FR2826454A1

FR2826454A1 - ANALYSIS CARDS

Info

Publication number: FR2826454A1
Application number: FR0108466A
Authority: FR
Inventors: Valerie Servat; Jean Paul Chapel; Alain Theretz
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2001-06-26
Filing date: 2001-06-26
Publication date: 2002-12-27
Anticipated expiration: 2021-06-26
Also published as: FR2826454B1; WO2003000748A1

Abstract

The invention relates to the use of a particular polymer for the production of analysis cards, said polymer having the following properties:- said polymer has a glass transition temperature less than 60 DEG C, - in the absence of any functionalisation said polymer is hydrophobic and, for the purpose envisaged, said polymer is mass functionalised by reactive hydrophilic functions, or reactive hydrophilic function pre-cursors. The application of said polymer permits the simple monitoring of the properties of the surface of said analysis card and, in particular, the support thereof and to modify said properties on the monitored areas. The invention further relates to analysis cards, the support of which is made from said polymer and a method for modifying the surface properties of said support.

Description

La présente invention concerne le domaine technique des matériaux polymères utilisés pour la fabrication de cartes d'analyse. The present invention relates to the technical field of polymeric materials used for the manufacture of analysis cards.

Les cartes d'analyse permettent l'analyse d'un ou plusieurs échantillons liquides différents, dans lequel on cherche à identifier un ou plusieurs analytes, selon tous les processus simples ou complexes d'analyse mettant en jeu un ou plusieurs réactifs différents selon la nature chimique, physique ou biologique du ou des analytes recherchés. Les cartes d'analyse ne sont pas, en général, limitées à un analyte particulier, la seule condition requise est que l'analyte soit distribué dans l'échantillon à analyser en suspension ou en solution. En particulier, le processus d'analyse mis en oeuvre peut être effectué, sous forme homogène, hétérogène ou mixte. The analysis cards allow the analysis of one or more different liquid samples, in which one seeks to identify one or more analytes, according to all the simple or complex analysis processes involving one or more reagents depending on the nature chemical, physical or biological aspect of the desired analyte (s). Assay cards are not, in general, limited to a particular analyte, the only requirement is that the analyte be distributed in the sample to be analyzed in suspension or in solution. In particular, the analysis process implemented can be performed in homogeneous, heterogeneous or mixed form.

Une carte d'analyse peut, par exemple, permettre l'analyse biologique, d'un ou plusieurs ligands, nécessitant pour leur détection et/ou leur quantification, l'utilisation d'un ou plusieurs anti-ligands. Aussi, dans ce cas, les cartes d'analyse présentent en surface des ligands biologiques possédant au moins un site de reconnaissance leur permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. An analysis card can, for example, allow the biological analysis of one or more ligands, requiring for their detection and / or quantification, the use of one or more anti-ligands. Also, in this case, the analysis cards have on the surface biological ligands having at least one recognition site allowing them to react with a target molecule of biological interest.

Un exemple d'application des techniques d'analyse concerne les immuno essais, quelque soit leur format, par analyse directe ou par compétition. An example of application of the analysis techniques concerns immunoassays, whatever their format, by direct analysis or by competition.

Un autre exemple d'application concerne la détection et/ou la quantification d'acides nucléiques comprenant l'ensemble des opérations nécessaires à cette détection et/ou cette quantification à partir d'un prélèvement quelconque contenant les acides nucléiques cibles. Parmi ces différentes opérations, on peut citer la lyse, la fluidification, la concentration, les étapes d'amplification enzymatique des acides nucléiques, les étapes de détection incorporant une étape d'hybridation utilisant par exemple une puce à ADN ou une sonde marquée. Les demandes de brevet publiées sous les numéros WO 97/02 357 et WO 00/40 590 expliquent différentes étapes nécessaires dans le cas d'analyse d'acides nucléiques. Another example of application relates to the detection and / or quantification of nucleic acids comprising all the operations necessary for this detection and / or quantification from any sample containing the target nucleic acids. Among these various operations, mention may be made of the lysis, the fluidification, the concentration, the enzymatic amplification steps of the nucleic acids, the detection steps incorporating a hybridization step using, for example, a DNA chip or a labeled probe. The patent applications published under the numbers WO 97/02357 and WO 00/40590 explain various necessary steps in the case of nucleic acid analysis.

En terme de réalisation, ces cartes d'analyse peuvent se présenter sous différentes formes, par exemple carrée, rectangulaire ou circulaire. Ces cartes sont constituées d'un support et éventuellement d'un couvercle, le support étant muni d'une pluralité de puits et/ou canaux dans lesquels les différents processus d'analyse sont mis en oeuvre. Les supports des cartes d'analyse et des biopuces sont en général In terms of implementation, these analysis cards can be in different forms, for example square, rectangular or circular. These cards consist of a support and possibly a cover, the support being provided with a plurality of wells and / or channels in which the various analysis processes are implemented. The supports of the analysis cards and biochips are in general

réalisés par usinage de matériaux choisis parmi le verre, le quartz, le silicium, éventuellement revêtu d'une couche d'oxyde ou de nitrure (WO 93/09 668) ou bien dans des polymères du type polystyrène (FR 2 790 686). Il est également envisagé dans la demande de brevet publiée sous le numéro WO 99/58 245 d'utiliser des matériaux plastiques du type polycarbonate ou polymère hydrocarboné comme les polyoléfines, présentant une surface hydrophobe. Pour contrôler la fluidique des échantillons à analyser, ces matériaux sont modifiés chimiquement ou physiquement, par exemple, sous l'action d'un greffage ou d'un traitement plasma, pour créer des zones hydrophiles et ainsi modifier les caractéristiques de surface du matériau. made by machining materials selected from glass, quartz, silicon, optionally coated with an oxide or nitride layer (WO 93/09 668) or in polymers of the polystyrene type (FR 2 790 686). It is also envisaged in the patent application published under the number WO 99/58 245 to use plastic materials of the polycarbonate or hydrocarbon polymer type, such as polyolefins, having a hydrophobic surface. To control the fluidity of the samples to be analyzed, these materials are chemically or physically modified, for example, under the action of grafting or plasma treatment, to create hydrophilic zones and thus modify the surface characteristics of the material.

En effet, pour les applications ci-dessus mentionnées, il est très important de contrôler le caractère hydrophile/hydrophobe des canaux présents sur les supports de ces cartes d'analyse, afin notamment :

- d'éviter la formation de bulles durant le transport de fluides dans ces canaux, - d'éviter les pertes de liquide dues à des interactions trop fortes entre le fluide et la nature de la surface des canaux, - d'éviter l'adsorption sur les parois des molécules biologiques que l'on désire transporter. Indeed, for the applications mentioned above, it is very important to control the hydrophilic / hydrophobic character of the channels present on the supports of these analysis cards, in particular:

- to avoid the formation of bubbles during the transport of fluids in these channels, - to avoid liquid losses due to too strong interactions between the fluid and the nature of the surface of the channels, - to avoid adsorption on the walls of the biological molecules that one wishes to transport.

Aussi, la présente invention concerne l'utilisation nouvelle d'un matériau polymère particulier pour la fabrication de cartes d'analyse, caractérisée en ce que le polymère : - a une température de transition vitreuse inférieure à 60 C, de préférence inférieure à 37 C, et préférentiellement inférieure à 20 C, - est hydrophobe en l'absence de fonctionnalisation, et - est fonctionnalisé dans sa masse par des fonctions hydrophiles réactives, ou génératrices de fonctions hydrophiles réactives. Also, the present invention relates to the novel use of a particular polymeric material for the production of analysis cards, characterized in that the polymer: has a glass transition temperature of less than 60 ° C., preferably less than 37 ° C. and preferably less than 20 ° C., is hydrophobic in the absence of functionalization, and is functionalized in its mass by reactive hydrophilic functions, or generating reactive hydrophilic functions.

L'utilisation des propriétés intrinsèques de ce matériau permettent de modifier simplement les caractéristiques de sa surface, en modifiant localement son caractère hydrophobe/hydrophile. The use of the intrinsic properties of this material makes it possible to simply modify the characteristics of its surface, by locally modifying its hydrophobic / hydrophilic character.

Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir des cartes d'analyse qui soient simples, économiques et industrielles. Another essential objective of the present invention is to provide analysis cards that are simple, economical and industrial.

La présente invention a également pour objet les cartes d'analyse dont le support est fabriqué à partir d'un tel polymère. The present invention also relates to analysis cards whose support is manufactured from such a polymer.

Un autre objectif essentiel est de fournir un procédé simple et économique permettant de modifier la surface de certains puits ou canaux du support de ladite carte, en faisant circuler un fluide approprié. Another essential objective is to provide a simple and economical method for modifying the surface of certain wells or channels of the support of said card, by circulating a suitable fluid.

La présente invention a donc pour objet un procédé pour modifier, au moins en partie, la surface du polymère constitutif du support d'une carte d'analyse selon l'invention, ce procédé mettant en oeuvre une étape de traitement de ladite surface, réalisée à une température supérieure à la température de transition vitreuse du polymère, avec un milieu susceptible de créer des interactions acido-basiques avec les fonctions hydrophiles réactives, cette étape de traitement entraînant la migration en surface des fonctions hydrophiles réactives présentes dans la masse du polymère et, éventuellement, leur hydrolyse en d'autres fonctions hydrophiles réactives. The subject of the present invention is therefore a method for modifying, at least in part, the surface of the polymer constituting the support of an analysis card according to the invention, this method implementing a step of treating said surface, carried out at a temperature above the glass transition temperature of the polymer, with a medium capable of creating acid-base interactions with the reactive hydrophilic functions, this treatment step resulting in the surface migration of the reactive hydrophilic functions present in the bulk of the polymer and optionally, their hydrolysis to other hydrophilic reactive functions.

Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un procédé simple permettant de créer localement des zones hydrophobes ou hydrophiles, dans certains puits ou canaux du support de la carte d'analyse. Another essential objective of the present invention is to provide a simple method for locally creating hydrophobic or hydrophilic zones, in certain wells or channels of the support of the analysis card.

Selon un autre de ses aspects, l'invention a donc également pour objet un procédé pour modifier localement la surface du polymère constitutif du support d'une carte d'analyse selon l'invention. Ce procédé consiste notamment à réaliser : - des zones hydrophobes en surface du polymère en effectuant sur les zones à modifier : (1) une étape de traitement de ladite surface, réalisée à une température supérieure à la température de transition vitreuse du polymère, avec un milieu susceptible de créer des interactions acido-basiques avec les fonctions hydrophiles réactives, cette étape de traitement entraînant la migration en surface des fonctions hydrophiles réactives présentes dans la masse du polymère et éventuellement, leur hydrolyse en d'autres fonctions hydrophiles réactives, suivie, (2a) d'une étape de greffage chimique, sur les fonctions hydrophiles réactives présentes en surface, de groupements hydrophobes, - des zones hydrophiles en surface du polymère en effectuant sur les zones à modifier : (1) une étape de traitement de ladite surface, réalisée à une température supérieure à la température de transition vitreuse du polymère, avec un According to another of its aspects, the invention therefore also relates to a method for locally modifying the surface of the polymer constituting the support of an analysis card according to the invention. This method consists in particular in producing: hydrophobic zones at the surface of the polymer by performing on the zones to be modified: (1) a step of treating said surface, carried out at a temperature above the glass transition temperature of the polymer, with a medium capable of creating acid-base interactions with reactive hydrophilic functions, this treatment step resulting in surface migration of the reactive hydrophilic functions present in the polymer mass and, optionally, their hydrolysis to other hydrophilic reactive functions, followed, 2a) of a chemical grafting step, on the hydrophilic reactive functions present on the surface, of hydrophobic groups, - hydrophilic zones on the surface of the polymer by performing on the zones to be modified: (1) a step of treating said surface, at a temperature above the glass transition temperature of the polymer, with a

milieu susceptible de créer des interactions acido-basiques avec les fonctions hydrophiles réactives, cette étape de traitement entraînant la migration en surface des fonctions hydrophiles réactives présentes dans la masse du polymère et éventuellement, leur hydrolyse en d'autres fonctions hydrophiles réactives, suivie éventuellement, (2b) d'une étape de greffage chimique, sur les fonctions hydrophiles réactives présentes en surface, de ligands biologiques. medium capable of creating acid-base interactions with reactive hydrophilic functions, this treatment step resulting in surface migration of the reactive hydrophilic functions present in the polymer mass and, optionally, their hydrolysis to other hydrophilic reactive functions, optionally followed, (2b) a chemical grafting step, on the reactive hydrophilic functions present at the surface, biological ligands.

Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci-dessous, en référence aux dessins annexés. Various other features appear from the description given below, with reference to the accompanying drawings.

La fig. 1 représente une vue de dessus d'un support de carte d'analyse muni d'une pluralité de puits à fond ronds. Fig. 1 is a top view of an analysis card holder provided with a plurality of round bottom wells.

La fig. 2A représente une vue de dessus d'un support de carte d'analyse muni de canaux parallèles et la fig. 2B une vue latérale en coupe. Fig. 2A shows a top view of an analysis card holder provided with parallel channels and FIG. 2B a side view in section.

La fig. 3 représente une vue schématique de dessus d'un embranchement entre canaux. Fig. 3 represents a schematic view from above of a branch between channels.

La fig. 4 représente les résultats de détection colorimétrique sous forme d'histogrammes, obtenus lors d'un test ELOSA. Fig. 4 represents the colorimetric detection results in the form of histograms, obtained during an ELOSA test.

L'objet de l'invention concerne l'utilisation d'un polymère particulier pour la fabrication de cartes d'analyses, ledit polymère ayant les propriétés suivantes : - ce polymère possède une température de transition vitreuse inférieure à 60 C, de préférence inférieure à 37 C, et préférentiellement inférieure à
20 C, - en l'absence de fonctionnalisation, ce polymère est hydrophobe, et - pour l'application envisagée, il est fonctionnalisé dans sa masse par des fonctions hydrophiles réactives ou génératrices de fonctions hydrophiles réactives. The subject of the invention relates to the use of a particular polymer for the production of analysis cards, said polymer having the following properties: this polymer has a glass transition temperature of less than 60 ° C., preferably less than 60 ° C. 37 C, and preferentially less than
C, in the absence of functionalization, this polymer is hydrophobic, and for the intended application, it is functionalized in its mass by reactive hydrophilic functions or generating reactive hydrophilic functions.

L'utilisation d'un tel polymère permet de contrôler facilement les propriétés de surface de la carte d'analyse et en particulier de son support, et de modifier ces propriétés sur des zones contrôlées. The use of such a polymer makes it possible to easily control the surface properties of the analysis card and in particular of its support, and to modify these properties on controlled areas.

En effet, les polymères utilisés sont, en l'absence de fonctionnalisation, des polymères hydrophobes. De plus, à une température supérieure à leur température de transition vitreuse, les chaînes des polymères utilisés possèdent une grande mobilité. Indeed, the polymers used are, in the absence of functionalization, hydrophobic polymers. In addition, at a temperature above their glass transition temperature, the chains of the polymers used have a high mobility.

Cette propriété est connue et est déjà utilisée, par exemple dans les phénomènes d'adhésion. Aussi, à une température supérieure à leur température de transition vitreuse, si la surface du polymère est mise en contact avec un milieu susceptible de créer des interactions acido-basiques avec les fonctions hydrophiles réactives ou génératrices de fonctions hydrophiles réactives présentes dans le polymère, ces fonctions vont migrer de la masse du polymère à caractère plutôt hydrophobe, vers sa surface. Les groupements hydrophiles, alors présents en surface, viennent du matériau lui-même et non d'un traitement chimique ou physique extérieur. Ainsi, à la différence des surfaces de silicium ou de polymère de type polystyrène utilisées jusqu'à présent, qui nécessitent des traitements assez lourds destinés à promouvoir leur réactivité, notamment des traitements physiques tels que le traitement plasma, le flammage, ou des traitements chimiques tels que le greffage, les polymères utilisés dans la présente invention possèdent des propriétés intrinsèques qui permettent de modifier simplement leur surface. This property is known and is already used, for example in adhesion phenomena. Also, at a temperature above their glass transition temperature, if the surface of the polymer is brought into contact with a medium capable of creating acid-base interactions with the reactive hydrophilic functions or generating reactive hydrophilic functions present in the polymer, these functions will migrate from the mass of the rather hydrophobic polymer to its surface. The hydrophilic groups, then present on the surface, come from the material itself and not from a chemical or external physical treatment. Thus, unlike the silicon or polystyrene-type polymer surfaces used up to now, which require rather heavy treatments intended to promote their reactivity, in particular physical treatments such as plasma treatment, flame treatment, or chemical treatments. such as grafting, the polymers used in the present invention have intrinsic properties that allow their surface to be simply modified.

Pour la présente invention, la technique de référence de la mesure de la transition vitreuse (Tg) est décrite dans Technique de l'Ingénieur , volume AM2, numéro AM 3274. For the present invention, the reference technique of measuring the glass transition (Tg) is described in Engineering Technique, volume AM2, AM number 3274.

Comme exemple de fonctions hydrophiles selon l'invention, on peut citer les groupements hydrazino, imino, azido, thiophosphate, hydrazono, sulfamoyl, thiocarboxy, amide éventuellement substitué, triazano, triazéno, amido, semicarbazono, carbamoyl, cyano, alkylthio, arylthio, sulfate, sulfonate, phosphate, anhydride, époxyde, acide carboxylique, hydroxyle ou amine... As examples of hydrophilic functional groups according to the invention, mention may be made of the hydrazino, imino, azido, thiophosphate, hydrazono, sulfamoyl, thiocarboxy, optionally substituted amide, triazano, triazeno, amido, semicarbazono, carbamoyl, cyano, alkylthio and arylthio groups. , sulfonate, phosphate, anhydride, epoxide, carboxylic acid, hydroxyl or amine ...

Les fonctions du type anhydride, époxyde, acide carboxylique (-COOH), hydroxyle (-OH) ou amine primaire (-NH2) sont des fonctions hydrophiles réactives préférées. Ces fonctions ont l'avantage de permettre ultérieurement le greffage de molécules hydrophobes ou de ligands biologiques. The functions of the anhydride, epoxide, carboxylic acid (-COOH), hydroxyl (-OH) or primary amine (-NH2) type are preferred hydrophilic reactive functions. These functions have the advantage of subsequently allowing the grafting of hydrophobic molecules or biological ligands.

L'utilisation des polymères fonctionnalisés en masse permet d'une part, d'avoir un potentiel de fonctions disponibles plus important que dans le cas d'une simple fonctionnalisation de surface et d'autre part, d'utiliser une plus grande diversité de fonctions hydrophiles par rapport aux traitements physiques, tel que le traitement plasma. The use of bulk functionalized polymers makes it possible, on the one hand, to have a greater potential for available functions than in the case of a simple surface functionalization and, on the other hand, to use a greater diversity of functions. hydrophilic compared to physical treatments, such as plasma treatment.

D'une manière générale, le circuit fluidique des cartes d'analyse selon l'invention comprend des éléments tels que des canaux ou microcanaux, des vannes ou des intersections de canaux (en forme de T, en forme de Y ou en forme de croix), des parties de circuit qui autorisent l'incubation (des puits ou des canaux serpentant) ou la séparation (des longueurs de canaux équivalents à des colonnes par exemple). In general, the fluid circuit of the analysis cards according to the invention comprises elements such as channels or microchannels, valves or intersections of channels (T-shaped, Y-shaped or cross-shaped). ), circuit parts that allow incubation (shafts or channels snaking) or separation (for example column lengths equivalent to columns).

La fig. 1 est une vue de dessus d'un exemple simple d'un support 1 de carte d'analyse muni d'une pluralité de puits 2 à fond rond. Ce support de dimension 65x35x4 mm3 possède des puits en forme de demi sphère de 5 mm de diamètre sur une profondeur de 2,5 mm. Fig. 1 is a top view of a simple example of an analysis card holder 1 provided with a plurality of wells 2 with a round bottom. This 65x35x4 mm3 support has wells in the shape of a half sphere 5 mm in diameter to a depth of 2.5 mm.

Les fig. 2A et 2B représentent une autre variante simple d'un support 1 de carte d'analyse muni de canaux parallèles 3. Ce support de dimension 65x35x4 mm3 possède des canaux en forme de demi cylindre de 2 mm de diamètre sur une profondeur de 1 mm. Figs. 2A and 2B show another simple variant of an analysis card holder 1 provided with parallel channels 3. This 65x35x4 mm3 support has half-cylindrical channels 2 mm in diameter to a depth of 1 mm.

En fonction du type d'analyse effectuée sur la carte, la forme des cartes d'analyse peut varier. Les cartes d'analyse selon l'invention peuvent utiliser un principe de séparation par électrophorèse capillaire. Depending on the type of analysis performed on the card, the shape of the analysis cards may vary. The analysis cards according to the invention can use a separation principle by capillary electrophoresis.

Selon une autre variante de réalisation des cartes, les fluides sont acheminés, non plus électriquement mais par un système de pompe extérieur ou intégré, de vide, de pousse-seringue, ou par la force centrifuge comme dans le système décrit, par exemple, dans la demande de brevet publiée sous le numéro WO 99/58 245. According to another embodiment of the cards, the fluids are conveyed, not electrically but by an external or integrated pump system, vacuum, syringe pump, or by centrifugal force as in the system described, for example, in the patent application published under the number WO 99/58 245.

Un autre exemple de carte d'analyse est celui présenté dans les brevets US 5,766, 553 et US 4,318, 994. Ces cartes consistent en une soixantaine de puits, tous reliés à une entrée commune par un ensemble de microcanaux. Ces puits sont tous remplis simultanément par une mise sous vide suivie d'un retour à pression atmosphérique. Another example of an analysis card is that presented in US Pat. Nos. 5,766, 553 and 4,318,994. These cards consist of about sixty wells, all connected to a common input by a set of microchannels. These wells are all filled simultaneously with a vacuum followed by a return to atmospheric pressure.

Les cartes d'analyses peuvent être obtenues par moulage de précision de ces dits polymères mais toute autre méthode de fabrication et notamment celles utilisées dans les techniques des semi-conducteurs, comme celles décrites dans les demandes de brevet publiées sous les numéros WO 97/02 357 et WO 00/78 452, sont utilisables pour la fabrication de ces cartes d'analyse. Analysis cards can be obtained by precision molding of said polymers but any other method of manufacture and especially those used in semiconductor techniques, such as those described in patent applications published under numbers WO 97/02 357 and WO 00/78452, can be used for the manufacture of these analysis cards.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les polymères utilisés pour fabriquer les cartes d'analyse présentent une température de transition vitreuse inférieure à 20 C. Ainsi, le polymère est caoutchoutique et ses chaînes sont mobiles, à température ambiante. According to a particular embodiment of the invention, the polymers used to make the analysis cards have a glass transition temperature below 20 C. Thus, the polymer is rubbery and its chains are mobile, at room temperature.

Par polymère hydrophobe en l'absence de fonctionalisation, on entend par exemple des polymères dont l'angle de contact avec l'eau est supérieur ou égal à 90 . Hydrophobic polymer in the absence of functionalization means for example polymers whose contact angle with water is greater than or equal to 90.

Ces angles de contact sont, par exemple, déterminés en déposant, à l'aide d'une microseringue, une goutte d'eau sur la surface plane du polymère à étudier, puis l'angle de contact est mesuré à partir des dimensions de la goutte, selon une méthode bien connue de l'homme de l'art. These contact angles are, for example, determined by depositing, with the aid of a microsyringe, a drop of water on the flat surface of the polymer to be studied, then the contact angle is measured from the dimensions of the drop, according to a method well known to those skilled in the art.

Les polyoléfines fonctionnalisées, et en particulier le polyéthylène ou le polypropylène fonctionnalisé sont des exemples de polymères utilisés selon la présente invention. Functionalized polyolefins, and in particular functionalized polyethylene or polypropylene, are examples of polymers used according to the present invention.

En particulier, le polyéthylène ou le polypropylène fonctionnalisé par de l'acide acrylique, ou de préférence de l'anhydride maléique est utilisé. Avantageusement le polymère utilisé contient jusqu'à'2%, de préférence jusqu'à 0,3% en poids d'anhydride maléique. In particular, polyethylene or polypropylene functionalized with acrylic acid, or preferably maleic anhydride is used. Advantageously, the polymer used contains up to 2%, preferably up to 0.3% by weight of maleic anhydride.

D'autres polymères tels que le polyéthylène imine (PEI), le polyéthylènevinylacétate (PEVA), des terpolymères d'éthylène, d'esters acryliques et de méthacrylate de glycidyle ou d'anhydride maléique, commercialisés respectivement par la société ATOFINA sous les noms LOADERS et ORES ACE peuvent également être mis en oeuvre. Other polymers such as polyethyleneimine (PEI), polyethylenevinylacetate (PEVA), terpolymers of ethylene, acrylic esters and glycidyl methacrylate or maleic anhydride, sold respectively by the company ATOFINA under the names LOADERS and ORES ACE can also be implemented.

La présente invention a également pour objet un procédé pour modifier, au moins en partie, la surface du polymère constitutif du support d'une carte d'analyse selon l'invention. Ledit procédé comprend une étape de traitement de ladite surface, réalisée à une température supérieure à la température de transition vitreuse du polymère, avec un milieu susceptible de créer des interactions acido-basiques avec les fonctions hydrophiles réactives, cette étape de traitement entraînant la migration en surface des fonctions hydrophiles réactives présentes dans la masse du polymère et éventuellement, leur hydrolyse en d'autres fonctions hydrophiles réactives. The present invention also relates to a method for modifying, at least in part, the surface of the polymer constituting the support of an analysis card according to the invention. Said method comprises a step of treating said surface, carried out at a temperature above the glass transition temperature of the polymer, with a medium capable of creating acid-base interactions with the reactive hydrophilic functions, this treatment step resulting in the migration of surface of reactive hydrophilic functions present in the mass of the polymer and optionally their hydrolysis to other hydrophilic reactive functions.

Comme milieu susceptible de créer des interactions acido-basiques avec les fonctions hydrophiles réactives, on pourra citer, à titre non limitatif, le glycérol ou As a medium capable of creating acid-base interactions with the reactive hydrophilic functions, there may be mentioned, without limitation, glycerol or

l'éthylène glycol, ou de préférence des milieux polaires ou hydrophiles, comme par exemple, l'eau ou un liquide contenant au moins 50 % en poids d'eau, tel qu'un mélange eau/solvant organique comme le diméthylsulfoxyde. ethylene glycol, or preferably polar or hydrophilic media, such as, for example, water or a liquid containing at least 50% by weight of water, such as a water / organic solvent mixture such as dimethylsulfoxide.

Selon la présente invention, il est donc très simple de modifier le caractère hydrophobe/hydrophile de la surface du support des cartes d'analyse, le traitement étant effectué en faisant circuler ou en mettant en contact la surface avec un milieu susceptible de créer des interactions acido-basiques avec les fonctions hydrophiles réactives, pendant 1 à plusieurs heures, par exemple 15 heures. En effet, le simple contact de la surface du polymère avec un milieu susceptible de créer des interactions acido-basiques avec les fonctions hydrophiles réactives, et en particulier avec un milieu polaire ou hydrophile, entraîne la migration des chaînes hydrophiles présentes dans la masse du polymère, en surface de celui-ci. Dans le cas particulier des polyoléfines greffées à l'anhydride maléique, lorsque un liquide polaire tel que l'eau est utilisé, cette migration s'accompagne d'une hydrolyse de certaines fonctions anhydride en fonctions-COOH. According to the present invention, it is therefore very simple to modify the hydrophobic / hydrophilic character of the surface of the support of the analysis cards, the treatment being carried out by circulating or bringing the surface into contact with a medium capable of creating interactions. acid-base with reactive hydrophilic functions, for 1 to several hours, for example 15 hours. Indeed, the mere contact of the polymer surface with a medium capable of creating acid-base interactions with the reactive hydrophilic functions, and in particular with a polar or hydrophilic medium, causes the migration of the hydrophilic chains present in the mass of the polymer. , on the surface of it. In the particular case of polyolefins grafted with maleic anhydride, when a polar liquid such as water is used, this migration is accompanied by hydrolysis of certain anhydride functional groups to COOH functions.

Ce traitement peut être suivi par une étape de greffage chimique sur les fonctions hydrophiles réactives présentes en surface, de ligands biologiques. Cette étape de greffage peut être précédée d'une étape d'activation des fonctions hydrophiles réactives présentes en surface. This treatment can be followed by a chemical grafting step on the reactive hydrophilic functions present on the surface of biological ligands. This grafting step may be preceded by a step of activating the reactive hydrophilic functions present on the surface.

Par ligand biologique, on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. By biological ligand is meant a compound which has at least one recognition site allowing it to react with a target molecule of biological interest.

A titre d'exemple on peut citer, comme ligands biologiques, les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines et les haptènes. By way of example, mention may be made, as biological ligands, of polynucleotides, antigens, antibodies, polypeptides, proteins and haptens.

Le terme"polynucléotide"signifie un enchaînement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison intemucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates, les alkyl-phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides (FR 2 607 507), ou les PNA The term "polynucleotide" means a sequence of at least 2 deoxyribonucleotides or ribonucleotides optionally comprising at least one modified nucleotide, for example at least one nucleotide comprising a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino- 5 deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base for hybridization. This polynucleotide can also be modified at the level of the internucleotide linkage, for example phosphorothioates, H-phosphonates or alkylphosphonates, at the level of the backbone such as, for example, alpha-oligonucleotides (FR 2 607 507), or NAPs.

(Egholm M. et al., J. Am. Chem, Soc., 1992,114, 1895-1897), ou les 2-0-alkyl ribose, ou les LNA (de l'anglais Loked Nucleic Acids , décrits notamment dans la demande de brevet publiée sous le numéro WO 00/66 604). Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Le polynucléotide peut être un oligonucléotide, un acide nucléique naturel ou son fragment comme un ADN, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique. (Egholm M. et al., J. Am. Chem, Soc., 1992, 114, 1895-1897), or the 2-O-alkyl ribose, or the Loked Nucleic Acids (LNAs), described in particular in the patent application published under the number WO 00/66604). Each of these modifications can be taken in combination. The polynucleotide may be an oligonucleotide, a natural nucleic acid or its fragment such as a DNA, a ribosomal RNA, a messenger RNA, a transfer RNA, a nucleic acid obtained by an enzymatic amplification technique.

Par"polypeptide", on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés. By "polypeptide" is meant a sequence of at least two amino acids.

Par acides aminés, on entend les acides aminés primaires qui codent pour les protéines, les acides aminés dérivés après action enzymatique comme la trans-4hydroxyproline et les acides aminés naturels mais non présents dans les protéines comme la norvaline, la N-méthyl-L-leucine, la staline (Hunt S. dans Chemistry and Biochemistry of the amino acides, Barett G. C., ed., Chapman and Hall, London, 1985), les acides aminés protégés par des fonctions chimiques utilisables en synthèse sur support solide ou en phase liquide et les acides aminés non naturels. By amino acids, we mean the primary amino acids that code for proteins, amino acids derived after enzymatic action such as trans-4hydroxyproline and natural amino acids but not present in proteins such as norvaline, N-methyl-L- leucine, stalin (Hunt S. in Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids, Barett GC, ed., Chapman and Hall, London, 1985), amino acids protected by chemical functions for use in synthesis on a solid support or in a liquid phase and unnatural amino acids.

Le terme"haptène"désigne'des composés non immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux-mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnus par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptène-protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à 2000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines ou divers médicaments, les nucléosides et les nucléotides. The term "hapten" refers to non-immunogenic compounds, i.e. incapable by themselves of promoting an immune reaction by production of antibodies, but capable of being recognized by antibodies obtained by immunization of animals. under known conditions, in particular by immunization with a hapten-protein conjugate. These compounds generally have a molecular mass of less than 3000 Da, and most often less than 2000 Da and can be for example glycosylated peptides, metabolites, vitamins, hormones, prostaglandins, toxins or various drugs, nucleosides and nucleotides.

Le terme"anticorps"inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique et des fragments d'anticorps. Le

terme"antigène"désigne un composé susceptible d'être reconnu par un anticorps dont il a induit la synthèse par une réponse immune. Le terme"protéine"inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires. The term "antibodies" includes polyclonal or monoclonal antibodies, antibodies obtained by genetic recombination and antibody fragments. The

term "antigen" means a compound capable of being recognized by an antibody for which it has induced synthesis by an immune response. The term "protein" includes holoproteins and heteroproteins such as nucleoproteins, lipoproteins, phosphoproteins, metalloproteins and both fibrous and globular glycoproteins.

L'étape de traitement avec un milieu susceptible de créer des interactions acido-basiques avec les fonctions hydrophiles réactives, conférant un caractère hydrophile à la surface, peut également être suivie par une étape de greffage chimique sur les fonctions hydrophiles présentes en surface, de groupements hydrophobes. Un tel greffage confère alors des propriétés hydrophobes à la surface, proches de ses propriétés initiales. Les groupes de type silane comme les thiolsilanes, tel que le mercaptopropyltriméthoxysilane, les alkylsilanes, tels que le diméthyléthoxysilane (DMES) et le n-octadécyltriethoxysilane, sont des exemples de groupements hydrophobes utilisables. The treatment step with a medium capable of creating acid-base interactions with the reactive hydrophilic functions, conferring a hydrophilic character on the surface, may also be followed by a chemical grafting step on the hydrophilic functions present on the surface, of groups hydrophobic. Such a graft then confers hydrophobic properties on the surface, close to its initial properties. Silane groups such as thiolsilanes, such as mercaptopropyltrimethoxysilane and alkylsilanes, such as dimethylethoxysilane (DMES) and n-octadecyltriethoxysilane, are examples of useful hydrophobic groups.

Les étapes de greffage chimique de groupements hydrophobes ou hydrophiles sont effectuées selon des techniques bien connues de l'homme de l'art. The chemical grafting steps of hydrophobic or hydrophilic groups are carried out according to techniques well known to those skilled in the art.

La présente invention a également pour objet un procédé pour modifier localement la surface du polymère constitutif du support d'une carte d'analyse selon l'invention. Ce procédé consiste à réaliser : - des zones hydrophobes en surface du polymère en effectuant sur les zones à modifier : (1) une étape de traitement de ladite surface, réalisée à une température supérieure à la température de transition vitreuse du polymère, avec un milieu susceptible de créer des interactions acido-basiques avec les fonctions hydrophiles réactives, ce traitement entraînant la migration en surface des fonctions hydrophiles réactives présentes dans la masse du polymère et éventuellement, leur hydrolyse en d'autres fonctions hydrophiles réactives, suivie, (2a) d'une étape de greffage chimique, sur les fonctions hydrophiles présentes en surface, de groupements hydrophobes, - des zones hydrophiles sont réalisées en surface du polymère en effectuant sur les zones à modifier : (1) une étape de traitement de ladite surface, réalisée à une température supérieure à la température de transition vitreuse du polymère, avec un milieu susceptible de créer des interactions acido-basiques avec les fonctions hydrophiles réactives, ce traitement entraînant la migration en surface des fonctions hydrophiles réactives présentes dans la masse du The present invention also relates to a method for locally modifying the surface of the polymer constituting the support of an analysis card according to the invention. This method consists in producing: hydrophobic zones on the surface of the polymer by performing on the zones to be modified: (1) a step of treating said surface, carried out at a temperature above the glass transition temperature of the polymer, with a medium capable of creating acid-base interactions with reactive hydrophilic functions, this treatment leading to surface migration of the reactive hydrophilic functions present in the polymer mass and, optionally, their hydrolysis to other hydrophilic reactive functions, followed by (2a) d a step of chemical grafting, on the hydrophilic functions present on the surface, of hydrophobic groups, hydrophilic zones are formed on the surface of the polymer by performing on the areas to be modified: (1) a step of treating said surface, carried out at a temperature above the glass transition temperature of the polymer, with a susceptible medium e to create acid-base interactions with the reactive hydrophilic functions, this treatment leading to the surface migration of the reactive hydrophilic functions present in the mass of the

polymère et éventuellement, leur hydrolyse en d'autres fonctions hydrophiles réactives, suivie éventuellement, (2b) d'une étape de greffage chimique, sur les fonctions hydrophiles présentes en surface, de ligands biologiques, par exemple, choisis parmi les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines et les haptènes. polymer and optionally, their hydrolysis to other hydrophilic reactive functions, followed optionally, (2b) a chemical grafting step, on the hydrophilic functions present at the surface, biological ligands, for example, selected from polynucleotides, antigens , antibodies, polypeptides, proteins and haptens.

Pour modifier localement la surface du polymère, l'utilisation de masques ou la circulation de fluides, pourra, par exemple, être mise en oeuvre. For local modification of the surface of the polymer, the use of masks or the circulation of fluids, may, for example, be implemented.

L'utilisation de masques permet de ne mettre que les surfaces non masquées en contact avec des solutions et donc de ne modifier que celles-ci. The use of masks makes it possible to put only the unmasked surfaces in contact with solutions and thus to modify only these.

Par contre, lorsque la circulation d'eau ou d'autres solutions est utilisée, il faut que la structure de la carte se prête à une modification limitée aux zones désirées. En jouant sur la forme des embranchements ou intersections entre canaux, il est possible de créer des vannes. La fig. 3 représente une intersection 4 aménagée sur un support de carte d'analyse selon l'invention et comportant un premier canal 5 et un deuxième canal 7 se rejoignant pour former un canal commun 6. La circulation d'un fluide hydrophile, par exemple l'eau, dans les canaux 5 et 6 dans le sens fl permet de faire migrer en surface les chaînes hydrophiles présentes dans le polymère, rendant ainsi la surface des canaux 5 et 6 hydrophile. Aussi, si une solution aqueuse est acheminée dans le canal 6, dans le sens inverse f2, elle choisira préférentiellement au niveau de l'embranchement 4, le canal 5, plutôt que le canal 7 qui est resté hydrophobe. On the other hand, when the circulation of water or other solutions is used, it is necessary that the structure of the card lends itself to a modification limited to the desired zones. By playing on the shape of the branches or intersections between channels, it is possible to create valves. Fig. 3 represents an intersection 4 arranged on an analysis card support according to the invention and comprising a first channel 5 and a second channel 7 joining to form a common channel 6. The circulation of a hydrophilic fluid, for example the water, in the channels 5 and 6 in the direction fl makes it possible to migrate at the surface the hydrophilic chains present in the polymer, thus making the surface of the channels 5 and 6 hydrophilic. Also, if an aqueous solution is conveyed in the channel 6, in the opposite direction f2, it will preferentially choose at the branch 4, the channel 5, rather than the channel 7 which remained hydrophobic.

La présente invention a donc également pour objet les cartes d'analyse selon l'invention dont le support a une surface modifiée, au moins en partie, grâce au procédé ci-dessus. The present invention therefore also relates to the analysis cards according to the invention, the support has a modified surface, at least in part, thanks to the above method.

Il est très important de contrôler localement le caractère hydrophobe/hydrophile des cartes d'analyse. Par exemple, dans le cas des cartes d'analyse destinées à des échantillons contenant des protéines, il est connu que certaines protéines s'adsorbent préférentiellement sur des surfaces hydrophobes. It is very important to locally control the hydrophobic / hydrophilic character of the analysis cards. For example, in the case of assay maps for samples containing proteins, it is known that some proteins preferentially adsorb to hydrophobic surfaces.

Aussi, pour éviter de perdre des protéines sur la surface des canaux ou des puits, il est important de modifier leur paroi, de manière à les rendre hydrophiles, éventuellement non chargées. Also, to avoid losing proteins on the surface of the channels or wells, it is important to modify their wall, so as to make them hydrophilic, possibly uncharged.

De même, pour des cibles nucléiques, une surface hydrophile chargée négativement empêche préférentiellement ces molécules de s'adsorber par répulsion électrostatique. Au contraire, il peut également être envisagé d'adsorber des protéines sur des parois ou des zones déterminées. Il est alors nécessaire de rendre ces zones hydrophobes. Cependant, l'adsorption de protéines sur des parois hydrophobes change la nature de ces dernières. Similarly, for nucleic targets, a negatively charged hydrophilic surface preferentially prevents these molecules from being adsorbed by electrostatic repulsion. On the contrary, it can also be envisaged to adsorb proteins on specific walls or zones. It is then necessary to make these areas hydrophobic. However, the adsorption of proteins on hydrophobic walls changes the nature of the latter.

Pour mettre en évidence l'adsorption de ligands biologiques sur la surface des cartes d'analyses et en particulier de cibles ADN, on peut par exemple injecter une solution initiale de cibles en concentration connue et récupérer la solution en sortie du circuit fluidique. Ces deux solutions sont ensuite soumises à une réaction d'amplification de type PCR et déposées sur gel d'électrophorèse. La quantification est alors effectuée en comparant l'intensité des bandes d'électrophorèse obtenues. Des marqueurs fluorescents s'intercalant dans l'ADN double brin peuvent également être utilisés. To demonstrate the adsorption of biological ligands on the surface of the analysis cards and in particular of DNA targets, it is possible, for example, to inject an initial solution of targets in known concentration and to recover the solution at the outlet of the fluidic circuit. These two solutions are then subjected to a PCR type amplification reaction and deposited on an electrophoresis gel. Quantification is then performed by comparing the intensity of the electrophoresis bands obtained. Fluorescent markers that intercalate in double-stranded DNA can also be used.

A titre d'exemples non limitatifs selon l'invention, des support de cartes

d'analyse selon la fig. 1 ou la fig. 2 sont réalisés par moulage à 200 C, soit de granulés de polyéthylène fonctionnalisé avec 0,26 % en poids d'anhydride maléique (référence : PEgAM XA 255 de la société SOLVAY), soit de granulés de polypropylène fonctionnalisé avec 0,05 % en poids d'anhydride maléique (référence : PRIEX GP 12 de la société SOLVAY), soit de granulés de polypropylène fonctionnalisé avec 0,08 % en poids d'anhydride maléique (référence : PRIEX GP 13 de la société SOLVAY). Le polyéthylène utilisé a une température de transition vitreuse de l'ordre de-120 C et les polypropylènes utilisés ont une température de transition vitreuse proche de l'ordre de-20 C. Ces polymères sont donc caoutchoutiques à température ambiante. As non-limiting examples according to the invention, card holders

analysis according to FIG. 1 or FIG. 2 are produced by molding at 200 ° C., ie granules of polyethylene functionalized with 0.26% by weight of maleic anhydride (reference: PEgAM XA 255 from Solvay), or of polypropylene granules functionalized with 0.05% by weight of polypropylene. weight of maleic anhydride (reference: PRIEX GP 12 from Solvay), or of polypropylene granules functionalized with 0.08% by weight of maleic anhydride (reference: PRIEX GP 13 from Solvay). The polyethylene used has a glass transition temperature of the order of -120 C and the polypropylenes used have a glass transition temperature close to about -20 C. These polymers are therefore rubbery at room temperature.

L'écoulement et la formation de bulles après plusieurs passages sur les supports de carte d'analyse selon l'invention sont étudiés visuellement, par exemple, par l'intermédiaire d'une caméra et d'un microscope. The flow and the formation of bubbles after several passes on the analysis card holders according to the invention are studied visually, for example, by means of a camera and a microscope.

Pour des raisons pratiques, les mesures d'angle de contact avec l'eau, mettant en évidence les différentes propriétés hydrophile/hydrophobe de surface obtenues grâce au procédé selon l'invention, sont réalisées sur des supports plans et non sur ces supports munis de puits ou de canaux. For practical reasons, the water contact angle measurements, highlighting the different hydrophilic / hydrophobic surface properties obtained by means of the process according to the invention, are carried out on flat supports and not on these supports provided with wells or channels.

Les exemples ci-après illustrent donc le procédé de modification de surface selon l'invention et mettent en évidence les propriétés hydrophile/hydrophobe de surface obtenues. The following examples therefore illustrate the surface modification method according to the invention and demonstrate the surface hydrophilic / hydrophobic properties obtained.

EXEMPLES EXEMPLE 1

Des support plans de dimension 25x15xO, 5 mm3 de polyéthylène fonctionnalisé avec 0, 26 % en poids d'anhydride maléique (EXEMPLE 1), ou de polypropylène fonctionnalisé avec 0,05% (EXEMPLE 2) ou 0,08% en poids (EXEMPLE 3) d'anhydride maléique, sont réalisés comme suit :
Le polymère fonctionnalisé est introduit, sous forme de granulés, dans un moule en acier et l'ensemble est inséré dans une presse dont les plateaux sont maintenus à 200 C. Après 10 minutes de séjour, le support obtenu est refroidi, en présence d'une masse appliquée, destinée à limiter toute déformation. Le support est ensuite placé entre deux lames de verre greffées avec du n-octadécyl-triéthoxysilane (OTES) (obtenues par immersion de lames de verre pendant 15 minutes dans un mélange acide sulfurique/eau oxygénée à 30 , 70/30, v/v, suivie d'un rinçage à l'eau ultrapure et d'une immersion pendant 15 heures dans une solution d'OTES à 2 % dans le toluène anhydre) et réintroduit dans une étuve thermostatée à 180 C. Une masse est appliquée sur cet assemblage et l'étuve est mise sous vide primaire, afin de limiter les phénomènes d'oxydation. Après 1 heure 30 minutes, le vide est rompu et l'assemblage est refroidi lentement. Le support est alors lavé pendant deux heures avec du chloroforme, puis séché. EXAMPLES EXAMPLE 1

Supports 25x15xO planes, 5 mm3 of polyethylene functionalized with 0.26% by weight of maleic anhydride (EXAMPLE 1), or polypropylene functionalized with 0.05% (EXAMPLE 2) or 0.08% by weight (EXAMPLE 3) of maleic anhydride, are carried out as follows:
The functionalised polymer is introduced, in the form of granules, into a steel mold and the assembly is inserted into a press whose trays are kept at 200 ° C. After 10 minutes of residence, the support obtained is cooled, in the presence of an applied mass, intended to limit any deformation. The support is then placed between two glass slides grafted with n-octadecyl-triethoxysilane (OTES) (obtained by immersion of glass slides for 15 minutes in a sulfuric acid / hydrogen peroxide mixture at 30, 70/30, v / v followed by rinsing with ultrapure water and immersion for 15 hours in a solution of OTES at 2% in anhydrous toluene) and reintroduced in a thermostatically controlled oven at 180 C. A mass is applied to this assembly and the oven is placed under a primary vacuum, in order to limit the oxidation phenomena. After 1 hour 30 minutes, the vacuum is broken and the assembly is cooled slowly. The support is then washed for two hours with chloroform and dried.

A titre de comparaison, des supports réalisés en polyéthylène hyper haute densité (référence : PE-hhd ELTEX de la société SOLVAY) (PE) ou en polypropylène (référence : PP 3120 de la société APPRYL) (PP) sont préparés, selon le même mode opératoire, en remplaçant les lames de verre greffées avec de l'OTES, par des lames de verre simples. By way of comparison, supports made of hyper-high density polyethylene (reference: PE-hhd ELTEX from SOLVAY) (PE) or polypropylene (reference: PP 3120 from the company APPRYL) (PP) are prepared according to the same procedure, replacing glass slides grafted with OTES, by simple glass slides.

Les angles de contact obtenus au mouillage de la surface des support des EXEMPLES 1 à 3 avec de l'eau ultra pure (Sa) et au démouillage de la surface (sur) ont été mesurés. L'hystérésis AO = sa-sur rend compte de la réorganisation de la The contact angles obtained by wetting the surface of the supports of EXAMPLES 1 to 3 with ultrapure water (Sa) and dewetting of the surface (on) were measured. The hysteresis AO = sa-on accounts for the reorganization of the

surface avec l'eau. Les résultats obtenus avec les EXEMPLES 1,2 et 3 sont comparés avec ceux obtenus avec les supports PE et PP. surface with water. The results obtained with EXAMPLES 1,2 and 3 are compared with those obtained with the supports PE and PP.

Les angles de contact donnés dans le TABLEAU 1 ci-après sont des angles moyens calculés à partir de l'ensemble des mesures effectuées sur une surface. Ils sont complétés par un écart type rendant compte de l'hétérogénéité de la surface étudiée. The contact angles given in TABLE 1 below are average angles calculated from the set of measurements made on a surface. They are supplemented by a standard deviation accounting for the heterogeneity of the studied surface.

TABLEAU 1

TABLE 1

<tb>
<tb> CARTE <SEP> oa, <SEP> <SEP> or, <SEP> <SEP> A8, <SEP> o
<tb> PE <SEP> 103, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 77101, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 812, <SEP> 3
<tb> EXEMPLE <SEP> 1 <SEP> 75, <SEP> 2 <SEP> 4, <SEP> 544, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 224
<tb> PP <SEP> 104, <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 098, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 6, <SEP> 7
<tb> EXEMPLE <SEP> 2 <SEP> 98, <SEP> 8 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 81, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 8178
<tb> EXEMPLE <SEP> 3 <SEP> 84, <SEP> 2 <SEP> 2, <SEP> 766, <SEP> 7 <SEP> t <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 17, <SEP> 5
<tb> <Tb>
<tb> MAP <SEP> oa, <SEP><SEP> or, <SEP><SEP> A8, <SEP> o
<tb> PE <SEP> 103, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 77101, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 812, <SEP> 3
<tb> EXAMPLE <SEP> 1 <SEP> 75, <SEP> 2 <SEP> 4, <SEQ> 544, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 224
<tb> PP <SEP> 104, <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 098, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 6, <SEP> 7
<tb> EXAMPLE <SEP> 2 <SEP> 98, <SEP> 8 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 81, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 8178
<tb> EXAMPLE <SEP> 3 <SEP> 84, <SEP> 2 <SEP> 2, <SEQ> 766, <SEP> 7 <SEP> t <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 17, <SEP> 5
<Tb>

Les angles de contact obtenus pour les polyoléfines non fonctionnalisées correspondent aux valeurs trouvées dans la littérature. The contact angles obtained for the nonfunctionalized polyolefins correspond to the values found in the literature.

Les angles de contact obtenus pour les EXEMPLES 1,2 et 3, tant au mouillage qu'au démouillage, sont plus faibles que ceux obtenus avec les polyoléfines non fonctionnalisées. Cette diminution assez importante est attribuée à la présence des groupements polaires de type anhydride maléique ou-COOH présents en surface et ceci, malgré des taux d'incorporation faibles (0,26 % au maximum pour l'EXEMPLE 1). The contact angles obtained for EXAMPLES 1,2 and 3, both at wetting and dewetting, are lower than those obtained with nonfunctionalized polyolefins. This rather important decrease is attributed to the presence of polar groups of maleic anhydride or -COOH type present on the surface and this, despite low incorporation rates (0.26% maximum for EXAMPLE 1).

De plus, l'augmentation de AO obtenu avec les EXEMPLES 1,2 et 3 par rapport aux polyoléfines non fonctionnalisées correspondantes, prouve la réorganisation des groupements de surface des supports sous l'action d'un milieu susceptible de créer des interactions acido-basiques : sous la goutte d'eau, les fonctions d'anhydride maléique sont attirées en surface et s'orientent vers le liquide et certaines de ces fonctions d'anhydride maléique sont hydrolysées pour donner des fonctions acides-COOH. In addition, the increase of AO obtained with EXAMPLES 1,2 and 3 with respect to the corresponding non-functionalized polyolefins, proves the reorganization of the surface groups of the supports under the action of a medium likely to create acid-base interactions Under the drop of water, the functions of maleic anhydride are attracted to the surface and orient towards the liquid and some of these functions of maleic anhydride are hydrolysed to give acid-COOH functions.

EXEMPLE 4
Sur le support de l'EXEMPLE 1, on fait circuler, à température ambiante, de l'eau pure, puis ce support est plongé, toujours à température ambiante, pendant 15 heures, dans une solution contenant 2 % en poids de diméthyléthoxysilane (DMES) dans du toluène anhydre. EXAMPLE 4
On the support of EXAMPLE 1, pure water is circulated at ambient temperature, then this support is immersed, still at ambient temperature, for 15 hours, in a solution containing 2% by weight of dimethylethoxysilane (DMES ) in anhydrous toluene.

Avant de mesurer les angles de contact, les supports sont rincées au chloroforme pour garantir l'extraction des polycondensats de silane physisorbés à la surface du polymère. Before measuring the contact angles, the supports are rinsed with chloroform to ensure the extraction of the silane polycondensates physisorbed on the surface of the polymer.

Les angles de contact de l'eau obtenus sont présentés dans le TABLEAU 2 ciaprès.

The contact angles of the water obtained are presented in TABLE 2 below.

TABLEAU 2

TABLE 2

<tb>
<tb> CARTE <SEP> Oa <SEP> Or <SEP> AO
<tb> PE <SEP> 103, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 77101, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 8123
<tb> EXEMPLE <SEP> 1 <SEP> 75, <SEP> 2 <SEP> 4, <SEP> 544, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 224
<tb> EXEMPLE <SEP> 4 <SEP> 102, <SEP> 8 <SEP> 2, <SEP> 676, <SEP> 4 <SEP> 4, <SEP> 7264
<tb> <Tb>
<tb> CARD <SEP> Oa <SEP> Gold <SEP> AO
<tb> PE <SEP> 103, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 77101, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 8123
<tb> EXAMPLE <SEP> 1 <SEP> 75, <SEP> 2 <SEP> 4, <SEQ> 544, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 224
<tb> EXAMPLE <SEP> 4 <SEP> 102, <SEP> 8 <SEP> 2, <SEP> 676, <SEP> 4 <SEP> 4, <SEP> 7264
<Tb>

Ces résultats montrent que le greffage de DMES permet d'obtenir une surface présentant un caractère hydrophobe proche de celui obtenu avec un support réalisé en polyéthylène non modifié (PE). These results show that the grafting of DMES makes it possible to obtain a surface having a hydrophobic character close to that obtained with a support made of unmodified polyethylene (PE).

EXEMPLE 5
Cinq traitements différents sont effectués, à température ambiante, sur le support de l'EXEMPLE 1, dans le but de caractériser l'adsorption et/ou le couplage d'oligonucléotides sur le polymère fonctionnalisé : EXEMPLE 5 A : EXEMPLE 1 activé par du carbodiimide EXEMPLE 5B : EXEMPLE 1 traité par immersion dans l'eau pendant 15 heures EXEMPLE 5C : EXEMPLE 1 traité par immersion dans l'eau pendant 15 heures et activé par du carbodiimide. EXAMPLE 5
Five different treatments are carried out, at room temperature, on the support of EXAMPLE 1, in order to characterize the adsorption and / or the coupling of oligonucleotides on the functionalized polymer: EXAMPLE 5 A: EXAMPLE 1 Activated by carbodiimide EXAMPLE 5B: EXAMPLE 1 treated by immersion in water for 15 hours EXAMPLE 5C: EXAMPLE 1 treated by immersion in water for 15 hours and activated with carbodiimide.

EXEMPLE 5D : EXEMPLE 1 traité par immersion dans une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium ( > 10 mM) pendant 15 heures. EXAMPLE 5D: EXAMPLE 1 treated by immersion in an aqueous solution of potassium hydroxide (> 10 mM) for 15 hours.

EXEMPLE 5E : EXEMPLE 1 traité par immersion dans une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium ( > 10 mM) pendant 15 heures et activé par du carbodiimide. EXAMPLE 5E: EXAMPLE 1 treated by immersion in an aqueous solution of potassium hydroxide (> 10 mM) for 15 hours and activated with carbodiimide.

Les EXEMPLES 5A à 5E sont soumis au test ELOSA (de l'anglais"Enzyme- Linked OligoSorbent Assay , on pourra se référer à F. Mallet et al., J. Clin. EXAMPLES 5A to 5E are subjected to the ELOSA test (English "Enzyme-Linked OligoSorbent Assay", reference may be made to F. Mallet et al., J. Clin.

Microbiol., 1993,31 (6), 1444-1449 et à WO 91/19812), de détection d'acides nucléiques sur support solide. Ce test, reposant sur l'hybridation moléculaire entre oligonucléotides et acides nucléiques cibles, est effectué, dans le cas présent, pour détecter la présence ou non d'une"sonde de capture"sur un support solide. Un acide nucléique cible possédant une séquence complémentaire de celle de l'oligonucléotide (ODN de capture), est mis en contact avec la carte d'analyse. La complémentarité des séquences entraîne une hybridation des deux molécules. Un ODN de détection est ensuite ajouté. Il s'hybride sur une séquence complémentaire de la cible, différente de la première. L'enzyme catalyse ensuite la transformation d'un substrat en un produit détectable, dont la concentration est proportionnelle à la concentration en cible. Microbiol., 1993, 31 (6), 1444-1449 and WO 91/19812) for the detection of nucleic acids on a solid support. This test, based on the molecular hybridization between oligonucleotides and target nucleic acids, is carried out, in this case, to detect the presence or absence of a "capture probe" on a solid support. A target nucleic acid having a sequence complementary to that of the oligonucleotide (capture ODN) is brought into contact with the analysis card. The complementarity of the sequences leads to hybridization of the two molecules. A detection ODN is then added. It hybridizes to a complementary sequence of the target, different from the first one. The enzyme then catalyzes the transformation of a substrate into a detectable product, the concentration of which is proportional to the target concentration.

L'ODN cible utilisé de SEQ ID n l comprend 78 bases :
SEQ ID n l : 5'-AAG TAT CCC CAT AAG TTT CAT AGA TAT ATT GTT CTA
AGC TAT GGA GCC ATA TCC TAG GAA AAT GTC TAA CAG CTT CAC-3'
L'ODN de capture utilisé de SEQ ID n 2 comprend 20 bases et comporte un bras aminé en position 5', comme décrit dans la demande de brevet publiée sous le numéro WO 91/19812 : SEQ ID n 2 : 5'-TAT GAA ACT TAT GGG GAT AC-3'
Ce test comprend quatre étapes : une étape d'immobilisation de l'ODN de capture, une étape d'incubation de la cible sur l'ODN de capture immobilisé, une étape d'incubation de l'ODN de détection sur la cible et une étape d'analyse The target ODN used of SEQ ID nl comprises 78 bases:
SEQ ID NO: 5'-AAG TAT CCC CAT AAG TTT CAT AGA TAT ATT GTT CTA
AGC TAT GGA GCC ATA TCC TAG GAA AAT GTC TAA CAG CTT CAC-3 '
The capture ODN used of SEQ ID No. 2 comprises 20 bases and comprises an amine arm at the 5 'position, as described in the patent application published under the number WO 91/19812: SEQ ID No. 2: 5'-TAT GAA ACT TAT GGG GAT AC-3 '
This test comprises four steps: an immobilization step of the capture ODN, a target incubation step on the immobilized capture ODN, a step of incubation of the detection ODN on the target and a analysis step

colorimétrique, correspondant à la réaction enzymatique. Ce test se déroule de la manière suivante. colorimetric, corresponding to the enzymatic reaction. This test is performed as follows.

Une étape d'immobilisation de l'ODN de capture correspond à la mise en présence de la sonde de capture sur le support polymère. La sonde de capture utilisée est terminée par une fonction amine aliphatique primaire. En cas de couplage avec une fonction anhydride en surface, le couplage est assuré par la réaction directe de cette fonction avec la fonction amine primaire de l'ODN de capture. Pour le cas, où les groupements présents en surface seraient des fonctions-COOH issues de l'hydrolyse des anhydrides, un agent d'activation tel le 1-methyl-3-(3- diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) est utilisé.

A step of immobilization of the capture ODN corresponds to placing the capture probe in the presence of the polymer support. The capture probe used is terminated by a primary aliphatic amine function. In case of coupling with an anhydride function at the surface, the coupling is ensured by the direct reaction of this function with the primary amine function of the capture ODN. For the case, where the groups present on the surface would be COOH functions resulting from the hydrolysis of the anhydrides, an activating agent such as 1-methyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) is used.

Typiquement, 40 ul d'une solution contenant 0, 05 pmole/J. f. l d'ODN de capture, en présence ou non de 0, 2 pmole/al d'EDC en tampon Phosphate 10 mM, pH 6, 8 sont placés en contact avec la surface pendant 1 heure. Le support est ensuite lavé par le tampon de lavage (tampon Phosphate 0,05 M, NaCI 0, 15 M, Tween 20 0,05 %, pH 7,2) afin d'éliminer les biomolécules faiblement absorbées. Ce tampon est utilisé dans toutes les étapes de lavage. Typically, 40 μl of a solution containing 0.05 pmol / day. f. 1 μl of capture ODN, in the presence or absence of 0.2 pmol / μl of EDC in 10 mM phosphate buffer, pH 6.8 are placed in contact with the surface for 1 hour. The support is then washed with the washing buffer (0.05 M phosphate buffer, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.2) in order to remove the weakly absorbed biomolecules. This buffer is used in all washing steps.

L'incubation de la cible est réalisée en déposant, pendant 1 heure, 40 ul d'une solution contenant 1012 copies/ml de tampon d'hybridation (phosphate 0,06 M, NaCl 0,9 M, ADN de sperme de saumon 50 mg/ml, lait en poudre 3 % en poids, Triton 0,05 %, pH 7,4). En fin d'incubation, le support est rincé par le tampon de lavage. The target incubation is carried out by depositing, for 1 hour, 40 μl of a solution containing 1012 copies / ml of hybridization buffer (0.06 M phosphate, 0.9 M NaCl, salmon sperm DNA). mg / ml, milk powder 3% by weight, 0.05% Triton, pH 7.4). At the end of incubation, the support is rinsed with the washing buffer.

L'ODN de détection de SEQ ID n 3 est un conjugué constitué d'un fragment d'acide nucléique de 23 bases complémentaire de la cible et greffé en position 5'sur une enzyme, l"'Horse Radish Peroxydase"ou HRP, comme décrit dans la demande de brevet publiée sous le numéro WO 91/19812 : SEQ ID n 3 : 5'-GAA GCT GTT AGA CAT TTT CCT AG-3'
L'hybridation de ce conjugué sur la cible immobilisée est réalisée en laissant incuber, pendant 1 heure, 40 ul d'une solution d'ODN de détection à 0,05 pmole/ml de tampon d'hybridation. En fin d'incubation, le support est rincé par le tampon de lavage. The detection ODN of SEQ ID No. 3 is a conjugate consisting of a 23-base nucleic acid fragment complementary to the target and grafted at the 5-position on an enzyme, Horse Radish Peroxidase or HRP, as described in the patent application published under number WO 91/19812: SEQ ID No. 3: 5'-GAA GCT GTT AGA CAT TTT CCT AG-3 '
Hybridization of this conjugate on the immobilized target is carried out by incubating, for 1 hour, 40 μl of a detection ODN solution at 0.05 pmole / ml of hybridization buffer. At the end of incubation, the support is rinsed with the washing buffer.

L'analyse colorimétrique est réalisée de la manière suivante. Les échantillons sont mis en présence du substrat colorimétrique de l'HRP, l'ortho-phénylène diamine ou OPD. Initialement incolore, celui-ci est transformé par l'HRP en un produit The colorimetric analysis is carried out as follows. The samples are brought into contact with the colorimetric substrate of HRP, ortho-phenylene diamine or OPD. Initially colorless, it is transformed by HRP into a product

coloré, l'orthonitroaniline. Après 10 minutes de révélation, la réaction enzymatique est stoppée par ajout d'une solution d'acide sulfurique IN dans le milieu. La densité optique (DO) de la coloration, proportionnelle à la quantité d'enzyme, et donc à la quantité de cibles hybridées, est mesurée à 492 nanomètres. colored, orthonitroaniline. After 10 minutes of revelation, the enzymatic reaction is stopped by adding a solution of sulfuric acid IN in the medium. The optical density (OD) of the staining, proportional to the amount of enzyme, and therefore to the amount of hybridized targets, is measured at 492 nanometers.

Ce test permet donc de caractériser l'adsorption et/ou le couplage d'oligonucléotides sur le polymère étudié. Il permet également de déterminer la nature des fonctions chimiques présentes à la surface des échantillons. La présence de la sonde de détection reflète en effet, la présence préalable de la sonde de capture sur la surface (qu'elle soit adsorbée ou couplée), donc la présence d'un site réactionnel. This test therefore makes it possible to characterize the adsorption and / or the coupling of oligonucleotides on the polymer studied. It also makes it possible to determine the nature of the chemical functions present on the surface of the samples. The presence of the detection probe indeed reflects the prior presence of the capture probe on the surface (whether adsorbed or coupled), thus the presence of a reaction site.

Les résultats obtenus après test ELOSA sur l'EXEMPLE 1 et les EXEMPLES 5A à 5E par détection colorimétrique sont présentés à la fige 4. Ces résultats prouvent que des fonctions-COOH, présentes à la surface des supports des EXEMPLES 5C et 5E, sont couplées avec des biomolécules. Aussi ces résultats démontrent que le traitement de la surface du polymère fonctionnalisé à l'anhydride maléique avec de l'eau ou une solution d'hydroxyde de potassium attire les fonctions d'anhydride maléique du volume vers la surface puis les hydrolyse en fonctions - COOH. The results obtained after ELOSA test on EXAMPLE 1 and EXAMPLES 5A to 5E by colorimetric detection are presented in FIG. 4. These results prove that COOH functions, present on the surface of the supports of EXAMPLES 5C and 5E, are coupled. with biomolecules. These results demonstrate that the surface treatment of the maleic anhydride-functionalized polymer with water or potassium hydroxide solution attracts the functions of maleic anhydride from the volume to the surface and then hydrolyzes them to COOH functions. .

Claims

1-Analysis card whose support is manufactured from a polymer, characterized in that this polymer: has a glass transition temperature of less than 60 ° C., and is hydrophobic in the absence of functionalization, and is functionalized in its mass by reactive hydrophilic functions, or generators of reactive hydrophilic functions.

2-Analysis card according to the claim characterized in that the polymer is functionalized in its mass by reactive hydrophilic functions, or generating reactive hydrophilic functions chosen from anhydride, epoxide, carboxylic acid, hydroxyl or primary amine functions.

3-Analysis card according to claim 1 or 2, characterized in that the

polymer has a glass transition temperature of less than 37 C, preferably less than 20 C.

4-Analysis card according to claim 3, characterized in that the polymer used is a functionalized polyolefin.

5-Analysis card according to claim 4, characterized in that the polymer used is a functionalized polyethylene.

6-Analysis card according to claim 4, characterized in that the polymer used is a functionalized polypropylene.

7-analysis card according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the polymer is functionalized with maleic anhydride.

8-Analysis card according to claim 7, characterized in that the polymer contains up to 2%, preferably up to 0.3% by weight of maleic anhydride.

9-Process for modifying, at least in part, the surface of the polymer constituting the support of an analysis card according to any one of claims 1 to 8, characterized in that it comprises a step of treating said surface , carried out at a temperature above the glass transition temperature of the polymer, with a medium capable of creating acid-base interactions with the reactive hydrophilic functions, this treatment step resulting in surface migration of the reactive hydrophilic functions present in the bulk of the polymer. polymer and optionally their hydrolysis to other hydrophilic reactive functions.

10-Process according to claim 9, characterized in that the medium capable of creating acid-base interactions with the hydrophilic reactive functions is a liquid containing at least 50% by weight of water.

11-Process according to claim 9 or 10, characterized in that the treatment step is followed by a chemical grafting step, on the reactive hydrophilic functions present on the surface, of biological ligands.

12-Process according to claim 11, characterized in that the biological ligands are selected from polynucleotides, antigens, antibodies, polypeptides, proteins, and haptens.

13-Process according to claim 9 or 10, characterized in that the treatment step is followed by a chemical grafting step, on the hydrophilic functions present on the surface, of hydrophobic groups.

14-Process according to claim 13, characterized in that the hydrophobic groups are chosen from thiolsilanes and alkylsilanes.

15-Process for locally modifying the surface of the polymer constituting the support of an analysis card according to any one of Claims 1 to 8, characterized in that: (1) a step of treating said surface, carried out at a a temperature greater than the glass transition temperature of the polymer, with a medium capable of creating acid-base interactions with the reactive hydrophilic functions, this treatment step resulting in the surface migration of the reactive hydrophilic functions present in the bulk of the polymer and optionally, their hydrolysis to other hydrophilic reactive functions, followed, (2a) by a chemical grafting step, on the hydrophilic reactive functions present on the surface, of hydrophobic groups, - hydrophilic zones on the surface of the polymer by carrying out on the zones to modify: (1) a step of treating said surface, carried out at a temperature greater than the temperature transition of the polymer, with a medium capable of creating acid-base interactions with the reactive hydrophilic functions, this treatment step resulting in the

surface migration of the reactive hydrophilic functions present in the polymer mass and, optionally, their hydrolysis to other hydrophilic reactive functions, optionally followed (2b) by a chemical grafting step, on the reactive hydrophilic functions present at the surface, biological ligands.

16-Process according to claim 15, characterized in that in the treatment step (1), the medium capable of creating acid-base interactions with the hydrophilic reactive functions is a liquid containing at least 50% by weight of water.

17-analysis card according to any one of claims 1 to 8, characterized in that its support has a modified surface, at least in part, according to the method of any one of claims 9 to 16.