FR2827606A1 - New peptide derived from diphtheria anatoxin, useful as carrier in vaccines, lacks at least one Cys residue, also related nucleic acids - Google Patents
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Abstract
Description
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L'invention concerne de nouveaux dérivés d'anatoxines diphtériques et une composition pharmaceutique comprenant dans un milieu pharmaceutiquement acceptable de tels dérivés, tout comme l'utilisation de ces dérivés pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers. The invention relates to novel diphtheria toxoid derivatives and a pharmaceutical composition comprising in a pharmaceutically acceptable medium such derivatives, as the use of these derivatives for the preparation of a vaccine for the prophylactic or therapeutic treatment of viral infections, bacterial, parasitic or fungal or for the preparation of a vaccine for the prophylactic or therapeutic treatment of cancers.
La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Le succès des campagnes de vaccination dans ces domaines a permis d'étendre le concept de vaccin jusqu'alors utilisé dans le domaine de l'infectiologie aux domaines du cancer et des maladies auto-immunes. Vaccination is an effective way to prevent or reduce viral or bacterial infections. The success of vaccination campaigns in these areas has made it possible to extend the concept of vaccines previously used in the field of infectious diseases to the areas of cancer and autoimmune diseases.
La mise au point de vaccins parfaitement définis et dépourvus d'effets secondaires marqués, nécessite l'emploi d'antigènes vaccinants de faible masse moléculaire, tels que des peptides ou des oligosaccharides. Ces antigènes de faible masse, mais aussi certains antigènes de masse moléculaire supérieure tels que les polysaccharides de la paroi bactérienne, ne peuvent induire seuls une réponse immunitaire durable et intense. Il est indispensable de lier ces antigènes, par voie chimique ou par génie génétique, à des protéines porteuses. The development of well-defined vaccines with no marked side effects requires the use of low molecular weight vaccine antigens, such as peptides or oligosaccharides. These low-mass antigens, but also some higher molecular weight antigens such as polysaccharides in the bacterial wall, can not induce a lasting and intense immune response alone. It is essential to link these antigens, either chemically or genetically, to carrier proteins.
Comme protéines porteuses, on peut notamment citer les extraits de protéines
membranaires bactériennes telles que les OMPC de Neisseria meningitidis (Vella et al., Infect. Immun., 60 : 4977-4983,1992), TraT d'Escherichia coli (Croft et al., J. Immunol., 146 : 793-798,1991) ou PorB de Neisseria meningitidis (Fusco et al., J. Infect. Dis., 175 : 364-372,1997). As carrier proteins, mention may especially be made of protein extracts
bacterial membranes such as OMPC Neisseria meningitidis (Vella et al., Infect Immun., 60: 4977-4983,1992), TraT Escherichia coli (Croft et al., J. Immunol., 146: 793-798 1991) or PorB of Neisseria meningitidis (Fusco et al., J. Infect Dis., 175: 364-372, 1997).
Sont également utilisés comme porteurs, les anatoxines tétanique et diphtérique ; l'anatoxine tétanique (Rauly et al., Infect. Immun., 67 : 5547-5551,1999), quant à elle, est une protéine utilisée dans les vaccins à usage humain. Tetanus and diphtheria toxoids are also used as carriers; tetanus toxoid (Rauly et al., Infect Immun., 67: 5547-5551, 1999), for its part, is a protein used in vaccines for human use.
L'anatoxine au sens strict du terme est un dérivé atoxique de la toxine diphtérique obtenue après chauffage et traitement au formol. L'anatoxine est utilisée pour la vaccination antidiphtérique. The toxoid in the strict sense of the term is an atoxic derivative of diphtheria toxin obtained after heating and treatment with formalin. Toxoid is used for diphtheria vaccination.
<Desc/Clms Page number 2> <Desc / Clms Page number 2>
Les CRM (Cross Reacting Materials) sont des protéines modifiées obtenues par mutagénèse avec du nitrosoguanidine sur le corynephage P DNA contenant le gène tox de DT (toxine diphthérique) (Uchida et al., 1. Biol. Chem., 248 : 3838,3845, 3851,1973). CRMs (Cross Reacting Materials) are modified proteins obtained by mutagenesis with nitrosoguanidine on the corynephage P DNA containing the tox gene of DT (diphtheria toxin) (Uchida et al., 1. Biol Chem., 248: 3838-3845 , 3851, 1973).
Ces protéines sont similaires d'un point de vue antigénique à la toxine native mais ne présentent pas de toxicité. These proteins are antigenically similar to the native toxin but do not exhibit toxicity.
Comme exemple de CRM, on peut citer le CRM 197 (Giannini G. et al., Nucleic Acids Res., 12 : 4063,1984) qui est remarquable du fait qu'il ne présente qu'une modification d'un seul acide aminé (substitution du résidu Gly (position aa 52) avec Glu) et ne se distingue pas d'un point de vue antigénique de la toxine native. Cette unique mutation a totalement aboli le caractère toxique de la protéine. On peut également citer le CRM 45 (Giannini G. et al., Nucleic Acids Res., 12 : 4063,1984) qui résulte de la délétion d'une partie C-terminale de la sous-unité B de DT, environ de 17 Kda, partie responsable de la fixation sur le récepteur de la cellule. Par conséquent, la protéine CRM 45 n'a plus la capacité de se lier à la surface de la cellule. An example of CRM is CRM 197 (Giannini, G. et al., Nucleic Acids Res., 12: 4063, 1984), which is remarkable in that it exhibits only one modification of a single amino acid (substitution of the Gly residue (position aa 52) with Glu) and is not distinguished from an antigenic point of view of the native toxin. This unique mutation has completely abolished the toxic nature of the protein. Mention may also be made of CRM 45 (Giannini, G. et al., Nucleic Acids Res., 12: 4063, 1984) which results from the deletion of a C-terminal portion of the B subunit of DT, approximately from 17 Kda, part responsible for fixing on the receiver of the cell. As a result, the CRM 45 protein no longer has the ability to bind to the surface of the cell.
Il a été constaté par les inventeurs que la production de peptides dérivés d'anatoxines posaient de multiples problèmes, notamment lorsque le porteur est couplé à un antigène peptidique. Il a ainsi été constaté qu'il pouvait se former lors de la production des dérivés d'anatoxines, des multimètres desdits dérivés. Les configurations initiales, notamment au niveau de la formation des ponts disulfures, peuvent se modifier. It has been found by the inventors that the production of peptides derived from toxoids posed multiple problems, especially when the carrier is coupled to a peptide antigen. It has thus been found that it can be formed during the production of toxoid derivatives, multimeters of said derivatives. The initial configurations, especially at the level of the formation of disulfide bridges, can be modified.
De même, lors de la production de protéine de fusion entre un dérivé d'anatoxine et un peptide ou protéine d'intérêt, la configuration initiale, notamment au niveau de la formation des ponts disulfures du dérivé d'anatoxine ou du peptide d'intérêt peut se modifier. De plus dans le cas de protéine de fusion entre un dérivé d'anatoxine et un peptide ou protéine d'intérêt des appariements non désirés, à savoir de nouveaux ponts disulfures, peuvent se produire. Similarly, during the production of fusion protein between an anatoxin derivative and a peptide or protein of interest, the initial configuration, especially in the formation of the disulfide bridges of the toxoid derivative or the peptide of interest can change. In addition, in the case of a fusion protein between an anatoxin derivative and a peptide or protein of interest, undesired pairings, ie new disulfide bridges, may occur.
Ainsi, les rendements obtenus ne pouvaient être considérés comme satisfaisants. Thus, the yields obtained could not be considered satisfactory.
L'homme de l'art recherche donc des dérivés d'anatoxine plus facile à synthétiser. Those skilled in the art therefore seek toxoid derivatives easier to synthesize.
Ainsi, l'objet de la présente invention est d'obtenir de nouveaux peptides dérivés d'anatoxine répondant aux problèmes ci-dessus mentionnés, faciles à produire industriellement et permettant d'obtenir une réponse immune contre tout antigène qui lui Thus, the object of the present invention is to obtain new toxoid-derived peptides that respond to the aforementioned problems, which are easy to produce industrially and which make it possible to obtain an immune response against any antigen that
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est couplé ou fusionné, le moins de risque possible d'effets secondaires immunologiques et présentant une HSI (HyperSensibilité Immédiate) négative. is coupled or fused, with the least possible risk of immunologic side effects and negative HSI (Hypersensitivity Immediate).
De manière surprenante, il a été mis en évidence que certains dérivés d'anatoxines diphtériques répondent à ces besoins. Surprisingly, it has been demonstrated that certain diphtheria toxoid derivatives meet these needs.
La présente invention a ainsi pour objet de nouveaux dérivés d'anatoxines diphtériques, ces derniers étant plus faciles à produire industriellement tout en permettant d'augmenter l'immunogénicité d'un antigène associé de manière covalente, soit conjugué de manière chimique soit fusionné. The present invention thus relates to novel derivatives of diphtheria toxoids, the latter being easier to produce industrially while allowing to increase the immunogenicity of a covalently associated antigen, either chemically conjugated or fused.
Par"anatoxines diphtériques", on entend désigner en particulier tout peptide de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés de l'anatoxine diphtérique qui, lorsqu'il est associé à un antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'une cellule tumorale, est capable de générer ou accroître une réponse immunitaire dirigée contre ledit agent infectieux ou ladite cellule tumorale. Par "anatoxines diphtériques", on entend également désigner toute protéine génétiquement modifiée similaire d'un point de vue antigénique à la toxine native mais qui ne présente pas de toxicité. Ainsi, au sens de la présente invention, le terme"anatoxines diphtériques" comprend également les CRM tels que le CRM 197 et le CRM 45, et notamment ceux décrits dans Uchida et al., J. Biol. Chem., 248 : 3838,3845, 3851,1973 et Giannini G. et al., Nucleic Acids Res., 12 : 4063,1984. The term "diphtheria toxoids" is intended to denote in particular any peptide of amino acid sequence included in the amino acid sequence of diphtheria toxoid which, when combined with an antigen or hapten specific for an infectious agent or a tumor cell, is capable of generating or increasing an immune response directed against said infectious agent or said tumor cell. By "diphtheria toxoids" is also meant any genetically modified protein antigenically similar to the native toxin but which does not exhibit toxicity. Thus, for the purposes of the present invention, the term "diphtheria toxoids" also includes CRMs such as CRM 197 and CRM 45, and in particular those described in Uchida et al., J. Biol. Chem., 248: 3838, 3845, 3851, 1973 and Giannini, G. et al., Nucleic Acids Res., 12: 4063, 1984.
L'invention concerne ainsi un peptide dérivé d'anatoxine diphtérique de séquence comprenant au moins un résidu cystéine, caractérisé en ce que ledit peptide présente une séquence identique à la séquence de ladite anatoxine diphtérique et comprenant en outre une délétion d'au moins un résidu cystéine. The invention thus relates to a peptide derived from diphtheria toxoid of sequence comprising at least one cysteine residue, characterized in that said peptide has a sequence identical to the sequence of said diphtheria toxoid and further comprising a deletion of at least one residue cysteine.
De tels nouveaux dérivés selon l'invention sont d'autant plus surprenants sachant que l'art antérieur enseignait à l'homme du métier de rajouter des résidus cystéines. Ainsi, le brevet WO 87/02987 préconise de rajouter un codon cystéine en région C-terminale de l'ADN codant pour la toxine diphtérique. Such new derivatives according to the invention are all the more surprising knowing that the prior art taught the skilled person to add cysteine residues. Thus, patent WO 87/02987 recommends adding a cysteine codon in the C-terminal region of the DNA coding for diphtheria toxin.
L'invention concerne également un peptide présentant après alignement optimal au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, 90 %, 95 % et 99 % d'homologie avec un peptide dérivé d'anatoxine diphtérique selon l'invention et comprenant la délétion dudit au moins résidu cystéine du peptide dérivé d'anatoxine diphtérique. The invention also relates to a peptide having, after optimal alignment, at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 95% and 99% homology with a peptide derived from diphtheria toxoid according to the invention and comprising the deletion said at least one cysteine residue of the peptide derived from diphtheria toxoid.
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Le peptide dérivé d'anatoxine diphtérique peut être obtenu par voie recombinante. The peptide derived from diphtheria toxoid can be obtained recombinantly.
Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description, on pourra néanmoins se référer à la méthode décrite dans les exemples. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, il faut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins P. O. et Lee S. C., Curr. Op. Biotechnology, 4 : 520-525, 1993), mais également les cellules de levure (Buckholz R. G., Curr. Op. Biotechnology, 4 : 538-542,1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifère (Edwards C. P. et Aruffo A., Curr. Op. Biotechnology, 4 : 558-563, 1993) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus (Luckow V. A., Curr. Op. Biotechnology, 4 : 564-572,1993). The methods of preparation of recombinant proteins are now well known to those skilled in the art and will not be developed in the present description, it will nevertheless be possible to refer to the method described in the examples. Among the cells that can be used for the production of these recombinant proteins, it is of course necessary to mention bacterial cells (Olins PO and Lee SC, Curr Op Op Biotechnology, 4: 520-525, 1993), but also yeast cells (Buckholz RG, Curr Op., Biotechnology, 4: 538-542, 1993), as well as animal cells, particularly mammalian cell cultures (Edwards CP and Aruffo A., Curr Op Op Biotechnology, 4: 558; 563, 1993) but also the insect cells in which processes using, for example, baculoviruses (Luckow VA, Curr Op Op Biotechnology, 4: 564-572, 1993) can be used.
De manière tout à fait préférée, l'anatoxine diphtérique est choisie parmi le dérivé atoxique de la toxine diphtérique obtenue après chauffage et traitement au formol, le CRM 197 de séquence SEQ ID NO 10 et le CRM 45 de séquence SEQ ID NO Il. In a most preferred manner, the diphtheria toxoid is chosen from the atoxic derivative of diphtheria toxin obtained after heating and formalin treatment, the CRM 197 of sequence SEQ ID NO 10 and the CRM 45 of sequence SEQ ID NO II.
Les cystéines sont préférentiellement délétées dans les régions N-terminales ou Cterminales, notamment dans six des protéines de fusion entre un dérivé d'anatoxine et un peptide ou protéine d'intérêt de manière à éviter des appariements non désirés, tels que de nouveaux ponts disulfures. The cysteines are preferably deleted in the N-terminal or terminal regions, in particular in six of the fusion proteins between an anatoxin derivative and a peptide or protein of interest so as to avoid unwanted pairings, such as new disulfide bridges. .
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, toutes les cystéines sont délétées. In a preferred embodiment of the invention, all cysteines are deleted.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le peptide dérivé d'anatoxine diphtérique comprend ou a pour séquence : a) une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés SEQ ID ? 1, SEQ ID ? 2 et SEQ ID ? 3 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant après alignement optimal une homologie d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 % avec la séquence d'acides aminés de référence SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 3. In a particularly preferred embodiment of the invention, the peptide derived from diphtheria toxoid comprises or has the following sequence: a) an amino acid sequence selected from amino acid sequences SEQ ID. 1, SEQ ID? 2 and SEQ ID? 3; b) the amino acid sequence of a sequence having, after optimal alignment, a homology of at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 99% with the reference amino acid sequence SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 or SEQ ID NO 3.
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Le peptide de séquence SEQ ID NO 1, dénommé DTa, correspond au CRM 197 et possède en outre une délétion en C-terminal après le résidu Ala position 185, juste avant le résidu Cys 186. The peptide of sequence SEQ ID No. 1, called DTa, corresponds to CRM 197 and also has a C-terminal deletion after residue A1 at position 185, just before the Cys residue 186.
Le peptide de séquence SEQ ID NO 2, dénommé DTb, comporte une délétion de la partie responsable du binding de DT au récepteur de la cellule, à savoir de la partie Nterminale de 8 aa (Cys en position 8), et en C-terminale après l'aa K (456)
Le peptide de séquence SEQ ID NO 3, dénommé DTaDTb est un conjugué de DTa et DTb. The peptide of sequence SEQ ID NO 2, called DTb, contains a deletion of the part responsible for the binding of DT to the cell's receptor, namely the Nterminal part of 8 aa (Cys at position 8), and in C-terminal after aa K (456)
The peptide of sequence SEQ ID NO 3, called DTaDTb, is a conjugate of DTa and DTb.
Par séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés présentant une homologie d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés déterminée, on entend désigner une séquence qui après alignement optimal avec ladite séquence déterminée comprend un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec ladite séquence déterminée. By nucleic acid sequence or amino acid sequence having a homology of at least 80% after optimal alignment with a determined nucleic acid or amino acid sequence, is meant a sequence which after optimal alignment with said determined sequence comprises an identity percentage of at least 80% with said determined sequence.
Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math., 2 : 482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol., 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85 : 2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P). By percentage identity between two nucleic acid or amino acid sequences in the sense of the present invention, it is meant to designate a percentage of nucleotides or identical amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being randomly distributed over their entire length. The sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally performed by comparing these sequences after optimally aligning them, said comparison being made by segment or comparison window to identify and compare the local regions of the sequence. sequence similarity. The optimal alignment of the sequences for comparison can be realized, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math., 2: 482], using the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol., 48: 443], using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2444], using computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, or by BLAST N or BLAST P comparison software).
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Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. The percentage identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences by comparison window in which the region of the nucleic acid or amino acid sequence to be compared. may include additions or deletions relative to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences. The percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window. and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage identity between these two sequences.
Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, BLAST 2 sequences , disponible sur le site http : //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorfì'b12. html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres open gap penaltie : 5, et extension gap penaltie : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice BLOSUM 62 proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme. For example, we can use the BLAST program, BLAST 2 sequences, available on the website http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / gorfì'b12. html, the parameters used being those given by default (in particular for the parameters open gap penalty: 5, and gap gap penalty: 2, the chosen matrix being for example the matrix BLOSUM 62 proposed by the program), the percentage of identity between the two sequences to be compared being calculated directly by the program.
Parmi lesdites séquences présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence de référence, on préfère les séquences de, ou codant pour des, peptides capables d'induire une réponse immunitaire dirigée spécifiquement contre l'antigène ou haptène qui lui est associée, telle que l'induction d'une réponse immunitaire mesurée au moyen des techniques standard décrites dans les exemples ci-après. Among said sequences having a homology of at least 80% with the reference sequence, sequences of or coding for peptides capable of inducing an immune response specifically directed against the antigen or hapten associated therewith, are preferred. such as induction of an immune response measured using the standard techniques described in the examples below.
La présente invention concerne encore un acide nucléique codant pour un dérivé d'anatoxines diphtériques selon l'invention, et préférentiellement pour un dérivé d'anatoxines diphtériques de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 3. The present invention also relates to a nucleic acid encoding a diphtheria toxoid derivative according to the invention, and preferably to a derivative of diphtheria toxoids of SEQ ID No. 1, SEQ ID NO 2 or SEQ ID NO 3.
L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un peptide dérivé d'anatoxines diphtériques selon l'invention ou un acide nucléique codant pour ledit peptide. The invention also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises in a pharmaceutically acceptable medium at least one peptide derived from diphtheria toxoids according to the invention or a nucleic acid encoding said peptide.
La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au The present invention also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises in a pharmaceutically acceptable medium at
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moins une cellule hôte transformée capable d'exprimer ledit peptide dérivé d'anatoxines diphtériques selon l'invention. less a transformed host cell capable of expressing said peptide derived from diphtheria toxoids according to the invention.
L'invention a également pour objet la composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre, un antigène, immunogène ou haptène. The subject of the invention is also the composition according to the invention, characterized in that the said pharmaceutical composition further comprises an antigen, an immunogen or a hapten.
Par immunogène, antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'une cellule tumorale , on entend désigner en particulier tout composé exprimé par un agent infectieux, tel qu'un virus, une bactérie, une levure, un champignon ou un parasite, par une cellule tumorale, ou un de leurs analogues structuraux, qui seul ou en association avec un adjuvant ou porteur est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale. By immunogen, antigen or hapten specific for an infectious agent or a tumor cell is meant in particular any compound expressed by an infectious agent, such as a virus, a bacterium, a yeast, a fungus or a parasite, by a tumor cell, or a structural analogue thereof, which alone or in combination with an adjuvant or carrier is capable of inducing a specific immune response of said infectious agent or said tumor cell.
On entend également désigner par"immunogène, antigène ou haptène"dans la présente description un composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène ou haptène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène ou haptène dans un organisme préalablement immunisé avec ledit composé analogue. The term "immunogen, antigen or hapten" in the present description is also intended to denote a compound having a structural analogy with said antigen or hapten capable of inducing an immunological response directed against said antigen or hapten in an organism previously immunized with said analogous compound.
Ledit antigène ou haptène peut notamment être choisi parmi les protéines, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques et les lipides. Said antigen or hapten may in particular be chosen from proteins, glycopeptides, lipopeptides, polysaccharides, oligosaccharides, nucleic acids and lipids.
Dans une forme de réalisation de l'invention, ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon. In one embodiment of the invention, said antigen, immunogen or hapten is derived from a virus, bacterium, parasite or fungus.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le VRS, le para influenza virus (PIV), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques. In a preferred embodiment of the invention, said antigen, immunogen or hapten comprises at least one peptide derived from a microorganism responsible for pathologies of the airway chosen from RSV, para-influenza virus (PIV), influenza virus. , hantaviruses, streptococci, pneumococci, haemophilus influenza type b, rhinoviruses, coronoviruses and meningococci.
Dans un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un fragment de la protéine G du virus respiratoire syncytial. In an even more preferred embodiment of the invention said antigen, immunogen or hapten comprises at least one fragment of the G protein of respiratory syncytial virus.
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention ledit antigène, immunogène ou haptène est décrit dans les demandes de brevets WO 87/04185 relative à des protéines structurales du VRS, WO 89/02935 qui décrit la protéine F entière du In another preferred embodiment of the invention said antigen, immunogen or hapten is described in patent applications WO 87/04185 relating to structural proteins of RSV, WO 89/02935 which describes the entire protein F of the invention.
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VRS, éventuellement modifiée sous forme monomérique ou déglycosylée, WO 95/27787 qui concerne des peptides issus de la protéine G du VRS et plus particulièrement le peptide dénommé G2Na (fragment aa 130-230 de la protéine G du VRS humain de type
A identifié par la séquence SEQ ID NO 1 du document WO 95/27787 appelé encore "G2A"), WO 97/46581 qui divulgue des peptides structurellement homologues à la séquence 149-197 de la protéine G et dans laquelle aucun oligosaccharide n'est lié à une sérine, thréonine ou asparagine ou dans la demande WO 99/03987 qui décrit des épitopes spécifiques de la protéine G du VRS. VRS, optionally modified in monomeric or deglycosylated form, WO 95/27787 which relates to peptides derived from the G protein of the RSV and more particularly the peptide called G2Na (fragment aa 130-230 of the human VRS G protein type
Identified by the sequence SEQ ID No. 1 of WO 95/27787, also called "G2A"), WO 97/46581 which discloses peptides structurally homologous to the sequence 149-197 of the G protein and in which no oligosaccharide is linked to a serine, threonine or asparagine or in WO 99/03987 which describes epitopes specific for the RSV G protein.
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention ledit antigène correspond à un peptide immunogène dérivé de la protéine G du VRS du sous-groupe A ou B comprenant au moins : - un premier peptide dérivé de la protéine G du VRS du sous-groupe A ou B comprenant au moins en position 173,176, 182 et 186 une cystéine, et dont l'extrémité C-terminale comprend au plus l'acide aminé en position 192 ; et - un deuxième peptide dérivé d'une protéine du VRS du sous-groupe A ou B, ledit deuxième peptide étant situé en aval dudit premier peptide, de manière à ce que le peptide immunogène produit présente un pont disulfure reliant les résidus 173 et 186 et un deuxième pont disulfure reliant les résidus 176 et 182. In another preferred embodiment of the invention, said antigen corresponds to an immunogenic peptide derived from the RSV G protein of subgroup A or B comprising at least: a first peptide derived from the RSV G protein of the sub-group group A or B comprising at least in position 173, 176, 182 and 186 a cysteine, and whose C-terminal end comprises at most the amino acid in position 192; and a second peptide derived from a RSV protein of subgroup A or B, said second peptide being located downstream of said first peptide, so that the immunogenic peptide produced has a disulfide bridge connecting residues 173 and 186. and a second disulfide bridge connecting residues 176 and 182.
Par peptide"comprenant au moins en position 173,176, 182 et 186 une cystéine, et dont l'extrémité C-terminale comprend au plus l'acide aminé en position 192", on entend désigner tout peptide présentant au moins 4 cystéines dans la même configuration que la protéine G native. Les numéros de position font référence à la protéine native et ne signifient pas que le premier peptide selon l'invention comprend forcément tous les 192 premiers acides aminés de la protéine G native, mais que ce peptide est un peptide de séquence n-m, avec n = 1-172 et m = 187-192. By "peptide" comprising at least in position 173,176, 182 and 186 a cysteine, and whose C-terminus comprises at most the amino acid at position 192 ", is meant any peptide having at least 4 cysteines in the same configuration. than the native G protein. The position numbers refer to the native protein and do not mean that the first peptide according to the invention necessarily comprises all the first 192 amino acids of the native G protein, but that this peptide is a peptide of nm sequence, with n = 1-172 and m = 187-192.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit premier peptide présente une séquence choisie parmi la séquence de la protéine G du VRS de sous groupe A ou B 130-190,130-192, 140-190,140-192, 145-190,145-192, 148-190,148-192, 130-188, 140-188,145-188 ou 148-188, et préférentiellement la séquence 140-190. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, ledit deuxième peptide présente une séquence choisie parmi la séquence 144-158,144-159 de la protéine G du VRS. On préfère dans le In a preferred embodiment of the invention, said first peptide has a sequence selected from the group VRS G protein sequence of subgroup A or B 130-190,130-192, 140-190,140-192, 145-190,145-192. , 148-190,148-192, 130-188, 140-188,145-188 or 148-188, and preferentially the 140-190 sequence. In another preferred embodiment of the invention, said second peptide has a sequence selected from the sequence 144-158,144-159 of the VRS G protein. We prefer in the
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cadre de la présente invention tout particulièrement l'antigène dénommé G20a correspondant à la séquence 140-190 de la protéine G du VRS, sous groupe A, couplée à la séquence 144-158 de la protéine G du VRS, sous groupe A. It is particularly within the scope of the present invention that the antigen designated G20a corresponding to the 140-190 sequence of the RSV G protein, subgroup A, coupled to the 144-158 sequence of the VRS G protein, subgroup A.
L'antigène, immunogène ou haptène peut également être associé ou spécifique d'une cellule tumorale. The antigen, immunogen or hapten may also be associated or specific to a tumor cell.
Parmi les cancers dont les tumeurs expriment un antigène tumoral associé pouvant être prévenus ou traités par les utilisations selon la présente invention, on peut citer en particulier, mais sans s'y limiter : * le cancer du sein, du poumon, du côlon, et le carcinome gastrique (Kawashima et al.,
Cancer Res., 59 : 431-5,1999) ;
. le mésothéliome, l'ostéosarcome, les cancers du cerveau (Xie et al., J. Natl. Cancer. Among the cancers whose tumors express an associated tumor antigen which can be prevented or treated by the uses according to the present invention, mention may be made in particular of, but not limited to: breast cancer, lung cancer, colon cancer, and gastric carcinoma (Kawashima et al.,
Cancer Res., 59: 431-5, 1999);
. mesothelioma, osteosarcoma, brain cancers (Xie et al., J. Natl Cancer.
Inst., 91 : 169-75, 1999) ; * le mélanome (Zheuten et al., Bratilsl. Lek. Listy, 99 : 426-34, 1998) ; * l'adénome cystique du pancréas (Hammel et al., Eur. J. gastroenterol. Hepatol.,
10 : 345-8,1998) ; * le cancer colorectal (Ogura et al., Anticancer Res., 18 : 3669-75, 1998) ; . le carcinome des cellules rénales (Jantzer et al., Cancer Res., 58 : 3078-86,1998) ; et * le cancer de l'ovaire et du cervix (Sonoda et al., Cancer, 77 : 1501-9,1996). Inst., 91: 169-75, 1999); melanoma (Zheuten et al., Brailsl, Lek, Listy, 99: 426-34, 1998); cystic adenoma of the pancreas (Hammel et al., Eur J. Gastroenterol, Hepatol.
10: 345-8.1998); * colorectal cancer (Ogura et al., Anticancer Res., 18: 3669-75, 1998); . renal cell carcinoma (Jantzer et al., Cancer Res., 58: 3078-86, 1998); and * ovarian and cervix cancer (Sonoda et al., Cancer, 77: 1501-9, 1996).
La présente invention a aussi pour objet une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est couplé ou mélangé au peptide dérivé d'anatoxines diphtériques selon l'invention. The subject of the present invention is also a composition according to the invention, characterized in that said antigen, immunogen or hapten is coupled to or mixed with the peptide derived from diphtheria toxoids according to the invention.
Ainsi, le dérivé d'anatoxine diphtérique selon l'invention peut être couplé par liaison covalente, notamment par couplage chimique, avec l'immunogène, antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'une cellule tumorale. Thus, the diphtheria toxoid derivative according to the invention may be coupled by covalent bonding, in particular by chemical coupling, with the immunogen, antigen or hapten specific for an infectious agent or a tumor cell.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans le dérivé d'anatoxines diphtériques selon l'invention et/ou dans ledit antigène ou haptène pour faciliter le couplage chimique, de préférence, ledit élément de liaison introduit est un acide aminé. In a particular embodiment of the invention, one or more linking elements are introduced into the diphtheria toxoid derivative according to the invention and / or into said antigen or hapten to facilitate the chemical coupling, preferably, said element. introduced is an amino acid.
Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre le peptide dérivé d'anatoxines diphtériques selon l'invention et ledit immunogène, antigène ou According to the invention, it is possible to introduce one or more linking elements, in particular amino acids, to facilitate the coupling reactions between the peptide derived from diphtheria toxoids according to the invention and said immunogen, antigen or
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haptène. Le couplage covalent entre le peptide dérivé d'anatoxines diphtériques selon l'invention et ledit immunogène, antigène ou haptène selon l'invention peut être réalisé à l'extrémité N-ou C-terminale dudit peptide. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité dudit peptide choisie pour effectuer le couplage et de la nature dudit immunogène, antigène ou haptène à coupler. hapten. The covalent coupling between the peptide derived from diphtheria toxoids according to the invention and said immunogen, antigen or hapten according to the invention can be carried out at the N- or C-terminal end of said peptide. The bifunctional reagents allowing this coupling will be determined as a function of the end of said peptide chosen to effect the coupling and of the nature of said immunogen, antigen or hapten to be coupled.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement préféré, le couplage entre ledit immunogène, antigène ou haptène et ledit peptide dérivé d'anatoxines diphtériques selon l'invention est réalisé par recombinaison génétique, lorsque ledit immunogène, antigène ou haptène est de nature peptidique. In another particularly preferred embodiment, the coupling between said immunogen, antigen or hapten and said peptide derived from diphtheria toxoids according to the invention is carried out by genetic recombination, when said immunogen, antigen or hapten is peptide in nature.
Les conjugués issus d'un couplage entre l'immunogène, antigène ou haptène et ledit peptide dérivé d'anatoxines diphtériques selon l'invention, peuvent être préparés par recombinaison génétique. La protéine chimérique ou hybride (le conjugué) peut être produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour ledit peptide dérivé d'anatoxines diphtériques selon l'invention, d'une séquence codant pour ledit immunogène, antigène ou haptène de nature protéique. Conjugates resulting from a coupling between the immunogen, antigen or hapten and said peptide derived from diphtheria toxoids according to the invention may be prepared by genetic recombination. The chimeric or hybrid protein (the conjugate) may be produced by recombinant DNA techniques by insertion or addition to the DNA sequence coding for said peptide derived from diphtheria toxoids according to the invention, of a sequence coding for said immunogen, antigen or hapten of protein nature.
Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D. V. Goeddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185, 3-187,1990). Methods for synthesizing hybrid molecules include methods used in genetic engineering to construct hybrid polynucleotides encoding the desired polypeptide sequences. For example, the technique for obtaining genes coding for fusion proteins described by D.V. Goeddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology, vol 185, 3-187, 1990) can be advantageously referred to.
L'invention comprend également un tel conjugué entre un dérivé d'anatoxine diphtérique selon l'invention et un immunogène, antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'une cellule tumorale. The invention also comprises such a conjugate between a diphtheria toxoid derivative according to the invention and an immunogen, antigen or hapten specific for an infectious agent or a tumor cell.
Comme exemple de tels conjugués, on peut citer les peptides de séquences SEQ ID NO 4 à SEQ ID NO 9 correspondant respectivement aux conjugués G2Na et DTa, G2Na et DTb, et G2Na et DTaDTb et aux conjugués G20a et DTa, G20a et DTb, et G20a et DTaDTb. As examples of such conjugates, there may be mentioned the peptides of SEQ ID NO 4 to SEQ ID NO 9 corresponding respectively to the G2Na and DTa conjugates, G2Na and DTb, and G2Na and DTaDTb conjugates G20a and DTa, G20a and DTb, and G20a and DTaDTb.
La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique qui comprend une construction nucléique codant pour ledit conjugué, ou qui comprend un vecteur contenant une construction nucléique codant pour ledit conjugué ou une cellule The present invention also relates to a pharmaceutical composition which comprises a nucleic construct coding for said conjugate, or which comprises a vector containing a nucleic construct coding for said conjugate or a cell
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hôte transformée contenant ladite construction nucléique capable d'exprimer ledit conjugué. transformed host containing said nucleic construct capable of expressing said conjugate.
Les compositions selon l'invention peuvent contenir en outre un adjuvant. Ce dernier peut notamment être choisi parmi le MPL-A ( MonoPhosphoryl Lipid A ), le MF-59, le Quil-A (adjuvant dérivé de saponine), l'ISCOM ( ImmunoStimulating COMplex ), le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC), les CpG (oligodésoxynucléotides contenant un motif spécifique centré sur un dinucléotide CpG), la Leif (antigène protéique dérivé de Leishmania capable de stimuler les cellules PBMC et présentatrices d'antigène, et de produire une réaction cytokine de type Th-1), la CT (Toxine Cholérique), la LT ( heat Labil Toxin ) et les versions détoxifiées de la CT ou la LT. The compositions according to the invention may further contain an adjuvant. The latter may in particular be chosen from MPL-A (MonoPhosphoryl Lipid A), MF-59, Quil-A (adjuvant derived from saponin), ISCOM (ImmunoStimulating COMplex), Dimethyl Dioctadecyl Ammonium in the form of bromide ( DDAB) or chloride (DDAC), CpGs (oligodeoxynucleotides containing a specific motif centered on a CpG dinucleotide), Leif (protein antigen derived from Leishmania capable of stimulating PBMC and antigen presenting cells, and producing a cytokine reaction Th-1 type), CT (Chlorine Toxin), LT (heat Labil Toxin) and detoxified versions of CT or LT.
Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, préférentiellement un milieu injectable chez l'homme. Il peut être constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol. For the purposes of the present invention, the pharmaceutically acceptable medium is the medium in which the compounds of the invention are administered, preferentially an injectable medium in humans. It may consist of water, an aqueous saline solution or an aqueous solution based on dextrose and / or glycerol.
L'invention comprend également une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité ; ainsi, elle peut être véhiculée sous forme de liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères ou microcapsules. The invention also comprises a composition according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition is conveyed in a form making it possible to improve its stability and / or its immunogenicity; thus, it can be transported in the form of liposomes, virosomes, nanospheres, microspheres or microcapsules.
L'utilisation d'un peptide dérivé d'anatoxines diphtériques selon l'invention tel que défini ci-dessus comme porteur dans la fabrication d'un vaccin constitue un autre objet de l'invention. The use of a peptide derived from diphtheria toxoids according to the invention as defined above as a carrier in the manufacture of a vaccine is another subject of the invention.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un peptide dérivé d'anatoxines diphtériques selon l'invention tel que défini ci-dessus pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers. The invention also relates to the use of a peptide derived from diphtheria toxoids according to the invention as defined above for the preparation of a vaccine intended for the prophylactic or therapeutic treatment of viral, bacterial, parasitic or fungal infections or for the preparation of a vaccine for the prophylactic or therapeutic treatment of cancers.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un peptide dérivé d'anatoxines diphtériques selon l'invention tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. The subject of the invention is also the use of a peptide derived from diphtheria toxoids according to the invention as defined above for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase an immune response against an infectious agent or a tumor cell.
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Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. The legends of the figures and examples which follow are intended to illustrate the invention without in any way limiting its scope.
Légendes des figures : Figures 1A et 1B : Titres anti-G2Na et VRS-A après une ou deux immunisations chez des rats de cotton immunisés avec différents immunogènes. Legends of the Figures: Figures 1A and 1B: Anti-G2Na and VRS-A titres after one or two immunizations in cotton rats immunized with different immunogens.
Figure 2 : Protection contre un challenge avec VRS-A chez le rat de cotton immunisé par différentes molécules. Figure 2: Protection against challenge with RSV-A in cotton rats immunized with different molecules.
Exemple 1 : Colonage de dérivés d'anatoxines diphtériques
A titre d'exemple, le gène codant pour DTa (aal-aal85 de CRM 197), obtenu par PCR directement à partir du génome de Corynebacterium Diphtheria (souche CRM 197), a été cloné dans un vecteur d'expression dont le promoteur est basé sur l'opéron Tryptophan (Trp). Il en résulte le vecteur nommé pTEXDTa dont l'ADN de l'insert a été vérifié par séquençage ADN. Le vecteur a été transformé dans une bactérie Escherishia coli K12 nommée ICONE@. La même procédure de clonage a été effectuée pour le clonage de DTb (aa202-aa456 de CRM 197). La protéine de fusion DTaDTb résulte de la fusion des gènes codant pour DTa et DTb. De même, la protéine G20aDTa résulte de la fusion des gènes codant pour G20a et DTa. L'exemple suivante illustre la production et la purification de G20aDTa. Example 1: Colonization of derivatives of diphtheria toxoids
By way of example, the gene encoding DTa (aal-aal85 of CRM 197), obtained by PCR directly from the Corynebacterium Diphtheria genome (CRM 197 strain), has been cloned in an expression vector whose promoter is based on the Tryptophan operon (Trp). The result is the vector named pTEXDTa whose DNA of the insert has been verified by DNA sequencing. The vector was transformed into an Escherichia coli K12 bacterium named ICONE @. The same cloning procedure was performed for the cloning of DTb (aa202-aa456 from CRM 197). The DTaDTb fusion protein results from the fusion of the genes encoding DTa and DTb. Similarly, the G20aDTa protein results from the fusion of the genes encoding G20a and DTa. The following example illustrates the production and purification of G20aDTa.
Exemple 2 : Expression du dérivé d'anatoxines diphtériques chez Escherichia coli
Dans un fermenteur de 30 1 (CHEMAP CMF400) contenant 18 1 de milieu minimum de culture (g/l) (KH2P04, 6/K2HP04, 4/Na3 citrate 2H20, 9/Extrait de
levure 1/ (NH4) 2S04, 5/CaCh, 0, 3/MgS04, 7H2O, 2/Glycérol 100), les Oligo- éléments (1 mYl) et de l'antimousse Struktol (0, 4 mVI) supplémentés par une solution de Tétracycline et du Tryptophane à concentration finale respectivement de 0,008 g/ ! et de 0,3 g/l, on inocule 1 400 ml du même milieu issu d'une préculture de E. coli recombinante ayant le vecteur d'expression de G20aDTa dans un fermenteur de 2 litres. En culture type batch, les paramètres physico-chimiques suivants sont maintenus
constants : Température à 37 C, pH à 7 régulé avec NFLOH, Agitation 500-1000 tr/mn pour maintenir le taux d'02 dissous à 30 %. Lorsque la densité optique (DO 620 nm) du milieu de culture atteint la valeur de 50, il est possible d'induire l'expression de la EXAMPLE 2 Expression of the derivative of diphtheria toxoids in Escherichia coli
In a 30 L fermenter (CHEMAP CMF400) containing 18 L of minimal culture medium (g / L) (KH 2 PO 4, 6 / K 2 HPO 4, 4 / Na 3 citrate 2H 2 O,
yeast 1 / (NH 4) 2 SO 4, 5 / CaCl 2, 0.3 / MgSO 4, 7H 2 O, 2 / Glycerol 100), Oligo-elements (1 mYl) and Struktol antifoam (0, 4 mVI) supplemented with a solution of Tetracycline and Tryptophan at a final concentration of 0.008 g / ml, respectively; and 0.3 g / l, 1400 ml of the same medium from a preculture of recombinant E. coli having the G20aDTa expression vector in a 2 liter fermentor were inoculated. In batch culture, the following physicochemical parameters are maintained
constant: Temperature at 37 C, pH at 7 regulated with NFLOH, agitation 500-1000 rpm to maintain the dissolved O 2 at 30%. When the optical density (OD 620 nm) of the culture medium reaches the value of 50, it is possible to induce the expression of the
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protéine recombinante en ajoutant 2 ml/litre de culture d'une solution d'acide 3 indolacrylique (IAA) à 12,5 g/1. Quelques heures après, la fermentation est arrêtée par refroidissement à 4 C après épuisement de substrat carboné (mesuré par un dosage enzymatique du glycérol dans le milieu de culture). La biomasse bactérienne est obtenue par centrifugation continue du milieu (14000 tr/mn, débit 100 l/h). Le rendement en biomasse est d'environ 40 g de cellules sèches/ !. recombinant protein by adding 2 ml / liter of culture of an indolacrylic acid solution (IAA) at 12.5 g / l. A few hours later, the fermentation is stopped by cooling to 4 C after depletion of carbon substrate (measured by an enzymatic assay of glycerol in the culture medium). The bacterial biomass is obtained by continuous centrifugation of the medium (14000 rpm, flow rate 100 l / h). The biomass yield is about 40 g of dry cells.
Exemple 3 : Extraction et purification du dérivé G20aDTa
La biomasse (environ 500 g de cellules sèches) est reprise dans 10 1 de tampon TST (Tris HCI 25 mM pH 8, MgCIz 6H2O 5 mM, EDTA 2mM). La suspension bactérienne est broyée au Manton-Gaulin (3 cycles à 560 bar). La protéine recombinante G20aDTa étant majoritairement soluble, la purification peut être réalisée directement à partir de la suspension broyée. On peut réaliser par exemple la capture de DTa par chromatographie d'échange d'ions en lit expansé (Streamline, Pharmacia). Deux ou trois étapes de chromatographie supplémentaires (échange d'ions et exclusion) sont nécessaires afin d'éliminer les contaminants ADN et protéiques de la cellule hôte. Les protéines purifiées sont analysées sur gel SDS-PAGE dans des conditions réduites, sur l'appareil MINI PROTEAN II SYSTEM (BioRads). Elles peuvent être visualisées avec du Coomassie brilliant blue R250. Example 3 Extraction and Purification of the G20aDTa Derivative
The biomass (approximately 500 g of dry cells) is taken up in 10 l of TST buffer (25 mM Tris HCl pH 8, 5 mM MgCl 2 6H 2 O, 2 mM EDTA). The bacterial suspension is milled in Manton-Gaulin (3 cycles at 560 bar). Since the recombinant G20aDTa protein is predominantly soluble, the purification can be carried out directly from the ground suspension. It is possible, for example, to capture DTa by expanded ion exchange chromatography (Streamline, Pharmacia). Two or three additional chromatography steps (ion exchange and exclusion) are required to remove DNA and protein contaminants from the host cell. The purified proteins are analyzed on SDS-PAGE gel under reduced conditions, on the MINI PROTEAN II SYSTEM (BioRads) apparatus. They can be visualized with Coomassie brilliant blue R250.
Exemple 4 : Couplage du peptide G20a A. Synthèse chimique et caractérisation analytique du peptide G20a
Le peptide G20a est un fragment de la protéine G du VRS-A (140-190)- (144- 158) de 69 acides aminés. Il comporte 4 cystéines capables de former 2 ponts disulfures.
The G20a peptide is a 69-amino acid VRS-A (140-190) - (144-158) G protein fragment. It has 4 cysteines capable of forming 2 disulfide bridges.
La séquence du peptide G20a est la suivante (SEQ ID NO 12) : MEFQi4oTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCn3SICi76SNNPTCi82WAI Cis6KRIPi9oSi44KPTTKQRQNKPPNKts8
Le peptide G20a est obtenu par synthèse automatique en phase solide en chimie Fmoc/tBu à l'échelle de 0,25 mmole à partir d'une résine hydroxyméthylphénoxyméthyle (HMP) préchargée avec une Lys (Boc) (0,70 mmole/g) et des Fmocacides aminés protégés au niveau des chaînes latérales par les groupes suivants : trityl (Trt) pour Asn, Gln et His ; tert-butyl éther (tBu) pour Ser et Thr ; tert-butyl ester (OtBu) pour Asp et Glu ; tert-butyloxycarbonyl (Boc) pour Lys et Trp et 2,2, 5,7, 8- The sequence of the G20a peptide is as follows (SEQ ID NO: 12): MEFQi4oTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCn3SICi76SNNPTCi82WAI Cis6KRIPi9oSi44KPTTKQRQNKPPNKts8
The G20a peptide is obtained by solid phase automatic synthesis in Fmoc / tBu chemistry at a scale of 0.25 mmol from a hydroxymethylphenoxymethyl resin (HMP) preloaded with a Lys (Boc) (0.70 mmol / g). and amide amino acids protected at the side-chain level by the following groups: trityl (Trt) for Asn, Gln and His; tert-butyl ether (tBu) for Ser and Thr; tert-butyl ester (OtBu) for Asp and Glu; tert-butyloxycarbonyl (Boc) for Lys and Trp and 2.2, 5.7, 8-
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pentaméthylchromane-6 sulfonyl (Pmc) pour Arg. Les cystéines utilisées possédaient les groupes protecteurs orthogonaux suivants : Trt pour les Cys 176 et 182 d'une part et acétamidométhyl (Acm) pour les Cys 173 et 186. A la fin de la synthèse, 1000 mg des 2500 mg de peptide-résine ont été clivés par un mélange TFA/EDT/thioanisol/phenol /TIS/H20 : 20 ml/0, 25 ml/1 ml/1,5 g/0,22 ml/1 ml. Après 3 heures de réaction sous agitation à température ambiante, le mélange est filtré pour éliminer la résine et le peptide brut est précipité grâce à l'addition de diéthyl éther froid. Le précipité est solubilisé dans un mélange HO/CHCN/TFA : 80/20/0,1 : v/v/v puis lyophilisé. 6-pentamethylchroman sulfonyl (Pmc) for Arg. The cysteines used had the following orthogonal protective groups: Trt for Cys 176 and 182 on the one hand and acetamidomethyl (Acm) for Cys 173 and 186. At the end of the synthesis, 1000 mg of the 2500 mg of peptide-resin were were cleaved with TFA / EDT / thioanisol / phenol / TIS / H2O: 20 ml / 0.25 ml / 1 ml / 1.5 g / 0.22 ml / 1 ml. After stirring for 3 hours at room temperature, the mixture is filtered to remove the resin and the crude peptide is precipitated by the addition of cold diethyl ether. The precipitate is solubilized in a mixture HO / CHCN / TFA: 80/20 / 0.1: v / v / v and then lyophilized.
Avant oxydation, le peptide brut est purifié par RP-HPLC ("Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography") à l'aide d'un gradient eau/acétonitrile et analysé par RP-HPLC (pureté RP-HPLC > 75 % ; rendement : 38 %) et ES-MS (masse calculée : 8186, 42 Da/masse mesurée : 8186,40). Before oxidation, the crude peptide is purified by RP-HPLC (Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography) using a water / acetonitrile gradient and analyzed by RP-HPLC (purity RP-HPLC> 75%; 38%) and ES-MS (calculated mass: 8186, 42 Da / measured mass: 8186.40).
Formation des ponts disulfures en 2 étapes. Pour former le pont entre les Cys 176 et 182, non protégées, le peptide lyophilisé est solubilisé (1 mg/ml) dans un mélange DMSO-H2O à 20 % (v/v) et agité à température ambiante pendant 4 jours (Tarn et al., J. Formation of disulfide bridges in 2 steps. To form the bridge between the unprotected Cys 176 and 182, the lyophilized peptide is solubilized (1 mg / ml) in a 20% (v / v) DMSO-H2O mixture and stirred at room temperature for 4 days (Tarn et al. al., J.
Am. Chem. Soc., 113,6657, 1991). En fin de réaction pour éliminer le DMSO, le peptide est purifié par RP-HPLC dans les mêmes conditions que le peptide réduit. Les fractions correspondant au pic principal sont collectées et lyophilisées. Un aliquot est soumis à une analyse par ES-MS ("ElectroSpray Mass Spectrometry"pour vérifier que le premier pont disulfure a bien été formé. Le second pont, entre les Cys (Acm) 173 et 186 est obtenu par oxydation à (Buku et al., Int. J. Peptide. Res., 33 : 86,1989 et Annis et al., Meth. Enzymol., 289 : 198,1997). Le peptide est solubilisé (1 mg/ml) dans un mélange acide acétique/eau à 80 % (v/v) et 10 % d'HCI 1 N sont ajoutés. La solution est saturée par de l'azote. Puis 10 équivalents d'iode solubilisé dans un mélange d'acide acétique/eau à 80 % (v/v) sont ajoutés rapidement et le milieu est agité pendant 5 heures à température ambiante. L'excès d'iode est réduit par l'addition goutte à goutte d'une solution aqueuse d'acide ascorbique jusqu'à ce que la couleur caractéristique de l'iode disparaisse. Le peptide oxydé brut est purifié par RP-HPLC, lyophilisé et analysé par RP-HPLC et ES-MS. Am. Chem. Soc., 113, 6657, 1991). At the end of the reaction to eliminate the DMSO, the peptide is purified by RP-HPLC under the same conditions as the reduced peptide. Fractions corresponding to the main peak are collected and lyophilized. An aliquot is subjected to ES-MS (ElectroSpray Mass Spectrometry) analysis to verify that the first disulfide bridge has been formed and the second bridge between the Cys (Acm) 173 and 186 is obtained by oxidation at (Buku et al. Al., Int. J. Peptide Res., 33: 86, 1989 and Annis et al., Meth Enzymol., 289: 198, 1997.) The peptide is solubilized (1 mg / ml) in an acetic acid mixture. 80% (v / v) water and 10% 1N HCl are added The solution is saturated with nitrogen Then 10 equivalents of iodine solubilized in a mixture of acetic acid / water at 80% (v / v) are added rapidly and the medium is stirred for 5 hours at room temperature The excess iodine is reduced by the dropwise addition of an aqueous ascorbic acid solution until the Characteristic color of disappearing iodine The crude oxidized peptide is purified by RP-HPLC, lyophilized and analyzed by RP-HPLC and ES-MS.
Formation des ponts disulfures en 1 étape. Un protocole d'obtention en une étape a également par oxydation directe à l'iode sur le peptide réduit permettant Formation of disulfide bridges in 1 step. A one-step production procedure also by direct oxidation with iodine on the reduced peptide allowing
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également d'obtenir le peptide d'intérêt. Le rendement passe alors de 22 à 44 % (pureté RP-HPLC > 90 % ; masse calculée : 8140,22 Da/masse mesurée : 8040, 30 Da). also to obtain the peptide of interest. The yield then increases from 22 to 44% (RP-HPLC purity> 90%, calculated mass: 8140.22 Da / measured mass: 8040, 30 Da).
L'appariement des ponts disulfures est étudié par LC-MS ("Liquid Chromatography Mass Spectrometry") et par microséquençage des fragments obtenus suite à une coupure du peptide à la thermolysine. Les fragments obtenus et leur interprétation sont décrits dans le tableau 1 ci-dessous. Le protocole utilisé permet d'obtenir uniquement la forme native G20a (1-4/2-3). The pairing of the disulfide bridges is studied by LC-MS ("Liquid Chromatography Mass Spectrometry") and by microsequencing of the fragments obtained following a cleavage of the peptide with thermolysin. The fragments obtained and their interpretation are described in Table 1 below. The protocol used makes it possible to obtain only the native form G20a (1-4 / 2-3).
Tableau 1 : Carte peptidique (thermolysine) du peptide G20a
<tb>
<tb> Masse <SEP> Masse
<tb> Interprétation <SEP> Attribution
<tb> mesurée <SEP> théorique
<tb> 1691, <SEP> 52 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 1692,1 <SEP> 1
<tb> FVPCSI <SEP> ICKRIPSKP <SEP> 1-4
<tb> 1591, <SEP> 10 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 1591, <SEP> 0 <SEP> 1
<tb> 1-4
<tb> FVPCS <SEP> ICKRIPSKP
<tb> ICSNNPTCW
<tb> 1035,49 <SEP> ~ <SEP> 0,66 <SEP> 1035,2 <SEP> # <SEP> 2-3
<tb> ICSNNPTCWA
<tb> 1106,27 <SEP> ~ <SEP> 0,33 <SEP> 1106,3 <SEP> # <SEP> 2-3
<tb> Conclusion <SEP> : <SEP> #
<tb> ---FVPCSICSNNPTCWICKRIPSKPT--- <SEP> 1-4/2-3
<tb> G20a <SEP> 1-4/2-3 <SEP> #
<tb>
B. Couplage du peptide G20a à l'aide d'un réactif homobifonctionnel (glutaraldéhyde)
10 mg de DTa sont dialysés contre un tampon phosphate 0,1 M pH 7. La concentration est ajustée à 2 mg/ml à l'aide d'un tampon carbonate 0,1 M pH 9.200 mg de SDS d'une solution à 4 % sont ajoutés. <Tb>
<tb> Mass <SEP> Mass
<tb> Interpretation <SEP> Attribution
<tb> measured <SEP> theoretical
<tb> 1691, <SEP> 52 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 1692.1 <SEP> 1
<tb> FVPCSI <SEP> ICKRIPSKP <SEP> 1-4
<tb> 1591, <SEP> 10 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 1591, <SEP> 0 <SEP> 1
<tb> 1-4
<tb> FVPCS <SEP> ICKRIPSKP
<tb> ICSNNPTCW
<tb> 1035.49 <SEP> ~ <SEP> 0.66 <SEP> 1035.2 <SEP>#<SEP> 2-3
<tb> ICSNNPTCWA
<tb> 1106.27 <SEP> ~ <SEP> 0.33 <SEP> 1106.3 <SEP>#<SEP> 2-3
<tb> Conclusion <SEP>: <SEP>#
<tb> --- FVPCSICSNNPTCWICKRIPSKPT --- <SEP> 1-4 / 2-3
<tb> G20a <SEP> 1-4 / 2-3 <SEP>#
<Tb>
B. Coupling of the G20a Peptide Using a Homobifunctional Reagent (Glutaraldehyde)
10 mg of DTa are dialyzed against a 0.1 M phosphate buffer pH 7. The concentration is adjusted to 2 mg / ml using a 0.1 M carbonate buffer pH 9.200 mg of SDS of a 4% solution % are added.
55,5 u ! de glutaraldéhyde à 2,5 % sont ajoutés à 2,5 ml d'une solution de peptide G20a à 1 mg/ml dans un tampon carbonate 0,1 M pH 9 à un pH se situant entre 9 et 10. 55.5 u! 2.5% glutaraldehyde is added to 2.5 ml of a solution of G20a peptide at 1 mg / ml in a 0.1 M carbonate buffer pH 9 at a pH between 9 and 10.
Le milieu réactionnel est agité à 4 C pendant 24 h puis ramené à température ambiante 25 lil de lysine sont ajoutés pour bloquer la réaction. La solution est dialysée contre du tampon phosphate 0.1 M pH 7 pendant 24 h à 4 C sous agitation. Le dialysat est récupéré et le SDS éliminé par précipitation à l'aide d'une solution de KCI 0,02 M à 6 The reaction medium is stirred at 4 ° C. for 24 h and then brought back to ambient temperature. 25 μl of lysine are added to block the reaction. The solution is dialyzed against 0.1 M pH 7 phosphate buffer for 24 h at 4 ° C. with stirring. The dialysate is recovered and the SDS removed by precipitation with a 0.02 M KCl solution at 6
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reprises. Le dernier surnageant qui contient le conjugué Dta-G20a glutaraldéhyde est conservé sous forme congelé à 4 C après une filtration stérilisante (0,22 lam). Les conjugués sont caractérisés pas dosage de protéines et par électrophorèse de type SDSPAGE ("SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). Les conditions de couplage utilisées ont été étudiées sur l'hexadécapeptide modèle G4a (fragment aa 171-187 de la protéine G du VRS humain de type A, correspondant à la séquence SEQ ID NO 15 du document WO 95/27787) qui possède la même séquence en acides aminés et le même appariement 1-4/2-3 des 4 cystéines. Ces conditions ne modifient pas l'appariement natif du peptide modèle (Beck et al., J. Peptide Res., 55 : 24,2000). times. The last supernatant which contains the Dta-G20a glutaraldehyde conjugate is stored in a frozen form at 4 ° C. after sterilizing filtration (0.22 μl). Conjugates are characterized by protein assay and SDSPAGE (SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) type electrophoresis The coupling conditions used were studied on hexadecapeptide model G4a (aa 171-187 fragment of human VRS G protein type A, corresponding to the sequence SEQ ID No. 15 of WO 95/27787) which has the same amino acid sequence and the same 1-4 / 2-3 pairing of the 4 cysteines These conditions do not modify the pairing Native peptide model (Beck et al., J. Peptide Res., 55: 24,2000).
Exemple 5 : Immunosénicité et protection du conjugué A. Titres anti-G2Na et VRS-A après une ou deux immunisations chez des rats de cotton immunisés avec différents immunogènes
Les rats des cottonniers (6/groupe) ont été immunisés en intramusculaire (100 ul) avec 6 ug d'équivalent G2Na, quel que soit l'immunogène testé, mélangé à 20 % (v/v) A1 (OH) 3 à JO et J21 et J40. Example 5 Immunosenicity and Protection of the Conjugate A. Anti-G2Na and RSV-A Titers After One or Two Immunizations in Cotton Rats Immunized with Different Immunogens
The cottonniers rats (6 / group) were immunized intramuscularly (100 μl) with 6 μg of G2Na equivalent, regardless of the immunogen tested, mixed with 20% (v / v) Al (OH) 3 at 0. and J21 and J40.
10 jours après la dernière immunisation, les rats sont challengés avec 105 pfu VRS-A/50 ul en intranasal. 5 jours après challenge, ils sont euthanasiés et les poumons récupérés pour évaluer la charge virale résiduelle. 10 days after the last immunization, the rats are challenged with 105 pfu RSV-A / 50 ul intranasal. 5 days after challenge, they are euthanized and the lungs recovered to evaluate the residual viral load.
Les titres anticorps anti-G2Na et VRS-A sont analysés. The anti-G2Na and VRS-A antibody titers are analyzed.
Les résultats d'immunogénicité (voir figure 1) observés chez le rat des cottons indiquent que G20DTa et G20DTaDTb sont immunogéniques après une ou deux immunisations. L'immunigénicité obtenue est comparable à celle observée avec BBG2Na (peptide G2Na fusionné au fragment dénommé"BB", récepteur de la sérum albumine humaine de streptococcus tel que décrit dans le document WO 95/27787). The immunogenicity results (see Figure 1) observed in the cottons rat indicate that G20DTa and G20DTaDTb are immunogenic after one or two immunizations. The immunogenicity obtained is comparable to that observed with BBG2Na (G2Na peptide fused to the fragment designated "BB", human streptococcus serum albumin receptor as described in WO 95/27787).
De plus, l'effet porteur est clairement démontré : l'antigène G20a ne permet pas d'obtenir une réponse immunitaire aussi forte que celle obtenue en utilisant les porteurs DTa ou DTaDTb. In addition, the carrier effect is clearly demonstrated: the G20a antigen does not make it possible to obtain an immune response as strong as that obtained using the DTa or DTaDTb carriers.
B. Protection contre un challenge avec VRS-A chez le rat des cottons immunisé par différentes molécules B. Protection against challenge with RSV-A in rat cottons immunized with different molecules
<Desc/Clms Page number 17> <Desc / Clms Page number 17>
Après challenge des rats de cotton avec VRS-A, une protection des voies pulmonaires a été observée (voir figure 2) après immunisation des rats par G20DTa, G20DTaDTb comparable à celle observée avec BBG2Na. After challenge of cotton rats with RSV-A, protection of the pulmonary tract was observed (see Figure 2) after immunization of rats with G20DTa, G20DTaDTb comparable to that observed with BBG2Na.
A nouveau, l'effet porteur est clairement démontré : l'antigène G20 ne permet pas d'obtenir une réponse immunitaire aussi forte que celle obtenue en utilisant les porteurs DTa ou DTaDTb. Once again, the carrier effect is clearly demonstrated: the G20 antigen does not make it possible to obtain an immune response as strong as that obtained using the DTa or DTaDTb carriers.
Ces résultats indiquent que G20DTa et G20DTaDTb sont immunogéniques et protecteurs chez le rat des cottons et que l'effet biologique de ces molécules est comparable à celle de BBG2Na. These results indicate that G20DTa and G20DTaDTb are immunogenic and protective in rat cottons and that the biological effect of these molecules is comparable to that of BBG2Na.
Exemple 6 : Détermination du HSI
Les cobayes sont immunisés à JO et J8 avec le porteur DTaDTb adjuvant par de l'adjuphos 20 % (v/v) en i. m.. A J21, un rappel est effectué avec le porteur non adjuvant en i. v. Example 6: Determination of HSI
The guinea pigs are immunized at OJ and J8 with the adjuvant carrier DTaDTb by adjuphos 20% (v / v) im. At D21, a booster is made with the non-adjuvant carrier iv
La mort des cobayes est alors évaluée. The death of the guinea pigs is then evaluated.
Un témoin positif d'expérience constitué d'ovalbumine à 200 flg est inclus pour chaque molécule testée. An experimental positive control consisting of 200 μg ovalbumin is included for each molecule tested.
Tableau 2 : Résultats obtenus après immunisation
<tb>
<tb> T+ <SEP> (OVA) <SEP> T-4 <SEP> mg <SEP> 40 <SEP> mg
<tb> DTaDTb <SEP> 6/6 <SEP> 0/6 <SEP> 0/6 <SEP> 0/6
<tb> <Tb>
<tb> T + <SEP> (OVA) <SEP> T-4 <SEP> mg <SEP> 40 <SEP> mg
<tb> DTaDTb <SEP> 6/6 <SEP> 0/6 <SEP> 0/6 <SEP> 0/6
<Tb>
Les résultats au tableau 2 indiquent que DtaDTb n'induit pas de HSI chez 6/6 animaux testés.The results in Table 2 indicate that DtaDTb does not induce HSI in 6/6 animals tested.
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Also Published As
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| WO2003010313A1 (en) | 2003-02-06 |
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