FR2834638A1

FR2834638A1 - Composition comprenant en association au moins un flavonoide, au moins un extrait peptidique de lupin et au moins une huile vegetale, son utilisation comme agent dermatologique ou dermo-cosmetique

Info

Publication number: FR2834638A1
Application number: FR0200342A
Authority: FR
Inventors: Jean Luc Charagnac
Original assignee: Laboratoire Medix
Current assignee: Laboratoire Medix
Priority date: 2002-01-11
Filing date: 2002-01-11
Publication date: 2003-07-18
Anticipated expiration: 2022-01-11
Also published as: FR2834638B1

Abstract

La présente invention concerne une composition comprenant en association : au moins un flavonoide, au moins un extrait peptidique de lupin et au moins une huile végétale. L'invention a également pour objet une telle composition pour son utilisation comme agent dermatologique ou dermato-cosmétique, notamment comme agent anti-inflammatoire et comme agent régénérateur du tissu épidermique et dermique, ou encore pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des oedèmes, des escarres, ou des troubles de la micro-circulation cutanée, ou encore dans le traitement des radiodermites.

Description

La présente invention concerne une nouvelle composition comprenant en association au moins un flavonoïde, au moins un extrait peptidique de lupin et au moins une huile végétale. L'invention a également pour objet une telle composition pour son utilisation comme agent dermatologique ou dermato-cosmétique, notamment comme agent anti-inflammatoire et comme agent régénérateur du tissu épidermique et dermique, ou encore pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des oedèmes, des escarres, ou des troubles de la micro-circulation cutanée, ou encore dans le traitement des radiodermites.

De nombreuses compositions pour la peau, à base de corps peroxydés tels que des huiles peroxydées, ont été utilisées dans l'art antérieur, notamment pour faciliter la restructuration cellulaire de la peau du visage ou du corps, ou traiter la condition inflammatoire liée aux peaux sèches (FR 2 591 104), ou encore pour préserver et améliorer l'état de la peau, en prévenant par exemple les troubles de la microcirculation (FR 2 750 331).

La demanderesse a découvert de manière surprenante que l'association des trois composés suivants : un bioflavonoïde, tel que la troxérutine, un extrait peptidique du lupin, ainsi qu'une huile végétale, dans des compositions pour la peau, telles que des compositions dermatologiques ou dermato-cosmétiques, permettait de traiter divers troubles et affections cutanés, et ceci de manière beaucoup plus efficace que les compositions à base de composés peroxydés utilisées jusqu'à présent.

Il a ainsi été découvert que l'association des trois composés selon la présente invention présentaient divers avantages, par rapport à l'utilisation d'une huile peroxygénée dans une composition pour application cutanée, tels qu'une amélioration de la dynamique micro-circulatoire, une réduction de la dilatation capillaire induite et de l'oedème interstitiel secondaire, une augmentation de l'épaisseur de la couche cornée compacte, une modulation positive sur la protection des protéines de structure de l'épithélium, une augmentation des lipides totaux, ainsi qu'une stimulation de la prolifération épithéliale.

En outre, les flavonoïdes, les extraits peptidiques de lupin, ainsi que les huiles végétales s'avèrent être des composés, cosmétiquement, pharmaceutiquement et dermatologiquement acceptables, non agressifs, ni toxiques, ni irritants pour la peau, hypoallergéniques, apaisants, hydratants et anti-inflammatoires pour la peau. De plus, ces composés sont disponibles commercialement.

Ainsi, la demanderesse a montré que ces trois actifs pouvaient être utilisés en association dans des compositions pharmaceutiques, dermatologiques ou dermatocosmétiques, notamment en tant qu'agents anti-inflammatoires, en tant qu'agents régénérateurs du tissu épidermique et dermique, dans la prévention ou le traitement des oedèmes, des escarres, ou des troubles de la micro-circulation cutanée, ou encore dans le traitement des radiodermites.

La présente invention a ainsi pour objet une composition comprenant en association : (a) au moins un flavonoïde, (b) au moins un extrait peptidique de lupin, et (c) au moins une huile végétale.

Les flavonoïdes, encore connus sous le nom de bioflavonoïdes, sont des polyphénols comportant un squelette de base à 15 atomes de carbone résultant de la fusion de deux unités aromatiques, dont l'une dérive du benzène et l'autre du phénylpropane.

Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, le flavonoïde (a) est une flavanone, de formule générale (1) :

(1)
Dans un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, le flavonoïde (a) est une flavone, de formule générale (II) :

(II)
Les flavones ou flavanones utilisables selon la présente invention sont obtenues par synthèse chimique ou sont des substances naturelles extraites de produits naturels, notamment à partir de végétaux. Les flavonoïdes (a) selon la présente invention peuvent être sous forme aglycone ou sous forme glycosylée. Les formes glycosylées des flavonoïdes selon la présente invention, qui sont les formes les plus abondantes dans la nature, peuvent comporter un ou plusieurs oses, pouvant notamment être le rutinose, le mannose, le rhamnose, le glucose, etc. Avantageusement selon la présente invention, lorsque les flavonoïdes (a) sont sous forme glycolysée, ils sont substitués par un groupe 0-rutinose, de préférence en position 3 ou 7.

De manière avantageuse selon la présente invention, lorsque le flavonoïde (a) est une flavanone, ledit flavonoïde est choisi dans le groupe constitué par la naringénine, la naringine, l'hespérétine, et l'hespéridine.

De manière avantageuse selon la présente invention, lorsque le flavonoïde (a) est une flavone, ledit flavonoïde est choisi dans le groupe constitué par la rutine, la troxérutine, la diosmine, la diosmétine, la chrysine, la quercétine et la lutéoline.

Le flavonoïde (a) selon la présente invention peut également être un flavonol qui correspond à une flavone substituée en position 3 par un groupe hydroxy, ou un dihydroflavonol qui correspond à une flavanone substituée en position 3 par un groupe hydroxy. Le flavonoïde (a) peut également être un flavanol qui répond à la formule générale (III) suivante, ou encore un flavandiol (leucoanthocyanidine) qui correspond à un flavanol substitué en position 4 par un groupe hydroxy.

La cathéchine ou la leucocyanidine peuvent ainsi être notamment utilisés en tant que flavonoïde (a) selon la présente invention.

Dans un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, les extraits peptidiques de lupin (b) peuvent être extraits de diverses variétés du lupin (lupinus). De manière avantageuse selon la présente invention, les extraits (b) sont issus du lupin blanc doux (lupinus albus), de genre européen, de préférence la variété Arès de faible teneur en alcaloïdes.

De façon générale, l'invention comprend les farines de lupin lipides, ou encore les extraits peptidiques comprenant encore les sucres. Avantageusement selon la présente invention, l'extrait peptidique de lupin (b) comprend des peptides glutaminés de faible poids moléculaire et des oligosaccharides.

De manière avantageuse selon la présente invention, l'extrait peptidique de lupin (b) est obtenu par hydrolyse de la fraction protéique de lupin, qui contient majoritairement des acides aminés, des peptides et des protéines. L'hydrolyse peut être effectuée par n'importe quel moyen approprié, notamment une hydrolyse enzymatique, acide ou basique. Avantageusement selon la présente invention, lorsque l'extrait peptidique de lupin (b) est hydrolysé, ledit extrait, sous forme de solution aqueuse, contient 45 à 55 g/l de matières sèches, 24 à 32 g/l de protéines et 8 à 14 g/1 de sucres totaux (sucres simples et oligosaccharides). Un extrait peptidique de lupin selon la présente invention peut être disponible commercialement auprès de Silab (Structurine).

Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention l'extrait peptidique de lupin (b) peut être obtenu selon le procédé comprenant les étapes suivantes :

- préparation d'un tourteau de lupin délipidé et broyé ou d'une farine de lupin (lipide) micronisée, extraction des fractions protéiques et osiques solubles ou précipitation à pH acide (4 ou 5) selon le point isoélectrique, éventuellement séparation de la fraction protéique, - éventuellement hydrolyse de la fraction protéique et récupération, éventuellement après filtration, de l'extrait protéique.

De préférence, l'extrait protéique présente la composition en acides aminés suivante (les concentrations données ci-dessous peuvent varier de plus ou moins 50 %) :

<tb>
<tb> Aspartique <SEP> 5.0 <SEP> g/100 <SEP> g
<tb> Thréonine <SEP> 2. <SEP> 1g/100g
<tb> Sérine <SEP> 2. <SEP> 8g/100g
<tb> Acide <SEP> Glutamique <SEP> 9.8 <SEP> g/100 <SEP> g
<tb> Glycine <SEP> 2g/100g
<tb> Alanine <SEP> 2. <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> g
<tb> Valine <SEP> 1. <SEP> 8 <SEP> g/100 <SEP> g
<tb> Cystine <SEP> 0. <SEP> 4g/100g
<tb> Méthionine <SEP> 0. <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> g
<tb> Isoleucine <SEP> 1. <SEP> 9 <SEP> g/100 <SEP> g
<tb> Leucine <SEP> 3.6 <SEP> g <SEP> 1100 <SEP> g
<tb> Tyrosine <SEP> 1. <SEP> 9g/100g
<tb> Phénylalanine <SEP> 1. <SEP> 9 <SEP> g/100 <SEP> g
<tb> Ornithine <SEP> 0. <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> g
<tb> Lysine <SEP> 2 <SEP> g/100 <SEP> g
<tb> Histidine <SEP> 1. <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> g
<tb> Arginine <SEP> 5 <SEP> g/100 <SEP> g
<tb> Proline <SEP> 1. <SEP> 9g/100g
<tb>

Dans un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, l'huile végétale (c) est une huile riche en acides gras de la famille n-6, ou une huile riche en

acides gras de la famille n-3, ou encore une huile riche en acides gras des familles n-6 et n-3.

Par le terme d'''huiles riches en acides gras de la famille n-6", on entend au sens de la présente invention, les huiles riches en acide linoléique (Cl 8 : 2), contenant avantageusement plus de 20% en poids, de préférence de 20 à 50% en poids de cet acide, par rapport aux acides gras totaux, telles que l'huile de tournesol ou l'huile de pépins de raisin.

Par le terme d"'huiles riches en acides gras de la famille n-3", on entend au sens de la présente invention, les huiles riches en acide alpha-linolénique (C18 : 3), contenant avantageusement plus de 10% en poids, de préférence de 10 à 40% en poids de cet acide par rapport aux acides gras totaux, telles que l'huile de chia, l'huile de lin ou l'huile de Rosier Muscat.

Avantageusement selon la présente invention, l'huile végétale (c) est l'huile de Rosier Muscat. Cette huile peut présenter une teneur en acide linoléique d'environ 30 à 50% en poids, et une teneur en acide alpha-linolénique d'environ 25 à 40% en poids.

L'huile de Rosier Muscat peut être extraite des graines du fruit du rosier, avantageusement selon le procédé consistant à extraire l'huile par pression à froid.

De façon encore plus avantageuse selon la présente invention, le flavonoïde (a) est présent à une concentration comprise entre 0, 1 et 20 %, avantageusement entre 1 et 10 %, par rapport au poids total de la composition. Avantageusement, l'extrait peptidique de lupin (b) est présent à une concentration comprise entre 0, 1 et 20 %, avantageusement entre 1 et 10 %, par rapport au poids total de la composition.

Les compositions selon la présente invention peuvent être des compositions pharmaceutiques, dermatologiques ou dermo-cosmétiques. Les compositions selon la présente invention peuvent par ailleurs contenir des véhicules et excipients cosmétologiquement et/ou pharmaceutiquement acceptables, ainsi que des additifs cosmétiques conventionnels, connus de l'homme du métier.

Avantageusement, les compositions selon la présente invention sont formulées pour être administrée par voie topique externe, par exemple sous forme de crème blanche ou colorée, de pommade, de lait, de lotion, d'onguent, de sérum, de pâte, de mousse, ou d'aérosol.

De manière encore plus avantageuse selon la présente invention, les compositions se présentent sous forme d'une émulsion. En particulier, les compositions contiennent en outre un polymère émulsifiant de type Pemulen. De manière encore plus avantageuse, les compositions selon la présente invention sont conditionnées sous forme de spray.

Les Pemulen sont des polymères de haut poids moléculaire à longue portion hydrophile et à plus courte portion lipophile. Leur structure chimique leur permet de jouer efficacement le rôle d'émulsifiant dans les émulsions huile-dans-eau. La partie lipophile adsorbe à l'interface huile-eau, et la partie hydrophile gonfle dans la phase aqueuse pour former des émulsions d'une grande stabilité avec une large gamme d'huiles.

Les émulsions réalisées avec de faibles quantités de Pemulen sont très stables.

Entourées par un gel aqueux à seuil d'écoulement élevé, les gouttelettes d'huile sont protégées et maintenues en suspension. En formant des émulsions huile-dans-eau (H/E), les molécules de Pemulen forment une couche de gel adsorbé autour de chaque gouttelette d'huile, la partie lipophile du polymère étant fixée dans la phase huileuse. Ainsi, quand deux gouttelettes s'approchent l'une de l'autre, une force de répulsion est engendrée par la présence de ces couches de gel adsorbé.

Les Pemulen sont ainsi avantageusement utilisés dans le cadre de la présente invention, car ils surmontent de nombreux inconvénients rencontrés dans les émulsions classiques. Ils éliminent ainsi l'irritation potentielle pouvant être associée aux surfactants, de faibles quantités de surfactants pouvant toutefois être ajoutées pour optimiser certaines caractéristiques de l'émulsion. A l'application, une couche homogène d'huile se forme immédiatement sur la peau. Ce film ne contient aucun résidu de surfactant et résiste à l'immersion dans l'eau.

Ces polymères Pemulen présentent également divers autres avantages sur les émulsifiants conventionnels : ils sont efficaces à très faible concentration (0,1% à 0,5%), permettant ainsi de réduire les coûts de formulation ; ils émulsifient toute huile, et ce, même à température ambiante ; ils émulsifient les cires, pour peu qu'elles soient fondues pendant la préparation ; des émulsions stables peuvent être réalisées avec des surfactants qui seront employés en faibles quantités afin d'optimiser la taille des gouttelettes d'huile et apporter une émollience ou un étalement supplémentaire, ou

encore d'autres propriétés esthétiques ; ils possèdent une excellente stabilité à long terme (sur plus de deux ans) ; le relargage de la phase huileuse peut être déclenché lors d'un contact avec des surfaces contenant des électrolytes.

La présente invention a également pour objet les compositions décrites cidessus pour leur utilisation comme agents dermatologiques ou dermato-cosmétiques.

La présente invention a également pour objet les compositions décrites cidessus pour leur utilisation comme agents anti-inflammatoires ou comme agent régénérateurs du tissu épidermique et dermique, permettant ainsi d'augmenter le renouvellement cellulaire de l'épiderme.

La présente invention a également pour objet les compositions décrites cidessus pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement des oedèmes, des escarres, ou des troubles de la micro-circulation cutanée.

La présente invention a également pour objet les compositions décrites cidessus pour leur utilisation dans le traitement des radiodermites. Les radiodermites se caractérisent notamment par des troubles de la micro-circulation cutanée et de la régénération de l'épithélium.

Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. A moins qu'il n'en soit précisé autrement, les pourcentages indiqués dans les exemples suivants sont des pourcentages en poids. Dans les exemples suivants, l'huile de rosier muscat a été extraite de graines de rosier par pression à froid et l'extrait peptidique de lupin a été fourni par Silab (Structurine).

Exemple 1 : Composition

<tb>
<tb> Phases <SEP> Matières <SEP> premières <SEP> %
<tb> Aqueuse <SEP> Eau <SEP> purifiée <SEP> 55,55
<tb> Mélange <SEP> conservateurs <SEP> 0,8
<tb> Pemulen <SEP> TR2 <SEP> NF <SEP> 0,2
<tb> Carbopol <SEP> 981 <SEP> NF <SEP> 0,05
<tb> NaOH <SEP> (10% <SEP> m/m) <SEP> 0,8
<tb> Extrait <SEP> peptidique <SEP> de <SEP> lupin
<tb> 7
<tb> (Structurine)
<tb> Troxérutine <SEP> 5
<tb> Huile <SEP> de <SEP> rosier <SEP> muscat <SEP> 30
<tb> Grasse
<tb> Mélange <SEP> conservateurs <SEP> 0,2
<tb> EDTA <SEP> di <SEP> Na
<tb> 0,1
<tb> (Dissolvine <SEP> Na <SEP> 2P)
<tb> Arôme <SEP> yerbatone <SEP> 0,3
<tb> TOTAL <SEP> 100
<tb> Composition <SEP> mélange <SEP> conservateurs <SEP> : <SEP> Phenoxyéthano <SEP> 1 <SEP> 73,3 <SEP> %
<tb> PHB <SEP> Méthyle <SEP> 20%
<tb> PHB <SEP> Propyle <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> %
<tb>
Exemple 2 : Evaluation des modifications trophiques et hémodynamiques induites par l'application d'une composition selon la présente invention versus une huile peroxygénée sur un modèle expérimental de peau humaine maintenue en survie L'objet de cette étude est d'évaluer l'action d'une composition selon la présente invention sur un modèle expérimental de peau humaine maintenue en survie. La composition utilisée est celle de l'exemple l, qui se présente sous la forme d'une émulsion pour application cutanée. Cette composition sera désignée ci-après par le terme MI09. L'action du produit M109 d'une part sur les protéines de structure et les lipides épidermiques, et d'autre part sur le tonus vasculaire entraînant une diminution des oedèmes par réduction de la perméabilité capillaire et permettant ainsi de concourir

à la prévention de la survenue d'escarres a ainsi été évaluée et comparée à celle d'une huile peroxygénée, désignée ci-après par H PO.

1. Modèle expérimental
Le premier modèle expérimental sur peau humaine maintenue en survie a permis d'altérer les qualités protectrices de l'épithélium telles qu'elles se présentent au stade initial de l'escarre (stade 1), et de montrer l'action du M109. Pour ce faire, un modèle d'altération du stratum corneum par application d'acétone a été utilisé. L'étude a été effectuée en analysant la modulation de la filaggrine, de la transglutaminase de type 1 (témoignant de la différenciation terminale) et du taux de lipides épidermiques.

En effet, la filaggrine intervient dans la différenciation épidermique, mais également dans la protection du stratum corneum vis-à-vis des agressions déshydratantes. Son rôle ne peut être dissocié des lipides qui jouent non seulement un rôle essentiel dans la rétention d'eau et la limitation de l'évaporation d'eau et dans le maintien des NMF à l'intérieur des cornéocytes. La modulation de la transglutaminase de type 1 témoigne d'une bonne différenciation épithéliale. Ces résultats ont été corrélés à l'analyse histologique du stratum corneum (SC) et plus particulièrement des zones SC compactum.

Le second protocole a fait appel à un modèle expérimental de vasodilatation sur peau humaine maintenue en survie en utilisant comme neuromédiateur la substance P (SP) qui est un puissant agent vasodilatateur de la peau avec formation d'oedème.

L'évaluation de l'effet a été histologique avec évaluation du calibre des capillaires et de la réduction de l'oedème.

Enfin, la modulation de la prolifération cellulaire a été également évaluée par analyse immunohistochimique de la protéine Ki67 (témoin des cellules en phase de prolifération).

2. Matériel et méthodes 2.1. Maintien en survie de peau humaine Les cultures d'organe (8 à 12 donneurs différents selon les protocoles) ont été réalisées à partir de fragments de peau issus d'opérations de chirurgie plastique. Les fragments de peau ont été placés dans des inserts eux-mêmes positionnés sur des puits de culture.

Le milieu de culture (antibiotiques, SVF) a été ajouté dans le fond des puits, un passage s'effectuant par diffusion lente entre les deux compartiments par l'intermédiaire d'une membrane poreuse (12 um). 2 séries de peaux ont été maintenues en survie, l'une pour une étude au niveau épidermique, l'autre pour une étude au niveau dermique.

2.2. Modèle expérimental pour l'évaluation des protéines de structure, des lipides épidermiques, du stratum corneum, de la réduction des oedèmes et de l'augmentation du tonus vasculaire Le M109 versus une huile peroxygénée (Sanyrène (S), Laboratoire Urgo) a été appliqué en surface une fois par jour pendant 48 heures. Les fragments de peau ont été soumis à l'action d'un neuromédiateur pour l'analyse du tonus vasculaire : la substance P qui a été ajoutée dans le milieu de culture pendant 24 heures supplémentaires. Les fragments de peau ont été également soumis à une déshydratation le dernier jour de culture afin d'altérer la fonction barrière avec de l'acétone appliquée à la surface de la peau pendant 15 minutes. Les comparaisons suivantes ont été réalisées : - peau témoin, - peau déshydratée et soumise à l'action de la substance P, - peau déshydratée, soumise à l'action de la substance P et traitée par le Mil 09 - peau déshydratée, soumise à l'action de la substance P et traitée par une huile peroxygénée.

Les mises en survie ont été stoppées à J3 (au bout de 3 jours) pour différentes analyses histologiques. Les fragments de peaux ont été recueillis, fixés dans le liquide de Bouin et inclus en paraffine. a) Analyse immunohistochimique de la filaggrine et de différenciation terminale A partir des fragments inclus en paraffine, il est possible de détecter par immunohistochimie les marqueurs de différenciation avec l'anticorps anti-filaggrine (anticorps BT 576, Clinisciences) et avec l'anticorps anti-transglutaminase de type I (anticorps BT 621, Clinisciences). L'immunodétection est réalisée à l'aide d'une technique d'immunoperoxydase indirecte en 3 couches (kit ABC Peroxydase, Vector Laboratories) et révélee en DAB (Diaminobenzidine).

* L'intensité du marquage immunohistochimique de la filaggrine et de la transglutaminase de type 1 a été évaluée à l'aide de différents scores histologiques semi-quantitatifs : score 1 : + intensité faible score 2 : + à ++ intensité légèrement augmentée score 3 : ++ intensité modérée score 4 : ++ à +++ : intensité importante

* La topographie du marquage immunohistochimique de la filaggrine a été évaluée à l'aide de différents scores histologiques semi-quantitatifs : score 1 : marquage de rares secteurs de la couche granuleuse et de la couche cornée score 2 : marquage de plusieurs secteurs de la couche granuleuse et de la couche cornée score 3 : marquage de toute la couche granuleuse et de la couche cornée b) Analyse histologique de l'épaisseur de la couche cornée L'épaisseur de la couche cornée a également été mesurée sur les coupes histologiques.

Le nombre de secteurs de stratum corneum de type compactum a été comptabilisé (10 champs à l'objectif x 40). Une analyse morphométrique de l'épaisseur de ce stratum compactum a été réalisée (m). c) Dosage des lipides Les lipides du sebum (esters de cholestérol, squalènes, triglycérides et diglycérides) et du stratum corneum (acides gras libres, cholestérol et lipides divers dont les céramides de type 1 à VI, glycérol, monoglycérides) ont été obtenus par extraction directe à l'aide d'un solvant type chloroforme/methanol (2/1). Ils ont été séparés par chromatgraphie sur couche mince. La taille de spots correspondant à chaque classe de lipide a été mesurée par densitométrie (scanner). Les résultats sont exprimés en % de chacune des classes de lipides par rapport à la quantité totale de lipide en séparant les lipides du sebum et du stratum corneum. La quantité totale de lipides par peau a également été évaluée.

d) Analyse histologique de la vasoconstriction Après coloration par l'hémalun-éosine, la dilatation vasculaire a été évaluée par un comptage du nombre de vaisseaux dilatés sur l'ensemble de la coupe histologique (16 champs au grossissement 40). Ce nombre a été rapporté au nombre total de vaisseaux afin de calculer le pourcentage de vaisseaux dilatés. Par ailleurs, une analyse

morphométrique de la surface (m) occupée par la lumière des vaisseaux a été réalisée afin de déterminer la surface moyenne (um2) occupée par les vaisseaux. e) Analyse histologique de l'oedème L'évaluation a été effectuée à l'aide de scores semi-quantitatifs dans le derme superficiel et dans la partie haute du derme moyen sur un même nombre de champs (4 champs au grossissement 10) : - pas d'oedème : 0 (score 0) - oedème très léger : + (score 1) - oedème modéré : ++ (score 2) - oedème important : +++ (score 3) - oedème très important : ++++ (score 4) 2.3. Evaluation de la prolifération cellulaire par immunomarquage à l'aide d'un anticorps anti-Ki67 La prolifération épithéliale a été analysée par immunohistochimie à l'aide d'un anticorps anti-Ki67 (marqueur des cellules en phases M, S, G 1 et G2 du cycle cellulaire). L'immunodétection a été réalisée à l'aide d'une technique d'immunoperoxydase indirecte en 3 couches, amplifiée (kit DAKO) et révélée en AEC. Le nombre de cellules marquées est évalué par rapport à un total de 200 à 400 cellules. Le pourcentage de cellules en cours de prolifération au niveau de la couche basale a ainsi été calculé.

2.4. Statistiques L'analyse statistique sera effectuée par le test de Student dit de l'écart réduit ou test des échantillons appariés, avec un risque alpha de 5%.

3. Résultats 3.1. Evaluation de la filaggrine Les résultats de l'évaluation immunohistochimique de la filaggrine (scores semiquantitatifs) sont exposés dans le Tableau 1.

Tableau 1 :

<tb>
<tb> Topographie <SEP> de <SEP> Intensité <SEP> de
<tb> l'immunomarquage <SEP> l'immunomarquage
<tb> peau <SEP> témoin <SEP> 1, <SEP> 502= <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 072=0, <SEP> 94
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> 0, <SEP> 80 <SEP> 1 <SEP> * <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 1, <SEP> 24 <SEP> *
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> + <SEP> M109 <SEP> 1,60#0,7$ <SEP> 2,502=
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> + <SEP> H <SEP> PO** <SEP> 0,64~0,44* <SEP> 1,14~1,09
<tb>
** : Huile PerOxygénée * : différence statistiquement significative par rapport à la peau témoin (test apparié de Student, p < 0, 05) &num; : différence statistiquement significative par rapport à la peau traitée par l'acétone (test apparié de Student, p < 0, 05) $ : différence statistiquement significative entre peau traitée par M109 et peau traitée par les huiles peroxygénées (test apparié de Student, p < 0, 05) Ainsi, le modèle expérimental de déshydratation par l'acétone a permis d'obtenir une diminution statistiquement significative de la topographie et de l'intensité de cet immunomarquage. Le produit M109 appliqué sur ces peaux a permis de conserver un immunomarquage identique à la peau témoin et statistiquement différent de la peau déshydratée (p < 0, 05). L'huile peroxygénée n'a pas permis d'obtenir une protection de la filaggrine épidermique.

3.2. Evaluation de la transglutaminase de type 1 Les résultats de l'évaluation immunohistochimique de la transglutaminase de type 1 (intensité de l'immunomarquage à l'aide de scores semi-quantitatifs) sont exposés dans le Tableau II.

Tableau II :

<tb>
<tb> peau <SEP> témoin <SEP> 3, <SEP> 642 <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 44
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> 2, <SEP> 14 <SEP> + <SEP> 1 <SEP> *
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> + <SEP> M109 <SEP> 2, <SEP> 90 <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> * <SEP> &num;
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> + <SEP> H <SEP> PO <SEP> 2,70~0,7 <SEP> *
<tb>
* : différence statistiquement signiticative par rapport à la peau témoin (test apparié de Student, p < 0, 05) &num; : différence statistiquement significative par rapport à la peau traitée par l'acétone (test apparié de Student, p < 0, 05) Ainsi, le modèle expérimental de déshydratation par l'acétone a permis d'obtenir une diminution statistiquement significative de l'intensité de cet immunomarquage. Le produit M109 ainsi que l'huile peroxygénée appliqués sur ces peaux ont permis de conserver un immunomarquage identique à la peau témoin et statistiquement différent de la peau déshydratée (p < 0, 05).

3.3. Evaluation de l'épaisseur du stratum corneum compactum Les résultats concernant le stratum corneum sont exposés dans les Tableaux III et IV.

La moyenne de l'épaisseur du stratum comeum compactum est ainsi présentée dans le tableau III, alors que le pourcentage de stratum corneum compactum par coupe analysée est présenté dans le tableau IV.

Tableau III : Moyenne de l'épaisseur du stratum corneum compactum (hemalun- éosine, enum) :

<tb>
<tb> peau <SEP> témoin <SEP> 20, <SEP> 55 <SEP> 8, <SEP> 6
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> 9,83 <SEP> i. <SEP> 7 <SEP> *
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> + <SEP> M109 <SEP> 15,90 <SEP> ~ <SEP> 8,9 <SEP> &num; <SEP> $
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> + <SEP> H <SEP> PO <SEP> 9,86 <SEP> i. <SEP> 6,45 <SEP> *
<tb>
* : différence statistiquement significative par rapport à la peau témoin (test apparié de Student, p < 0, 05)

&num;: différence statistiquement significative par rapport à la peau traitée par l'acétone (test apparié de Student, p < 0, 05) $ : différence statistiquement significative entre peau traitée par M109 et peau traitée par les huiles peroxygénées (test apparié de Student, p < 0,05) Tableau IV : Pourcentage de stratum corneum compactum par coupe analysée (10 champs examinées à l'obiectifx40, hemalun-éosine) :

<tb>
<tb> peau <SEP> témoin <SEP> 79, <SEP> 0 <SEP> : <SEP> t <SEP> 22, <SEP> 5
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> 44,15 <SEP> : <SEP> 24, <SEP> 85 <SEP> *
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> + <SEP> Ml09 <SEP> 68,5 <SEP> i <SEP> 23,15 <SEP> &num; <SEP> $
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> + <SEP> H <SEP> PO <SEP> 46,3 <SEP> + <SEP> 20, <SEP> 3 <SEP> *
<tb>
* : différence statistiquement significative par rapport à la peau témoin (test apparié de Student, p < 0, 05) &num; : différence statistiquement significative par rapport à la peau traitée par l'acétone (test apparié de Student, p < 0, 05) $ : différence statistiquement significative entre peau traitée par M109 et peau traitée par les huiles peroxygénées (test apparié de Student, p < 0, 05) La déshydratation par l'acétone a permis d'obtenir une diminution significative du stratum corneum de type compactum (p < 0, 05). L'application du produit M109 entraîne une augmentation significative des secteurs de stratum corneum compactum et de son épaisseur (p < 0, 05). Par ailleurs, une différence statistiquement significative peut être remarquée entre la peau traitée par le produit M109 et celle traitée par l'huile peroxygénée (p < 0, 05).

3. 4. Dosage des lipides Les résultats concernant le dosage des lipides sont exposés dans les Tableaux V, VI et VII. Le dosage des lipides totaux est ainsi présenté dans le tableau V, le dosage des lipides au sebum est quant à lui présenté dans le tableau VI, alors que le dosage des lipides intercellulaires du stratum corneum est présenté dans le tableau VII.

Tableau V : Dosage des lipides totaux (surface des pics) :

<tb>
<tb> moyenne <SEP> + <SEP> SD
<tb> peau <SEP> témoin <SEP> 10 <SEP> 042 <SEP> ~ <SEP> 2482
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> 7 <SEP> 412,5 <SEP> + <SEP> 2548 <SEP> *
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> + <SEP> M109 <SEP> 8 <SEP> 480,5 <SEP> : <SEP> : <SEP> t <SEP> 1636 <SEP> &num;
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> + <SEP> H <SEP> PO <SEP> 7 <SEP> 455 <SEP> ~ <SEP> 1374 <SEP> *
<tb>

* : différence statistiquement significative par rapport à la peau témoin (test apparié de Student, p < 0, 05) &num; : différence statistiquement significative par rapport à la peau traitée par l'acétone (test apparié de Student, p < 0, 05) Tableau VI : Dosage des lipides au sebum (moyenne ~ ET (%)) :

<tb>
<tb> diglycérides <SEP> triglycérides <SEP> squalènes <SEP> ester <SEP> de
<tb> cholestérol
<tb> peau <SEP> témoin <SEP> 3, <SEP> 9 <SEP> ~ <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 39, <SEP> 7 <SEP> ~ <SEP> 13, <SEP> 3 <SEP> 11, <SEP> 76 <SEP> ~ <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> i <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 4
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> i <SEP> : <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 33, <SEP> 75 <SEP> ~ <SEP> 18, <SEP> 8 <SEP> 8,95 <SEP> + <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP> * <SEP> 1,54 <SEP> ~ <SEP> 0, <SEP> 7
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone
<tb> 4,16 <SEP> # <SEP> 2,7$ <SEP> 33,3 <SEP> # <SEP> 15,2 <SEP> 9,3#4,25 <SEP> 2,7#1,2*
<tb> +M109
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone
<tb> 2,86 <SEP> ~ <SEP> 2,7 <SEP> 31,7 <SEP> ~ <SEP> 16,45 <SEP> 8,2 <SEP> ~ <SEP> 4,5 <SEP> 2,3 <SEP> ~ <SEP> 1,24
<tb> +HPO
<tb>
* : différence statistiquement significative par rapport à la peau témoin (test apparié de Student, p < 0, 05) $ : différence statistiquement significative entre peau traitée par M109 et peau traitée par les huiles peroxygénées (test apparié de Student, p < 0, 05) Tableau VII : Dosage des lipides intercellulaires du stratum corneum (moyenne ~ ET (%) ) :

<tb>
<tb> cholesterol <SEP> lipides <SEP> divers,
<tb> céramides
<tb>

<tb>
<tb> peau <SEP> témoin <SEP> 23,08 <SEP> ~ <SEP> 12,9 <SEP> 25,0 <SEP> ~7
<tb> peau <SEP> ~ <SEP> acétone <SEP> 23,7 <SEP> ~ <SEP> 9,4 <SEP> 32,0 <SEP> ~ <SEP> 11,4*
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> + <SEP> M109 <SEP> 21,4 <SEP> ~ <SEP> 8,9 <SEP> 33,4 <SEP> ~ <SEP> 11,2*
<tb> peau <SEP> + <SEP> acétone <SEP> + <SEP> H <SEP> PO <SEP> 19,6 <SEP> ~ <SEP> 10,6 <SEP> 33,3 <SEP> ~ <SEP> 13,8
<tb>
Lipides divers : céramides de type 1 à VI, glycérol, monoglycérides...

* : différence statistiquement significative par rapport à la peau témoin (test apparié de Student, p < 0, 05)
Une diminution statistiquement significative des lipides totaux après application d'acétone (p < 0,05) peut ainsi être observée dans le tableau V.

L'application du produit M109 induit ainsi une augmentation significative des lipides (p < 0,05), alors que l'application de l'huile peroxygénée ne modifie pas la quantité de lipides par rapport à la peau traitée par l'acétone.

En ce qui concerne les lipides du sébum (Tableau VI), la déshydratation par l'acétone induit une diminution significative des squalènes (p < 0,05). Après traitement par le produit M109, une tendance à l'augmentation de ce paramètre par rapport aux peaux traitées par l'acétone peut être observée. Le paramètre ester de cholestérol est significativement augmenté par le traitement au M 109 (p < 0,05) par rapport aux peaux témoins. En ce qui concerne les diglycérides, une différence significative entre le traitement par le produit M109 et celui par l'huile peroxygénée peut être observée : 4,16% versus 2,86% (p < 0,05). Les triglycérides ne montrent pas de modification.

En ce qui concerne les lipides du stratum corneum (Tableau VII), l'acétone induit une augmentation statistiquement significative du taux de lipides divers (p < 0, 05).

L'application du produit M109 n'a pas modifié ce taux. Le cholestérol ne montre pas de modification.

3.5. Evaluation de la modulation vasculaire a) Evaluation du pourcentage global de capillaires dilatés Les résultats concernant le pourcentage global de capillaires dilatés sont exposés dans le Tableau VIII.

Tableau VIII : Evaluation histologique du calibre des capillaires dermiques (hemalun- éosine) :

<tb>
<tb> %
<tb> peau <SEP> témoin <SEP> 40, <SEP> 6 <SEP> i <SEP> 15, <SEP> 1
<tb> peau <SEP> + <SEP> SP <SEP> 76,2 <SEP> i <SEP> 16, <SEP> 3 <SEP> *
<tb> peau <SEP> + <SEP> SP <SEP> + <SEP> M109 <SEP> 49, <SEP> 3 <SEP> i <SEP> 9 <SEP> * <SEP> &num; <SEP> $
<tb> peau <SEP> + <SEP> SP <SEP> + <SEP> H <SEP> PO <SEP> 76,95 <SEP> i <SEP> 13, <SEP> 8 <SEP> *
<tb>
* : différence statistiquement significative par rapport à la peau témoin (test apparié de Student, p < 0, 05) &num; : différence statistiquement significative par rapport à la peau traitée par l'acétone (test apparié de Student, p < 0, 05) $ : différence statistiquement significative entre peau traitée par M109 et peau traitée par les huiles peroxygénées (test apparié de Student, p < 0,05) L'application de substance P induit une vasodilatation statistiquement significative par rapport à la peau témoin (p < 0,05). Après application du produit M109, le pourcentage de capillaires dilatés est significativement diminué, par rapport aux peaux témoins expérimentales (P < 0, 05). Une différence statistiquement significative apparaît clairement entre la peau traitée par le produit M109 et celle traitée par l'huile peroxygénée (p < 0,05). b) Mesure de la surface moyenne des capillaires Les résultats concernant la mesure de la surface moyenne des capillaires dilatés sont exposés dans le Tableau IX.

Tableau IX :

<tb>
<tb> surface <SEP> en <SEP> um
<tb> peau <SEP> témoin <SEP> 37, <SEP> 6 <SEP> : <SEP> t <SEP> 18, <SEP> 7
<tb>

<tb>
<tb> peau <SEP> + <SEP> SP <SEP> 148, <SEP> 0 <SEP> : <SEP> t <SEP> 76, <SEP> 2 <SEP> *
<tb> peau <SEP> + <SEP> SP <SEP> + <SEP> M109 <SEP> 41, <SEP> zu
<tb> peau+ <SEP> SP <SEP> +HPO <SEP> 115, <SEP> 4 <SEP> + <SEP> 52 <SEP> *
<tb>
* : différence statistiquement significative par rapport à la peau témoin (test apparié de Student, p < 0, 05) &num; : différence statistiquement significative par rapport à la peau traitée par l'acétone (test apparié de Student, p < 0, 05) $ : différence statistiquement significative entre peau traitée par M109 et peau traitée par les huiles peroxygénées (test apparié de Student, p < 0, 05) L'application de substance P induit ainsi une augmentation statistiquement significative de la surface moyenne des capillaires par rapport à la peau témoin (p < 0, 05). L'application du produit M109, et à un moindre degré celle de l'huile peroxygénée, permet de diminuer la surface moyenne des capillaires par rapport aux peaux témoins expérimentales. Cette diminution est significative uniquement pour le

produit M109 (p < O, 05). Par ailleurs, l'analyse statistique met en évidence une différence significative entre les peaux traitées par le produit M109 et celles traitées par l'huile peroxygénée (p < 0, 05). c) Evaluation de l'oedème dermique Les résultats concernant l'analyse de l'oedème dermique sont exposés dans le Tableau X.

Tableau X : Evaluation histologique semi-quantitative de l'oedème dermique (hemalun-éosine)

<tb>
<tb> scores
<tb> peau <SEP> témoin <SEP> 0, <SEP> 73 <SEP> =t <SEP> 0, <SEP> 3
<tb> peau <SEP> + <SEP> SP <SEP> 1,6 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> *
<tb> peau <SEP> + <SEP> SP <SEP> + <SEP> M109 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> ~ <SEP> 0,5 <SEP> &num;
<tb> peau <SEP> + <SEP> SP <SEP> + <SEP> H <SEP> PO <SEP> 1,45 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> *
<tb>

* : différence statistiquement significative par rapport à la peau témoin (test apparié de Student, p < 0, 05) &num; : différence statistiquement significative par rapport à la peau traitée par l'acétone (test apparié de Student, p < 0, 05) L'application de substance P induit une augmentation statistiquement significative de l'oedème par rapport à la peau témoin (p < 0, 05). L'application du produit Ml 09 permet de diminuer l'oedème de façon significative par rapport aux peaux témoins expérimentales (p < 0, 05). Ces résultats ne sont pas retrouvés après application d'huile peroxygénée.

3.5. Evaluation de l'activité mitotique Les résultats concernant l'évaluation de la prolifération épithéliale analysée par immunohistochimie sont exposés dans le Tableau XI.

Tableau XI : Analyse de la prolifération après immunomarquage à l'aide d'un anticorps anti-Ki67 (% de cellules basales positives)

<tb>
<tb> Peau <SEP> témoin <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP> 2, <SEP> 7
<tb> Peau <SEP> + <SEP> MI09 <SEP> 7, <SEP> 06 <SEP> 3, <SEP> 16*$
<tb> Peau <SEP> + <SEP> H <SEP> PO <SEP> 3, <SEP> 45 <SEP> 2, <SEP> 25
<tb>
* : différence statistiquement significative par rapport à la peau témoin (test apparié de Student, p < 0, 05) $ : différence statistiquement significative entre peau traitée par M109 et peau traitée par les huiles peroxygénées (test apparié de Student, p < 0, 05) La prolifération épithéliale analysée par immunohistochimie à l'aide d'un anticorps anti-Ki67 est augmentée de façon statistiquement significative après application du produit M109 par rapport aux peaux témoins (p < 0,05). L'application d'huile peroxygénée ne modifie pas la prolifération épithéliale par rapport aux peaux témoins et on note une différence significative entre peaux traitées par le produit M109 et peaux traitées avec l'huile peroxygénée (p < 0,05).

4. Conclusions
Le modèle expérimental de peau humaine déshydratée a permis de mettre en évidence une modulation positive du produit M109 sur la protection des protéines de structure de l'épithélium, filaggrine et transglutaminase de type 1. En effet, le modèle a permis d'obtenir une diminution statistiquement significative par rapport à la peau témoin de l'intensité de ces deux immunomarquages, et l'application préventive du produit M109 avant l'étape de déshydratation a permis de conserver un immunomarquage identique à la peau témoin. Ces résultats ne sont pas observés après application d'une huile peroxygénée.

Ces données peuvent également être corrélées avec une augmentation significative des secteurs de stratum comeum compactum et de son épaisseur au niveau des peaux traitées par M109, augmentation non observée avec l'huile peroxygénée.

La quantité de lipides totaux est significativement augmentée après application du produit M109 dans ce modèle de peau déshydratée.

Dans le modèle expérimental de vasodilatation par la substance P, a été mise en évidence une efficacité du produit M109 sur le tonus vasculaire. En effet, le produit M109 a permis de protéger la peau soumise à la substance P et d'empêcher la vasodilatation des capillaires ainsi que l'oedème. Cette protection, statistiquement significative par rapport à la peau soumise à la substance P, n'a pas été observée après application d'huile peroxygénée.

Le produit M109, contrairement à l'huile peroxygénée, a permis d'obtenir une modulation positive de l'immunomarquage avec l'anticorps anti-Ki67 traduisant une augmentation statistiquement significative de la prolifération épithéliale, par rapport aux témoins.

Claims

REVENDICATIONS

1. Composition comprenant en association : (a) au moins un flavonoïde, (b) au moins un extrait peptidique de lupin, et (c) au moins une huile végétale.

2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le flavonoïde (a) est une flavanone, avantageusement choisie dans le groupe constitué par la naringénine, la naringine, l'hespérétine, et l'hespéridine.

3. Composition selon la revendication l, caractérisée en ce que le flavonoïde (a) est une flavone, avantageusement choisie dans le groupe constitué par la rutine, la troxérutine, la diosmine, la diosmétine, la chrysine, la quercétine et la lutéoline.

4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'extrait peptidique de lupin (b) comprend des peptides glutaminés de faible poids moléculaire et des oligosaccharides.

5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'extrait peptidique de lupin (b) est obtenu par hydrolyse de la fraction protéique de lupin.

6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'huile végétale (c) est une huile riche en acides gras de la famille n-6, une huile riche en acides gras de la famille n-3, ou une huile riche en acides gras des familles n-6 et n-3.

7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'huile végétale (c) est l'huile de Rosier Muscat.

8. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le flavonoïde (a) est présent à une concentration comprise entre 0,1 et 20 %, avantageusement entre 1 et 10 %, par rapport au poids total de la composition.

9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'extrait peptidique de lupin (b) est présent à une concentration

comprise entre 0,1 et 20 %, avantageusement entre 1 et 10 %, par rapport au poids total de la composition.

10. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition est formulée pour être administrée par voie topique.

11. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition se présente sous forme d'une émulsion.

12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que la composition contient en outre un polymère émulsifiant de type Pemulen.

13. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que la composition est conditionnée sous forme de spray.

14. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour son utilisation comme agent dermatologique ou dermato-cosmétique.

15. Composition selon la revendication 14 pour son utilisation comme agent anti-inflammatoire ou comme agent régénérateur du tissu épidermique et dermique.

16. Composition selon la revendication 14 pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des oedèmes, des escarres, ou des troubles de la microcirculation cutanée.

17. Composition selon la revendication 14 pour son utilisation dans le traitement des radiodermites.