FR2822234A1

FR2822234A1 - Determining local structural parameters of molecules, useful e.g. for detecting hybridization of nucleic acid, from changes in excitonic coupling between chromophores

Info

Publication number: FR2822234A1
Application number: FR0103478A
Authority: FR
Inventors: Serena Bernacchi; Yves Mely
Original assignee: Universite Louis Pasteur Strasbourg I
Current assignee: Universite Louis Pasteur Strasbourg I
Priority date: 2001-03-14
Filing date: 2001-03-14
Publication date: 2002-09-20
Anticipated expiration: 2021-03-14
Also published as: FR2822234B1

Abstract

Determining local structural parameters (A) of a molecule (I), or of two molecules, (I) and (II), that interact structurally, particularly biochemical or pharmacological compounds, is new. Determining local structural parameters (A) of a molecule (I), or of two molecules, (I) and (II), that interact structurally, particularly biochemical or pharmacological compounds, is new. Excitonic coupling (EC) between two markers, either both on (I) or one each on (I) and (II), is measured: (i) where the molecules are in a first physicochemical state with a defined orientation and spacing between the markers; and (ii) in at least one other state where orientation and spacing differ from those in (i). In at least one state the spacing between markers is over 1 nm and in at least one other it is less than 1 nm. The parameters are then deduced from these measurements.

Description

DESCRIPTION
La présente invention concerne le domaine de la biochimie ou de la biologie moléculaire et plus particulièrement celui des méthodes d'analyses de structures tridimensionnelles de substances biochimiques (ou similaires) seules ou en interaction éventuelle avec des agents extérieurs. DESCRIPTION
The present invention relates to the field of biochemistry or molecular biology and more particularly that of methods of analysis of three-dimensional structures of biochemical substances (or the like) alone or in possible interaction with external agents.

Elle a pour objet un procédé de détermination locale de paramètres structuraux de telles substances, reposant sur l'utilisation du couplage excitonique comme sonde hyper-sensible de l'ouverture ou de la déformation de ces substances marquées par deux marqueurs ou chromophores. Elle a également comme objet différentes utilisations du procédé, par exemple, pour détecter des modifications structurales de substances telles que l'ADN, l'ARN... It relates to a process for local determination of structural parameters of such substances, based on the use of exciton coupling as a hyper-sensitive probe for the opening or deformation of these substances marked by two markers or chromophores. It also has as object various uses of the process, for example, to detect structural modifications of substances such as DNA, RNA ...

Les substances qui peuvent être employées dans ces analyses ne se limitent toutefois pas à ces cas et peuvent être très variées incluant notamment des molécules chimiques (études stéréochimiques, étude de catalyseurs, de complexants, de macromolécules...), des protéines, des molécules biologiquement ou pharmacologiquement actives... The substances which can be used in these analyzes are not however limited to these cases and can be very varied including in particular chemical molecules (stereochemical studies, study of catalysts, complexing agents, macromolecules ...), proteins, molecules biologically or pharmacologically active ...

L'invention est particulièrement adaptée pour la réalisation d'études structurales portant sur des substances telles que notamment les acides nucléiques, les oligonucléotides ou les phospholipides. The invention is particularly suitable for carrying out structural studies relating to substances such as in particular nucleic acids, oligonucleotides or phospholipids.

Une tâche courante dans la recherche en chimie ou en biochimie consiste à déterminer les structures dans l'espace adoptées par les molécules étudiées ainsi que l'étude des effets que peuvent avoir certaines interactions desdites molécules avec leur environnement (variation de la température, du pH, nature du solvant, ajout de réactifs...). A common task in research in chemistry or biochemistry consists in determining the structures in space adopted by the molecules studied as well as the study of the effects that certain interactions of said molecules can have with their environment (variation of temperature, pH , nature of the solvent, addition of reagents ...).

Ainsi, par exemple, il peut être très utile de connaître le mode d'interaction d'une protéine spécifique avec une séquence nucléique cible donnée, notamment pour en comprendre les mécanismes d'action et favoriser ou inhiber lesdites interactions, par exemple pour la réalisation d'un médicament bien précis. Thus, for example, it can be very useful to know the mode of interaction of a specific protein with a given target nucleic sequence, in particular to understand the mechanisms of action and to favor or inhibit said interactions, for example for carrying out of a specific drug.

Pour réaliser cette tâche, il existe actuellement un procédé utilisant des molécules dites balises (molecular beacons en anglais). To achieve this task, there is currently a process using so-called molecular beacons.

Ces molécules, dont le mode de fonctionnement précis sera décrit plus en détail ultérieurement, présentent une structure dite tigeboucle constituée par une séquence de nucléotides (A, T, C, G) formant, These molecules, the precise mode of operation of which will be described in more detail later, have a structure known as a stem-loop constituted by a sequence of nucleotides (A, T, C, G) forming,

d'une part la boucle, et dont les deux extrémités formant la tige sont appariées par complémentarité des bases (A-T, T-A, G-C et C-G) formant la séquence. L'une des extrémités de la tige porte un fluorophore et l'autre un groupement d'inhibition ou d'extinction (quencher en anglais) dudit fluorophore. on the one hand, the loop, and the two ends of which form the rod are paired by complementarity of the bases (A-T, T-A, G-C and C-G) forming the sequence. One end of the rod carries a fluorophore and the other an inhibition or extinction group (quencher in English) of said fluorophore.

La séquence de la tige maintient le fluorophore et le groupement extincteur proches l'un de l'autre de sorte que la fluorescence du fluorophore est éteinte par le groupement d'extinction. The stem sequence keeps the fluorophore and the extinguisher group close together so that the fluorescence of the fluorophore is quenched by the quenching group.

La séquence de la boucle est complémentaire de celle de la cible. Ainsi, lorsque ladite molécule, qui agit comme une sonde, localise sa cible, ladite boucle s'hybride avec ladite cible. The sequence of the loop is complementary to that of the target. Thus, when said molecule, which acts as a probe, locates its target, said loop hybridizes with said target.

Ceci entraîne à son tour une ouverture de la tige et par conséquent, l'éloignement du fluorophore du voisinage du groupement d'exctinction, permettant ainsi à la fluorescence d'apparaître et d'être mesurée de manière quantitative. En effet, la fluorescence observée est (du moins en théorie) directement proportionnelle à la quantité de séquence cible présente dans l'échantillon. This in turn leads to an opening of the rod and consequently, the distance of the fluorophore from the vicinity of the extinction group, thus allowing the fluorescence to appear and to be measured quantitatively. Indeed, the fluorescence observed is (at least in theory) directly proportional to the quantity of target sequence present in the sample.

Des expériences effectuées par le passé ont montré que grâce à cette structure boucle/tige, les balises moléculaires présentent une spécificité plus élevée pour leurs cibles que les sondes oligonucléotidiques linéaires connues (Tyagi et al., 1998.). Experiments carried out in the past have shown that, thanks to this loop / rod structure, the molecular beacons have a higher specificity for their targets than the known linear oligonucleotide probes (Tyagi et al., 1998.).

L'utilisation de balises multicolores et la détection simultanée de différentes cibles dans le même échantillon ont également été rendues possible avec la technique susvisée. The use of multicolored beacons and the simultaneous detection of different targets in the same sample have also been made possible with the abovementioned technique.

Toutefois, la mise en oeuvre de procédés faisant intervenir de telles balises moléculaires présente certaines difficultés, en particulier dans l'analyse finale des résultats. Ces difficultés peuvent notamment résulter de l'interaction des protéines avec le fluorophore, par exemple, avec la rhodamine 6G habituellement utilisée. En effet, ces interactions ont pour effet de diminuer de manière importante la fluorescence de celle-ci. However, the implementation of methods involving such molecular beacons presents certain difficulties, in particular in the final analysis of the results. These difficulties can in particular result from the interaction of proteins with the fluorophore, for example, with the rhodamine 6G usually used. Indeed, these interactions have the effect of significantly reducing the fluorescence thereof.

Une substitution de la rhodamine 6G par d'autres fluorophores comme la tétraméthylrhodamine ou la fluorescéine n'a pas permis de résoudre les problèmes rencontrés. Substitution of rhodamine 6G with other fluorophores such as tetramethylrhodamine or fluorescein did not resolve the problems encountered.

Avec le procédé connu, il est par conséquent souvent impossible de tirer des conclusions quant aux modifications structurales

résultant des interactions examinées, par exemple d'une protéine sur la séquence nucléique étudiée. With the known method, it is therefore often impossible to draw conclusions as to the structural modifications.

resulting from the interactions examined, for example from a protein on the nucleic sequence studied.

De plus, les balises moléculaires et les techniques connues qui les font intervenir, présentent plusieurs autres inconvénients : - elles sont limitées aux acides nucléiques en tige-boucle dont la tige présente un nombre limité de paires de bases, - elles nécessitent la mise en oeuvre de la spectroscopie de fluorescence, relativement complexe, coûteuse et conduisant souvent à des artéfacts. En effet, la fluorescence est extrêmement sensible à l'environnement. De ce fait, un agent extérieur agissant sur une séquence nucléique donnée peut modifier la fluorescence du fluorophore en interagissant avec celui-ci. Il en résulte que l'augmentation de fluorescence suite à l'éloignement de l'inhibiteur peut être compensée par la diminution de fluorescence résultant de l'interaction de l'agent extérieur avec le fluorophore, ce qui peut conduire à des conclusions erronées. In addition, molecular tags and the known techniques which involve them have several other drawbacks: - they are limited to nucleic acids in stem-loop whose stem has a limited number of base pairs, - they require implementation fluorescence spectroscopy, relatively complex, expensive and often leading to artifacts. Indeed, fluorescence is extremely sensitive to the environment. Therefore, an external agent acting on a given nucleic sequence can modify the fluorescence of the fluorophore by interacting with it. As a result, the increase in fluorescence following the removal of the inhibitor can be compensated by the decrease in fluorescence resulting from the interaction of the external agent with the fluorophore, which can lead to erroneous conclusions.

- elles ne permettent de détecter facilement que les transition du type tout ou wien entre une tige ouverte ou fermée . Par contre, une ouverture ou une déformation partielle de la tige n'entraînera qu'un écartement réduit des fluorophores et donc, qu'une faible variation de fluorescence qui sera difficilement détectable. - They only allow easy detection of all or wien type transitions between an open or closed rod. On the other hand, an opening or a partial deformation of the rod will only cause a reduced spacing of the fluorophores and therefore, only a slight variation in fluorescence which will be difficult to detect.

La présente invention a pour but de pallier au moins certains des inconvénients précités. The present invention aims to overcome at least some of the aforementioned drawbacks.

A cette fin, elle a pour objet un procédé de détermination locale de paramètres structuraux d'une molécule ou de deux molécules destinées à interagir structurallement, en particulier de molécules biochimiques ou pharmacologiques, caractérisé en ce qu'il consiste à : - mesurer au moins une variation du couplage excitonique existant entre deux marqueurs présents sur une même molécule dont on cherche à déterminer lesdits paramètres structuraux ou entre deux marqueurs présents sur deux molécules distinctes destinées à interagir structurallement et dont on cherche à déterminer les paramètres structuraux, la ou les mesures du couplage excitonique étant réalisées lorsque la ou les molécules passent d'un premier état physico-chimique dans lequel les marqueurs ont une orientation et un éloignement définis à au moins un second état différent dans lequel l'orientation et l'éloignement diffèrent de ceux du premier état, au moins un desdits premier ou second états présentant un éloignement desdits marqueurs supérieur à 1 nm et au moins un desdits premier ou second états présentant un éloignement desdits marqueurs inférieur à 1 nm, puis, To this end, it relates to a method for local determination of structural parameters of a molecule or two molecules intended to interact structurally, in particular of biochemical or pharmacological molecules, characterized in that it consists in: - measuring at least a variation of the excitonic coupling existing between two markers present on the same molecule for which one seeks to determine said structural parameters or between two markers present on two distinct molecules intended for interacting structurally and for which one seeks to determine the structural parameters, the measurement or excitonic coupling being carried out when the molecule or molecules pass from a first physicochemical state in which the markers have a defined orientation and a distance to at least a second different state in which the orientation and the distance differ from those of the first state, at least one of said first or second é states having a distance from said markers greater than 1 nm and at least one of said first or second states having a distance from said markers less than 1 nm, then,

- déduire les paramètres recherchés à partir des mesures précédemment effectuées. - deduce the parameters sought from the measurements previously carried out.

Elle a également pour objet différentes utilisations du procédé, notamment pour l'analyse de modifications structurales locales de molécules spécifiques telles que l'ADN, l'ARN... It also relates to different uses of the method, in particular for the analysis of local structural modifications of specific molecules such as DNA, RNA ...

Les inventeurs ont découvert de manière inattendue et surprenante, lors d'études en parallèle des spectres d'absorption desdites molécules balises, la présence de modifications importantes des spectres d'absorption des chromophores sous l'effet de l'ajout d'une protéine. Ce point a été à l'origine de la mise en évidence du couplage excitonique dans différentes molécules, en particulier dans les séquences nucléiques doublement marquées. The inventors have unexpectedly and surprisingly discovered, during studies in parallel of the absorption spectra of said tag molecules, the presence of significant modifications of the absorption spectra of chromophores under the effect of the addition of a protein. This point was at the origin of the demonstration of excitonic coupling in different molecules, in particular in the doubly labeled nucleic sequences.

L'objet de la présente invention constitue un outil supplémentaire par rapport aux produits existant sur le marché. Il confère également des potentialités nouvelles pour l'utilisation des balises moléculaires susmentionnées. The object of the present invention constitutes an additional tool compared to the products existing on the market. It also gives new potentials for the use of the aforementioned molecular beacons.

L'invention sera mieux comprise grâce à la description ciaprès, qui se rapporte à un mode de réalisation préféré, donné à titre d'exemple non limitatif, et expliqué avec référence aux dessins schématiques annexés, dans lesquels : la figure 1 est un schéma simplifié du mécanisme de fonctionnement d'un procédé connu de l'état de la technique utilisant des balises moléculaires, la figure 2 représente des exemples de structures de tigesboucles utilisées dans le cadre de l'invention, la figure 3 représente des exemples de spectres d'absorption utilisés dans la présente invention, la figure 4 représente une courbe illustrant la dépendance du couplage excitonique de la température, la figure 5 représente des exemples de tracés de spectres d'absorption d'échantillons additionnés d'un exemple d'intercalant et d'une protéine utilisés dans le cadre de la présente invention, et la figure 6 représente des exemples de tracés de spectres d'absorption d'échantillons additionnés d'un exemple de protéine utilisée dans le cadre de la présente invention. The invention will be better understood from the following description, which relates to a preferred embodiment, given by way of nonlimiting example, and explained with reference to the appended schematic drawings, in which: FIG. 1 is a simplified diagram of the operating mechanism of a method known from the state of the art using molecular beacons, FIG. 2 represents examples of rod-loop structures used in the context of the invention, FIG. 3 represents examples of spectra of absorption used in the present invention, FIG. 4 represents a curve illustrating the dependence of the excitonic coupling on the temperature, FIG. 5 represents examples of plots of absorption spectra of samples added with an example of intercalant and of a protein used in the context of the present invention, and FIG. 6 represents examples of plots of sample absorption spectra We added an example of protein used in the context of the present invention.

Comme expliqué dans la partie introductive, des constructions nucléiques, appelées molecular beacons (balises moléculaires) ont déjà As explained in the introductory part, nucleic constructions, called molecular beacons (molecular beacons) have already

été mises au point pour rapporter la présence de séquence nucléiques spécifiques et pour mettre en évidence certaines modifications de structures. have been developed to report the presence of specific nucleic acid sequences and to highlight certain structural modifications.

Ces constructions correspondent à des séquences en tige-boucle dont les extrémités couramment désignées par les positions dites 5' et 3' dans le vocabulaire spécifique aux séquences nucléiques sont occupées par un fluorophore et un groupement inhibiteur non fluorescent, par exemple un inhibiteur connu sous le nom de dabcyl et de formule

These constructions correspond to stem-loop sequences whose ends commonly designated by the positions known as 5 ′ and 3 ′ in the vocabulary specific to nucleic sequences are occupied by a fluorophore and a non-fluorescent inhibitor group, for example an inhibitor known under the dabcyl name and formula

Le fonctionnement de ces molécules balises est schématiquement représenté à la figure 1. Lorsque la tige 1 est fermée, le fluorophore 2 représenté par un cercle blanc est proche du groupement inhibiteur 3 schématisé par un cercle noir. Il en résulte que la fluorescence du fluorophore 2 est fortement éteinte. The operation of these tag molecules is schematically represented in FIG. 1. When the rod 1 is closed, the fluorophore 2 represented by a white circle is close to the inhibitor group 3 schematized by a black circle. As a result, the fluorescence of fluorophore 2 is strongly quenched.

A l'inverse, lorsque la boucle l'de cette construction s'hybride avec une séquence complémentaire (cible 4), il en résulte une ouverture de la tige 1 qui éloigne le fluorophore 2 du groupement inhibiteur 3. Il s'en suit une restauration de la fluorescence dudit fluorophore 2. Les constructions du type tige 1/boucle 1'précitées ont été mises au point pour reporter la présence de séquences nucléiques spécifiques in vitro et in vivo.

Conversely, when the ′ loop of this construction hybridizes with a complementary sequence (target 4), this results in an opening of the rod 1 which moves the fluorophore 2 away from the inhibitor group 3. There follows a restoration of the fluorescence of said fluorophore 2. The abovementioned rod 1 / loop 1 constructs have been developed to report the presence of specific nucleic sequences in vitro and in vivo.

Pour cela, on utilise des balises moléculaires dont la boucle l' présente une séquence complémentaire de la séquence nucléique (cible 4) dont on souhaite mettre en évidence la présence. Il est à noter que dans les balises moléculaires, la tige 1 doit être préférentiellement constituée d'environ 5 à 7 paires de bases. For this, molecular beacons are used, the loop of which presents a sequence complementary to the nucleic sequence (target 4) of which it is desired to demonstrate the presence. It should be noted that in the molecular tags, the rod 1 must preferably be made up of approximately 5 to 7 base pairs.

Cette limite vient du fait qu'en absence de séquence complémentaire à la boucle l', la tige 1 doit être suffisamment stable, donc suffisamment longue, pour maintenir le fluorophore 2 à proximité du groupement inhibiteur 3, c'est-à-dire à une distance d'environ quelques angström ou dixièmes de nanomètres. This limit comes from the fact that in the absence of a sequence complementary to the loop l ′, the rod 1 must be sufficiently stable, therefore sufficiently long, to maintain the fluorophore 2 near the inhibitor group 3, that is to say at a distance of about a few angstroms or tenths of a nanometer.

A l'inverse, lors de la mise en présence de la séquence complémentaire (cible 4) de la boucle 1', la tige 1 doit être suffisamment courte pour ne pas constituer un frein pour l'hybridation de la séquence de ladite boucle l'avec sa séquence complémentaire de la cible 4. Conversely, when the complementary sequence (target 4) of the loop 1 ′ is brought into contact, the rod 1 must be short enough not to constitute a brake for the hybridization of the sequence of the said loop l ′ with its sequence complementary to target 4.

Le procédé selon l'invention a également été mis en oeuvre pour des substrats protéiques d'enzymes. Ces substrats constitués par de petits peptides ont été marqués en deux endroits par deux sondes de fluorescence. En présence de l'enzyme de clivage, le peptide se rompt et fait disparaître le signal de fluorescence. Cette technique permet dans ce cas de mettre en évidence, la présence de la protéase. The process according to the invention has also been used for protein substrates of enzymes. These substrates consisting of small peptides were labeled in two places by two fluorescence probes. In the presence of the cleavage enzyme, the peptide ruptures and makes the fluorescence signal disappear. In this case, this technique makes it possible to demonstrate the presence of the protease.

Conformément à la présente invention, le procédé de détermination locale de paramètres structuraux d'une molécule ou de deux molécules destinées à interagir structurallement, en particulier de molécules biochimiques ou pharmacologiques, caractérisé en ce qu'il consiste à : - mesurer au moins une variation du couplage excitonique existant entre deux marqueurs présents sur une même molécule dont on cherche à déterminer lesdits paramètres structuraux ou entre deux marqueurs présents sur deux molécules distinctes destinées à interagir structurallement et dont on cherche à déterminer les paramètres structuraux, la ou les mesures du couplage excitonique étant réalisées lorsque la ou les molécules passent d'un premier état physico-chimique dans lequel les marqueurs ont une orientation et un éloignement définis à au moins un second état différent dans lequel l'orientation et l'éloignement diffèrent de ceux du premier état, au moins un desdits premier ou second états présentant un éloignement desdits marqueurs supérieur à 1 nm et au moins un desdits premier ou second états présentant un éloignement desdits marqueurs inférieur à 1 nm, puis, - déduire les paramètres recherchés à partir des mesures précédemment effectuées. In accordance with the present invention, the method for local determination of structural parameters of a molecule or of two molecules intended to interact structurally, in particular of biochemical or pharmacological molecules, characterized in that it consists in: - measuring at least one variation of the excitonic coupling existing between two markers present on the same molecule for which one seeks to determine said structural parameters or between two markers present on two distinct molecules intended to interact structurally and for which one seeks to determine the structural parameters, the measure (s) of excitonic coupling being produced when the molecule (s) pass from a first physicochemical state in which the markers have a defined orientation and distance to at least one second different state in which the orientation and the distance differ from those of the first state, at least one of said first or second states having a distance from said markers greater than 1 nm and at least one of said first or second states having a distance from said markers less than 1 nm, then, - deducing the parameters sought from the measurements previously carried out.

Dans un premier mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - marquer localement une même molécule, au niveau de la portion d'espace pour laquelle on veut déterminer les paramètres structuraux de ladite molécule, par deux marqueurs proches, - établir un premier spectre d'absorption de la molécule ainsi marquée et qui se trouve dans un premier état physico-chimique donné, - modifier ledit premier état physico-chimique précité pour faire passer la molécule marquée dans un second état physico-chimique donné différent dudit premier état en créant ainsi une variation du couplage excitonique existant entre les deux marqueurs, In a first embodiment, the method according to the invention is characterized in that it comprises the steps consisting in: - locally marking the same molecule, at the level of the portion of space for which it is desired to determine the structural parameters of said molecule, by two close markers, - establish a first absorption spectrum of the molecule thus labeled and which is in a first given physicochemical state, - modify said first physicochemical state mentioned above to make the labeled molecule pass into a second given physicochemical state different from said first state, thereby creating a variation in the excitonic coupling existing between the two markers,

- établir un second spectre d'absorption de la molécule marquée se trouvant dans ledit second état physico-chimique, - comparer les premier et second spectres précédemment obtenus, et - en déduire les paramètres recherchés. - establish a second absorption spectrum of the labeled molecule found in said second physicochemical state, - compare the first and second spectra previously obtained, and - deduce the parameters sought.

Dans une seconde variante, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - marquer localement deux molécules distinctes, au niveau de la portion d'espace pour laquelle on veut déterminer les paramètres structuraux de l'une ou l'autre molécule, - établir un premier spectre d'absorption de l'une des deux molécules seule ainsi marquée et qui se trouve dans un premier état physico-chimique donné, - modifier ledit premier état physico-chimique précité pour faire passer la molécule marquée dont on a obtenu le premier spectre dans un second état physico-chimique donné différent dudit premier état en créant ainsi une variation du couplage excitonique existant entre les deux marqueurs, - établir un second spectre d'absorption de la molécule marquée se trouvant dans ledit second état physico-chimique, - comparer les premier et second spectres précédemment obtenus, et - en déduire les paramètres recherchés. In a second variant, the method according to the invention is characterized in that it comprises the steps consisting in: - locally marking two distinct molecules, at the level of the portion of space for which it is desired to determine the structural parameters of the one or the other molecule, - establish a first absorption spectrum of one of the two molecules alone, thus marked and which is in a given first physicochemical state, - modify said aforementioned first physicochemical state to pass the labeled molecule of which the first spectrum was obtained in a second given physicochemical state different from said first state, thus creating a variation of the exciton coupling existing between the two markers, - establishing a second absorption spectrum of the labeled molecule being in said second physicochemical state, - compare the first and second spectra previously obtained, and - deduce the parameters sought.

Le principe théorique de base du procédé selon l'invention est schématiquement le suivant. Si on appelle A et B, deux marqueurs présents sur la même molécule ou sur deux molécules différentes destinées à interagir, le procédé selon l'invention consiste essentiellement à mesurer la différence en nombre d'ondes Av enke les maxima d'absorbance des marqueurs A et B dans l'exciton et la différence en nombre d'ondes Avo entre les maxima d'absorbance des marqueurs A et B lorsqu'ils ne sont pas en interaction. The basic theoretical principle of the method according to the invention is schematically the following. If A and B are called two markers present on the same molecule or on two different molecules intended to interact, the method according to the invention essentially consists in measuring the difference in number of waves Av enke the absorbance maxima of markers A and B in the exciton and the difference in number of Avo waves between the absorbance maxima of markers A and B when they are not interacting.

A partir de ces mesures, la distance R entre les deux marqueurs A et B est calculée préférentiellement d'après la formule :

From these measurements, the distance R between the two markers A and B is preferably calculated according to the formula:

où n est l'indice de réfraction du solvant, h la constante de Planck, c la vitesse de la lumière, Eo la permittivité du vide et, et g les modules respectifs des dipoles de transition des marqueurs A et B.

where n is the refractive index of the solvent, h the Planck constant, c the speed of light, Eo the permittivity of the vacuum and, and g the respective modules of the transition dipoles of markers A and B.

Le facteur d'orientation Kdépend de l'angle entre les dipoles de transition des marqueurs A et B ainsi que des angles entre ces dipoles et le vecteur rayon qui connecte les deux dipoles. Ce facteur d'orientation se déduit généralement de manière qualitative en comparant les déplacements des spectres des marqueurs A et B entre l'exciton et la situation où lesdits marqueurs A et B ne sont pas en interaction. The orientation factor Kdepends on the angle between the transition dipoles of markers A and B as well as the angles between these dipoles and the radius vector which connects the two dipoles. This orientation factor is generally deduced qualitatively by comparing the displacements of the spectra of markers A and B between the exciton and the situation where said markers A and B are not in interaction.

Dans la plupart des cas analysés par les inventeurs, une géométrie de type H a été observée, ce qui correspond au cas où K = 1. In most of the cases analyzed by the inventors, an H-type geometry was observed, which corresponds to the case where K = 1.

Selon une caractéristique avantageuse, le passage du premier état physico-chimique au second état physico-chimique est obtenu en modifiant la température de la ou des molécules marquées. According to an advantageous characteristic, the transition from the first physico-chemical state to the second physico-chemical state is obtained by modifying the temperature of the labeled molecule (s).

Le procédé selon l'invention peut donc être caractérisé en ce que l'on augmente la température de la ou des molécules marquées, en particulier, en ce que l'on fait passer la température de la ou des molécules marquées de la température ambiante à une température supérieure à celle du point de fusion de la ou desdites molécules marquées. The process according to the invention can therefore be characterized in that the temperature of the labeled molecule (s) is increased, in particular in that the temperature of the labeled molecule (s) is increased from ambient temperature to a temperature higher than that of the melting point of said labeled molecule (s).

Sans qu'il s'agisse d'une quelconque limitation, la présente invention concerne plus particulièrement les acides nucléiques (ADN ou ARN) présentant une région en forme de double brin au niveau de ses extrémités dites extrémités 5' et 3' . Cet exemple non limitatif particulièrement intéressant sera utilisé dans la suite pour décrire plus en détail le fonctionnement de la présente invention. Without being any limitation, the present invention relates more particularly to nucleic acids (DNA or RNA) having a region in the form of a double strand at its ends, termed 5 ′ and 3 ′ ends. This particularly interesting nonlimiting example will be used in the following to describe in more detail the operation of the present invention.

En effet, si l'on marque chacune des extrémités précitées par des marqueurs ou chromophores, ceux-ci vont se trouver très proches, c'est- à-dire à quelques dixièmes de nanomètres (angström) l'un de l'autre. Indeed, if each of the aforementioned ends is marked with markers or chromophores, these will be very close, that is to say a few tenths of a nanometer (angstrom) from each other.

Les inventeurs ont découvert de manière complètement surprenante et inattendue la présence d'un couplage excitonique entre les deux chromophores qui conduit à une modification importante du spectre d'absorption de ces chromophores. Cette modification spectrale est extrêmement sensible à la proximité et à l'orientation des chromophores. The inventors have discovered, in a completely surprising and unexpected manner, the presence of an excitonic coupling between the two chromophores which leads to a significant modification of the absorption spectrum of these chromophores. This spectral modification is extremely sensitive to the proximity and orientation of the chromophores.

Il en résulte que le procédé selon l'invention dont une étape consiste à faire varier l'orientation et la distance entre les extrémités 5'et 3', par exemple en les séparant ne fût-ce que de quelques angström, It follows that the method according to the invention, one step of which consists in varying the orientation and the distance between the ends 5 ′ and 3 ′, for example by separating them even if only by a few angstroms,

entraîne une disparition du spectre d'absorption de l'exciton au profit des spectres de chacune des espèces séparées. causes the absorption spectrum of the exciton to disappear in favor of the spectra of each of the separate species.

La présente invention permet, par exemple, de mettre sélectivement en évidence un éloignement des extrémités 5'et 3'd'un acide nucléique présentant une séquence double brin à son extrémité. Cet éloignement qui se traduit par la disparition du spectre d'absorption de l'exciton permet de détecter avec une grande sensibilité une ouverture (même partielle) ou une déformation du double brin, localisée au niveau de l'extrémité de l'acide nucléique. The present invention makes it possible, for example, to selectively highlight a distancing of the 5 ′ and 3 ′ ends of a nucleic acid having a double stranded sequence at its end. This distance, which results in the disappearance of the absorption spectrum of the exciton, makes it possible to detect with great sensitivity an opening (even partial) or a deformation of the double strand, localized at the level of the end of the nucleic acid.

Le procédé de la présente invention permet donc de mettre en évidence par la simple réalisation de spectres d'absorption, l'action d'un agent extérieur (température, protéine, autre acide nucléique...) sur l'extrémité de l'acide nucléique dans la mesure où ce dernier agit sur la distance existant entre les marqueurs judicieusement disposés au niveau de la portion d'espace dans laquelle se produit le changement de structure. The process of the present invention therefore makes it possible to demonstrate, by the simple production of absorption spectra, the action of an external agent (temperature, protein, other nucleic acid, etc.) on the end of the acid. nucleic acid insofar as the latter acts on the distance existing between the markers judiciously arranged at the level of the portion of space in which the change in structure occurs.

Lorsque deux chromophores sont présents aux extrémités 5'et 3'd'une séquence double brin, ils sont de fait très proches dans l'espace (typiquement entre 5 et 10 angström, soit 0,5 à 1 nm) et capables d'interagir entre eux. Il peut alors y avoir une interaction entre les moments de transition des deux chromophores, ce qui entraîne un transfert rapide de l'excitation électronique d'un chromophore à l'autre. Ce phénomène est appelé couplage excitonique. Il en résulte une délocalisation de l'excitation sur les deux sondes. De ce fait, les propriétés spectrales (en spectroscopie d'absorption) ne correspondent plus à celles des sondes individuelles mais constituent une signature spécifique de l'exciton. Ce couplage a été mis en évidence par les inventeurs sur les séquences tige-boucle dont les structures sont données en figure 2. Selon une autre caractéristique de l'invention, les marqueurs sont des chromophores absorbant dans la gamme de longueurs d'ondes comprise entre 300 nm et 800 nm. De manière préférée, au moins un des chromophores est un groupement dabcyl. When two chromophores are present at the 5 ′ and 3 ′ ends of a double-stranded sequence, they are in fact very close in space (typically between 5 and 10 angstroms, ie 0.5 to 1 nm) and capable of interacting between them. There can then be an interaction between the transition moments of the two chromophores, which results in a rapid transfer of electronic excitation from one chromophore to another. This phenomenon is called excitonic coupling. This results in a delocalization of the excitation on the two probes. As a result, the spectral properties (in absorption spectroscopy) no longer correspond to those of the individual probes but constitute a specific signature of the exciton. This coupling has been demonstrated by the inventors on the stem-loop sequences, the structures of which are given in FIG. 2. According to another characteristic of the invention, the markers are chromophores absorbing in the range of wavelengths between 300 nm and 800 nm. Preferably, at least one of the chromophores is a dabcyl group.

De manière particulièrement préférée, au moins un des chromophores est choisi dans le groupe formé par la tétraméthylrhodamine, la 5-carboxytétraméthylrhodamine, la 6-carboxytétraméthylrhodamine, la 5- (et-6)-carboxytétraméthylrhodamine, l'ester succinimidylique de la 5- carboxytétraméthylrhodamine, l'ester succinimidylique de la 6carboxytétraméthylrhodamine, l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)carboxytétraméthylrhodamine, la rhodamine X, le sel de triéthylammonium In a particularly preferred manner, at least one of the chromophores is chosen from the group formed by tetramethylrhodamine, 5-carboxytetramethylrhodamine, 6-carboxytetramethylrhodamine, 5- (and-6) -carboxytetramethylrhodamine, the succinimidyl ester of 5-carboxytetramethylrhodamine , succinimidyl ester of 6carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester of 5- (and-6) carboxytetramethylrhodamine, rhodamine X, triethylammonium salt

de la 5-carboxy-X-rhodamine, la 6-carboxy-X-rhodamine, l'ester succinimidylique de la 5-carboxy-X-rhodamine, l'ester succinimidylique de la 6-carboxy-X-rhodamine, l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)-carboxyX-rhodamine, la tétraéthylrhodamine, l'hydroxyde d'éthanaminium-N- (9- (4- (chlorosulfonyl)-2-sulfbphényl)-6- (diéthylamino)-3H-xanthène-3ylidène)-N-éthyle, la rhodamine 110, la rhodamine 123, la rhodamine phalloidine, l'hydrochlorure de l'ester succinimidylique de la 5- (et-6) carboxyrhodamine 110, l'ester succinimidylique du trifluoroacétamide de la 5- (et-6) carboxyrhodamine 110, l'hydrochlorure de l'ester succinimidylique de l'acide 5- (et-6) amino-hexanoïque-carboxyrhodamine 110, la sulforhodamine 101, la sulforhodamine B, la sulforhodamine G, la 5-

isothiocyanato-tétraméthylrhodamine (isomère G), la 6-isothiocyanatotétraméthylrhodamine (Isomère R), la 5- (et-6)-isothiocyanato- tétraméthylrhodamine, le 9- (2, 3,6, 7,12, 13,16, 17-octahydro- 1H, 5H, 11H, 15H-xanthèno (2,3, 4-ij : 5, 6, 7-i'j')-diquinolizin-18-ium, le sel interne de 9- (2 (ou 4)- (chlorosulfbnyl)-4 (ou 2)-sulfophényl)- (2,3, 6,7, 12,13, 16, 17-octahydro-lH, 5H, llH, 15H-xanthèno (2,3, 4-ij : 5,6, 7i'j')-diquinolizin-18-ium, le sel interne de 9-[2 (ou 4) -[[[6-[2, 5-dioxo-l-

pyrrolidinyl) oxy]-6-oxohéxyl] amino] sulfbnyl]-4 (ou 2)-sulfbphényl]- 2,3, 6,7, 12,13, 16, 17-octahydro-lH, 5H, IIH, 15H-xanthèno (2,3, 4-ij : 5,6, 7i'j')-diquinolizin-18-ium, la 5- (et-6)-isothiocyanato-rhodamine-X, la rhodamine 6G, le chlorure de la rhodamine 6G, l'hydrochlorure de la 6carboxyrhodamine 6G, l'hydrochlorure de la 5-carboxyrhodamine 6G, l'ester succinimidylique de la 5-carboxyrhodamine 6G, l'ester succinimidylique de la 6-carboxyrhodamine 6G et l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)-carboxyrhodamine 6G.

of 5-carboxy-X-rhodamine, 6-carboxy-X-rhodamine, succinimidyl ester of 5-carboxy-X-rhodamine, succinimidyl ester of 6-carboxy-X-rhodamine, ester 5- (and-6) -carboxyX-rhodamine succinimidyl, tetraethylrhodamine, ethanaminium hydroxide-N- (9- (4- (chlorosulfonyl) -2-sulfbphenyl) -6- (diethylamino) -3H- xanthene-3ylidene) -N-ethyl, rhodamine 110, rhodamine 123, rhodamine phalloidine, hydrochloride of succinimidyl ester of 5- (and-6) carboxyrhodamine 110, succinimidyl ester of trifluoroacetamide of 5 - (and-6) carboxyrhodamine 110, the hydrochloride of succinimidyl ester of 5- (and-6) amino-hexanoic acid-carboxyrhodamine 110, sulforhodamine 101, sulforhodamine B, sulforhodamine G, 5-

isothiocyanato-tetramethylrhodamine (G-isomer), 6-isothiocyanatotetramethylrhodamine (R-isomer), 5- (and -6) -isothiocyanato-tetramethylrhodamine, 9- (2, 3,6, 7,12, 13,16, 17- octahydro- 1H, 5H, 11H, 15H-xantheno (2,3, 4-ij: 5, 6, 7-i'j ') - diquinolizin-18-ium, the internal salt of 9- (2 (or 4) - (chlorosulfbnyl) -4 (or 2) -sulfophenyl) - (2,3, 6,7, 12,13, 16, 17-octahydro-1H, 5H, 11H, 15H-xantheno (2,3, 4-ij : 5,6,7i'j ') - diquinolizin-18-ium, the internal salt of 9- [2 (or 4) - [[[[6- [2, 5-dioxo-l-

pyrrolidinyl) oxy] -6-oxohexyl] amino] sulfbnyl] -4 (or 2) -sulfbphenyl] - 2,3, 6,7, 12,13, 16, 17-octahydro-1H, 5H, IIH, 15H-xantheno (2,3,4-ij: 5,6,7i'j ') - diquinolizin-18-ium, la 5- (et-6) -isothiocyanato-rhodamine-X, rhodamine 6G, chloride of rhodamine 6G , 6carboxyrhodamine 6G hydrochloride, 5-carboxyrhodamine 6G hydrochloride, 5-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, 6-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester and 5- (succinimidyl ester and-6) -carboxyrhodamine 6G.

Selon une variante, les chromophores sont choisis dans le groupe formé par la fluorescéine, la 5-carboxyfluorescéine, la 6-

carboxyfluorescéine, la 5- (et-6)-carboxyfluorescéine, l'ester succinimidylique de la 5-carboxyfluorescéine, l'ester succinimidylique de la 6-carboxyfluorescéine, l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)carboxyfluorescéine, la 5- (4, 6-dichlorotriazinyl) aminofluorescéine, l'ester succinimidylique de l'acide 6- (fluorescéine-5-carboxamido) hexanoïque, l'ester succinimidylique de l'acide 6- (fluorescéine-5- (et-6)-carboxamido) hexanoïque, l'ester succinimidylique de la fluorescéine-5-EX, la 5isothiocyanato-fluorescéine, la 6-isothiocyanato-fluorescéine, la 2', 7'- difluorofluorescéine, la 5-carboxy-2', 7'-difluorofluorescéine, l'ester-5- According to a variant, the chromophores are chosen from the group formed by fluorescein, 5-carboxyfluorescein, 6-

carboxyfluorescein, 5- (and-6) -carboxyfluorescein, succinimidyl ester of 5-carboxyfluorescein, succinimidyl ester of 6-carboxyfluorescein, succinimidyl ester of 5- (and-6) carboxyfluorescein, 5 - (4, 6-dichlorotriazinyl) aminofluorescein, the succinimidyl ester of 6- (fluorescein-5-carboxamido) hexanoic acid, the succinimidyl ester of 6- (fluorescein-5- (and-6) acid - carboxamido) hexanoic acid, succinimidyl ester of fluorescein-5-EX, 5isothiocyanato-fluorescein, 6-isothiocyanato-fluorescein, 2 ', 7'- difluorofluorescein, 5-carboxy-2', 7'-difluorofluorescein, ester-5-

succinimidylique de la 2', 7'-difluorofluorescéine, l'ester-6-succinimidylique de la 2', 7'-difluorofluorescéine, la 5- (et-6)-isothiocyanato-2', 7'difluorofluorescéine, la 5- (et-6)-carboxynaphthofluorescéine, l'ester succinimidylique de la 5- (et-6)-carboxynaphthofluorescéine, l'ester succinimidylique du N, O-bis-trifluoroacétamide de la 5- (et 6-) carboxylrhodamine 110 et l'hydrochlorure de l'acide 5- (et 6-) carboxylique du 3'-hydroxy-6'-aminofluorane.

2 ', 7'-difluorofluorescein succinimidyl, 2', 7'-difluorofluorescein 2-succinimidyl ester, 5- (and-6) -isothiocyanato-2 ', 7' difluorofluorescein, 5- ( and-6) -carboxynaphthofluorescein, the succinimidyl ester of 5- (and-6) -carboxynaphthofluorescein, the succinimidyl ester of N, O-bis-trifluoroacetamide of 5- (and 6-) carboxylrhodamine 110 and hydrochloride 5- (and 6-) carboxylic acid from 3'-hydroxy-6'-aminofluorane.

Selon une autre variante, au moins un des chromophores est choisi dans le groupe formé par l'acide 4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'acide 4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3pentanoïque, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl- 4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-pentanoïque, l'acide 4, 4-difluoro-5, 7diphényl-4-bora-3 a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5, 7-diphényl-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-3-propionique, l'acide 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7-tétraméthyl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-8-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7-tétraméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-8propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (2-thiényl)-4bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (2-pyrrolyl)-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3propionique, l'acide 4, 4-difluoro-5-styryl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5-styryl-4bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (4-phényl-1, 3-butadiényl)-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-3-propionique, l'acide 6- ( (4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4adiaza-s-indacène-3-propionyl) amino) hexanoïque, l'ester succinimidylique de l'acide 6- ( (4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3propionyl) amino) hexanoïque, l'acide 4, 4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-3, 5-dipropionique, l'ester succinimidylique de l'acide 6- ( ( (4- (4, 4difluoro-5- (2-thiényl)-4-bora-3a, 4a-diaza--indacène-3yl) phénoxy) acétyl) amino) hexanoïque, l'ester succinimidylique de l'acide 6- ( (4, 4-difluoro-l, 3-diméthyl-5- (4-méthoxyphényl)-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-2-propionyl) amino) hexanoïque, le sel sodé de l'ester sulfosuccinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4adiaza-s-indacène-3-propionique, le sel de triéthylammonium de l'ester According to another variant, at least one of the chromophores is chosen from the group formed by 4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl ester of 4,4-difluoro-5,7 -dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3pentanoic acid, succinimidyl ester of 4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl- 4-bora-3a, 4a-diaza-s -indacene-3-pentanoic acid, 4, 4-difluoro-5, 7-diphenyl-4-bora-3 a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, succinimidyl ester of acid 4, 4 -difluoro-5, 7-diphenyl-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacene-3-propionic, 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-8-propionic acid, succinimidyl ester of 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene- 8propionic, succinimidyl ester of 4, 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propi onic, succinimidyl ester of 4, 4-difluoro-5- (2-pyrrolyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3propionic, 4, 4-difluoro-5 acid -styryl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3propionic acid, succinimidyl ester of 4, 4-difluoro-5-styryl-4bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3 -propionic, succinimidyl ester of 4, 4-difluoro-5- (4-phenyl-1, 3-butadienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-sindacene-3-propionic, 6- ((4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4adiaza-s-indacene-3-propionyl) amino) hexanoic acid, succinimidyl ester 6- ((4, 4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3propionyl) amino) hexanoic acid 4, 4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacene -3,5-dipropionic acid succinimidyl ester 6- ((((4- (4, 4difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza - indacene-3yl) phenoxy) acetyl) amino) hexanoic acid, succinimidyl ester 6- ((4, 4-difluoro-1,3, dimethyl-5- (4-methoxyphenyl) -4-bora-3a) , 4a-diaza-sindacene-2-propionyl) amino) hexanoic acid, the sodium salt of the sulfosuccinimidyl ester of 4, 4-difluor-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4adiaza-s-indacene -3-propionic acid, the triethylammonium salt of the ester

succinimidylique de l'acide N- (4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl- 4-bora-3a, 4adiaza-s-indacène-3-propionyl) cystéique, l'acide 2, 6-dibromo-4, 4-difluoro- 5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique, l'ester succinimidylique de l'acide 2, 6-dibromo-4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique et l'ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5-phényl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique. Les molécules de ce dernier groupe font partie de la famille de composés connue sous la dénomination commerciale bodipy (marque déposée) de la société MOLECULAR PROBES INC.

succinimidylic acid N- (4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl- 4-bora-3a, 4adiaza-s-indacene-3-propionyl) cysteic, 2, 6-dibromo-4, 4 -difluoro- 5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic, succinimidyl ester of 2,6-dibromo-4,4-difluoro-5,7 -dimethyl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid and succinimidyl ester of 4, 4-difluoro-5-phenyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s acid -indacène-3-propionic acid. The molecules of this latter group are part of the family of compounds known under the trade name bodipy (registered trademark) of the company MOLECULAR PROBES INC.

Toutes les formules développées des composés précités sont données à la fin de la présente description. All of the structural formulas of the above-mentioned compounds are given at the end of this description.

Enfin, selon une autre caractéristique au moins un des chromophores est choisi dans le groupe formé par la 3, 3, 3', 3'-tétraméthylindodicarbocyanine 5 (CY5), la 3, 3, 3', 3'-tétraméthyl-indodicarbocyanine 3 (CY3) ou la 3, 3, 3', 3'-tétraméthyl-4, 5-benzindodicarbocyanine 5 (CY5. 5). Finally, according to another characteristic, at least one of the chromophores is chosen from the group formed by 3, 3, 3 ', 3'-tetramethylindodicarbocyanine 5 (CY5), 3, 3, 3', 3'-tetramethyl-indodicarbocyanine 3 (CY3) or 3, 3, 3 ', 3'-tetramethyl-4, 5-benzindodicarbocyanine 5 (CY5.5).

Les structures de ces composés sont données ci-après.

The structures of these compounds are given below.

CY5

CY3

CY5.5

CY3

Cy5.5

A titre indicatif, les sélections de couples suivants se sont révélés particulièrement avantageux et ont été utilisés de manière préférée en tant que marqueurs (chromophores) : - rhodamine 6G, dabcyl, - tétraméthylrhodamine, dabcyl,

- tétraméthylrhodamine, tétraméthylrhodamine, - fluorescéine, tétraméthylrhodamine, - fluorescéine, Cy5
L'effet du couplage excitonique sur les spectres d'absorption est montré dans la figure 3 qui représente une mise en évidence du couplage excitonique. By way of indication, the following selections of pairs have proved to be particularly advantageous and have been used in a preferred manner as markers (chromophores): - rhodamine 6G, dabcyl, - tetramethylrhodamine, dabcyl,

- tetramethylrhodamine, tetramethylrhodamine, - fluorescein, tetramethylrhodamine, - fluorescein, Cy5
The effect of excitonic coupling on the absorption spectra is shown in Figure 3 which shows a demonstration of excitonic coupling.

Sur cette figure 3, les spectres d'absorption obtenus pour un échantillon de TAR (abréviation de transactivation response region) In this figure 3, the absorption spectra obtained for a TAR sample (abbreviation for transactivation response region)

doublement marqué par la tétraméthylrhodamine (TMR) ont été représentés pour une température de 20 C (traits mixtes) et de 60 C (tirets).

doubly labeled with tetramethylrhodamine (TMR) have been shown for a temperature of 20 C (dashed lines) and 60 C (dashes).

Le spectre d'absorption d'un mélange équimolaire composé de TARm simplement marqué en 3'par la tétraméthylrhodamine (TMR) et de TARm simplement marqué en 5'par le même chromophore a également été représenté en traits pleins sur cette figure. The absorption spectrum of an equimolar mixture composed of TARm simply labeled in 3 ′ by tetramethylrhodamine (TMR) and TARm simply labeled in 5 ′ by the same chromophore has also been shown in solid lines in this figure.

On note sur cette figure une diminution importante du pic à 521 nm (dû à la présence du couplage excitonique) et l'augmentation du pic à 558 nm (caractéristique du chromophore isolé) lorsque la température des échantillons passe de 20 C à 60 C. This figure shows a significant decrease in the peak at 521 nm (due to the presence of excitonic coupling) and the increase in the peak at 558 nm (characteristic of the isolated chromophore) when the temperature of the samples goes from 20 C to 60 C.

Lorsqu'on chauffe à 60 C la séquence doublement marquée, il y a fusion de la séquence double brin en brins individuels qui restaure un spectre d'absorption tout à fait superposable au spectre obtenu avec le mélange équimoléculaire des brins distincts simplement marqués et dans lequel le pic à 521 nm a disparu. Ce comportement spectral est tout à fait caractéristique d'un couplage excitonique. When the doubly-labeled sequence is heated to 60 ° C., the double-stranded sequence is merged into individual strands which restores an absorption spectrum entirely superimposable on the spectrum obtained with the equimolecular mixture of distinct strands simply marked and in which the peak at 521 nm has disappeared. This spectral behavior is completely characteristic of an excitonic coupling.

Dans ce cas particulier, ce couplage a une géométrie de type H, c'est-à-dire que les moments de transition des deux chromophores sont parallèles et les vecteurs distances qui relient les deux moments forment des angles droits avec ceux-ci. Un couplage excitonique a pu être observé avec l'ensemble des couples de chromophores qui ont été étudiés. In this particular case, this coupling has an H-type geometry, that is to say that the transition moments of the two chromophores are parallel and the distance vectors which connect the two moments form right angles with them. An exciton coupling has been observed with all of the pairs of chromophores that have been studied.

L'existence du couplage excitonique ne dépend pas de la nature des chromophores, de leur positions respectives en 5'et en 3', de la séquence double brin à laquelle ils sont attachés ou de la nature ARN ou ADN du double brin. The existence of excitonic coupling does not depend on the nature of the chromophores, their respective positions in 5 ′ and in 3 ′, the double stranded sequence to which they are attached or the RNA or DNA nature of the double strand.

Par contre, l'importance du couplage et par conséquent, la modification du spectre d'absorption, dépend essentiellement de la distance entre les marqueurs des sondes. On the other hand, the importance of the coupling and consequently, the modification of the absorption spectrum, essentially depends on the distance between the markers of the probes.

La dépendance en fonction de la distance est très importante puisque l'effet est inversement proportionnel à la distance au cube. Des simulations effectuées sur les systèmes étudiés par les inventeurs montrent que le décalage spectral dû à l'exciton devient imperceptible pour des distances entre chromophores au-delà d'environ 10 angström (1,0 nm). The dependence on distance is very important since the effect is inversely proportional to the distance to the cube. Simulations carried out on the systems studied by the inventors show that the spectral shift due to the exciton becomes imperceptible for distances between chromophores beyond about 10 angstrom (1.0 nm).

Cette distance reste très courte à l'échelle moléculaire et permet donc de détecter une ouverture d'un nombre très réduit de paires de bases, au niveau des extrémités du double brin. En outre, en se fondant sur le décalage This distance remains very short on the molecular scale and therefore makes it possible to detect an opening of a very reduced number of base pairs, at the ends of the double strand. Also, based on the lag

spectral entre les chromophores couplés et les chromophores isolés, on peut déduire la distance entre les chromophores. spectral between the coupled chromophores and the isolated chromophores, we can deduce the distance between the chromophores.

L'intérêt du couplage excitonique peut être illustré dans plusieurs exemples. The advantage of excitonic coupling can be illustrated in several examples.

Ainsi, on peut suivre la fusion par chauffage du double brin en suivant la disparition du signal de l'exciton. Dans le cas de TARm doublement marquée par de la tétraméthylrhodamine, la disparition du couplage en suivant la diminution du pic à 521 nm et l'augmentation du pic à 558 nm a été étudiée. En parallèle, l'hypochromisme, qui constitue un moyen bien connu pour suivre la fusion de tout acide nucléique, a été également suivi à 260 nm. Thus, the fusion can be followed by heating the double strand by following the disappearance of the signal from the exciton. In the case of TARm doubly labeled with tetramethylrhodamine, the disappearance of the coupling following the decrease in the peak at 521 nm and the increase in the peak at 558 nm was studied. In parallel, hypochromism, which constitutes a well-known means for monitoring the fusion of any nucleic acid, was also followed at 260 nm.

La figure 4 illustre les résultats obtenus pour les différentes longueurs d'ondes analysée et permet en outre de visualiser la dépendance du couplage excitonique de la température. Les variations d'absorbance en fonction de la température de TARm doublement marquée à la tétraméthylrhodamine ont ainsi été enregistrées à 260 nm (triangles), 521 nm (cercles) et 558 nm (carrés), respectivement. FIG. 4 illustrates the results obtained for the different wavelengths analyzed and also makes it possible to visualize the dependence of the exciton coupling of the temperature. The variations in absorbance as a function of the temperature of TARm doubly labeled with tetramethylrhodamine were thus recorded at 260 nm (triangles), 521 nm (circles) and 558 nm (squares), respectively.

On voit que les courbes à 521 et 558 nm sont superposables entre elles et parallèles à la courbe réalisée à 260 nm. On note cependant un décalage de 2 à 4 C entre les courbes de l'exciton et la courbe à 260 nm, suggérant que l'extrémité de la tige est moins stable que l'ensemble de la tige. We see that the curves at 521 and 558 nm are superimposable between themselves and parallel to the curve produced at 260 nm. However, there is a difference of 2 to 4 C between the exciton curves and the 260 nm curve, suggesting that the end of the rod is less stable than the whole of the rod.

Le couplage excitonique peut également être utilisé pour détecter une hybridation entre une séquence et sa séquence complémentaire. Excitonic coupling can also be used to detect hybridization between a sequence and its complementary sequence.

Dans ce cas, l'appariement entre une séquence doublement marquée et sa séquence complémentaire non marquée se traduit par un éloignement des sondes et une perte du signal de l'exciton. In this case, the pairing between a doubly labeled sequence and its complementary unlabeled sequence results in a distancing of the probes and a loss of the signal from the exciton.

Une alternative consiste à utiliser une séquence marquée en 5' par un chromophore et sa séquence complémentaire marquée en 3'par un chromophore. L'hybridation des deux séquences se traduit par l'apparition d'un couplage excitonique. An alternative consists in using a sequence marked in 5 ′ by a chromophore and its complementary sequence marked in 3 ′ by a chromophore. Hybridization of the two sequences results in the appearance of an exciton coupling.

Dans un autre mode de réalisation, le procédé conforme à la présente invention est caractérisé en ce que le passage du premier état physico-chimique au second état physico-chimique est obtenu en ajoutant à la ou aux molécules marquées une substance agissant sur la structure spatiale propre à la ou aux molécules marquées, en particulier sur l'éloignement existant entre les deux marqueurs. In another embodiment, the method according to the present invention is characterized in that the transition from the first physicochemical state to the second physicochemical state is obtained by adding to the labeled molecule or molecules a substance acting on the spatial structure specific to the labeled molecule or molecules, in particular the distance between the two markers.

Selon une caractéristique avantageuse, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les espèces atomiques ou moléculaires constituant la substance ajoutée s'intercalent au moins partiellement entre les deux marqueurs proches situés sur la ou les molécules marquées de façon à écarter un marqueur de l'autre. According to an advantageous characteristic, the method according to the invention is characterized in that the atomic or molecular species constituting the added substance are inserted at least partially between the two close markers located on the labeled molecule (s) so as to remove a marker from the other.

De manière préférée, la substance ajoutée est choisie dans le groupe formé par les dimères de cyanines. Preferably, the added substance is chosen from the group formed by cyanine dimers.

Le couplage excitonique a, par exemple, été examiné en fonction de l'ajout d'un intercalant de l'ADN ou d'une protéine (figure 5). The excitonic coupling has, for example, been examined as a function of the addition of a DNA intercalator or of a protein (FIG. 5).

Le spectre d'absorption de TARm doublement marquée par de la tétraméthylrhodamine y a été enregistré en absence (trait plein) et en présence (pointillés) d'un exemple de substance ajoutée préférée de formule

The absorption spectrum of TAR mR doubly labeled with tetramethylrhodamine was recorded there in the absence (solid line) and in the presence (dotted lines) of an example of preferred added substance of formula

tétraiodure de 2, 2'-[1, 3 propanediylbis[ (diméthylimino) -3, 1propandiyl-1 (4H)-pyridinyl-4-ylidèneméthylidyne]] bis [3-méthyl]benzoxazolium.

2, 2 'tetraiodide - [1, 3 propanediylbis [(dimethylimino) -3, 1propandiyl-1 (4H) -pyridinyl-4-ylidenemethylidyne]] bis [3-methyl] benzoxazolium.

Cette substance est également connue sous la dénomination POPO (marque déposée de la société MOLECULAR PROBES INC. ) et a été ajouté à l'échantillon de TARm selon un rapport molaire de 12 : 1. This substance is also known under the name POPO (registered trademark of the company MOLECULAR PROBES INC.) And was added to the TARm sample in a molar ratio of 12: 1.

Comme on peut le constater d'après la figure 5, la fixation de l'intercalant au double brin induit un décalage du spectre de l'exciton et une variation du rapport des pics, montrant ainsi que l'exciton est sensible à la déformation du double brin induite par l'intercalant. As can be seen from FIG. 5, the attachment of the intercalator to the double strand induces a shift in the spectrum of the exciton and a variation in the ratio of the peaks, thus showing that the exciton is sensitive to the deformation of the double strand induced by intercalating agent.

L'effet de l'addition de la protéine de la nucléocapside du virus de l'immunodéficience humaine (HIV) à la séquence TARm doublement marquée par de la tétraméthylrhodamine est également rapportée à la figure 5. Cette protéine est connue pour déstabiliser les structures en tigeboucle sans toutefois les ouvrir complètement. L'action déstabilisante de la protéine ajoutée à raison d'un rapport molaire d'une partie pour cinq nucléotides se manifeste par une variation du rapport des pics et par la restitution d'un spectre proche de celui obtenu après chauffage de l'oligonucléotide. The effect of the addition of the human immunodeficiency virus (HIV) nucleocapsid protein to the TARm sequence doubly labeled with tetramethylrhodamine is also reported in FIG. 5. This protein is known to destabilize the structures in rod loop without opening them completely. The destabilizing action of the protein added at the rate of a molar ratio of one part per five nucleotides is manifested by a variation in the ratio of the peaks and by the restitution of a spectrum close to that obtained after heating of the oligonucleotide.

Selon une autre variante, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les espèces atomiques ou moléculaires constituant la substance ajoutée agissent sur la ou les molécules marquées de façon à rapprocher les marqueurs l'un de l'autre. According to another variant, the method according to the invention is characterized in that the atomic or molecular species constituting the added substance act on the labeled molecule or molecules so as to bring the markers closer to one another.

Par exemple, le procédé peut être caractérisé en ce que la substance ajoutée est choisie dans le groupe formé par les protéines. For example, the method can be characterized in that the added substance is chosen from the group formed by proteins.

Comme évoqué ci-dessus, le procédé peut être caractérisé en ce que les molécules marquées sont deux brins complémentaires séparés constitués chacun d'une séquence d'acides nucléiques marqués chacun par un marqueur et que la substance ajoutée est une protéine ou un agent physico-chimique favorisant l'hybridation des deux brins complémentaires. As mentioned above, the method can be characterized in that the labeled molecules are two separate complementary strands each consisting of a sequence of nucleic acids each labeled with a marker and that the substance added is a protein or a physical agent. chemical promoting the hybridization of the two complementary strands.

La figure 6 illustre l'effet de la protéine de la nucléocapside du virus de l'immunodéficience humaine sur un mélange d'une séquence TAR marquée en 3'par de la fluorescéine (TAR fluo) et de sa séquence complémentaire marquée en 5'par de la tétraméthylrhodamine (TAR comp. FIG. 6 illustrates the effect of the nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus on a mixture of a TAR sequence marked in 3 ′ by fluorescein (fluorescent TAR) and of its complementary sequence marked in 5 ′ tetramethylrhodamine (TAR comp.

TMR). La protéine favorise l'hybridation des deux brins complémentaires, ce qui génère la formation d'un couplage excitonique entre la fluorescéine et la tétraméthylrhodamine. Comme on peut le voir sur la figure 6 précitée, le couplage excitonique représenté en traits pleins se traduit par une baisse d'absorbance du pic de la tétraméthylrhodamine et une augmentation d'absorbance du pic de la fluorescéine par rapport au spectres des espèces non hybridées (traits pointillés). TMR). The protein promotes hybridization of the two complementary strands, which generates the formation of an excitonic coupling between fluorescein and tetramethylrhodamine. As can be seen in FIG. 6 above, the excitonic coupling shown in solid lines results in a decrease in absorbance of the tetramethylrhodamine peak and an increase in absorbance of the fluorescein peak compared to the spectra of non-hybridized species (dotted lines).

De manière générale, le procédé selon l'invention peut être caractérisé en ce que les paramètres structuraux déterminés localement sont la distance entre les deux marqueurs portés par la ou les molécules marquées et l'orientation angulaire de l'un des deux marqueurs portés par la ou les molécules marquées par rapport à l'autre. In general, the method according to the invention can be characterized in that the structural parameters determined locally are the distance between the two markers carried by the marked molecule or molecules and the angular orientation of one of the two markers carried by the or the molecules labeled relative to each other.

La présente invention concerne également l'utilisation du procédé pour l'analyse de modifications structurales locales de molécules, d'ADN, en particulier d'ADN humain, d'ARN et en particulier d'ARN humain. The present invention also relates to the use of the method for the analysis of local structural modifications of molecules, of DNA, in particular of human DNA, of RNA and in particular of human RNA.

Dans une autre application l'utilisation du procédé selon l'invention est prévue pour détecter une hybridation entre une séquence et sa séquence complémentaire. In another application, the use of the method according to the invention is provided for detecting a hybridization between a sequence and its complementary sequence.

L'effet de l'addition de la protéine de la nucléocapside du virus de l'immunodéficience humaine (HIV) à un mélange équimolaire de la séquence TAR marquée en 3'par un groupement dabcyl et de séquence The effect of the addition of the nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus (HIV) to an equimolar mixture of the TAR sequence marked in 3 ′ with a dabcyl group and of sequence

complémentaire marquée en 5'par un groupement tétraméthylrhodamine est également rapportée sur la figure 6. L'addition de la protéine au mélange d'oligonucléotides induit l'apparition d'un couplage excitonique qui démontre l'hybridation entre les deux séquences sous l'effet de la protéine. complementary labeled in 5 ′ by a tetramethylrhodamine group is also reported in FIG. 6. The addition of the protein to the mixture of oligonucleotides induces the appearance of an excitonic coupling which demonstrates the hybridization between the two sequences under the effect protein.

Par rapport aux balises moléculaires connues et aux techniques qui les font intervenir, la présente invention présente donc plusieurs caractères distinctifs et innovants qui permettent de pallier au moins certains des désavantages présents dans les procédés de l'art antérieur. Compared to the known molecular beacons and to the techniques which involve them, the present invention therefore has several distinctive and innovative characteristics which make it possible to overcome at least some of the disadvantages present in the processes of the prior art.

En effet, le procédé conforme à la présente invention n'est pas limité aux acides nucléiques en tige-boucle et peut être appliqué à n'importe molécule en particulier à n'importe quelle séquence nucléique, à condition que celle-ci présente une structure permettant de fixer deux marqueurs de manière suffisamment proche à l'endroit qui doit être examiné. De manière préférée, les molécules dont on veut déterminer les paramètres structuraux à l'aide du procédé selon la présente invention sont des nucléotides ou des phospholipides. In fact, the method according to the present invention is not limited to nucleic acids in rod-loop and can be applied to any molecule in particular to any nucleic sequence, provided that this has a structure allowing two markers to be fixed sufficiently close to the place to be examined. Preferably, the molecules whose structural parameters are to be determined using the method according to the present invention are nucleotides or phospholipids.

Le procédé selon l'invention ne nécessite pas la présence d'un groupement inhibiteur de fluorescence. On peut en fait utiliser n'importe quel couple de chromophores, ce qui augmente grandement la flexibilité du procédé selon l'invention. The method according to the invention does not require the presence of a fluorescence inhibitor group. Any pair of chromophores can in fact be used, which greatly increases the flexibility of the method according to the invention.

Il utilise la spectroscopie d'absorption et non la spectroscopie de fluorescence. La spectroscopie d'absorption est de mise en oeuvre plus simple, présente moins d'artéfacts et est moins coûteuse que la spectroscopie de fluorescence. It uses absorption spectroscopy and not fluorescence spectroscopy. Absorption spectroscopy is simpler to use, has fewer artifacts and is less expensive than fluorescence spectroscopy.

Il permet aussi bien de détecter facilement les ouvertures partielles ou les déformations minimes des substances analysées que des modifications structurales plus importantes. It makes it possible to easily detect partial openings or minimal deformations of the substances analyzed as well as more significant structural modifications.

De plus, la technique de spectrométrie d'absorption est peu sensible à l'environnement et les signaux détectés ont peu de chances de contenir des contributions provenant de la perturbation de l'échantillon par un agent extérieur. In addition, the absorption spectrometry technique is not very sensitive to the environment and the signals detected are unlikely to contain contributions from the disturbance of the sample by an external agent.

Les formules développées des chromophores utilisées dans le cadre de la présente invention sont données ci-après. The expanded formulas of the chromophores used in the context of the present invention are given below.

En ce qui concerne des molécules issues de la famille des rhodamines on a : With regard to molecules from the rhodamine family, we have:

Tétraméthylrhodamine (TAMRA ou TMR)

Tetramethylrhodamine (TAMRA or TMR)

5-carboxytétraméthylrhodamine (5-TAMRA)

5-carboxytetramethylrhodamine (5-TAMRA)

6-carboxytétraméthylrhodamine (6-TAMRA)

6-carboxytetramethylrhodamine (6-TAMRA)

5- (et-6)-carboxytétraméthylrhodamine (5 (6)-TAMRA)

Ester succinimidylique de la 5-carboxytétraméthylrhodamine (5-TAMRA, SE)

Ester succinimidylique de la 6-carboxytétraméthylrhodamine (6-TAMRA, SE)

5- (and-6) -carboxytetramethylrhodamine (5 (6) -TAMRA)

5-carboxytetramethylrhodamine succinimidyl ester (5-TAMRA, SE)

6-carboxytetramethylrhodamine succinimidyl ester (6-TAMRA, SE)

Ester succinimidylique de la 5-(et-6)-carboxytétraméthylrhodamine (5 (6)-TAMRA, SE)

Rhodamine X

Sel de triéthylammonium de la 5-carboxy-X-rhodamine (5-ROX)

5- (and-6) -carboxytetramethylrhodamine (5 (6) -TAMRA, SE) succinimidyl ester

Rhodamine X

5-carboxy-X-rhodamine (5-ROX) triethylammonium salt

6-carboxy-X-rhodamine (6-ROX)

Ester succinimidylique de la 5-carboxy-X-rhodamine (5-ROX, SE)

Ester succinimidylique de la 6-carboxy-X-rhodamine (6-ROX, SE)

6-carboxy-X-rhodamine (6-ROX)

5-carboxy-X-rhodamine succinimidyl ester (5-ROX, SE)

6-carboxy-X-rhodamine succinimidyl ester (6-ROX, SE)

Ester succinimidylique de la 5- (et-6)-carboxy-X-rhodamine (5 (6)ROX, SE)

5- (and-6) -carboxy-X-rhodamine succinimidyl ester (5 (6) ROX, SE)

Tétraéthylrhodamine (rhodamine B)

Tetraethylrhodamine (rhodamine B)

Hydroxyde d'éthanaminium, N- (9- (4-chlorosulfonyl)-2-sulfophényl)-

6- (diéthytamino)-3H-xanthène-3-y ! idène)-N-éthyle (chlorure de sulfonyl de la Lissamine rhodamine B)

Rhodamine 110 (R1100

Rhodamine 123 (R123)

Ethanaminium hydroxide, N- (9- (4-chlorosulfonyl) -2-sulfophenyl) -

6- (diethytamino) -3H-xanthene-3-y! idene) -N-ethyl (Lissamine rhodamine B sulfonyl chloride)

Rhodamine 110 (R1100

Rhodamine 123 (R123)

Rhodamine phalloidine

Rhodamine phalloidin

Hydrochlorure de l'ester succinimidylique de la 5- (et-6) carboxyrhodamine 110 (Rhodamine Gréent (5 (6)-CR 110, SE)

5- (et-6) carboxyrhodamine 110 succinimidyl ester hydrochloride (Rhodamine Gréent (5 (6) -CR 110, SE)

Ester succinimidylique du trifluoroacétamide de la 5- (et-6) carboxyrhodamine 110 (Rhodamine GreenTM) (5 (6)-CR110TFA, SE)

0 0 Il Il 0ff) 3 3 0 0 0 6-1 f M-O-C 1 I I Il 0

Hydrochlorure de l'ester succinimidylique de l'acide 5- (et-6) aminohexanoïque-carboxyrhodamine 110) (Rhodamine GreenTm-X)

5- (and-6) carboxyrhodamine 110 (Rhodamine GreenTM) trifluoroacetamide succinimidyl ester (5 (6) -CR110TFA, SE)

0 0 Il Il 0ff) 3 3 0 0 0 6-1 f MOC 1 II Il 0

5- (et-6) aminohexanoic-carboxyrhodamine 110) succinimidyl ester hydrochloride (Rhodamine GreenTm-X)

Sulforhodamine 101

Sulforhodamine 101

Sulforhodamine B

Sulforhodamine G

5-isothiocyanato-tétraméthylrhodamine (5-TRITC ; isomère G)

Sulforhodamine B

Sulforhodamine G

5-isothiocyanato-tetramethylrhodamine (5-TRITC; G isomer)

6-isothiocyanato-tétraméthylrhodamine (6-TRITC ; isomère R)

6-isothiocyanato-tetramethylrhodamine (6-TRITC; R isomer)

5- (et-6)-isothiocyanato-tétraméthylrhodamine (5 (6)-TRITC)

5- (and-6) -isothiocyanato-tetramethylrhodamine (5 (6) -TRITC)

9- (2, 3, 6, 7, 12, 13, 16, 17-octahydro-lH, 5H, IlH, 15H-xanthèno (2, 3, 4ij : 5, 6, 7-i'j') -diquinolizin-18-ium (Texas Red)

9- (2, 3, 6, 7, 12, 13, 16, 17-octahydro-1H, 5H, IlH, 15H-xanthèno (2, 3, 4ij: 5, 6, 7-i'j ') -diquinolizin -18-ium (Texas Red)

Sel interne de 9- (2 4)-(chlorosulfonyl)-4 (ou 2)-sulfophényl)- 2,3, 6,7, 12,13, 16, 17-octahydro-lH, 5H, 11H, 15H-xanthèno (2,3, 4- ij : 5,6, 7-i'j')-diquinolizin-18-ium (chlorure de sulfonyle du Texas Red&commat;)

Internal salt of 9- (2 4) - (chlorosulfonyl) -4 (or 2) -sulfophenyl) - 2,3, 6,7, 12,13, 16, 17-octahydro-1H, 5H, 11H, 15H-xantheno (2,3,4-ij: 5,6,7-i'j ') - diquinolizin-18-ium (sulfonyl chloride from Texas Red &commat;)

Sel interne de 9- [2 (ou 4)-[[[6-[2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-6- oxohéxyl]amino]sulfonyl]-4-(ou 2)-sulfophényl]-2, 3,6, 7,12, 13,16, 17- octahydro-lH, 5H, 11H, 15H-xanthèno (2,3, 4-ij : 5,6, 7-i'j')-diquinolizin-
18-ium (ester succinimidylique du Texas Red-X)

Internal salt of 9- [2 (or 4) - [[[[6- [2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl) oxy] -6- oxohexyl] amino] sulfonyl] -4- (or 2) -sulfophenyl] - 2, 3,6, 7,12, 13,16, 17- octahydro-1H, 5H, 11H, 15H-xanthèno (2,3, 4-ij: 5,6, 7-i'j ') - diquinolizin-
18-ium (Texas Red-X succinimidyl ester)

5-(et-6)-isothiocyanato-rhodamine-X (5 (6)-XRITC)

Rhodamine 6G

Chlorure de la rhodamine 6G

5- (and-6) -isothiocyanato-rhodamine-X (5 (6) -XRITC)

Rhodamine 6G

Rhodamine chloride 6G

Hydrochlorure de la 6-carboxyrhodamine 6G (6-CR 6G)

6-carboxyrhodamine 6G hydrochloride (6-CR 6G)

Hydrochlorure de la 5-carboxyrhodamine 6G (5-CR 6G)

5-carboxyrhodamine 6G hydrochloride (5-CR 6G)

Ester succinimidylique de la 5-carboxyrhodamine 6G (5-CR 6G, SE)

5-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester (5-CR 6G, SE)

Ester succinimidylique de la 6-carboxyrhodamine 6G (6-CR 6G, SE)

6-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester (6-CR 6G, SE)

Ester succinimidylique de la 5- (et-6)-carboxyrhodamine 6G (5 (6)-CR 6G, SE)

5- (and-6) -carboxyrhodamine succinimidyl ester 6G (5 (6) -CR 6G, SE)

En ce qui concerne des molécules issues de la famille des bodipy on a :
Acide 4, 4-difluor-5, 7-diméthyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacène- 3- propionique (BODIPY&commat; FL)

Ester succinimidylique de l'acide 4,4-difluoro-5, 7-diméthyl- 4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène- 3-propionique (BODIPY# FL, SE)

With regard to molecules from the bodipy family, we have:
4, 4-difluor-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid (BODIPY &commat; FL)

4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl ester (BODIPY # FL, SE)

Acide 4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacène- 3- pentanoïque (BODIPY&commat; FL Cs)

4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-pentanoic acid (BODIPY &commat; FL Cs)

Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-5, 7-diméthyl- 4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3-pentanoïque (BODIPY&commat; FL Cg, SE)

4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-pentanoic acid succinimidyl ester (BODIPY &commat; FL Cg, SE)

Acide 4, 4-difluoro-5, 7-diphényl- 4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène- 3propionique (BODIPY&commat; 530/550)

4, 4-difluoro-5, 7-diphenyl- 4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene- 3propionic acid (BODIPY &commat; 530/550)

Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-5, 7-diphényl- 4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique (BODIPY&commat; 530/550, SE)

4,4-difluor-5,7-diphenyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl ester (BODIPY &commat; 530/550, SE)

Acide 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7-tétraméthyl- 4-bora-3a, 4a-diaza-sindacène-8-propionique (BODIPY (E) 493/503 C3)

4, 4-difluor-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacene-8-propionic acid (BODIPY (E) 493/503 C3)

Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7-tétraméthyl- 4bora-3a, 4a-diaza-s-indacène- 8-propionique (BODIPY&commat; 493/503, SE)

4,4-difluor-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-8-propionic acid succinimidyl ester (BODIPY &commat; 493/503, SE)

Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (2-thiényl) -4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique (BODIPY&commat; 558/568, SE)

4,4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl ester (BODIPY &commat; 558/568, SE)

Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (2-pyrrolyl)-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène- 3-propionique (BODIPY 576/589, SE)

4,4-difluoro-5- (2-pyrrolyl) -4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl ester (BODIPY 576/589, SE)

Acide 4, 4-difluoro-5-styryl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3propionique (BODIPY (g) 564/570)

4, 4-difluoro-5-styryl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacene-3propionic acid (BODIPY (g) 564/570)

Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5-styryl-4-bora- 3a, 4adiaza-s-indacène-3-propionique (BODIPY (R) 564/570, SE)

4,4-difluoro-5-styryl-4-bora-3a, 4adiaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl ester (BODIPY (R) 564/570, SE)

Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5- (4-phényl-1, 3- butadiényl)-4-bora-3a, 4a- diaza-s-indacène-3-propionique (BODIPY# 581/591, SE)

4,4-difluoro-5- (4-phenyl-1, 3-butadienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl ester (BODIPY # 581/591, SE)

Acide 6- ( (4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza--mdacène- 3-propionyl) amino) hexanoïque (BODIPY&commat; FL-X)

Ester succinimidylique de l'acide 6-((4,4-difluoro-5,7-diméthyl- 4- bora-3a, 4a-diaza-s-indacène- 3-propionyl) amino) hexanoïque (BODIPY&commat; FL-X, SE)

6- ((4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza - mdacene-3-propionyl) amino) hexanoic acid (BODIPY &commat; FL-X)

6 - ((4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionyl) amino) hexanoic acid succinimidyl ester (BODIPY &commat; FL-X, SE)

Acide 4, 4-difluoro-4-bora-3a, 4a- diaza-s-indacène-3, 5-dipropionique (BODIPY&commat; 500/510)

4, 4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3, 5-dipropionic acid (BODIPY &commat; 500/510)

Ester succinimidylique de l'acide 6- ( ( (4- (4, 4-difluoro-5- (2- thiényl)-4- bora-3a, 4a-diaza- s-indacène-3-yl) phénoxy) acétyl) amino) hexanoïque (BODIPY&commat; TR-X, SE)

Ester succinimidylique de l'acide 6-((4,4-difluoro-1,3-diméthyl- 5-(4- méthoxyphényl)-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-2-propionyl) amino) hexanoïque (BODIPY&commat; TMR-X, SE)

6- ((((4- (4, 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4- bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-yl) phenoxy) acetyl) acetyl ester) amino) hexanoic (BODIPY &commat; TR-X, SE)

6 - ((4,4-difluoro-1,3-dimethyl- 5- (4-methoxyphenyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-2-propionyl) amino acid succinimidyl ester) hexanoic (BODIPY &commat; TMR-X, SE)

Sel sodé de l'ester sulfosuccinimidylique de l'acide 4, 4-difluor-5, 7diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène- 3-propionique (BODIPY (B) FL, SSE)

Sodium salt of 4, 4-difluor-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic sulfosuccinimidyl ester of acid (BODIPY (B) FL, SSE)

Sel de triéthylammonium de l'ester succinimidylique de l'acide N- (4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl- 4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène- 3propionyl) cystéique (BODIPY&commat; FL, CASE)

Cysteic triethylammonium salt of succinimidyl ester of N- (4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl- 4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene- 3propionyl) acid (BODIPY &commat; FL, CASE )

Acide 2, 6-dibromo-4, 4-difluoro-5, 7-diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza- sindacène-3-propionique (BODIPY&commat; FL Br2)

2, 6-dibromo-4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacene-3-propionic acid (BODIPY &commat; FL Br2)

Ester succinimidylique de l'acide 2,6-dibromo-4, 4-difluor-5, 7diméthyl-4-bora-3a, 4a-diaza- s-indacène-3-propionique (BODIPY#
FL Br2, SE)

Ester succinimidylique de l'acide 4, 4-difluoro-5-phényl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique (BODIPY&commat; R6G, SE)

2,6-dibromo-4,4-difluor-5,7dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl ester (BODIPY #
FL Br2, SE)

4,4-difluoro-5-phenyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl ester (BODIPY &commat; R6G, SE)

En ce qui concerne des molécules issues de la famille des fluorescéines on a : Fluorescéine 3'-6'-dihydroxyspiro [isobenzofuran-l (3H), 9'- [9H] xanthèn]-3-one

Regarding molecules from the fluorescein family, we have: Fluorescein 3'-6'-dihydroxyspiro [isobenzofuran-1 (3H), 9'- [9H] xanthene] -3-one

5-carboxyfluorescéine (5-FAM)

5-carboxyfluorescein (5-FAM)

6-carboxyfluorescéine (6-FAM)

6-carboxyfluorescein (6-FAM)

5- (et-6) -carboxyfluorescéine (5 (6)-FAM)

5- (and-6) -carboxyfluorescein (5 (6) -FAM)

Ester succinimidylique de la 5-carboxyfluorescéine, (5-FAM, SE)

Ester succinimidylique de la 6-carboxyfluorescéine, (6-FAM, SE)

5-carboxyfluorescein succinimidyl ester, (5-FAM, SE)

6-carboxyfluorescein succinimidyl ester, (6-FAM, SE)

Ester succinimidylique de la 5- (et-6) -carboxyfluorescéine (5 (6)-FAM, SE)

5- (and-6) -carboxyfluorescein (5 (6) -FAM, SE) succinimidyl ester

5-(4,6-dichlorotriazinyl)aminofluorescéine (5-DTAF)

Ester succinimidylique de l'acide 6-(fluorescéine-5-carboxamido) hexanoïque (5-SFX)

Ester succinimidylique de l'acide 6-(fluorescéine-5-(et-6)- carboxamido) hexanoïque (5 (6)-SFX)

5- (4,6-dichlorotriazinyl) aminofluorescein (5-DTAF)

6- (fluorescein-5-carboxamido) hexanoic acid succinimidyl ester (5-SFX)

6- (fluorescein-5- (and-6) - carboxamido) hexanoic acid succinimidyl ester (5 (6) -SFX)

Ester succinimidylique de la fluorescéine-5-EX

5-isothiocyanato-fluorescéine (FITC Isomère I)

6-isothiocyanato-fluorescéine (FITC Isomère II)

Fluorescein-5-EX succinimidyl ester

5-isothiocyanato-fluorescein (FITC Isomer I)

6-isothiocyanato-fluorescein (FITC Isomer II)

2', 7'-difluorofluorescéine (Vert Oregon 488-Oregon Green 488)

2 ', 7'-difluorofluorescein (Oregon Green 488-Oregon Green 488)

5-carboxy-2', 7'-difluorofluorescéine

5-carboxy-2 ', 7'-difluorofluorescein

Ester-5-succinimidylique de la 2', 7' -difluorofluorescéine

2 ', 7' -difluorofluorescein 2-ester-5-succinimidyl ester

Ester-6-succinimidylique de la 2', 7'-difluorofluorescéine

2 ', 7'-difluorofluorescein ester-6-succinimidyl

5- (et-6)-isothiocyanato-2', 7'-difluorofluorescéine (F2FITC)

5- (and-6) -isothiocyanato-2 ', 7'-difluorofluorescein (F2FITC)

5- (et-6)-carboxynaphthofluorescéine

5- (and-6) -carboxynaphthofluorescein

Ester succinimidylique de la 5-(et-60-carboxynaphthofluorescéine

Ester succinimidylique du N, O-bis-trifluoroacétamide de la 5- (et-6) carboxylrhodamine 110 (Rhodol GreenTM) (5 (6)-CRF 492 TFA, SE)

Hydrochlorure de l'acide 5- (et-6) carboxylique du 3'-hydroxy-6'aminofluorane (Rhodol GreenTM) (5 (6)-CRF 492)

5- (and-60-carboxynaphthofluorescein) succinimidyl ester

N, O-bis-trifluoroacetamide succinimidyl ester of 5- (and-6) carboxylrhodamine 110 (Rhodol GreenTM) (5 (6) -CRF 492 TFA, SE)

5- (et-6) carboxylic acid hydrochloride of 3'-hydroxy-6'aminofluorane (Rhodol GreenTM) (5 (6) -CRF 492)

Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation décrit et représenté aux dessins annexés. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention. Of course, the invention is not limited to the embodiment described and shown in the accompanying drawings. Modifications remain possible, in particular from the point of view of the constitution of the various elements or by substitution of technical equivalents, without thereby departing from the scope of protection of the invention.

De même, les inventeurs ne sont pas liés par les théories scientifiques qu'ils exposent ou auxquelles ils se réfèrent dans la présente description, en particulier pour l'explication scientifique des résultats obtenus. Likewise, the inventors are not bound by the scientific theories which they expose or to which they refer in the present description, in particular for the scientific explanation of the results obtained.

Claims

1. Method for local determination of structural parameters of a molecule or of two molecules intended to interact structurally, in particular of biochemical or pharmacological molecules, characterized in that it consists in: - measuring at least one variation of the excitonic coupling existing between two markers present on the same molecule whose structural parameters one seeks to determine or between two markers present on two distinct molecules intended to interact structurally and whose structural parameters one seeks to determine, the measurement (s) of excitonic coupling being carried out when the or the molecules pass from a first physicochemical state in which the markers have a defined orientation and distance to at least one second different state in which the orientation and the distance differ from those of the first state, at least one of said first or second states with distance t of said markers greater than 1 nm and at least one of said first or second states having a distance from said markers less than 1 nm, then, - deducing the parameters sought from the measurements previously carried out.

2. Method according to claim 1, characterized in that it comprises the steps consisting in: - locally marking the same molecule, at the level of the portion of space for which it is desired to determine the structural parameters of said molecule, by two markers close, - establish a first absorption spectrum of the molecule thus marked and which is in a first given physicochemical state, - modify said first physicochemical state mentioned above to make the labeled molecule pass into a second physicochemical state data different from said first state, thus creating a variation of the exciton coupling existing between the two markers, - establishing a second absorption spectrum of the labeled molecule found in said second physicochemical state, - comparing the first and second spectra previously obtained , and

- deduce the parameters sought.

3. Method according to claim 1, characterized in that it comprises the steps consisting in: - locally marking two distinct molecules, at the level of the portion of space for which it is desired to determine the structural parameters of one or the another molecule, - establish a first absorption spectrum of one of the two molecules alone, thus marked and which is in a first given physicochemical state, - modify said first physico-chemical state mentioned above to pass the marked molecule which has obtained the first spectrum in a second given physicochemical state different from said first state, thereby creating a variation in the excitonic coupling existing between the two markers,

1 - establish a second absorption spectrum of the labeled molecule found in said second physicochemical state, - compare the first and second spectra previously obtained, and - deduce the parameters sought.

4. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the transition from the first physicochemical state to the second physicochemical state is obtained by modifying the temperature of the labeled molecule (s).

5. Method according to claim 4, characterized in that the temperature of the labeled molecule or molecules is increased.

6. Method according to claim 4 or 5, characterized in that the temperature of the labeled molecule (s) is passed from ambient temperature to a temperature higher than that of the melting point of the labeled molecule (s).

7. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the transition from the first physicochemical state to the second physicochemical state is obtained by adding to the labeled molecule or molecules a substance acting on the proper spatial structure to the labeled molecule (s), in particular on the distance existing between the two markers.

8. Method according to claim 7, characterized in that the atomic or molecular species constituting the added substance

are inserted at least partially between the two close markers located on the marked molecule (s) so as to separate one marker from the other.

9. Method according to claim 7 or 8, characterized in that the added substance is chosen from the group formed by cyanine dimers.

10. Method according to any one of claims 7 to 9,

characterized in that the substance added is the tetraiodide of 2,2'- [1,3 propanediylbis [(dimethylimino) -3,1-propandiyl-l (4H) -pyridinyl-4ylidenemethylidyne]] bis [3-methyl] -benzoxazolium .

11. Method according to claim 7, characterized in that the atomic or molecular species constituting the added substance act on the labeled molecule or molecules so as to bring the markers closer to one another.

12. Method according to claim 7 or 11, characterized in that the added substance is chosen from the group formed by proteins.

13. Method according to any one of claims 7 or 11 and 12, characterized in that the labeled molecules are two separate complementary strands each consisting of a nucleic acid sequence each labeled with a marker and that the added substance is a protein or a physico-chemical agent promoting the hybridization of the two complementary strands.

14. Method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that the structural parameters determined locally are the distance between the two markers carried by the marked molecule or molecules and the angular orientation of one of the two markers carried by the molecule (s) marked with respect to the other.

15. Method according to any one of claims 1 to 14, characterized in that the markers are chromophores absorbing in the range of wavelengths between 300 nm and 800 nm.

16. The method of claim 15, characterized in that at least one of the chromophores is a dabcyl group.

17. The method of claim 15 or 16, characterized in that at least one of the chromophores is chosen from the group formed by the

tetramethylrhodamine, 5-carboxytetramethylrhodamine, 6carboxytetramethylrhodamine, 5- (and-6) -carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester of 5-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester of 6-carboxytetramethylrhodamine, ester

6-carboxyfluorescein, the succinimidyl ester of 5- (and-6) carboxyfluorescein, 5- (4, 6-dichlorotriazinyl) aminofluorescein, the succinimidyl ester of 6- (fluorescein-5-carboxamido) acid, succinimidyl ester of 6- (fluorescein-5- (and-6) -carboxamido) hexanoic acid, succinimidyl ester of fluorescein-5-EX, 5-

18. Method according to any one of claims 15 to 17, characterized in that at least one of the chromophores is chosen from the group formed by fluorescein, 5-carboxyfluorescein, 6carboxyfluorescein, 5- (and-6) -carboxyfluorescein, the succinimidyl ester of 5-carboxyfluorescein, the succinimidyl ester of

(2, 3, 6, 7, 12, 13, 16, 17-octahydro-1H, 5H, l IH, 15H-xanthèno (2, 3, 4-ij: 5, 6, 7i'j ') - diquinolizin- 18-ium, the internal salt of 9- [2 (or 4) - [[[6- [2, 5-dioxo-1pyrrolidinyl) oxy] -6-oxohexyl] amino] sulfbnyl] -4 (or 2) -sulfophenyl ] - 2, 3, 6, 7, 12, 13, 16, 17-octahydro-1H, 5H, 1 IH, 15H-xanthèno (2, 3, 4-ij: 5, 6, 7i'j ') - diquinolizin -18-ium, 5- (and-6) -isothiocyanato-rhodamine-X, rhodamine 6G, rhodamine chloride 6G, 6carboxyrhodamine 6G hydrochloride, 5-carboxyrhodamine 6G hydrochloride, l succinimidyl ester of 5-carboxyrhodamine 6G, succinimidyl ester of 6-carboxyrhodamine 6G and succinimidyl ester of 5- (and-6) carboxyrhodamine 6G

5- (and-6) -carboxy-X-rhodamine, tetraethylrhodamine, ethanaminium hydroxide-N- (9- (4- (chlorosulfbnyl) -2-sulfbphenyl) -6- (diethylamino) - 3H- xanthene-3-ylidene) -N-ethyl, rhodamine 110, rhodamine 123, rhodamine phalloidine, hydrochloride of 5- (and-6) carboxyrhodamine 110 succinimidyl ester, trifluoroacetamide succinimidyl ester 5- (and-6) carboxyrhodamine 110, the hydrochloride of succinimidyl ester of 5- (and-6) amino-hexanoic-carboxyrhodamine 110, sulforhodamine 101, sulforhodamine B, sulforhodamine G, 5-isothiocyanato-tetramethylrhodamine (G-isomer), 6-isothiocyanatotetramethylrhodamine (R-isomer), 5- (and-6) -isothiocyanatotetramethylrhodamine, 9- (2, 3,6, 7,12, 13,16, 17- octahydro- 1H, 5H, 11H, 15H-xantheno (2,3, 4-ij: 5,6, 7-i'j ') - diquinolizin-18-ium, the internal salt of 9- (2 (or 4) - (chlorosulfbnyl) -4 (or 2) -sulfbphenyl) -

5- (and-6) -carboxytetramethylrhodamine succinimidyl, rhodamine X, triethylammonium salt of 5-carboxy-X-rhodamine, 6-carboxy-X-rhodamine, succinimidyl ester of 5-carboxy- X-rhodamine, the succinimidyl ester of 6-carboxy-X-rhodamine, the succinimidyl ester of

isothiocyanato-fluorescein, 6-isothiocyanato-fluorescein, 2 ', 7'difluorofluorescein, 5-carboxy-2', 7'-difluorofluorescein, 2 'ester, 7'-difluorofluorescein, ester -6-succinimidyl of 2 ', 7'-difluorofluorescein, 5- (and-6) -isothiocyanato-2', 7'difluorofluorescein, 5- (and-6) -carboxynaphthofluorescein, succinimidyl ester of 5 - (and-6) -carboxynaphthofluorescein, the succinimidyl ester of V, <9-bis-trifluoroacetamide of 5- (and-6) carboxylrhodamine 110 and the hydrochloride of 5- (and-6) carboxylic acid 3'-hydroxy-6'-aminofluoran.

19. Method according to any one of claims 15 to 18, characterized in that at least one of the chromophores is chosen from the group formed by acid 4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl-4-bora- 3a, 4a-diaza-sindacene-3-propionic acid, succinimidyl ester of 4, 4-difluoro-5, 7dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, 4, 4-difluoro- 5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-pentanoic acid, succinimidyl ester of 4, 4-difluor-5, 7-dimethyl -4-bora-3a, 4a-diaza-sindacene-3-pentanoic acid 4, 4-difluor-5, 7-diphenyl-4-bora-3a, 4adiaza-s-indacene-3-propionic, 4,4difluor-7-diphenyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, succinimidyl ester, 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7-tetramethyl -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-8propionic, succinimidyl ester of 4, 4-difluor-1, 3, 5, 7tetramethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s -indacene-8-propionic acid, 4,4-difluoro-5- succinimidyl ester (2-thienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-sindacene-3-propionic acid, succinimidyl ester of 4, 4-difluoro-5- (2-pyrrolyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid 4, 4difluoro-5-styryl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl ester 4 , 4-difluoro-5-styryl-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacene-3-propionic, succinimidyl ester of 4, 4-difluoro-5- (4-phenyl-1, 3- butadienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid 6- (((4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza- s-indacene-3propionyl) amino) hexanoic acid, succinimidyl ester 6- ((4, 4difluoro-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3propionyl) amino) hexanoic acid, 4, 4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-sindacene-3, 5-dipropionic acid, succinimidyl ester of 6- ((((4- (4, 4difluoro-5 - (2-thienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3yl) phenoxy) acetyl) amino) hexanoic acid, succinimidyl ester 6- ((4, 4-d ifluoro-1, 3-dimethyl-5- (4-methoxyphenyl) -4-bora-3 a, 4a-diaza-s-

indacene-2-propionyl) amino) hexanoic, the sodium salt of the sulfosuccinimidyl ester of 4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4adiaza-s-indacene-3-propionic, the triethylammonium salt of the succinimidyl ester of N- (4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4adiaza-s-indacene-3-propionyl) acid, acid 2 , 6-dibromo-4, 4-difluoro- 5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, succinimidyl ester of 2, 6-dibromo-4 , 4-difluoro-5, 7-dimethyl-4-bora- 3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid and succinimidyl ester of 4, 4-difluoro-5-phenyl-4-bora -3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic.

20. Method according to any one of claims 15 to 19, characterized in that at least one of the chromophores is chosen from the group formed by 3,3, 3 ', 3'-tetramethyl-indodicarbocyanine 5, la 3, 3, 3 ', 3'tetramethyl-indodicarbocyanine 3 or 3,3, 3', 3'-tetramethyl-4, 5benzindodicarbocyanine 5.

21. Method according to any one of claims 1 to 20, characterized in that the molecule or molecules whose structural parameters are to be determined are nucleotides.

22. Method according to any one of claims 1 to 20, characterized in that the molecule or molecules whose structural parameters are to be determined are phospholipids.

23. Use of the method according to any one of claims 1 to 22, for the analysis of local structural modifications of molecules.

24. Use according to claim 23 for the analysis of local structural modifications of DNA, in particular of human DNA.

25. Use according to claim 23 for the analysis of local structural modifications of RNA, in particular of human RNA.

26. Use according to any one of claims 23 to 25 for detecting a hybridization between a sequence and its complementary sequence.