généralement après 24 heures de culture dans les conditions normales (37 C pour Escherichia coli)), et à répéter cette opération. Chaque opération de nouvel ensemencement correspond à la réalisation d'environ 10 générations. A method of propagation of the host consists in seeding a thousandth of a culture medium with an aliquot from a stationary culture
(usually after 24 hours of culture under normal conditions (37 C for Escherichia coli)), and to repeat this operation. Each new seeding operation corresponds to about 10 generations.
Dans un premier mode de réalisation, l'invention se rapporte à un vecteur d'expression d'une protéine dans ue eubactérie, caractérisé en ce qu'il comprend, en tant qu'unique facteur de sélection positive, un gène complémentant une auxotrophie à l'acide meso-diaminopimélique (DAP), choisi notamment dans les gènes de synthèse de DAP. In a first embodiment, the invention relates to a vector for expressing a protein in eubacteria, characterized in that it comprises, as sole positive selection factor, a gene complementing an auxotrophy to mesodiaminopimelic acid (DAP), chosen especially in the DAP synthesis genes.
De préférence, le facteur de sélection positive n'est pas le gène dapD2, mais est le gène asd (codant pour l'aspartate semialdéhyde déhydrogénase, Haziza et al., EMBO J., 1982,1 (3), 379-84, GenBank V00262, SEQ ID NO 20), ou le gène dapA. Preferably, the positive selection factor is not the dapD2 gene, but is the asd gene (coding for aspartate semialdehyde dehydrogenase, Haziza et al., EMBO J., 1982, 1 (3), 379-84, GenBank V00262, SEQ ID NO. 20), or the dapA gene.
Le gène dapA choisi est de préférence issu de E. coli, tel le gène décrit dans GenBank (M12844), et dont la séquence codante est représentée par SEQ ID NO 1. The dapA gene chosen is preferably derived from E. coli, such as the gene described in GenBank (M12844), and whose coding sequence is represented by SEQ ID No. 1.
Ce gène dapA code pour la dihydropicolinate synthase, enzyme qui catalyse la première étape de la synthèse de l'acide meso-diaminopimélique (DAP) précurseur du peptidoglycanne de la paroi et de la lysine des protéines. This dapA gene codes for dihydropicolinate synthase, an enzyme that catalyzes the first step in the synthesis of mesodiaminopimelic acid (DAP), a precursor for the peptidoglycan of the lysine wall and lysine.
Le gène asd code pour l'aspartate semialdéhyde déhydrogénase, enzyme impliquée non seulement dans la synthèse du DAP mais aussi dans celle de la lysine, la méthionine, et la thréonine des protéines. The asd gene codes for aspartate semialdehyde dehydrogenase, an enzyme involved not only in the synthesis of DAP but also in that of lysine, methionine, and threonine proteins.
Un intérêt d'utiliser une auxotrophie au DAP est que, contrairement à la plupart des autres auxotrophies décrites, on peut utiliser des milieux riches classiques pour propager les bactéries. En effet, ceux-ci ne contiennent pas de DAP, alors qu'ils contiennent généralement les facteurs de complémentation pour les autres auxotrophies (acides aminés...), et qu'il est donc nécessaire, pour ces autres auxotrophies, d'utiliser des milieux minimaux. An advantage of using DAP auxotrophy is that, unlike most of the other described auxotrophies, conventional rich media can be used to propagate the bacteria. Indeed, these do not contain DAP, whereas they generally contain the complementation factors for the other auxotrophies (amino acids ...), and it is therefore necessary for these other auxotrophies to use minimal environments.
Un autre intérêt du choix de DAP comme marqueur d'auxotrophie est que le déficit en cet élément est bactéricide (et non bactériostatique). Another advantage of the choice of DAP as an auxotrophy marker is that the deficiency of this element is bactericidal (and not bacteriostatic).
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Afin de réaliser la sélection des transformants, on utilise alors des hôtes pour lesquels le gène dapA a été inactivé, de préférence de façon non réversible, c'est-àdire qu'une mutation naturelle lors de la croissance de l'hôte ne peut pas restaurer l'activité endogène du gène dapA. Lorsque le gène est inactivé, les bactéries ne peuvent pas se développer sur un milieu ne contenant pas de DAP. En revanche, après transformation par le vecteur selon l'invention et complémentation en trans, la présence de DAP n'est plus requise pour la croissance des microorganismes. In order to carry out the selection of the transformants, we then use hosts for which the dapA gene has been inactivated, preferably in a non-reversible manner, that is to say that a natural mutation during the growth of the host can not be used. restore the endogenous activity of the dapA gene. When the gene is inactivated, the bacteria can not grow on a medium that does not contain DAP. On the other hand, after transformation with the vector according to the invention and complementation in trans, the presence of DAP is no longer required for the growth of microorganisms.
On obtient les bactéries modifiées par des techniques classiques de mutagenèse dirigée ou d'inactivation du gène par recombinaison homologue. The modified bacteria are obtained by conventional techniques of site-directed mutagenesis or inactivation of the gene by homologous recombination.
Toutes ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. On préfère notamment le remplacement du gène dapA par recombinaison homologue, pour assurer que l'inactivation est irréversible. Pour ce faire, on peut utiliser un vecteur de recombinaison homologue, dans lequel un gène de résistance à un antibiotique (par exemple de résistance au chloramphénicol ou à l'érythromycine) est flanqué de séquences homologues aux séquences flanquant le gène dapA. On sélectionne les bactéries Adapt, en fonction de leur résistance à l'antibiotique et de leur incapacité à pousser en absence de DAP. All these techniques are well known to those skilled in the art. It is particularly preferred to replace the dapA gene by homologous recombination, to ensure that the inactivation is irreversible. For this purpose, a homologous recombination vector may be used, in which an antibiotic resistance gene (for example resistance to chloramphenicol or to erythromycin) is flanked by sequences homologous to the sequences flanking the dapA gene. Adapt bacteria are selected based on their resistance to the antibiotic and their inability to grow in the absence of DAP.
Il convient de noter que l'utilisation d'un antibiotique pour obtenir la bactérie mutante est moins gênante, dans la mesure où le gène de résistance à l'antibiotique est introduite dans le génome bactérien. Les risques de dissémination dudit gène à d'autres organismes sont alors réduits. De plus, le gène n'est présent qu'en une seule copie dans la bactérie (alors qu'il est présent à un grand nombre de copies lorsqu'il est porté par un plasmide). Par ailleurs, il n'est nul besoin de maintenir une pression de sélection en utilisant l'antibiotique sur la bactérie après avoir sélectionné la bactérie mutante désirée. It should be noted that the use of an antibiotic to obtain the mutant bacterium is less troublesome, since the antibiotic resistance gene is introduced into the bacterial genome. The risks of dissemination of said gene to other organisms are then reduced. In addition, the gene is present in only one copy in the bacterium (whereas it is present at a large number of copies when carried by a plasmid). On the other hand, there is no need to maintain a selection pressure by using the antibiotic on the bacterium after selecting the desired mutant bacterium.
En conséquence, la technique classique d'obtention d'une bactérie knockout pour le gène dapA peut être utilisée. De plus, si la présence d'un gène codant pour la résistance à l'antibiotique est réellement non désirable, certains systèmes de sélection négative peuvent permettre de supprimer ce gène, après inactivation du gène dapA. Accordingly, the conventional technique of obtaining a knockout bacterium for the dapA gene can be used. In addition, if the presence of a gene coding for antibiotic resistance is actually undesirable, some negative selection systems may allow this gene to be deleted after inactivation of the dapA gene.
Dans un mode de réalisation préféré, ledit vecteur est stable dans son hôte procaryote, qui est préférentiellement E. coli. In a preferred embodiment, said vector is stable in its prokaryotic host, which is preferentially E. coli.
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Dans un mode de réalisation préféré, ledit vecteur est dérivé du vecteur pQE-60 ou pQE-70 (le plasmide pQE-60 correspond à SEQ ID NO 3, le plasmide pQE-70 ne différant de celui ci que par un site multiple de clonage, ces deux plasmides étant commercialisés par Qiagen (www. qiagen. com)). In a preferred embodiment, said vector is derived from the vector pQE-60 or pQE-70 (the plasmid pQE-60 corresponds to SEQ ID NO 3, the plasmid pQE-70 differing from it only by a multiple cloning site these two plasmids being marketed by Qiagen (www.qiagen.com)).
L'homme du métier comprend le terme dérivé , qui signifie notamment que le vecteur final possède globalement le même squelette (notamment les origines de réplication, et éléments stabilisateurs...) que le vecteur de départ dont il est dérivé. Il est important de noter que ceci signifie également que, de préférence, les éléments intergéniques sont conservés. Those skilled in the art understand the term derivative, which means in particular that the final vector has globally the same skeleton (in particular the origins of replication, and stabilizing elements ...) as the starting vector from which it is derived. It is important to note that this also means that, preferably, the intergenic elements are conserved.
Dans le cas présent, les modifications apportées au vecteur de base sont restreintes et ne modifient pas l'hôte de réplication du vecteur, ni ses propriétés fondamentales (nombre de copies, taille de l'insert, stabilité...). Dans le cas présent, on considère surtout qu'un vecteur est dérivé d'un autre, après substitution du gène marqueur de sélection positive. In this case, the modifications made to the base vector are restricted and do not modify the replication host of the vector, nor its fundamental properties (number of copies, size of the insert, stability ...). In the present case, it is especially considered that one vector is derived from another, after substitution of the positive selection marker gene.
Dans le cas présent, le gène bla codant pour la résistance à l'ampicilline du vecteur pQE-60 ou pQE-70 est remplacé par le gène dapA. In this case, the bla gene coding for the ampicillin resistance of the vector pQE-60 or pQE-70 is replaced by the dapA gene.
Dans un cas particulier de l'invention, le vecteur comporte en outre un gène permettant la régulation ou l'induction de l'expression de ladite protéine. In a particular case of the invention, the vector further comprises a gene for regulating or inducing the expression of said protein.
En effet, lorsque le vecteur selon l'invention est dérivé de pQE-60 ou pQE- 70, le gène codant pour la protéine d'intérêt est alors sous le contrôle du promoteur T5, et de deux opérateurs lacO. Il peut donc être intéressant d'introduire, dans le
squelette du vecteur selon l'invention, le gène lacI, codant pour une protéine interagissant avec les opérateurs lacO, et restreignant l'expression de la protéine d'intérêt. Lorsque l'on ajoute de l'IPTG (Isopropyl-p-D-thiogalactosidase) au milieu de culture, celui-ci fixe la protéine LacI, menant donc à l'expression induite de la protéine d'intérêt.
Indeed, when the vector according to the invention is derived from pQE-60 or pQE-70, the gene coding for the protein of interest is then under the control of the T5 promoter, and two lacO operators. It may therefore be interesting to introduce, in the
skeleton of the vector according to the invention, the lacI gene, encoding a protein interacting with lacO operators, and restricting the expression of the protein of interest. When IPTG (Isopropyl-pD-thiogalactosidase) is added to the culture medium, it binds the LacI protein, thus leading to the induced expression of the protein of interest.
Dans un cas préféré, le vecteur selon l'invention est un vecteur pSP102, pSP114, pSP150, pSP139, pSP117, pSP136, tel que décrits dans les exemples, et en particulier le vecteur pSP114 ou pSP139 déposés à la CNCM sous les numéros d'ordre respectifs 1-2796 et 1-2793, le 08 février 2002. In a preferred case, the vector according to the invention is a vector pSP102, pSP114, pSP150, pSP139, pSP117, pSP136, as described in the examples, and in particular the vector pSP114 or pSP139 deposited at the CNCM under the numbers of respective orders 1-2796 and 1-2793, February 08, 2002.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention se rapporte à un système d'expression d'une protéine, caractérisé en ce qu'il comporte : - un premier vecteur selon l'invention, tel que décrit ci-dessus, et In another embodiment, the invention relates to a system for expressing a protein, characterized in that it comprises: a first vector according to the invention, as described above, and
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- un hôte eubactérien, présentant une inactivation dans le gène dapA. an eubacterial host, exhibiting inactivation in the dapA gene.
On a vu plus haut comment obtenir un hôte eubactérien (en particulier E. coli) présentant une inactivation, de préférence par une mutation (insertion, substitution, délétion) non réversible du gène codant pour ledit marqueur métabolique. We have seen above how to obtain an eubacterial host (in particular E. coli) having an inactivation, preferably by mutation (insertion, substitution, deletion) non-reversible gene encoding said metabolic marker.
Dans un autre mode de réalisation, ledit système d'expression comporte en outre un second vecteur portant un élément permettant la régulation ou l'induction de l'expression de ladite protéine. Ledit élément a été décrit plus haut. Il peut ainsi s'agir d'un gène codant pour une protéine se fixant au promoteur ou à un opérateur du système d'expression sur le premier vecteur, fixation pouvant être diminuée par l'addition d'un composé compétiteur. In another embodiment, said expression system further comprises a second vector carrying an element for regulating or inducing the expression of said protein. Said element has been described above. It can thus be a gene coding for a protein that binds to the promoter or to an operator of the expression system on the first vector, which binding may be reduced by the addition of a competing compound.
Alternativement, ledit élément peut être un facteur de transcription, sous le contrôle d'un promoteur inductible, notamment par l'IPTG, ou le lactose. Alternatively, said element may be a transcription factor, under the control of an inducible promoter, in particular by IPTG, or lactose.
Dans un mode de réalisation préféré, ledit second vecteur ne contient pas de gène de résistance à un antibiotique, et comprend le gène thyA, en tant qu'unique facteur de sélection positive. In a preferred embodiment, said second vector does not contain an antibiotic resistance gene, and includes the thyA gene as the sole positive selection factor.
Le gène thyA code pour la thymidylate synthase, et les bactéries présentant une inactivation dans le gène thyA nécessitent la présence de thymidine si elles possèdent l'allèle tdk, ou de thymine si elles possèdent aussi l'allèle deoA pour leur croissance. Un gène thyA préféré est celui d'E. coli, représenté par-SEQ ID NO 2. The thyA gene codes for thymidylate synthase, and the inactivating bacteria in the thyA gene require the presence of thymidine if they possess the tdk allele, or thymine if they also possess the deoA allele for their growth. A preferred thyA gene is that of E. coli, represented by SEQ ID NO 2.
Dans ce cas, et pour permettre la sélection, l'hôte eubactérien présente aussi une inactivation dans le gène thyA. In this case, and to allow selection, the eubacterial host also exhibits inactivation in the thyA gene.
Dans un cas particulier, ledit second vecteur est le vecteur pREP4 (SEQ ID NO 4, commercialisé par Qiagen), dans lequel le gène neo codant pour la résistance
la kanamycine a été remplacé par le gène codant pour thyA. In one particular case, said second vector is the vector pREP4 (SEQ ID No. 4, marketed by Qiagen), in which the neo gene coding for resistance
kanamycin has been replaced by the gene encoding thyA.
Dans un cas préféré, ledit système d'expression comporte au moins l'un des vecteurs choisis parmi pSP114, pSP139 et pVDM62 et au moins une souche choisie parmi +552, +838, +849, +1005, +1010 déposés à la CNCM sous les numéros d'ordre 1-2792 à 1-2796 le 08 février 2002. In a preferred case, said expression system comprises at least one of the vectors selected from pSP114, pSP139 and pVDM62 and at least one strain selected from +552, +838, +849, +1005, +1010 deposited at the CNCM. under order numbers 1-2792 to 1-2796 on February 08, 2002.
L'invention se rapporte également à un kit pour la production de protéines, comprenant un système d'expression selon l'invention, ainsi qu'à l'utilisation d'un vecteur selon l'invention, d'un système d'expression selon l'invention, ou d'un kit The invention also relates to a kit for the production of proteins, comprising an expression system according to the invention, as well as to the use of a vector according to the invention, of an expression system according to the invention. the invention, or a kit
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selon l'invention pour la production de protéines recombinantes. Dans un mode de réalisation particulier, la protéine recombinante est la protéine pipA*, codée en
particulier par le gène pipA * (SEQ ID NO 19). according to the invention for the production of recombinant proteins. In a particular embodiment, the recombinant protein is the protein pipA * encoded in
particularly by the gene pipA * (SEQ ID NO 19).
Dépôt de matériel biologique Les organismes suivants ont été déposés le 08 février 2002 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, selon les dispositions du Traité de Budapest.
Deposit of biological material The following organizations were deposited on February 8, 2002 at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, according to the provisions of the Budapest Treaty.
<tb>
<tb> - <SEP> Souche <SEP> +552 <SEP> Numéro <SEP> d'ordre <SEP> 1-2792
<tb> - <SEP> Souche <SEP> +838 <SEP> Numéro <SEP> d'ordre <SEP> 1-2793
<tb> - <SEP> Souche <SEP> +849 <SEP> Numéro <SEP> d'ordre <SEP> 1-2794
<tb> - <SEP> Souche <SEP> +1005 <SEP> Numéro <SEP> d'ordre <SEP> 1-2795
<tb> - <SEP> Souche <SEP> +1010 <SEP> Numéro <SEP> d'ordre <SEP> 1-2796
<tb>
Les souches déposées ont les génotypes suivants :
<Tb>
<tb> - <SEP> Strain <SEP> +552 <SEP> Order Number <SEP><SEP> 1-2792
<tb> - <SEP> Strain <SEP> +838 <SEP> Order Number <SEP><SEP> 1-2793
<tb> - <SEP> Strain <SEP> +849 <SEP> Order Number <SEP><SEP> 1-2794
<tb> - <SEP> Strain <SEP> +1005 <SEP> Order Number <SEP><SEP> 1-2795
<tb> - <SEP> Strain <SEP> +1010 <SEP> Order Number <SEP><SEP> 1-2796
<Tb>
The deposited strains have the following genotypes:
<tb>
<tb> - <SEP> Souche <SEP> +552 <SEP> AdapA <SEP> : <SEP> : <SEP> erm
<tb> - <SEP> Souche <SEP> +838 <SEP> AdapA <SEP> : <SEP> : <SEP> erm <SEP> pSP139
<tb> - <SEP> Souche <SEP> +849 <SEP> AdapA <SEP> : <SEP> : <SEP> cm
<tb> - <SEP> Souche <SEP> +1005 <SEP> AdapA <SEP> : <SEP> : <SEP> cm <SEP> AthyA <SEP> : <SEP> : <SEP> erm
<tb> - <SEP> Souche <SEP> +1010 <SEP> AdapA <SEP> : <SEP> : <SEP> cm <SEP> AthyA <SEP> : <SEP> : <SEP> erm <SEP> pSP114 <SEP> pVDM62
<tb> <Tb>
<tb> - <SEP> Strain <SEP> +552 <SEP> AdapA <SEP>: <SEP>: <SEP> erm
<tb> - <SEP> Strain <SEP> +838 <SEP> AdapA <SEP>: <SEP>: <SEP> erm <SEP> pSP139
<tb> - <SEP> Strain <SEP> +849 <SEP> AdapA <SEP>: <SEP>: <SEP> cm
<tb> - <SEP> Strain <SEP> +1005 <SEP> AdapA <SEP>: <SEP>: <SEP> cm <SEP> AthyA <SEP>: <SEP>: <SEP> erm
<tb> - <SEP> Strain <SEP> +1010 <SEP> AdapA <SEP>: <SEP>: <SEP> cm <SEP> AthyA <SEP>: <SEP>: <SEP> erm <SEP> pSP114 <SEP> pVDM62
<Tb>
Les plasmides inclus dans les souches peuvent aisément être isolés par des techniques connues de l'homme du métier, notamment en utilisant des kits commerciaux. The plasmids included in the strains can easily be isolated by techniques known to those skilled in the art, in particular by using commercial kits.
Les exemples ci-après sont destinés à illustrer certains modes de mise en oeuvre de l'invention, et ne doivent pas être considérés comme limitant l'invention. The examples below are intended to illustrate certain embodiments of the invention, and should not be considered as limiting the invention.
DESCRIPTION DES FIGURES Les figures représentent les plasmides décrits dans les exemples. DESCRIPTION OF THE FIGURES The figures represent the plasmids described in the examples.
<Desc/Clms Page number 7> <Desc / Clms Page number 7>
Figure 1 : pSP102. Description du plasmide : MCS (396-455) ; LacZ (fragment NTerm de la ss-Galactosidase) (469-146) ; Origine de réplication (réplicon pMB1) (866) : Gène dapA (séquence codante de la dihydropicolinate synthetase) (2504- 1626) Figure 2 : pQE 60. Description du plasmide : Début de numérotation/site Xhol (1) ; Promoteur T5/opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ;
MCS (113-132) ; 6xHis-tag (133-150) ; Lambda tO (terminaison de la transcription) (173-267) ; rmB Tl (terminaison de la transcription) (1033-1131) ; ColEl origine de réplication (1608) ; Gène bla (séquence codante de la b-lactamase) (3226-2366). Figure 3 : pSP114. Description du plasmide : Début de numérotation/site Xhol (1) ; Promoteur T5/opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; MCS (113-132) ; 6xHis-tag (133-150) ; Lambda to (terminaison de la transcription) (173-267) ; rmB Tl (terminaison de la transcription) (1033-1131) ; ColEl origine de réplication (1608) ; Gène dapA (séquence codante de la dihydropicolinate synthetase) (3244-2366) Figure 4 : pSP 139. Description du plasmide : Début de numérotation/site Xhol (1) ; Promoteur T5/opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; MCS (113-132) ; 6xHis-tag (133-150) ; Lambda to (terminaison de la transcription) (173-267) ; rmB Tl (terminaison de la transcription) (1033-1131) ; ColEl origine de réplication (2812) ; Gène régulateur de l'opéron lac (lac !) (1219-2310) ; Gène dapA (4448-3570) Figure 5 : pSP150. Description du plasmide : Début de numérotation/site XhoI (1) ; Promoteur T5/opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; MCS (113-132) ; 6xHis-tag (133-150) ; Lambda to (terminaison de la transcription) (173-267) ; rrnB Tl (terminaison de la transcription) (1033-1131) ; ColEl origine de réplication (2812) ; Gène régulateur de l'opéron lac (lacI) (1218-2309) ; Gène dapA (4447-3569) Figure 6 : plasmide pSPl 17. Description du plasmide : Début de numérotation/site XhoI (1) ; Promoteur T5/opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; 6xHis-tag (1203-1220) ; Lambda to (terminaison de la transcription) (1243- 1343) ; rmB Tl (terminaison de la transcription) (2103-2201) ; ColEl origine de réplication (2684) ; Gène dapA (4303-3425) Gène cloné : Gène synthétique pipA* (1068 pb ; 355 AA) (115-1182) Figure 1: pSP102. Description of the Plasmid: MCS (396-455); LacZ (NTerm fragment of ss-galactosidase) (469-146); Origin of replication (replicon pMB1) (866): dapA gene (coding sequence of dihydropicolinate synthetase) (2504-1626) Figure 2: pQE 60. Description of the plasmid: Beginning of numbering / Xhol site (1); T5 Promoter / Lake Operator (7-87); Site + 1 transcription start (61);
MCS (113-132); 6xHis-tag (133-150); Lambda t0 (transcription termination) (173-267); rmB T1 (transcription termination) (1033-1131); ColEl origin of replication (1608); Bla gene (coding sequence of β-lactamase) (3226-2366). Figure 3: pSP114. Description of the plasmid: Start of numbering / Xhol site (1); T5 Promoter / Lake Operator (7-87); Site + 1 transcription start (61); MCS (113-132); 6xHis-tag (133-150); Lambda to (termination of transcription) (173-267); rmB T1 (transcription termination) (1033-1131); ColEl origin of replication (1608); DapA gene (coding sequence of dihydropicolinate synthetase) (3244-2366) FIG. 4: pSP 139. Plasmid description: Start of numbering / Xhol site (1); T5 Promoter / Lake Operator (7-87); Site + 1 transcription start (61); MCS (113-132); 6xHis-tag (133-150); Lambda to (termination of transcription) (173-267); rmB T1 (transcription termination) (1033-1131); ColEl origin of replication (2812); Regenerative gene of the lac (lac!) Operon (1219-2310); DapA gene (4448-3570) Figure 5: pSP150. Description of the plasmid: Start of numbering / XhoI site (1); T5 Promoter / Lake Operator (7-87); Site + 1 transcription start (61); MCS (113-132); 6xHis-tag (133-150); Lambda to (termination of transcription) (173-267); rrnB T1 (transcription termination) (1033-1131); ColEl origin of replication (2812); Regenerative gene of the lac (lacI) operon (1218-2309); DapA gene (4447-3569) Figure 6: plasmid pSP1 17. Description of the plasmid: Start of numbering / XhoI site (1); T5 Promoter / Lake Operator (7-87); Site + 1 transcription start (61); 6xHis-tag (1203-1220); Lambda to (transcription termination) (1243-1343); rmB T1 (transcription termination) (2103-2201); ColEl origin of replication (2684); DapA gene (4303-3425) Cloned gene: synthetic gene pipA * (1068 bp; 355 AA) (115-1182)
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Figure 7 : pSP136. Description du plasmide : Début de numérotation/site XhoI (1) ; Promoteur T5/opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; 6xHis-tag (1203-1220) ; Lambda to (terminaison de la transcription) (1243-1343) ; rmB Tl (terminaison de la transcription) (2103-2201) ; ColEl origine de réplication (3882) ; Gène régulateur de l'opéron lac (lacI) (2278-3369) ; Gène dapA (5507- 4629) ;
Gène cloné : Gène synthétique pipA* (1068 pb ; 355 AA) (115-1182) Figure 8 : pREP4. Description du plasmide : Début de numérotation/site HindIII (1) ; Gène neo (codant 1'aminoglycoside 3'-phosphotransférase) (357-1151) ; Gène régulateur de l'opéron lac (lacl) (2620-1529) Figure 9 : pVDM62. Description du plasmide : Début de numérotation/site HindIII (1) ; Gène thyA (527-1321) ; Extrémité 3'du gène neo (1471-1702) ; Gène régulateur de l'opéron lac (lacI) (3171-2080)
EXEMPLES Exemple 1 : Construction de plasmides propagés de façon stable dans E. coli sans marqueur de résistance à un antibiotique. Figure 7: pSP136. Description of the plasmid: Start of numbering / XhoI site (1); T5 Promoter / Lake Operator (7-87); Site + 1 transcription start (61); 6xHis-tag (1203-1220); Lambda to (transcription termination) (1243-1343); rmB T1 (transcription termination) (2103-2201); ColEl origin of replication (3882); Regenerative gene of the lac (lacI) operon (2278-3369); DapA gene (5507-4629);
Cloned gene: synthetic gene pipA * (1068 bp; 355 AA) (115-1182) Figure 8: pREP4. Description of the Plasmid: Start of Numbering / HindIII Site (1); Neo gene (encoding aminoglycoside 3'-phosphotransferase) (357-1151); Lac (lacl) operon regulator gene (2620-1529) Figure 9: pVDM62. Description of the Plasmid: Start of Numbering / HindIII Site (1); ThyA gene (527-1321); 3'end of the neo gene (1471-1702); Regenerative gene of the lac operon (lacI) (3171-2080)
EXAMPLES Example 1 Construction of Plasmids Stably Propagated in E. coli Without an Antibiotic Resistance Marker
1.1. Construction d'un plasmide de clonage sans marqueur de résistance à un antibiotique. 1.1. Construction of a Cloning Plasmid Without an Antibiotic Resistance Marker
Cette construction est réalisée à partir du plasmide commercial pUC18 (BioLabs) qui porte une origine de réplication du groupe de compatibilité ColEI et le gène bla de résistance aux pénicillines spécifiant la p-lactamase. This construct is made from the commercial plasmid pUC18 (BioLabs) which carries an origin of replication of the ColEI compatibility group and the penicillin resistance bla gene specifying the β-lactamase.
La séquence du plasmide pUC18 a été modifiée par mutagénèse dirigée aux nucléotides 1615 (changement T vers C), 1617 (changement G vers A) et 1618 (changement T vers G) par une méthode décrite (Ansaldi et al., 1996 Anal. The sequence of plasmid pUC18 was modified by mutagenesis directed at nucleotides 1615 (change T to C), 1617 (change G to A) and 1618 (change T to G) by a method described (Ansaldi et al., 1996 Anal.
Biochem., 234 : 110-111) en utilisant les oligonucléotides PUC1 et PUC2 (SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 6). Le plasmide pSP98 ainsi obtenu possède un site unique XhoI. La digestion du plasmide pSP98 par les enzymes de restriction Sspl et Xhol permet d'éliminer le gène bla. Biochem., 234: 110-111) using oligonucleotides PUC1 and PUC2 (SEQ ID NO 5 and SEQ ID NO 6). The plasmid pSP98 thus obtained has a unique XhoI site. Digestion of the plasmid pSP98 with the restriction enzymes SspI and XhoI makes it possible to eliminate the bla gene.
Le gène dapA d'E. coli spécifie la dihydropicolinate synthase, enzyme qui catalyse la première étape de la synthèse de l'acide meso-diaminopimélique (DAP), un précurseur du peptidoglycanne. Ce gène a été amplifié par PCR sur l'ADN chromosomique d'E. coli. 2 ul d'ADN total ont été mis en présence des 4 dNTP The dapA gene of E. coli specifies dihydropicolinate synthase, an enzyme that catalyzes the first step in the synthesis of mesodiaminopimelic acid (DAP), a precursor of peptidoglycan. This gene was amplified by PCR on the chromosomal DNA of E. coli. 2 μl of total DNA were put in the presence of the 4 dNTPs
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(250 uM), de chacun des oligodésoxynucléotides PUC3 et PUC4 (500 nM) (SEQ ID NO 7 et SEQ ID NO 8) et d'une unité de Vent DNA Polymérase (BioLabs) dans un volume final de réaction de 50 ml dans le tampon 10 mM KCI, 10 mM
(NH4) 2S04, 20 mM Tris-HCl pH 8. 8, 2 mM MgS04, 0. 1 % Triton X-100. Après une période de dénaturation à 95 C pendant 5 min, l'amplification de l'ADN a été réalisée durant 30 cycles de dénaturation 30 sec à 950C - hybridation 30 sec à 52 C - élongation 1 min à 72 C, et terminée par 5 min d'élongation à 72 C. (250 μM) of each of the oligodeoxynucleotides PUC3 and PUC4 (500 nM) (SEQ ID NO 7 and SEQ ID NO 8) and a unit of Vent DNA polymerase (BioLabs) in a final reaction volume of 50 ml in the 10 mM KCI buffer, 10 mM
(NH4) 2SO4, 20 mM Tris-HCl pH 8. 8. 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100. After a denaturation period at 95 ° C. for 5 minutes, the amplification of the DNA was carried out for 30 cycles of dry denaturation at 950 ° C. - dry hybridization at 52 ° C. - 1 minute elongation at 72 ° C., and ended with 5 minutes. min of elongation at 72 C.
Le fragment ainsi amplifié a été digéré par Sspl et Xhol et introduit par ligation dans le plasmide pSP98 lui aussi préalablement digéré par Sspl et Xhol. The fragment thus amplified was digested with SspI and XhoI and ligated into plasmid pSP98, also previously digested with SspI and XhoI.
Les produits de ligation ont été introduits dans des souches d'E. coli portant une délétion au locus dapA et qui nécessitent donc pour croître la présence dans le milieu de culture d'acide méso-diaminopimélique (DAP), et plus précisément dans les souches +849, (AdapA : : cat, construite selon Richaud et al., 1993 J. Biol. Chem., 268 : 26827-26835), déposée à la CNCM sous le numéro 1-2794, ou +552 (AdapA : : erm, construite selon une méthode analogue à celle utilisée pour la souche +849), et déposée à la CNCM sous le numéro 1-2792. Les transformants ont été sélectionnés sur le milieu riche de Luria-Bertani (LB, DIFCO) sans DAP. The ligation products were introduced into E. coli strains. coli carrying a deletion at the dapA locus and which therefore require, in order to grow, the presence in the meso-diaminopimelic acid (DAP) culture medium, and more specifically in the +849 strains, (AdapA:: cat, constructed according to Richaud et al. J. Biol Chem., 268: 26827-26835), deposited at the CNCM under the number 1-2794, or +552 (AdapA: erm, constructed according to a method analogous to that used for the strain +849 ), and filed with the CNCM under the number 1-2792. Transformants were selected on rich Luria-Bertani medium (LB, DIFCO) without DAP.
Douze transformants ont été analysés pour essayer de déceler la présence de plasmides portant le gène dapA+ conformes à la construction espérée. Les ADN plasmidiques de ces 12 transformants ont été extraits (Kit Qiaprep, Qiagen) et soumis à des coupures analytiques par des enzymes de restriction appropriées. Un plasmide conforme a été isolé et nommé pSP102. Une représentation schématique de ce plasmide est donnée en Figure 1. Twelve transformants were analyzed to try to detect the presence of plasmids carrying the dapA + gene consistent with the expected construction. The plasmid DNAs of these 12 transformants were extracted (Qiaprep Kit, Qiagen) and subjected to analytical cleavage by appropriate restriction enzymes. A conforming plasmid was isolated and named pSP102. A schematic representation of this plasmid is given in FIG.
La souche +541 contenant le plasmide pSP102 (AdapA : : erm pSP102) a été restriée cinq fois consécutivement sur LB-agar sans DAP et le maintien du plasmide de clonage pSP102 en l'absence d'antibiotique a été établi. The strain +541 containing the plasmid pSP102 (AdapA :: erm pSP102) was restrained five consecutive times on LB-agar without DAP and the maintenance of the cloning plasmid pSP102 in the absence of antibiotic was established.
1.2. Construction d'un plasmide d'expression sans marqueur de résistance à un antibiotique. 1.2. Construction of an Expression Plasmid Without an Antibiotic Resistance Marker
Cette construction utilise le plasmide commercial pQE60 (Qiagen, représenté schématique en Figure 2). Ce plasmide (origine de réplication ColEl, gène bla) contient le promoteur du phage T5, deux éléments de l'opérateur lac, le This construct uses the commercial plasmid pQE60 (Qiagen, shown schematically in Figure 2). This plasmid (ColEl origin of replication, bla gene) contains the phage T5 promoter, two elements of the lac operator, the
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site synthétique de liaison ribosomique RBSH en 5'du polylinker et une séquence de codage pour un tag 6 x His en 3'du polylinker. RBSH synthetic ribosomal binding site at 5 'of the polylinker and a coding sequence for a 6 x His tag at 3' of the polylinker.
Afin de remplacer le gène bla par le gène dapA d'E. coli, la séquence du plasmide pQE60 a été modifiée par mutagénèse dirigée (méthode selon Ansaldi et al., 1996, op. cit.) au nucléotide 838 (changement T vers A, oligonucléotides PQE60/1 et PQE60/2, SEQ ID NO 9 et SEQ ID NO 10), entraînant la destruction
d'un site de restriction Sspl et aux nucléotides 2358-2360 (changement TCT vers GTC, oligonucléotides PQE60/3 et PQE60/4, SEQ ID NO Il et SEQ ID NO 12) entraînant la création d'un site de restriction SalI. Le plasmide obtenu, pSPHO, a été digéré ensuite par SspI et SalI afin d'éliminer le gène bla. In order to replace the bla gene with the dapA gene of E. coli, the plasmid sequence pQE60 was modified by site-directed mutagenesis (method according to Ansaldi et al., 1996, supra) at nucleotide 838 (change to A, oligonucleotides PQE60 / 1 and PQE60 / 2, SEQ ID NO 9 and SEQ ID NO 10), resulting in the destruction
an Sspl restriction site and nucleotides 2358-2360 (TCT to GTC change, oligonucleotides PQE60 / 3 and PQE60 / 4, SEQ ID NO II and SEQ ID NO 12) resulting in the creation of a SalI restriction site. The resulting plasmid, pSPHO, was then digested with SspI and SalI to remove the bla gene.
Le gène dapA d'E. coli a été amplifié par PCR sur ADN chromosomique d'E. coli comme décrit ci-dessus dans l'exemple 1.1 à l'aide des oligonucléotides PQE60/5 et PQE60/6 (SEQ ID NO 13 et SEQ ID No 14). The dapA gene of E. coli was amplified by PCR on chromosomal DNA of E. coli. coli as described above in Example 1.1 using oligonucleotides PQE60 / 5 and PQE60 / 6 (SEQ ID NO 13 and SEQ ID No. 14).
Le fragment ainsi amplifié a été digéré par les enzymes de restriction XhoI et EcoRV et introduit par ligation dans le plasmide pSPl 10 digéré par SspI et SalI. The fragment thus amplified was digested with the restriction enzymes XhoI and EcoRV and ligated into the plasmid pSP1 digested with SspI and SalI.
Les produits de ligation ont été introduits dans la souche +552 (ddapA : : erm) et la souche transformante +644 sélectionnée sur milieu LB sans ajout de DAP. La présence du gène dapA sur le plasmide extrait de cette souche a été confirmée par séquençage. Ce plasmide, représenté schématiquement en Figure 3 a été nommé pSP114. The ligation products were introduced into strain +552 (ddapA :: erm) and the +644 transformant strain selected on LB medium without the addition of DAP. The presence of the dapA gene on the plasmid extracted from this strain was confirmed by sequencing. This plasmid, schematically represented in FIG. 3, was named pSP114.
La construction d'un vecteur d'expression dapA+ d'E. coli portant le gène répresseur lad de l'opéron lactose a été réalisée à partir du plasmide pSP114 et le gène lad du plasmide pREP4 (Qiagen) amplifié par PCR. L'amplification a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus en 1.1. en présence d'ADN plasmidique 10 nM et des oligodésoxynucléotides PQE60/7 et PQE60/8 (SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 16). Le fragment ainsi amplifié a été digéré par NheI et introduit par ligation dans le plasmide pSPl14 préalablement digéré par Xbal (site de coupure unique au nucléotide 1134). Les produits de ligation ont été introduits dans la souche +552 et les transformants sélectionnés sur milieu LB sans ajout de DAP. The construction of a dapA + expression vector of E. The E. coli bearing the lactose operon repressor gene was made from plasmid pSP114 and the plasmid pREP4 lad gene (Qiagen) amplified by PCR. The amplification was carried out according to the protocol described above in 1.1. in the presence of 10 nM plasmid DNA and oligodeoxynucleotides PQE60 / 7 and PQE60 / 8 (SEQ ID NO 15 and SEQ ID NO 16). The fragment thus amplified was digested with NheI and ligated into the plasmid pSPl14 previously digested with XbaI (single cleavage site at nucleotide 1134). The ligation products were introduced into strain +552 and the selected transformants onto LB medium without the addition of DAP.
Les ADN plasmidiques des transformants ont été extraits et analysés. Ainsi, la présence du gène lad sur le plasmide pSP139 (fig. 4) de la souche transformante +838 et son orientation par rapport aux autres éléments du plasmide ont été The plasmid DNAs of the transformants were extracted and analyzed. Thus, the presence of the lad gene on the plasmid pSP139 (FIG 4) of the transforming strain +838 and its orientation with respect to the other elements of the plasmid were
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vérifiées par coupures analytiques avec des enzymes de restriction appropriées et par séquençage. La souche +838 a été déposée à la CNCM sous le numéro 1-2793. checked by analytical cleavage with appropriate restriction enzymes and by sequencing. The +838 strain was filed at the CNCM under the number 1-2793.
Le même schéma de construction a été appliqué au vecteur commercial pQE70 (QIAGEN) qui possède un site de clonage (MCS : multiple cloning site) différent de celui du pQE60. Le vecteur résultant (pSP150) est représenté schématiquement en Figure 5. The same construction scheme has been applied to the commercial vector pQE70 (QIAGEN) which has a cloning site (MCS: multiple cloning site) different from that of pQE60. The resulting vector (pSP150) is shown schematically in Figure 5.
Les plasmides pSP114, pSP139 (dérivés de pQE60) et pSP150 (dérivé de pQE70) offrent donc un large éventail de possibilités de clonage. Plasmids pSP114, pSP139 (derived from pQE60) and pSP150 (derived from pQE70) therefore offer a wide range of cloning possibilities.
Exemple 2 : Surexpression dans E. coli du gène hétérologue pipa* clonie dans les plasmides dapA+. Example 2: Overexpression in E. coli of the heterologous pipa * gene cloned in the dapA + plasmids.
Le gène pipA d'une taille de 1066 pb codant pour la lysine cyclodésaminase de Streptomyces pristinaespiralis et dont la séquence est décrite dans le brevet WO 9601901-Al, est composé d'une proportion en G + C de 69,6 %. Ce gène a été réécrit suivant le code génétique optimisé pour l'expression dans Escherichia coli (pipA*, SEQ ID n 19) et est désormais composé d'une proportion en G + C de 38 %. Ce gène a été construit par PCR. The 1066 bp pipA gene encoding Streptomyces pristinaespiralis lysine cyclodeaminase and whose sequence is described in WO 9601901-A1, is composed of a G + C proportion of 69.6%. This gene has been rewritten according to the genetic code optimized for expression in Escherichia coli (pipA *, SEQ ID No. 19) and is now composed of a G + C proportion of 38%. This gene was constructed by PCR.
Afin d'introduire un site de restriction unique Kpnl, le résidu thréonine 97 a été codé par ACC au lieu de ACT. Un codon de terminaison de la traduction TAA a été également ajouté en position 1080 (ler nucléotide du codon) de la séquence SEQ ID n 19, et des sites de restriction uniques EcoRI et Ncol d'une part, Hindi d'autre part, ont été introduits respectivement en 5'et en 3'du gène permettant ainsi son insertion dans un vecteur de clonage. La traduction commence à l'ATG en position 15. In order to introduce a unique KpnI restriction site, the threonine residue 97 was encoded by ACC instead of ACT. A termination codon of the translation TAA was also added at position 1080 (1st codon nucleotide) of the sequence SEQ ID No. 19, and unique restriction sites EcoRI and Ncol on the one hand, and Hindi on the other hand, were introduced respectively in 5 'and 3' of the gene thus allowing its insertion into a cloning vector. Translation begins at ATG in position 15.
Le gène synthétique pipA* a été préalablement cloné dans le vecteur pQE60 pour donner le plasmide pSP47. Il a ensuite été inséré dans les vecteurs dapA+ pSP114 et pSP139 (décrits ci-dessus en 1.2.). Le plasmide pSP47 a été coupé par les enzymes de restriction Ncol et BglII ; le fragment de digestion de 1076 bp a été introduit par ligation dans les plasmides pSP114 et pSP139 digérés par Ncol et BglII. Les produits de ligation ont été introduits dans la souche +552 (décrite à l'exemple 1.1) et les transformants sélectionnés en milieu LB sans DAP. Les plasmides pSP117 (Figure 6) et pSP136 (Figure 7) résultant respectivement des ligations avec les vecteurs pSP114 et pSP139 ont été caractérisés et réintroduits The synthetic gene pipA * was previously cloned into the vector pQE60 to give the plasmid pSP47. It was then inserted into the vectors dapA + pSP114 and pSP139 (described above in 1.2). Plasmid pSP47 was cut with restriction enzymes Ncol and BglII; the 1076 bp digest fragment was ligated into the Ncol and BglII digested pSP114 and pSP139 plasmids. The ligation products were introduced into strain +552 (described in Example 1.1) and the selected transformants into LB medium without DAP. The plasmids pSP117 (FIG. 6) and pSP136 (FIG. 7) resulting respectively from the ligations with the vectors pSP114 and pSP139 were characterized and reintroduced
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dans la souche +552. Les souches +626 et +823 ont été ainsi isolées, hébergeant respectivement les plasmides pSP117 et pSP136. in strain +552. Strains +626 and +823 were thus isolated, harboring plasmids pSP117 and pSP136, respectively.
L'expression du gène pipA* a été étudiée dans les trois souches +75, +626 et +823. La souche +75 est un dérivé de la souche d'E. coli K12 MG1655 (Vidal et al. (1998) J. Bacteriol., 180 : 2442-2449) contenant le plasmide pSP47 (pQE60 : : pipA*) et le plasmide auxiliaire pREP4 portant le gène lad. Les souches +626 et +823 et la souche contrôle +75 ont été cultivées en milieu LB à 37 C jusqu'à atteindre la densité optique (600 nm) de 0,8. The expression of the pipA * gene was studied in the three strains +75, +626 and +823. Strain +75 is a derivative of the strain of E. coli K12 MG1655 (Vidal et al., (1998) J. Bacteriol., 180: 2442-2449) containing the plasmid pSP47 (pQE60 :: pipA *) and the auxiliary plasmid pREP4 carrying the lad gene. The +626 and +823 strains and the +75 control strain were cultured in LB medium at 37 ° C. until the optical density (600 nm) of 0.8 was reached.
Dans le cas des souches +75 et +823, l'IPTG a été ajouté au milieu de culture suivant le protocole du fournisseur (Kit Qiaexpressionist, Qiagen) pour induire l'expression du gène pipA*. In the case of the +75 and +823 strains, IPTG was added to the culture medium according to the supplier's protocol (Qiaexpressionist Kit, Qiagen) to induce the expression of the pipA * gene.
Les protéines totales des cellules ainsi cultivées ont été séparées par électrophorèse en gel de polyacrylamide/SDS et colorées par le bleu de Coomassie. The total proteins of the cells thus cultivated were separated by polyacrylamide gel electrophoresis / SDS and stained with Coomassie blue.
Une protéine d'un poids moléculaire de 36 kDa a été détectée et son taux d'expression a été estimé à environ 5 % des protéines totales dans les trois souches. A protein with a molecular weight of 36 kDa was detected and its expression level was estimated at about 5% of total proteins in all three strains.
Des cultures témoins des souches +75 et +823 sans ajout d'IPTG ont permis de contrôler l'absence d'expression du gène pipA* et donc l'activité du répresseur lad porté, en trans sur le plasmide auxiliaire pREP4 (souche +75), en cis sur le plasmide pSP136 (souche +823). Control cultures of strains +75 and +823 without addition of IPTG made it possible to check the absence of expression of the pipA * gene and therefore the activity of the laced repr repressor lad on the auxiliary plasmid pREP4 (strain +75 ), in cis on the plasmid pSP136 (strain +823).
Exemple 3 : Stabilité de l'activité L-lysine cyclodésaminase propagée par un plasmide dapA+ lacI+ sans marqueur de résistance à un antibiotique. Example 3 Stability of L-lysine cyclodeaminase activity propagated by a dapA + lacI + plasmid without an antibiotic resistance marker.
Il est apparu que l'expression de l'activité de la L-lysine cyclodésaminase n'était pas stable dans la souche +626, bien que le plasmide se maintienne et assure la croissance en absence de DAP dans le milieu de culture. Ceci laisse suggérer que l'enzyme PipA* est toxique pour les cellules. Cet effet n'a pas été décrit auparavant. It was found that the expression of L-lysine cyclodeaminase activity was not stable in strain +626, although the plasmid is maintained and assures growth in the absence of DAP in the culture medium. This suggests that the enzyme PipA * is toxic to cells. This effect has not been described before.
Les constructions décrites ci-dessus (souches +75 et +823) permettent de verrouiller l'expression du gène pipA* par expression du répresseur lad, d'induire l'expression du gène toxique en présence d'IPTG et offrent, dans le cas de la souche +823, un vecteur d'expression inductible dépourvu de gène de résistance à un antibiotique. The constructs described above (strains +75 and +823) make it possible to lock the expression of the pipA * gene by expression of the lad repressor, to induce the expression of the toxic gene in the presence of IPTG and offer, in the case strain +823, an inducible expression vector lacking an antibiotic resistance gene.
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Les souches +75, +626 et +823 (décrites dans l'exemple 2) ont été cultivées chacune dans 100 ml de milieu LB à 37 C jusqu'à atteindre la phase stationnaire (24h). Ces cultures ont été ensuite diluées en inoculant 100 mL de LB neuf avec 100 mL de la culture stationnaire. Cette opération de dilution au millième a été réalisée sept fois consécutivement sur chaque culture, réalisant ainsi approximativement 70 générations. Strains +75, +626 and +823 (described in Example 2) were each cultured in 100 ml of LB medium at 37 C until reaching the stationary phase (24h). These cultures were then diluted by inoculating 100 ml of fresh LB with 100 ml of the stationary culture. This thousandth dilution operation was performed seven times consecutively on each culture, thus achieving approximately 70 generations.
L'activité L-lysine-cyclodésaminase de la protéine PipA* exprimée dans les souches +75, +626 et +823 a été testée suivant un protocole décrit ci-dessous sur des aliquots conservés par congélation des cultures correspondant à 0,20, 40,60 et 70 générations. The L-lysine-cyclodeaminase activity of the protein PipA * expressed in strains +75, +626 and +823 was tested according to a protocol described below on frozen culture-frozen aliquots corresponding to 0.20, 40 , 60 and 70 generations.
Après induction, les cultures sont centrifugées à 13000g et les culots cellulaires sont repris dans du milieu minéral MS de façon à concentrer les cellules 100 fois. Les cellules sont alors perméabilisées par deux étapes de congélation/décongélation à-20 C favorisant l'accès du substrat à l'enzyme. La Llysine monohydrochloride (pH = 7) est alors ajoutée à une concentration finale de 1 M dans les suspensions cellulaires (volume final = 2 mL). La réaction enzymatique
se fait à 37 C sous agitation. Au bout de 20 heures on prélève un échantillon de 300 f. 11 de chaque culture que l'on centrifuge à 13000g de façon à récupérer le surnageant. Une solution diluée des surnageant est ensuite déposée sur couche mince de silice. After induction, the cultures are centrifuged at 13000 g and the cell pellets are taken up in MS mineral medium in order to concentrate the cells 100 times. The cells are then permeabilized by two steps of freezing / thawing at -20 C promoting access of the substrate to the enzyme. Llysine monohydrochloride (pH = 7) is then added to a final concentration of 1 M in the cell suspensions (final volume = 2 mL). The enzymatic reaction
is at 37 C with stirring. After 20 hours a sample of 300 f is taken. 11 of each culture which is centrifuged at 13000g so as to recover the supernatant. A dilute solution of the supernatant is then deposited on a thin layer of silica.
L'activité de la lysine-cyclodésaminase est mesurée par la conversion de la L-lysine en acide-L-pipécolique dans des suspensions cellulaires et par la révélation de l'acide-L-pipécolique par coloration avec la ninhydrine après migration chromatographique en couche mince (Rf = 0.22 ; butanol/acide acétique/eau 4/1/1). The activity of lysine-cyclodeaminase is measured by the conversion of L-lysine to L-pipecolic acid in cell suspensions and by the revealing of L-pipecolic acid by staining with ninhydrin after layer chromatographic migration. thin (Rf = 0.22, butanol / acetic acid / water 4/1/1).
Dans le cas de la souche +626 on a constaté une perte totale d'activité au bout de 20 générations. En revanche, dans le cas des souches +75 et +823, l'activité de la L-lysine-cyclodésaminase est stable au-delà de 70 générations. In the case of strain +626 there was a total loss of activity after 20 generations. On the other hand, in the case of strains +75 and +823, the activity of L-lysine-cyclodeaminase is stable beyond 70 generations.
Exemple 4 : Construction d'une souche permettant la propagation stable de deux plasmides sans gènes de résistance à des antibiotiques. Example 4: Construction of a strain allowing the stable propagation of two plasmids without genes for resistance to antibiotics.
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4.1. Construction d'une souche d'E. coli portant deux délétions : au locus thy A spécifiant la thymidylate synthase et au locus dapA spécifiant la
dihvdropicolinate synthase. 4.1. Construction of a strain of E. coli carrying two deletions: at the thy A locus specifying the thymidylate synthase and at the dapA locus specifying the
dihydropicolinate synthase.
Un lysat du phage PI récolté sur la souche d'E. coli +849 (AdapA : : cat, exemple 1.1) a été employé pour transduire le caractère AdapA : : cat dans la souche P1308 (AthyA : : erm, Lemeignan et al., 1993 J. Mol. Biol., 231 : 161-166). La souche transductante +1005 (AdapA : : cat AthyA : : erm) a été sélectionnée en présence de chloramphénicol sur milieu LB supplémenté avec de la thymidine (dT, 0.3 mM) et du DAP (0. 1 mM). Les auxotrophies pour la thymidine et pour le DAP ont été confirmées sur les milieux appropriés. La souche +1005 a été déposée à la CNCM sous le numéro 1-2795. Phage phage lysate harvested from E. coli strain coli +849 (AdapA:: cat, example 1.1) was used to transduce the AdapA :: cat trait in strain P1308 (AthyA:: erm, Lemeignan et al., 1993 J. Mol Biol., 231: 161- 166). Transductant strain +1005 (AdapA :: cat AthyA :: erm) was selected in the presence of chloramphenicol on LB medium supplemented with thymidine (dT, 0.3 mM) and DAP (0.1 mM). The auxotrophies for thymidine and for DAP were confirmed on the appropriate media. The strain +1005 was deposited at the CNCM under the number 1-2795.
4.2. Construction d'un plasmide thyA+ sans marqueur de résistance à un antibiotique
Le gène thyA a été amplifié par PCR à partir du plasmide pTSO (Lemeignan et al., 1993) construit par insertion du gène thyA sauvage d'E. coli dans le plasmide commercial pTZ18R (BioRad). L'amplification PCR a été réalisée avec les oligonucléotides PREP 1 et PREP2 (SEQ ID NO 17 et SEQ ID NO 18) en utilisant la Vent Polymerase (Biolabs) selon le protocole décrit à l'exemple 1.1. Le fragment amplifié a été coupé avec les enzymes de restriction Ncol et BglII et introduit par ligation dans le vecteur pREP4 (Qiagen, représenté schématiquement en Figure 8) dont la cassette de résistance à la kanamycine (neo) a été éliminée par digestion avec Ncol et BglII. Les produits de ligation ont été introduits dans la souche pi 308 et des transformants sélectionnés sur milieu LB sans ajout de thymidine. Le plasmide pVDM62 (Figure 9) a été isolé. Le remplacement de la cassette neo par le gène thyA a été vérifié par coupure du plasmide pVDM62 avec des enzymes de restriction appropriées et séquençage du gène lad.
4.2. Construction of a thyA + plasmid without an antibiotic resistance marker
The thyA gene was amplified by PCR from the plasmid pTSO (Lemeignan et al., 1993) constructed by insertion of the wild type thyA gene from E. coli. coli in the commercial pTZ18R plasmid (BioRad). The PCR amplification was carried out with the oligonucleotides PREP 1 and PREP2 (SEQ ID NO 17 and SEQ ID NO 18) using the Wind Polymerase (Biolabs) according to the protocol described in Example 1.1. The amplified fragment was cut with the NcoI and BglII restriction enzymes and ligated into the pREP4 vector (Qiagen, shown schematically in Figure 8) whose kanamycin resistance cassette (neo) was removed by digestion with NcoI and BglII. The ligation products were introduced into the pi 308 strain and selected transformants on LB medium without the addition of thymidine. Plasmid pVDM62 (Figure 9) was isolated. Replacement of the neo cassette with the thyA gene was verified by cleavage of plasmid pVDM62 with appropriate restriction enzymes and sequencing of the lad gene.
4. 3. Expression inductible et stable du gène hétérologue pipA* dans la souche +1005 (AdapA : : cat AthyA : : erm) pa : : cat âth ~ ~,, n j
Le plasmide pVDM62 construit à l'exemple 4.2 a été introduit dans la souche +1005 décrite à l'exemple 4.1 ; les transformants ont été sélectionnés en 4. 3. Inducible and stable expression of the heterologous gene pipA * in strain +1005 (AdapA :: cat AthyA :: erm) pa:: cat thth ~ ~ ,, nj
The plasmid pVDM62 constructed in Example 4.2 was introduced into the strain +1005 described in Example 4.1; the transformants were selected in
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milieur LB en présence de DAP et en absence de thymidine. Un de ces transformants (souche +1007) a été ensuite isolé puis transformé avec le plasmide pSP117 résultant de la ligation entre le pSP114 coupé par Ncol et BglII et l'insert portant le gène pipA* du plasmide pSP47 coupé par les mêmes enzymes. Les transformants ont été sélectionnés sur milieu LB en absence de DAP. LB in the presence of DAP and in the absence of thymidine. One of these transformants (strain +1007) was then isolated and then transformed with the plasmid pSP117 resulting from the ligation between the pSP114 cut with Ncol and BglII and the insert carrying the pipA * gene of the plasmid pSP47 cut with the same enzymes. The transformants were selected on LB medium in the absence of DAP.
La souche (+ 1008) ainsi obtenue héberge les plasmides pVDM62 et pSP117. Cette souche a été cultivée en présence ou en absence d'IPTG et les activités de la lysine-cyclodésaminase produite ont été mesurées comme décrit à l'exemple 3 et comparées entre elles. Il a ainsi été vérifié que l'expression de l'enzyme est bien verrouillée par le répresseur lac présent en trans sur le plasmide pVDM62. The strain (+ 1008) thus obtained hosts plasmids pVDM62 and pSP117. This strain was cultured in the presence or absence of IPTG and the activities of the lysine-cyclodeaminase produced were measured as described in Example 3 and compared with each other. It has thus been verified that the expression of the enzyme is well locked by the lac repressor present in trans on the plasmid pVDM62.
Parallèlement la souche (+1010) a été construite en introduisant le plasmide pSP114 dans la souche +1007. Cette souche, hébergeant les plasmides pSP114 et pVMD62 a été déposée à la CNCM sous le numéro 1-2796. In parallel, the strain (+1010) was constructed by introducing the plasmid pSP114 into the strain +1007. This strain, harboring plasmids pSP114 and pVMD62, was deposited at the CNCM under the number 1-2796.
Ces exemples démontrent que les marqueurs de sélection métaboliques dapA et thyA peuvent être utilisés dans des vecteurs d'expression de protéines, dans des hôtes appropriés. Ils démontrent aussi l'utilité du répresseur lacI, et son activité en cis ou en trans. These examples demonstrate that the metabolic markers dapA and thyA can be used in protein expression vectors in appropriate hosts. They also demonstrate the utility of the lacI repressor, and its cis or trans activity.
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CIRILLO J D ET AL: "GENETIC DETERMINATION OF THE MESO-DIAMINOPIMELATE BIOSYNTHETIC PATHWAY OF MYCOBACTERIA", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 176, no. 14, July 1994 (1994-07-01), pages 4424 - 4429, XP002907358, ISSN: 0021-9193 * |
NAKAYAMA K ET AL: "CONSTRUCTION OF AN ASD+ EXPRESSION-CLONING VECTOR: STABLE MAINTAINANCE AND HIGH LEVEL EXPRESSION OF CLONED GENES IN A SALMONELLA VACCINE STRAIN", BIO/TECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING CO. NEW YORK, US, vol. 6, no. 6, 1 June 1988 (1988-06-01), pages 693 - 697, XP000578379, ISSN: 0733-222X * |
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