FR2822706A1

FR2822706A1 - Medicament for treating retinal degeneration, especially pigmentary retinitis or photoreceptor degeneration, containing glutamate receptor antagonist

Info

Publication number: FR2822706A1
Application number: FR0104234A
Authority: FR
Inventors: Laurent Meyer; Serge Picaud; Jose Alain Sahel
Original assignee: Universite Louis Pasteur Strasbourg I
Current assignee: Universite Louis Pasteur Strasbourg I
Priority date: 2001-03-29
Filing date: 2001-03-29
Publication date: 2002-10-04

Abstract

The use of a glutamate receptor antagonist (I) is claimed in the production of a medicament for treating retinal degeneration.

Description

La présente invention concerne l'utilisation d'antagonistes de récepteurs de glutamate dans le traitement de la dégénérescence rétinienne, en particulier dans le traitement de la rétinite pigmentaire. Elle concerne en outre un procédé de traitement d'un patient souffrant de dégénérescence rétinienne, notamment de rétinite pigmentaire, comprenant l'administration d'un antagoniste de glutamate audit patient. The present invention relates to the use of glutamate receptor antagonists in the treatment of retinal degeneration, in particular in the treatment of pigmentary retinitis. It further relates to a method of treating a patient suffering from retinal degeneration, in particular pigmentary retinitis, comprising the administration of a glutamate antagonist to said patient.

Ces dernières années, la compréhension des mutations et des événements cellulaires conduisant à la perte cellulaire dans la rétinite pigmentaire (RP) a augmenté considérablement. La plupart des mutations identifiées affectent des gènes exprimés dans les photorécepteurs des bâtonnets, comprenant la rhodopsine, des sous-unités de la phosphodiestérase, le canal commandé par le GMPc (guanosine monophosphate cyclique). Une voie commune de la mort, c'est-à-dire l'apoptose, des récepteurs des bâtonnets a été démontrée dans plusieurs modèles animaux. Cependant, les mécanismes rattachant ces mutations à l'apoptose restent obscurs. In recent years, the understanding of mutations and cellular events leading to cell loss in retinitis pigmentosa (RP) has increased considerably. Most of the mutations identified affect genes expressed in rod photoreceptors, including rhodopsin, phosphodiesterase subunits, the channel controlled by cGMP (cyclic guanosine monophosphate). A common pathway to death, i.e. apoptosis, from rod receptors has been demonstrated in several animal models. However, the mechanisms linking these mutations to apoptosis remain unclear.

Les connaissances les plus étendues sur la dégénérescence cellulaire des photorécepteurs des bâtonnets proviennent d'études effectuées sur la souris rd, un modèle animal de la rétinite pigmentaire qui a été découvert il y a plus de 70 ans. Le rétablissement de cônes et de bâtonnets au moyen d'un agent bloquant les canaux Ca2+ de type L a suggéré que la mort cellulaire des photorécepteurs pouvait résulter d'un influx accru de Ca2+. The most extensive knowledge on cell degeneration of rod photoreceptors comes from studies carried out on the rd mouse, an animal model of pigmentary retinitis which was discovered more than 70 years ago. The recovery of cones and rods with an L-type Ca2 + channel blocker suggested that cell death of photoreceptors could result from an increased influx of Ca2 +.

Un influx accru de Ca2+ dans les photorécepteurs peut en effet déclencher une libération de glutamate, la concentration du transmetteur augmentant jusqu'à un taux connu comme provoquant un endommagement excitotoxique dans les neurones glutaminergiques du cerveau et de la rétine. An increased influx of Ca2 + into photoreceptors can indeed trigger a release of glutamate, the concentration of the transmitter increasing to a level known to cause excitotoxic damage in the glutaminergic neurons of the brain and the retina.

Pour mieux évaluer cette hypothèse de l'excitotoxicité du glutamate sur les neurones post-synaptiques, on a administré quotidiennement à une souris rd de la NBQX (6-nitro-7-sulfamylbenzoquinoxaline-2, 3-dione), un antagoniste des récepteurs de glutamate de type kaïnate/AMPA (acide a-amino-3- hydroxy-5-méthylisoxazolepropionique)/, tandis qu'on n'a injecté que du véhicule à des souris rd témoins. To better evaluate this hypothesis of glutamate excitotoxicity on post-synaptic neurons, a rd mouse was administered daily NBQX (6-nitro-7-sulfamylbenzoquinoxaline-2, 3-dione), a receptor antagonist kainate-type glutamate / AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazolepropionic acid) /, while only rd control mice were injected with vehicle.

RÉTABLISSEMENT DE NEURONES POST-SYNAPTIQUES : Après une injection quotidienne de NBQX du 3e jour au 22e jour, on compare des coupes dans de la paraffine, colorées à l'hématoxyline, provenant d'animaux traités, à des coupes provenant de souris rdtémoins auxquelles avait été injecté le véhicule seul. Dans la couche nucléaire interne, les noyaux cellulaires sont 1,14 fois plus nombreux dans les coupes de rétine des souris rd traitées (218, 11 + 4, 66 e. t. m. (erreur type de la moyenne), n = 18) que dans celles des souris témoins (190, 95 3, 888 e. t. m., n = 20). Cette différence est statistiquement significative (P < 0,001). Ces observations indiquent que des neurones rétiniens nucléaires internes peuvent dégénérer chez la souris rden raison de l'excitotoxicité. RECOVERY OF POST SYNAPTIC NEURONS: After a daily injection of NBQX from day 3 to day 22, we compare sections in paraffin, stained with hematoxylin, from treated animals, to sections coming from control mice which had been injected the vehicle alone. In the internal nuclear layer, the cell nuclei are 1.14 times more numerous in the retina sections of rd treated mice (218, 11 + 4, 66 etm (standard error of the mean), n = 18) than in those of control mice (190, 95 3, 888 etm, n = 20). This difference is statistically significant (P <0.001). These observations indicate that internal nuclear retinal neurons can degenerate in rden mice due to excitotoxicity.

RÉTABLISSEMENT DE PHOTORÉCEPTEURS DE BÂTONNETS :
Lorsqu'on examine la couche nucléaire externe provenant d'animaux traités et de souris rdtémoins, on peut voir que les noyaux cellulaires sont en plus grand nombre chez les animaux traités. La détermination quantitative montre qu'ils sont 65 fois plus nombreux dans les coupes de rétine de souris ru traitées au NBQX (51, 55 1, 372 e. t. m., n = 18) que dans celles des souris rdtémoins (19, 40 + 0, 950 e. t. m., n = 20). La différence est là encore statistiquement significative (P < 0,001). Pour établir que ces noyaux cellulaires appartiennent aux photorécepteurs rétablis, on prépare deux autres groupes de souris traitées au NBQX et de souris rd témoins. Après le traitement, les rétines sont immunomarquées avec un anticorps qui reconnaît spécifiquement les photorécepteurs de bâtonnets. RECOVERY OF STICK PHOTOReceptors:
When examining the outer nuclear layer from treated animals and control mice, it can be seen that there are more cell nuclei in the treated animals. The quantitative determination shows that they are 65 times more numerous in the retinal sections of ru mice treated with NBQX (51, 55 1, 372 etm, n = 18) than in those of the control mice (19, 40 + 0, 950 etm, n = 20). The difference is again statistically significant (P <0.001). To establish that these cell nuclei belong to the restored photoreceptors, two other groups of NBQX-treated mice and control rd mice are prepared. After treatment, the retinas are immunolabelled with an antibody which specifically recognizes rod photoreceptors.

Lorsque les bâtonnets sont comptés à l'aide d'une technique stéréologique permettant un échantillonnage impartial, ils se révèlent être 3, 31 fois plus nombreux chez les souris rd traitées au NBQX (86 566 : 5 590 e. t. m., n = 8) que chez les souris ru témoins (26 094 : 3 086 e. t. m., n = 8) (P < 0,0001). Ces résultats indiquent que le blocage des récepteurs ionotropes de glutamate dans les neurones post-synaptiques peut protéger les photorécepteurs de bâtonnets présynaptiques. When the rods are counted using a stereological technique allowing impartial sampling, they appear to be 3.31 times more numerous in rd mice treated with NBQX (86,566: 5,590 etm, n = 8) than in control ru mice (26,094: 3,086 etm, n = 8) (P <0.0001). These results indicate that blocking ionotropic glutamate receptors in postsynaptic neurons may protect photoreceptors from presynaptic rods.

RÉTABLISSEMENT FONCTIONNEL : Pour déterminer si le rétablissement cellulaire induit par NBQX pouvait améliorer les fonctions visuelles chez des souris rd, on enregistre des électrorétinogrammes (ERG) chez des animaux traités et des animaux témoins, 22 jours après la naissance. À cet âge, les signaux d'ERG sont habituellement absents chez les souris rdtémoins. Dans nos essais, un signal mesurable n'est obtenu que chez une souris non traitée (8,5 % des 12 animaux au total). En revanche, des signaux d'ERG sont enregistrés chez 8 (66,7 %) des 12 souris rd traitées au NBQX. Les amplitudes des ondes a et b sont 3//V et 5 UV chez

les souris témoins, 8, 5 : 0, 690 /V (e. t. m., n = 12) et 1, 45 : 0, 987 /V (e. t. m., n = 12) chez les souris rdtraitées. L'analyse statistique de ces valeurs, effectuée avec le test non paramétrique de Mann-Whitney, montre une différence significative entre le groupe traité et le groupe non traité (P < 0,01). Ces résultats sont en accord avec un rétablissement des fonctions visuelles chez les souris rd traitées au NBQX. FUNCTIONAL RECOVERY: To determine whether NBQX-induced cell recovery could improve visual function in rd mice, electroretinograms (ERG) were recorded in treated and control animals 22 days after birth. At this age, ERG signals are usually absent in control mice. In our tests, a measurable signal is only obtained in an untreated mouse (8.5% of the 12 animals in total). In contrast, ERG signals were recorded in 8 (66.7%) of the 12 rd mice treated with NBQX. The amplitudes of waves a and b are 3 // V and 5 UV at

the control mice, 8: 5: 0.690 / V (etm, n = 12) and 1.45: 0.987 / V (etm, n = 12) in the treated mice. Statistical analysis of these values, performed with the non-parametric Mann-Whitney test, shows a significant difference between the treated group and the untreated group (P <0.01). These results are in agreement with a restoration of visual functions in rd mice treated with NBQX.

DISCUSSION
La présente neuroprotection induite par NBQX suggère que les neurones rétiniens internes dégénèrent par excitotoxicité. Il est en effet connu que la NBQX supprime l'endommagement excitotoxique dans le système nerveux central par inactivation de récepteurs de glutamate sensibles à l'AMPA et/ou au kaïnate, et ces récepteurs sont exprimés dans la plupart des neurones rétiniens internes, des cellules OFF bipolaires, des cellules horizontales, des cellules amacrines et des ganglions cellulaires. Ces neurones s'avèrent classiquement être sensibles à l'endommagement excitotoxique à la fois in vivo après injection intraoculaire d'agonistes de récepteurs de glutamate ou, in vitro, par incubation de ces agonistes. Nos résultats sur des souris rd au 22e jour après la naissance indiquent que ces endommagements de neurones post-synaptiques se produisent plus tôt qu'il était attendu. Ils peuvent même expliquer la maturation défectueuse de la couche plexiforme externe, où des photorécepteurs établissent normalement leurs connexions aux neurones postsynaptiques et où la première lésion ultrastructurale décelable a été constatée chez la souris rd DISCUSSION
The present NBQX-induced neuroprotection suggests that internal retinal neurons degenerate by excitotoxicity. NBQX is known to suppress excitotoxic damage in the central nervous system by inactivation of glutamate receptors sensitive to AMPA and / or kainate, and these receptors are expressed in most internal retinal neurons, cells OFF bipolar, horizontal cells, amacrine cells and cell nodes. These neurons are conventionally shown to be sensitive to excitotoxic damage both in vivo after intraocular injection of glutamate receptor agonists or, in vitro, by incubation of these agonists. Our results in rd mice on the 22nd day after birth indicate that this damage to postsynaptic neurons occurs earlier than expected. They can even explain the defective maturation of the external plexiform layer, where photoreceptors normally establish their connections to postsynaptic neurons and where the first detectable ultrastructural lesion was observed in rd mice

Dans les photorécepteurs, le glutamate induit un courant qui n'est pas bloqué par l'antagoniste de récepteurs NBQX ; le courant est en fait engendré par un transporteur couplé à des canaux CI. Il a été également rapporté dans l'état de la technique que le glutamate activait les récepteurs métabotropiques modulant les flux de Ca2+. Ces données pharmacologiques indiquent que le rétablissement de bâtonnets induit par NBQX ne peut pas être attribué à un effet direct de NBQX sur les photorécepteurs. Ils suggèrent au contraire que la suppression de l'excitation et de l'excitotoxicité post-synaptique par le glutamate peut ralentir la dégénérescence des photorécepteurs. In photoreceptors, glutamate induces a current which is not blocked by the NBQX receptor antagonist; the current is in fact generated by a transporter coupled to CI channels. It has also been reported in the prior art that glutamate activates metabotropic receptors which modulate Ca2 + fluxes. These pharmacological data indicate that the recovery of rods induced by NBQX cannot be attributed to a direct effect of NBQX on photoreceptors. On the contrary, they suggest that the suppression of post-synaptic excitation and excitotoxicity by glutamate can slow down the degeneration of photoreceptors.

Ce qui précède suggère que la neuroprotection par le diltiazem, un bloquant des canaux calciques, rapportée antérieurement, puisse en fait résulter en partie d'une réduction de la libération de glutamate. Le diltiazem limiterait l'excitotoxicité du glutamate par réduction de la libération de glutamate dépendant de Ca2+ au niveau des sites pré-synaptiques au lieu de bloquer les récepteurs post-synaptiques de glutamate. Même si l'hypothèse excitotoxique ne peut pas expliquer toute la dégénérescence des photorécepteurs, étant donné le rétablissement constaté, provoqué à la fois par NBQX et le diltiazem, elle ouvre néanmoins une nouvelle voie pour tenter de ralentir le processus de dégénérescence. The above suggests that neuroprotection with diltiazem, a calcium channel blocker, previously reported, may in fact result in part from a reduction in glutamate release. Diltiazem would limit the excitotoxicity of glutamate by reducing the release of Ca2 + dependent glutamate at pre-synaptic sites instead of blocking the post-synaptic glutamate receptors. Even if the excitotoxic hypothesis cannot explain all the degeneration of photoreceptors, given the recovery observed, provoked by both NBQX and diltiazem, it nevertheless opens a new way to try to slow down the degeneration process.

MATÉRIELS ET MÉTHODES
ANIMAUX ET TRAITEMENT MÉDICAMENTEUX
Toutes les expériences sont effectuées conformément à la Notification ARVO pour l'Emploi d'Animaux dans la Recherche Ophtalmique et sur la Vision. Elles sont effectuées sur des souris C3H/He/] homozygotes pour la mutation rd, obtenues auprès de Janvier Animal Suppliers (Le Genest St. Isle, France), maintenues en cycles d'éclairement-obscurité de 12 heures. Du 3e au 21 e jour après la naissance, des souris C3H ont reçu des injections intrapéritonéales de 60 pu de solution soit de NBQX, soit de véhicule (TocrisCookson, Bristol, GB). NBQX est dissous dans une solution de glucose à 5 %, pH 8, 5 et injecté par voie intrapéritonéale à une concentration finale de 7, 5

mM entre le 3'et le 71 jour après la naissance et de 15 mM entre le 8e et le 21 e jour après la naissance. Ces injections représentent des doses allant de 30 MATERIALS AND METHODS
ANIMALS AND DRUG TREATMENT
All experiments are carried out in accordance with the ARVO Notification for the Use of Animals in Ophthalmic Research and on Vision. They are carried out on C3H / He /] mice homozygous for the rd mutation, obtained from Janvier Animal Suppliers (Le Genest St. Isle, France), maintained in light-dark cycles of 12 hours. From the 3rd to the 21st day after birth, C3H mice received intraperitoneal injections of 60 μl of either NBQX or vehicle solution (TocrisCookson, Bristol, GB). NBQX is dissolved in a 5% glucose solution, pH 8.5, and injected intraperitoneally at a final concentration of 7.5

mM between 3 'and 71 days after birth and 15 mM between 8 and 21 days after birth. These injections represent doses ranging from 30

mg/kg à 60 mg/kg, qui se situent dans la plage de l'efficacité pharma- cologique. mg / kg to 60 mg / kg, which are within the range of pharmacological efficacy.

ÉLECTROPHYSIOLOGIE
Après une période d'adaptation à l'obscurité pendant 24 heures, les animaux sont anesthésiés par une injection intrapéritonéale (23 pl/g) d'éto- midate (0,2 mg/mi) et de midazolan (1,25 mg/ml), sous faible éclairement rouge. On les introduit dans une cage de Faraday, en leur immobilisant la tête dans un système de contention en forme d'U. On dilate la pupille par une application de tropicamide à 0,5 % et on anesthésie localement la cornée par une application locale de proparacaine à 0,5 %. Les paupières supérieure et inférieure sont rétractées en exophtalmie et maintiennent l'oeil ouvert. On insère une électrode de référence en acier inoxydable sous la peau de la tête de l'animal. On mesure ensuite l'ERG à l'aide d'une mèche en coton imprégnée de sérum physiologique, placée au sommet de la cornée et reliée à une électrode Ag : AgCl. Les réponses sont amplifiées et filtrées (filtres à basse fréquence de coupure de 0,1 Hz et haute fréquence de coupure de 1 000 Hz) à l'aide d'un amplificateur Universal (Gould, Texas, USA). Elles sont numérisées au moyen d'une carte Labmaster d'acquisition de données (Scientific Solutions, Solon, Ohio, USA) montée sur un ordinateur personnel IBMcompatible. Une ampoule au xénon de 150 W (Müller Instruments, Moosinning, RFA) fournit le stimulus lumineux de 2,9 log cd/m2, tel que mesuré au moyen d'un luxmètre au niveau des yeux. La durée du stimulus lumineux (300 ms) est définie par un obturateur commandé par ordinateur. ELECTRO
After a period of adaptation to darkness for 24 hours, the animals are anesthetized by an intraperitoneal injection (23 μl / g) of eto-midate (0.2 mg / mi) and of midazolan (1.25 mg / ml), under low red illumination. They are introduced into a Faraday cage, immobilizing their heads in a U-shaped restraint system. The pupil is dilated by an application of 0.5% tropicamide and the cornea is locally anesthetized by a local application of 0.5% proparacaine. The upper and lower eyelids are retracted into exophthalmos and keep the eye open. A stainless steel reference electrode is inserted under the skin of the animal's head. The ERG is then measured using a cotton wick impregnated with physiological saline, placed at the top of the cornea and connected to an Ag: AgCl electrode. The responses are amplified and filtered (filters with low cut-off frequency of 0.1 Hz and high cut-off frequency of 1000 Hz) using a Universal amplifier (Gould, Texas, USA). They are digitized using a Labmaster data acquisition card (Scientific Solutions, Solon, Ohio, USA) mounted on an IBMcompatible personal computer. A 150 W xenon bulb (Müller Instruments, Moosinning, RFA) provides the light stimulus of 2.9 log cd / m2, as measured by means of a luxmeter at eye level. The duration of the light stimulus (300 ms) is defined by a computer-controlled shutter.

On mesure les ERG sur un oeil par souris et l'expérimentateur ignore quelle souris a reçu des injections témoins ou des injections de NBQX. ERGs are measured on one eye per mouse and the experimenter does not know which mouse received control injections or NBQX injections.

IMMUNOMARQUAGE ET COMPTAGE DE BÂTONNETS
Les animaux sont sacrifiés au moyen d'une dose excessive de pentobarbital immédiatement après les enregistrements d'ERG. On retire les cupules optiques et on les fixe pendant 2 heures dans du formaldéhyde à 4 % avec une solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate (STP) à pH 7,4. IMMUNOTARKING AND COUNTING STICKS
Animals are sacrificed with an overdose of pentobarbital immediately after ERG registrations. The optical cups are removed and fixed for 2 hours in 4% formaldehyde with a phosphate-buffered sodium chloride solution (STP) at pH 7.4.

On sépare les rétines des cupules optiques postérieures. Elles sont rincées dans de la STP, perméabilisées pendant 5 minutes dans de la STP contenant 0,1 % de Triton X-100, puis mises à incuber pendant 20 minutes dans du tampon de The retinas are separated from the posterior optic cups. They are rinsed in STP, permeabilized for 5 minutes in STP containing 0.1% Triton X-100, then incubated for 20 minutes in buffer of

blocage (STP contenant 0, 1 % d'albumine de sérum bovin, 0, 1 % de Tween 20 et 0, 1 % d'azoture de sodium. On les met ensuite à incuber pendant 1 heure avec un anticorps anti-bâtonnet rho-4D2 (10 ug/mi) qui colore spécifiquement les photorécepteurs de bâtonnets, on les lave et on les immerge pendant 1 heure dans de l'antisérum de chèvre anti-lgG de souris couplé au rouge Texas (Jackson laboratories, West Grove, PA, USA). Après les avoir bien lavées, on monte à plat les rétines dans une solution à 50 % de STPglycérol (1 : 1), les photorécepteurs tournés vers le haut, et on les examine à l'aide d'un microscope à épifluorescence Nikon Optiphot 2. blocking (STP containing 0.1% bovine serum albumin, 0.1% Tween 20 and 0.1% sodium azide. They are then incubated for 1 hour with anti-rod antibody rho- 4D2 (10 ug / mi) which specifically stains the photoreceptors of rods, they are washed and immersed for 1 hour in goat anti-mouse IgG antiserum coupled to Texas red (Jackson laboratories, West Grove, PA, After having washed them well, the retinas are mounted flat in a 50% solution of STPglycerol (1: 1), the photoreceptors facing upwards, and they are examined using an epifluorescence microscope. Nikon Optiphot 2.

On évalue les bâtonnets immunomarqués en utilisant une méthode stéréologique permettant un échantillonnage impartial (Mohand, 1998). On choisit 120 champs de 8 000, um2 sur toute la surface de la rétine, en utilisant un encodeur à étages et un procédé aléatoire systématique. Les champs sont examinés au moyen d'une caméra à affichage graphique en couleurs Sony Trinitron et numérisés à l'aide du logiciel Automator pour Windows, fourni par Biocom (Lyon, France). Dans chaque champ, on compte les cellules dans deux grilles rectangulaires impartiales de 900/vm engendrées par le logiciel. The immunostained rods are evaluated using a stereological method allowing impartial sampling (Mohand, 1998). 120 fields of 8000, um2 are chosen over the entire surface of the retina, using a stepped encoder and a systematic random process. Fields are examined using a Sony Trinitron color graphic display camera and scanned using Automator software for Windows, supplied by Biocom (Lyon, France). In each field, the cells are counted in two impartial rectangular grids of 900 / vm generated by the software.

On évalue ensuite pour toute la surface rétinienne (9, 7 mm2 au 22e jour après la naissance) le nombre total de bâtonnets dans toute la rétine, qui est obtenu à l'aide d'un système d'analyse d'image (Optiscan, Apple Computer, Cupertino, CA, USA). The total number of rods in the entire retina is then evaluated for the entire retinal surface (9.7 mm 2 at the 22nd day after birth), which is obtained using an image analysis system (Optiscan, Apple Computer, Cupertino, CA, USA).

ÉTUDES HISTOMORPHOLOGIQUES
Le 22e jour après la naissance, les animaux sont sacrifiés par une dose excessive de pentobarbital. L'énucléation est pratiquée aisément et les yeux sont fixés dans du formaldéhyde à 10 % et traités pour l'inclusion dans de la paraffine. On prépare des coupes transversales (4 m d'épaisseur) dans la paraffine, comprenant le nerf optique, et on les colore à l'hématoxylinephloxine-safran. On utilise pour l'analyse des coupes incluant le nerf optique et la rétine jusqu'à l'orra serrati. Des images des coupes observées sous un grossissement de 40 x (microscope NIKON UFXDX) sont prises au moyen d'une caméra CCD (à couplage de charges) et numérisées sur un écran d'ordinateur (Macintosh LCIICi, Apple) à l'aide de la carte Optiscan. On obtient de même une image d'une cellule de Neubauer (carré de 50 um de HISTOMORPHOLOGICAL STUDIES
On the 22nd day after birth, the animals are sacrificed by an excessive dose of pentobarbital. Enucleation is easily performed and the eyes are fixed in 10% formaldehyde and treated for inclusion in paraffin. Cross sections (4 m thick) are prepared in the paraffin, comprising the optic nerve, and they are stained with hematoxylinphloxin-saffron. We use for the analysis of sections including the optic nerve and the retina to the orra serrati. Images of the sections observed under a magnification of 40 x (NIKON UFXDX microscope) are taken using a CCD camera (charge coupled) and digitized on a computer screen (Macintosh LCIICi, Apple) using the Optiscan card. We also obtain an image of a Neubauer cell (50 μm square of

côté) et on la superpose sur les images de rétine en utilisant le logiciel Optilab (Graftek, Voisins Le Bretonnaux, France). side) and overlay it on the retina images using Optilab software (Graftek, Voisins Le Bretonnaux, France).

En tenant compte des études morphologiques précédentes dans ce modèle, montrant que la perte cellulaire est beaucoup plus rapide dans la rétine postérieure (Carter-Dawson), on choisit la rétine péripapillaire, car elle manifeste la plus faible variabilité en ce qui concerne épaisseur de la rétine et nombre de photorécepteurs. Cette zone est analysée quantitativement sur une longueur de 125 um sur les deux côtés horizontaux et à 50 pom du nerf optique. On évalue les paramètres suivants : nombres de noyaux cellulaires dans les couches nucléaires interne et externe (INL, ONL). Taking into account previous morphological studies in this model, showing that cell loss is much faster in the posterior retina (Carter-Dawson), we choose the peripapillary retina, because it manifests the lowest variability with regard to thickness of the retina and number of photoreceptors. This area is quantitatively analyzed over a length of 125 µm on the two horizontal sides and 50 µm from the optic nerve. The following parameters are evaluated: numbers of cell nuclei in the internal and external nuclear layers (INL, ONL).

ANALYSE STATISTIQUE
Pour des comparaisons de souris rd témoins et de souris rd traitées au NBQX, on effectue une analyse de différences en utilisant la méthode paramétrique du test de Student pour des séries non appariées pour une variable : c'est-à-dire les nombres de cellules nucléaires internes et de photorécepteurs par coupe et le nombre de bâtonnets immunomarqués par rétine. On utilise le test non paramétrique de Mann-Whitney pour les comparaisons d'amplitudes d'ondes a et b sur l'EPG chez les souris ri témoins et les souris rd traitées. STATISTICAL ANALYSIS
For comparisons of control rd mice and rd mice treated with NBQX, a difference analysis is carried out using the parametric method of the Student test for unpaired series for a variable: that is to say the numbers of cells. internal nuclear and photoreceptor per section and the number of immunostained rods per retina. The non-parametric Mann-Whitney test is used for the comparison of amplitudes of waves a and b on the EPG in the control ri mice and the treated rd mice.

Toutes les données sont exprimées par la moyenne : erreur type de la moyenne (e. t. m.).All data are expressed as the mean: standard error of the mean (e. T. M.).

Claims

1. Use of a glutamate receptor antagonist in the manufacture of a medicament for the treatment of retinal degeneration.

2. Use according to claim 1, characterized in that said glutamate receptor antagonist is an AMPA / kainate type glutamate receptor antagonist, in particular an AMPA receptor antagonist and in particular also a kainate receptor antagonist.

3. Use according to claim 1, characterized in that said retinal degeneration is chosen from pigmentary retinitis and degeneration of photoreceptors.

4. Use according to claim 1, characterized in that said glutamate receptor antagonist is NBQX (6-nitro-7-sulfamoylbenzo-quinoxaline-2, 3-dione).

5. Use according to claim 1, characterized in that said medicament is intended for local ocular application, systemic administration and in particular intravitreal administration.

6. Use according to claim 1, characterized in that said degeneration means the degeneration of photoreceptors.