FR2820434A1

FR2820434A1 - USE OF OLIGONUCLEOTIDES TO IMPROVE THE TRANSFECTION OF PLASMIDS INTO CELLS, TRANSFECTION METHOD AND KIT

Info

Publication number: FR2820434A1
Application number: FR0101494A
Authority: FR
Inventors: Claude Malvy; Andrei Maksimenko; Marina Gottikh
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2001-02-05
Filing date: 2001-02-05
Publication date: 2002-08-09
Also published as: WO2002062943A3; AU2002233423A1; WO2002062943A2

Abstract

The invention concerns the use of oligonucleotides for improving gene transfection in cells, <i>in vitro</i> and <i>in vivo</i>, and the corresponding transfection method and mixture.

Description

La présente invention est relative à l'utilisation d'oligonucléotides pour améliorer la transfection de gènes dans des cellules, in vitro et in vivo, ainsi qu'au procédé et au un mélange de transfection correspondants. The present invention relates to the use of oligonucleotides for improving the transfection of genes in cells, in vitro and in vivo, as well as to the corresponding transfection method and mixture.

La thérapie génique est fondée sur l'administration thérapeutique d'acides nucléiques ; elle nécessite l'utilisation de vecteurs efficaces et sûrs pour le transfert des gènes thérapeutiques et son succès dépend donc de l'efficacité du transfert des gènes d'intérêt dans les cellules souhaitées. Gene therapy is based on the therapeutic administration of nucleic acids; it requires the use of efficient and safe vectors for the transfer of therapeutic genes and its success therefore depends on the efficiency of the transfer of the genes of interest into the desired cells.

De nombreuses compositions aptes à transfecter des cellules eucaryotes avec un matériel génétique sélectionné ont déjà été décrites et appartiennent essentiellement à deux grands types de vecteurs de transfection : - les vecteurs de transfection viraux, sont des outils puissants en terme d'efficacité de transfection, cependant ils présentent des limites d'utilisation : non-spécificité tissulaire, nécessité d'obtenir des constructions pour chaque gène d'intérêt, risques potentiels pour l'environnement qui conduisent à la mise en place d'infrastructures cliniques coûteuses et contraignantes pour le malade et pour le

personnel (Briand et al., Pathol. Biol., 1993, 41 (8), 663-671 ; Roessler BJ et al., Hum. Gene Ther., 1995, 6 (3), 307-316), problèmes de réponse immunitaire (Wagner E et al., Curr. Opin. Biotechnol., 1993, 4, 705-710 ; Curiel D. T., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1994, 716, 36-56), de production par recombinaison homologue de particules virales et d'effets oncogènes potentiels ; - les vecteurs de transfection non-viraux (vecteurs synthétiques), capables de promouvoir le transfert et l'expression de substances chimiques telles que l'ADN dans les cellules eucaryotes. Numerous compositions capable of transfecting eukaryotic cells with a selected genetic material have already been described and essentially belong to two major types of transfection vectors: - viral transfection vectors are powerful tools in terms of transfection efficiency, however they have limits of use: tissue non-specificity, need to obtain constructions for each gene of interest, potential risks for the environment which lead to the establishment of costly and restrictive clinical infrastructures for the patient and for the

personal (Briand et al., Pathol. Biol., 1993, 41 (8), 663-671; Roessler BJ et al., Hum. Gene Ther., 1995, 6 (3), 307-316), response problems immune (Wagner E et al., Curr. Opin. Biotechnol., 1993, 4, 705-710; Curiel DT, Ann. NY Acad. Sci., 1994, 716, 36-56), production by homologous recombination of particles viral and potential oncogenic effects; - non-viral transfection vectors (synthetic vectors), capable of promoting the transfer and expression of chemical substances such as DNA in eukaryotic cells.

Les vecteurs synthétiques sont donc proposés comme une alternative aux vecteurs viraux. Synthetic vectors are therefore offered as an alternative to viral vectors.

Ces vecteurs synthétiques doivent avoir essentiellement deux fonctions : condenser l'ADN à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et éventuellement les membranes nucléaires ; pour être efficaces, de tels vecteurs doivent donc mimer le fonctionnement des virus. These synthetic vectors must have essentially two functions: to condense the DNA to be transfected and to promote its cellular fixation as well as its passage through the plasma membrane and possibly the nuclear membranes; to be effective, such vectors must therefore mimic the functioning of viruses.

A ce titre, différents types de composés chargés positivement, capables d'interagir de façon électrostatique avec l'ADN chargé négativement, peuvent être utilisés. As such, different types of positively charged compounds capable of interacting electrostatically with negatively charged DNA can be used.

C'est ainsi que l'on a déjà proposé d'utiliser : - des polymères cationiques linéaires tels que la poly (L-lysine) et ses conjugués (Curiel et al., pré-cité ; Wagner E et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1991,88 (10), 4255-4259 ; Stankovics J. et al., Hum. Gene Ther., 1994,5 (9), 1095- 1104), - des polymères ramifiés tels que les dendrimères de type polyamidoamine, les dendrimères phosphorés (Haensler J et al., Bioconjug. Chem., 1993, 4 (5), 372-379 ; Kang SH et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 1999,9 (6),

497-505 ; Bielinska A et al., Nucleic Acids Res., 1996, 24 (11), 2176-2182 ; Tang et al., Bioconjug. Chem., 1996, 7 (6), 703-714 ; Loup et al., Chem. Eur. J., 1999, 5, 3644-3650) ou le polyéthylèneimine (Boussif 0 et al., Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A., 1995, 92 (16), 7297-7301), - des lipides cationiques (Bielinska et al., pré-cité ; Felgner PL et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1995, 772, 126-139 ; Vigneron JP et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Thus, it has already been proposed to use: linear cationic polymers such as poly (L-lysine) and its conjugates (Curiel et al., Cited above; Wagner E et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991,88 (10), 4255-4259; Stankovics J. et al., Hum. Gene Ther., 1994,5 (9), 1095-1104), - branched polymers such as polyamidoamine type dendrimers, phosphorus dendrimers (Haensler J et al., Bioconjug. Chem., 1993, 4 (5), 372-379; Kang SH et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 1999,9 (6 ),

497-505; Bielinska A et al., Nucleic Acids Res., 1996, 24 (11), 2176-2182; Tang et al., Bioconjug. Chem., 1996, 7 (6), 703-714; Loup et al., Chem. Eur. J., 1999, 5, 3644-3650) or polyethyleneimine (Boussif 0 et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1995, 92 (16), 7297-7301), - cationic lipids (Bielinska et al. ., cited above; Felgner PL et al., Ann. NY Acad. Sci., 1995, 772, 126-139; Vigneron JP et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

U. S. A., 1996, 93 (18), 9682-9686 ; Byk et al., J. Med. Chem., 1998, 41 (2), 229-235), ou bien encore -des liposomes (Miller et al., Chem., 1998, 11, 1882-1884 ; Hara T et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1997, 94 (26), 14547-14552 ; Koltover J et al., Science, 1998,281 (5373), 78-81). U. S. A., 1996, 93 (18), 9682-9686; Byk et al., J. Med. Chem., 1998, 41 (2), 229-235), or even liposomes (Miller et al., Chem., 1998, 11, 1882-1884; Hara T et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94 (26), 14547-14552; Koltover J et al., Science, 1998,281 (5373), 78-81).

Parmi ces composés cationiques, les dendrimères de type polyamidoamine (PAMAM) et les dendrimères phosphorés tels que ceux décrits par Loup C. et al. (pré-cité) sont les plus efficaces en terme de niveau de transfection vis- à-vis d'une large variété de cellules en culture (Haensler J et al., pré-cité) et sont intéressants, à efficacité égale, pour leur toxicité moindre par rapport à celle des systèmes lipidiques. Among these cationic compounds, dendrimers of polyamidoamine type (PAMAM) and phosphorus dendrimers such as those described by Loup C. et al. (cited above) are the most efficient in terms of transfection level against a wide variety of cells in culture (Haensler J et al., cited above) and are interesting, with equal efficiency, for their less toxicity compared to that of lipid systems.

Le terme dendrimère provient des mots dendrite et polymère, le premier évoquant la structure ramifiée des dendrimères, le second la répétition d'un motif. The term dendrimer comes from the words dendrite and polymer, the first referring to the branched structure of dendrimers, the second to the repetition of a motif.

Les dendrimères présentent en effet une structure fractale, constituée d'un coeur, de branches, de cavités internes résultant des ramifications de la molécule, et de fonctions terminales. The dendrimers in fact have a fractal structure, consisting of a core, branches, internal cavities resulting from the ramifications of the molecule, and terminal functions.

L'ensemble des points de jonctions des branches situés à une égale distance du coeur correspond à une génération. The set of branch junction points located at an equal distance from the heart corresponds to one generation.

Le nombre de générations pour un dendrimère donné n'est pas limité et dépend de la structure et de la longueur des branches. The number of generations for a given dendrimer is not limited and depends on the structure and the length of the branches.

Les dendrimères sont synthétisés par répétition d'une même séquence réactionnelle permettant l'obtention d'une nouvelle génération-à la fin de chaque cycle de synthèse et par conséquent d'un nombre croissant de branches et de fonctions périphériques toutes identiques (Frechet JM, Science, 1994,263 (5154), 1710-1715). The dendrimers are synthesized by repeating the same reaction sequence allowing a new generation to be obtained - at the end of each synthesis cycle and consequently an increasing number of branches and peripheral functions which are all identical (Frechet JM, Science, 1994,263 (5154), 1710-1715).

L'efficacité des dendrimères comme vecteurs synthétiques dépend de leur charge de surface, de leur solubilité, de leur taille et de la modification chimique de leur structure initiale par traitement thermique (Bielinska A et al., pré-

cité ; Tang et al., pré-cité ; Kukowska-Latallo JF et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,
1996,93 (10), 4897-4902). En particulier, les traitements thermiques des dendrimères conduisent à une population de composés hétérodispersés. The effectiveness of dendrimers as synthetic vectors depends on their surface charge, their solubility, their size and the chemical modification of their initial structure by heat treatment (Bielinska A et al., Pre-

cited; Tang et al., Supra; Kukowska-Latallo JF et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1996.93 (10), 4897-4902). In particular, the heat treatments of the dendrimers lead to a population of heterodisperse compounds.

Bien que présentant certains avantages par rapport à l'utilisation de vecteurs viraux, notamment du point de vue immunologique, l'utilisation des dendrimères à titre de vecteur synthétique est très onéreuse compte tenu de la quantité de dendrimères à utiliser lors de l'étape de transfection des cellules. Although having certain advantages over the use of viral vectors, in particular from an immunological point of view, the use of dendrimers as synthetic vector is very expensive given the quantity of dendrimers to be used during the step of transfection of cells.

En effet à l'heure actuelle, pour réaliser la transfection d'environ 10 6 cellules, il est nécessaire d'utiliser environ 20 ug de dendrimères et 2 u. g de plasmide. In fact, at the present time, to carry out the transfection of approximately 10 6 cells, it is necessary to use approximately 20 μg of dendrimers and 2 μg. g of plasmid.

Cependant, dans ces conditions, et au bout de 16 heures de réaction, seulement 20 % des cellules cibles sont transfectées par le plasmide, ce qui n'est pas satisfaisant tant du point de vue du taux de transfection (pourcentage de cellules transfectées) que du rendement de transfection (quantité de mélange de transfection à utiliser par rapport à un nombre de cellules cible donné). However, under these conditions, and after 16 hours of reaction, only 20% of the target cells are transfected with the plasmid, which is not satisfactory both from the point of view of the transfection rate (percentage of transfected cells) and transfection yield (amount of transfection mixture to be used relative to a given number of target cells).

D'autre part, une telle dose de dendrimères (20ug) est généralement toxique vis-à-vis des cellules à transfecter. On the other hand, such a dose of dendrimers (20 μg) is generally toxic to the cells to be transfected.

C'est afin de remédier à l'ensemble de ces problèmes que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de l'invention. It is in order to remedy all of these problems that the inventors have developed what is the subject of the invention.

La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'au moins un oligonucléotide à liaison phosphodiester, linéaire, comprenant de 20 à 60 bases, dans un procédé de transfection de cellules eucaryotes par une séquence d'acide nucléique d'intérêt, lequel procédé mettant en oeuvre au moins un dendrimère et au moins un acide nucléique d'intérêt, pour améliorer la transfection desdites cellules. A subject of the present invention is therefore the use of at least one linear oligonucleotide with a phosphodiester bond, comprising from 20 to 60 bases, in a process for transfection of eukaryotic cells with a nucleic acid sequence of interest, which process using at least one dendrimer and at least one nucleic acid of interest, to improve the transfection of said cells.

Les Inventeurs ont en effet démontré, de manière surprenante, que l'utilisation d'un tel oligonucléotide permet, pour un nombre identique de cellules cibles, non seulement d'améliorer le taux de transfection (environ 100 % des cellules cibles sont transfectées au bout de 16 heures de réaction), mais également le rendement de transfection puisqu'il permet de réduire de plus de trois fois la quantité nécessaire de dendrimère à utiliser. The inventors have in fact demonstrated, surprisingly, that the use of such an oligonucleotide makes it possible, for an identical number of target cells, not only to improve the transfection rate (approximately 100% of the target cells are transfected after 16 hours of reaction), but also the transfection yield since it makes it possible to reduce by more than three times the necessary quantity of dendrimer to be used.

Les dendrimères permettant de réaliser l'opération de transfection des cellules peuvent être sphériques ou dénaturés (cassés) par un traitement thermique (thermolyse). The dendrimers making it possible to carry out the operation of transfection of the cells can be spherical or denatured (broken) by heat treatment (thermolysis).

Parmi les dendrimères dénaturés thermiquement, on peut notamment citer les dendrimères de type polyamidoamine (PAMAM), de cinquième à dixième génération (G5-Glo), dans lesquels le noyau central (à partir duquel le processus de polymérisation est initié) est un ammonium ou une éthylènediamine (EDA).

Among the thermally denatured dendrimers, mention may in particular be made of dendrimers of polyamidoamine (PAMAM) type, from fifth to tenth generation (G5-Glo), in which the central nucleus (from which the polymerization process is initiated) is an ammonium or an ethylenediamine (EDA).

Ces dendrimères PAMAM contiennent un nombre défini de groupes tD aminés à leur surface et sont chargés positivement à pH physiologique. rz > ID
De tels dendrimères sont notamment décrits dans l'article de Tang et al. (pré-cité) et doivent être dénaturés par traitement thermique pour donner des composés actifs en transfection. These PAMAM dendrimers contain a defined number of amino tD groups on their surface and are positively charged at physiological pH. rz> ID
Such dendrimers are in particular described in the article by Tang et al. (cited above) and must be denatured by heat treatment to give compounds active in transfection.

Parmi ceux-ci, on peut notamment citer les dendrimères vendus sous la dénomination SuperFect < R) par la société Qiagen (qui sont des dendrimères dégradés thermiquement). Among these, mention may in particular be made of the dendrimers sold under the name SuperFect (R) by the company Qiagen (which are thermally degraded dendrimers).

Parmi les dendrimère sphériques, on peut notamment citer les dendrimères phosphorés polycationiques tels que ceux décrits dans l'article de Loup et al. (pré-cité) ainsi que dans la demande de brevet français 99 14864, constitués : Among the spherical dendrimers, mention may in particular be made of polycationic phosphorus dendrimers such as those described in the article by Loup et al. (cited above) as well as in French patent application 99 14864, consisting of:

- d'une couche centrale sous la forme d'un noyau central Po comprenant de 2 à 8 groupements fonctionnalisés, - de n couches intermédiaires, identiques ou différentes, chacune desdites couches intermédiaires étant constituée d'unités P répondant à la formule (I) suivante :

dans laquelle :
L est un atome d'oxygène, de phosphore ou de soufre,
M représente l'un des groupes suivants : un groupe aromatique di-, tri-ou tétrasubstitué par des groupes alkyles, des groupes alcoxy, des groupement insaturés du type oléfinique en CI-CI2, azoïques, acétylénique, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, ou . un groupe alkyle ou alcoxy comportant plusieurs substituants tels que définis lorsque M est un groupe aromatique,
RI et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, de soufre, d'azote ou des halogènes avec RI étant le plus souvent différent de RI, n est un nombre entier compris entre 1 et 11,
E est un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote, ledit atome d'azote pouvant être lié à un groupe alkyle, alcoxy ou aryle, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, - une couche externe constituée d'unités P2, identiques ou différentes, et répondant à la formule II suivante : - of a central layer in the form of a central core Po comprising from 2 to 8 functionalized groups, - of n intermediate layers, identical or different, each of said intermediate layers consisting of P units corresponding to formula (I) next :

in which :
L is an oxygen, phosphorus or sulfur atom,
M represents one of the following groups: a di-, tri- or tetrasubstituted aromatic group with alkyl groups, alkoxy groups, unsaturated groups of the olefinic type C 1 -C 2, azo, acetylenic, all these groups possibly incorporating or not phosphorus, oxygen, nitrogen, sulfur or halogen atoms, or. an alkyl or alkoxy group comprising several substituents as defined when M is an aromatic group,
RI and R2, which may be identical or different, represent a hydrogen atom or one of the following groups: alkyl, alkoxy, aryl, whether or not comprising phosphorus, oxygen, sulfur, nitrogen or halogens with RI being most often different from RI, n is an integer between 1 and 11,
E is an oxygen, sulfur or nitrogen atom, said nitrogen atom possibly being bonded to an alkyl, alkoxy or aryl group, all of these groups possibly incorporating phosphorus, oxygen or carbon atoms or not. nitrogen, sulfur or halogens, - an outer layer made up of P2 units, identical or different, and corresponding to the following formula II:

dans laquelle : Rs représente un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, W représente l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, tous ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, R3 et R4, identiques ou différents, représentent un groupe alkyle en CI-C5, X représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-5 ou est absent, et Z représente un ion halogénure, un groupe alkylCOO'ou tout autre groupement anionique comportant des atomes de carbone, d'oxygène, de soufre, d'azote, de phosphore ou d'halogène, ou est absent.

in which: Rs represents a hydrogen atom or one of the following groups: alkyl, alkoxy, aryl, these groups whether or not comprising phosphorus, oxygen, nitrogen, sulfur or halogen atoms, W represents one of the following groups: alkyl, alkoxy, aryl, all these groups whether or not comprising phosphorus, oxygen, nitrogen, sulfur or halogen atoms, R3 and R4, which may be identical or different, represent an alkyl group in CI-C5, X represents a hydrogen atom or a C 1-5 alkyl group or is absent, and Z represents a halide ion, an alkylCOO ′ group or any other anionic group comprising carbon or oxygen atoms, sulfur, nitrogen, phosphorus or halogen, or is absent.

De façon préférentielle, le noyau central Po de ces dendrimères est sélectionné dans le groupe constitué par le groupement de formule générale Illa : t > ID

Preferably, the central nucleus Po of these dendrimers is selected from the group consisting of the group of general formula IIIa: t> ID

et le groupement de formule générale lllb : 1

and the group of general formula IIIb: 1

la formule 1 représente le groupe suivant :

formula 1 represents the following group:

et le groupe de formule II est notamment le groupe suivant : lm

avec p = 1 à 5.

and the group of formula II is in particular the following group: lm

with p = 1 to 5.

On peut obtenir plusieurs types de produits désignés de manière générale par la formule A-[Gn], dans laquelle A définit le type d'unité terminale et Gn définit le nombre de couches d'unités intermédiaires Pl correspondant au nombre de générations :

- la série des composés 2-[Gn] présente des unités terminales de formule II, dans lesquelles X représente un atome d'hydrogène, p est égal à 2, R. 3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyles, Z est un ion chlorure et n est un nombre entier compris entre 1 et 11, de préférence entre 1 et 10 ; - la série des composés 3- [Gn] présente des unités terminales de formule II, dans lesquelles X est vide, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyles, Z est vide et n est un nombre entier compris entre 1 et 11, de préférence entre 1 et 10 ; - la série des composés 4- [Gn] présente des unités terminales de formule II, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyles, Z est un ion iodure et n est un nombre entier compris entre 1 et 11, de préférence entre 1 et 10 ; - la série des composés 5- [Gn] présente des unités terminales de formule II, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyles, Z est un groupe CH3COO-et n est un nombre entier compris entre 1 et 11, de préférence entre 1 et 10 ; Several types of products can be obtained, generally designated by the formula A- [Gn], in which A defines the type of terminal unit and Gn defines the number of layers of intermediate units Pl corresponding to the number of generations:

- the series of compounds 2- [Gn] has terminal units of formula II, in which X represents a hydrogen atom, p is equal to 2, R. 3 and R4 are identical and represent ethyl groups, Z is a chloride ion and n is an integer between 1 and 11, preferably between 1 and 10; - the series of compounds 3- [Gn] has terminal units of formula II, in which X is empty, p is equal to 2, R3 and R4 are identical and represent ethyl groups, Z is empty and n is an integer between 1 and 11, preferably between 1 and 10; - the series of compounds 4- [Gn] has terminal units of formula II, in which X represents a methyl group, p is equal to 2, R3 and R4 are identical and represent ethyl groups, Z is an iodide ion and n is an integer between 1 and 11, preferably between 1 and 10; - the series of compounds 5- [Gn] has terminal units of formula II, in which X represents a methyl group, p is equal to 2, R3 and R4 are identical and represent ethyl groups, Z is a CH3COO-group and n is an integer between 1 and 11, preferably between 1 and 10;

Parmi ces dendrimères, les composés 2- [G3-5] ayant respectivement 48 (2- [G3]), 96 (2- [G4]) et 192 (2- [G5]) charges positives de surface (ammonium quaternaires), sont particulièrement préférés selon l'invention. Ces dendrimères sont représentés sur les figures 1 à 3 annexées.

Among these dendrimers, the compounds 2- [G3-5] having respectively 48 (2- [G3]), 96 (2- [G4]) and 192 (2- [G5]) positive surface charges (quaternary ammonium), are particularly preferred according to the invention. These dendrimers are shown in Figures 1 to 3 attached.

Selon une forme de réalisation de l'invention, et lorsque le dendrimère utilisé est sphérique, c'est-à-dire qu'il n'a subi aucune dénaturation par traitement thermique, alors l'ON comprend de préférence de 20 à 40 bases. Dans ce cas de figure, on préfère utiliser tout particulièrement des ON comprenant 36 bases. According to one embodiment of the invention, and when the dendrimer used is spherical, that is to say that it has not undergone any denaturation by heat treatment, then the ON preferably comprises from 20 to 40 bases . In this case, it is most particularly preferred to use ONs comprising 36 bases.

Selon une autre forme de réalisation de l'invention, et lorsque le dendrimère utilisé a été dénaturé thermiquement, alors l'ON comprend de préférence de 45 à 55 bases. According to another embodiment of the invention, and when the dendrimer used has been thermally denatured, then the ON preferably comprises 45 to 55 bases.

Selon l'invention et de manière générale, le rapport pondéral acide nucléique/oligonucléotide (ON) /dendrimère à utiliser, varie de préférence entre 0, 5/2/10 et 1/6/14.

According to the invention and in general, the nucleic acid / oligonucleotide (ON) / dendrimer weight ratio to be used preferably varies between 0.5/2/10 and 1/6/14.

Lorsque le dendrimère utilisé est sphérique, pour 1 u. g d'acide nucléique à transfecter, il est préférable d'utiliser de 2 à 6 ig d'ON et de 10 à 14 u. g de dendrimère. When the dendrimer used is spherical, for 1 u. g of nucleic acid to be transfected, it is preferable to use 2-6 ug ON and 10-14 u. g of dendrimer.

Lorsque le dendrimère utilisé est dénaturé thermiquement, la quantité d'ON à utiliser dépend de la quantité de mélange acide nucléique/dendrimère utilisée et est de préférence de : - 2, 5 u. g d'oligonucléotide et 12 u. g de dendrimère pour 1 u. g d'acide nucléique ou bien -3 lug d'oligonucléotide et 6 g de dendrimère pour 0,5 u. g d'acide nucléique. When the dendrimer used is thermally denatured, the amount of ON to use depends on the amount of nucleic acid / dendrimer mixture used and is preferably: - 2.5 u. g of oligonucleotide and 12 u. g of dendrimer for 1 u. g of nucleic acid or alternatively -3 µg of oligonucleotide and 6 g of dendrimer for 0.5 u. g of nucleic acid.

Les cellules eucaryotes pouvant être transfectées selon l'utilisation conforme à l'invention sont les cellules humaines à traiter en fonction de la pathologie. The eukaryotic cells which can be transfected according to the use in accordance with the invention are the human cells to be treated depending on the pathology.

Un autre objet de l'invention est un mélange de transfection de cellules eucaryotes par une séquence d'acide nucléique d'intérêt caractérisé par le fait qu'il comprend, dans un milieu physiologiquement acceptable : - au moins un dendrimère, - au moins un oligonucléotide à liaison phosphodiester, linéaire, comprenant de 20 à 60 bases, et Another subject of the invention is a mixture for transfection of eukaryotic cells with a nucleic acid sequence of interest characterized in that it comprises, in a physiologically acceptable medium: - at least one dendrimer, - at least one linear phosphodiester-linked oligonucleotide comprising 20 to 60 bases, and

- au moins ledit acide nucléique d'intérêt. Selon une variante de l'invention, ce mélange de transfection peut résulter du mélange : - d'au moins une composition A contenant des dendrimères en solution dans un milieu physiologiquement acceptable, et - d'au moins une composition B contenant les oligonucléotides et les acides nucléiques d'intérêt en solution dans un milieu physiologiquement acceptable. - at least said nucleic acid of interest. According to one variant of the invention, this transfection mixture can result from the mixture of: - at least one composition A containing dendrimers in solution in a physiologically acceptable medium, and - at least one composition B containing the oligonucleotides and the nucleic acids of interest in solution in a physiologically acceptable medium.

Selon cette variante, le mélange des compositions A et B devra être effectué 10 à 30 minutes avant l'emploi du mélange de transfection résultant. According to this variant, the mixing of compositions A and B should be carried out 10 to 30 minutes before the use of the resulting transfection mixture.

Selon l'invention, le milieu physiologiquement acceptable est de préférence constitué par une solution de chlorure de sodium à la concentration physiologique de 150 mM. According to the invention, the physiologically acceptable medium is preferably constituted by a solution of sodium chloride at a physiological concentration of 150 mM.

Parmi ces mélanges de transfection, et lorsque les dendrimères utilisés sont sphériques, on préfère les mélanges comprenant de : a) de 5 à 7 ig de dendrimères,

b) de 1 à 3 ug d'oligonucléotides, et c) de 0, 4 à 0, 6 ig d'acides nucléiques. Among these transfection mixtures, and when the dendrimers used are spherical, preference is given to mixtures comprising: a) from 5 to 7 μg of dendrimers,

b) from 1 to 3 µg of oligonucleotides, and c) from 0.4 to 0.6 µg of nucleic acids.

Un mélange de transfection tout particulièrement préféré est constitué par une solution de : a) 6 pig de dendrimères sphériques, b) 1,5 g d'oligonucléotides, et c) 0,5 ug d'acides nucléiques, dans 150 u. l de chlorure de sodium 150 mM. A very particularly preferred transfection mixture consists of a solution of: a) 6 μg of spherical dendrimers, b) 1.5 g of oligonucleotides, and c) 0.5 μg of nucleic acids, in 150 μ. l of 150 mM sodium chloride.

Selon une autre forme de réalisation préférée de l'invention, et lorsque les dendrimères utilisés sont dénaturés thermiquement, on préfère les mélanges de transfection comprenant : a) 12 g de dendrimères, b) 2,5 ug d'oligonucléotides et c) 1 g d'acides nucléiques ; ou bien a) 6 g de dendrimères,

b) 3 ug d'oligonucléotides et ZD According to another preferred embodiment of the invention, and when the dendrimers used are thermally denatured, the transfection mixtures comprising: a) 12 g of dendrimers, b) 2.5 μg of oligonucleotides and c) 1 g are preferred. nucleic acids; or a) 6 g of dendrimers,

b) 3 µg of oligonucleotides and ZD

c) 0, 5 ug d'acides nucléiques.

c) 0.5 µg of nucleic acids.

Enfin l'invention a pour objet un procédé de transfection de cellules eucaryotes caractérisé par le fait qu'il consiste à mettre en contact lesdites cellules avec un mélange de transfection conforme à l'invention et tel que défini précédemment. Finally, the subject of the invention is a process for transfection of eukaryotic cells, characterized in that it consists in bringing said cells into contact with a transfection mixture in accordance with the invention and as defined above.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de transfection de cellules HeLa par un complexe plasmide/dendrimère en présence ou en l'absence d'oligonucléotide, ainsi qu'aux figures 1 à 5 qui représentent : - Figure 1 : le dendrimère 2- [G3] utilisé à l'exemple 1, - Figure 2 : le dendrimère 2- (G4) utilisé à l'exemple 1, - Figure 3 : le dendrimère 2 [G5] utilisé à l'exemple 1, - Figure 4a : l'activité ss-galactosidase (Unités Relatives de Luminescence : URL/g de protéine) exprimée en fonction des rapports plasmide/dendrimère,

- Figure 4b : l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) exprimée en fonction de la quantité d'ON36L en u. g, - Figure 5a : l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) exprimée en fonction de différentes quantités de mélanges p ! asmide/ON36L/dendrimère, - la figure 5b : l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) exprimée en fonction de différentes quantités de mélanges plasmide/dendrimère (sans oligonucléotide). In addition to the foregoing arrangements, the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to an example of transfection of HeLa cells by a plasmid / dendrimer complex in the presence or in the absence of. oligonucleotide, as well as in Figures 1 to 5 which represent: - Figure 1: the dendrimer 2- [G3] used in example 1, - Figure 2: the dendrimer 2- (G4) used in example 1, - Figure 3: dendrimer 2 [G5] used in Example 1, - Figure 4a: ss-galactosidase activity (Relative Luminescence Units: URL / g of protein) expressed as a function of the plasmid / dendrimer ratios,

- Figure 4b: ss-galactosidase activity (URL / g of protein) expressed as a function of the amount of ON36L in u. g, - Figure 5a: ss-galactosidase activity (URL / g of protein) expressed as a function of different amounts of mixtures p! asmid / ON36L / dendrimer, - Figure 5b: ss-galactosidase activity (URL / g of protein) expressed as a function of different amounts of plasmid / dendrimer mixtures (without oligonucleotide).

Il doit être bien entendu toutefois que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont il ne constitue en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that this example is given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which it in no way constitutes a limitation.

EXEMPLE : ÉTUDE COMPARATIVE DE LA TRANSFECTION DES CELLULES HeLa PAR LE PLASMIDE pCMVÇ-gal AVEC OU SANS OLIGONUCLÉOTIDE A) Matériel et méthode A-1) Produits chimiques
Dendrimères utilisés : - le dendrimère dénaturé thermiquement vendu sous la dénomination SuperFect&commat; (3mg/ml) par la société Qiagen (Allemagne), (ou SU) ;

- le dendrimère 2-[G3] tel que représenté à la figure 1, présentant ZD une masse moléculaire de 16 285, 041 g. mol'' (ou PG3) ; - le dendrimère 2-[G4] tel que représenté à la figure 2, présentant une masse moléculaire de 33 702, 337 g. mol'' (ou PG4) ; - le dendrimère 2-[G5] tel que représenté à la figure 3, présentant une masse moléculaire de 68 536,93 g. mol'' (ou PG5).

EXAMPLE: COMPARATIVE STUDY OF HeLa CELL TRANSFECTION BY PLASMID pCMVÇ-gal WITH OR WITHOUT OLIGONUCLEOTIDE A) Material and method A-1) Chemicals
Dendrimers used: - the thermally denatured dendrimer sold under the name SuperFect &commat; (3 mg / ml) by the company Qiagen (Germany), (or SU);

- the dendrimer 2- [G3] as represented in FIG. 1, exhibiting ZD a molecular mass of 16,285,041 g. mol '' (or PG3); - the dendrimer 2- [G4] as represented in FIG. 2, exhibiting a molecular mass of 33 702, 337 g. mol '' (or PG4); - the dendrimer 2- [G5] as represented in FIG. 3, exhibiting a molecular mass of 68,536.93 g. mol '' (or PG5).

Autre produit :

- CPRG (rouge de chlorophénol-ss-D-galactopyranoside) vendu par la société Boeringher Mannheim A-2) Plasmide et oligonucléotides - plasmide pCMVp-gaI (Clontech) codant pour le gène de la ss-galactosidase, - oligonucléotide linéaire comprenant 36 bases (ON36L), correspondant à la SEQ ID n l :
ACATCTTGACACCTTGACTCCCTATTGCCACTCCAC. Other product:

- CPRG (chlorophenol-ss-D-galactopyranoside red) sold by the company Boeringher Mannheim A-2) Plasmid and oligonucleotides - plasmid pCMVp-gaI (Clontech) encoding the ss-galactosidase gene, - linear oligonucleotide comprising 36 bases (ON36L), corresponding to SEQ ID nl:
ACATCTTGACACCTTGACTCCCTATTGCCACTCCAC.

Cet oligonucléotide a été synthétisé et purifié par Eurogentech. This oligonucleotide was synthesized and purified by Eurogentech.

A-3) Lignée cellulaire et conditions de culture
Des cellules HeLa (Human epitheloid carcinoma cells ; Institut Pasteur, Paris) ont été cultivées dans un milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) contenant 10% de sérum de veau foetal (SVF) inactivé par un traitement à la chaleur à 57 C pendant 30 minutes (Gibco-BRL, Allemagne), de la streptomycine (100 g/ml) et de la pénicilline (100 U/ml). Les cellules ont été maintenues à 37 C en atmosphère humide à 5 % de COl. A 80 % de confluence, les cellules ont été A-3) Cell line and culture conditions
HeLa cells (Human epitheloid carcinoma cells; Institut Pasteur, Paris) were cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) medium containing 10% fetal calf serum (FCS) inactivated by heat treatment at 57 C for 30 minutes (Gibco-BRL, Germany), streptomycin (100 g / ml) and penicillin (100 U / ml). The cells were maintained at 37 ° C. in a humid atmosphere at 5% COl. At 80% confluence, the cells were

détachées par traitement à la trypsine-EDTA (Gibco-BRL, Allemagne), puis cultivées à nouveau dans de nouveaux flacons de culture après une dilution au 115. detached by treatment with trypsin-EDTA (Gibco-BRL, Germany), then cultured again in new culture flasks after dilution to 115.

A-4) Préparation des complexes dendrimères/plasmide
Les quantités désirées de plasmide (à partir d'une solution aqueuse stock initiale à 0,4 mg/ml) et de dendrimères SU, PG3, PG4 et PGs (à partir de solution stock dans l'eau stérile) ont été diluées dans chacune 50 u. l d'une solution de NaCl 150 mM, vortexées doucement et centrifugées.

A-4) Preparation of dendrimer / plasmid complexes
The desired amounts of plasmid (from an initial stock aqueous solution at 0.4 mg / ml) and SU, PG3, PG4 and PGs dendrimers (from stock solution in sterile water) were diluted in each. 50 u. l of 150 mM NaCl solution, gently vortexed and centrifuged.

La même procédure a été utilisée pour la préparation de solutions de 100 nul de l'ON 36L dans du NaCl 150 mM. The same procedure was used for the preparation of 100 nil solutions of ON 36L in 150 mM NaCl.

Ont ainsi été préparées : des solutions de plasmide dans 50 ul de NaCl 150 mM, des solutions de chacun des dendrimères dans 50 u. l de NaCI 150 mM et des solutions identiques de l'ON 36L dans 100 nul de Nach 150 mM. The following were thus prepared: plasmid solutions in 50 μl of 150 mM NaCl, solutions of each of the dendrimers in 50 μl. 1 of 150 mM NaCl and identical solutions of ON 36L in 100 µl of 150 mM Nach.

Au bout de 5 minutes, les solutions contenant le plasmide ont été mélangées avec les solutions d'ON 36L. After 5 minutes, the solutions containing the plasmid were mixed with the ON 36L solutions.

Au bout de 10 minutes, les solutions de dendrimères ont été ajoutées à chacun des mélanges plasmide/ON36L préparées précédemment, vortexées et incubées pendant 15 minutes à température ambiante. Ces solutions finales, renfermant le mélange plasmide/ON36L/dendrimère ont ensuite été immédiatement utilisées pour la transfection des cellules. After 10 minutes, the dendrimer solutions were added to each of the plasmid / ON36L mixtures prepared previously, vortexed and incubated for 15 minutes at room temperature. These final solutions, containing the plasmid / ON36L / dendrimer mixture, were then immediately used for the transfection of the cells.

A titre de comparatif, des solutions ne contenant pas d'ON36L, mais contenant seulement un mélange plasmide/dendrimère ont été préparées dans les mêmes conditions. By way of comparison, solutions not containing ON36L, but containing only a plasmid / dendrimer mixture were prepared under the same conditions.

A-5) Préparation des complexes dendrimères/plasmide
Les cellules adhérentes ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits (TPP, Suisse), la veille de la transfection, de façon à atteindre 60-70 % de confluence le jour de la transfection. Toutes les expériences ont été réalisées en triple. A-5) Preparation of dendrimer / plasmid complexes
The adherent cells were seeded in 6-well plates (TPP, Switzerland), the day before transfection, so as to reach 60-70% confluence on the day of transfection. All the experiments were performed in triplicate.

Une demi-heure avant la transfection, les cellules ont été rincées avec 2 ml par puits de tampon phosphate (PBS) et 850 ul de milieu neuf ont été ajoutés dans chaque puits. Half an hour before transfection, cells were rinsed with 2 ml per well of phosphate buffer (PBS) and 850 µl of fresh medium was added to each well.

150 ul de solution contenant le mélange de transfection plasmide/ON36L/dendrimère ou le mélange plasmide/dendrimère à tester est ensuite

ajouté dans chacun des puits. i 150 μl of solution containing the mixture of plasmid / ON36L / dendrimer or the mixture of plasmid / dendrimer to be tested is then

added in each of the wells. i

Après 20 heures d'incubation à 37OC, les cellules ont été lavées deux fois avec 2 ml de PBS, puis l'expression du gène rapporteur a été testée. After 20 hours of incubation at 37OC, the cells were washed twice with 2 ml of PBS, then the expression of the reporter gene was tested.

A-6) Mesure de l'activité ss-galactosidase
400 ul d'un tampon de lyse cellulaire (Promega) a été ajouté dans chacun des puits. Au bout de 20-25 minutes, le lysat cellulaire a été récolté et

centrifugé à 14 000 tours par minute pendant 15 minutes à 4 cl. A-6) Measurement of ss-galactosidase activity
400 µl of cell lysis buffer (Promega) was added to each of the wells. After 20-25 minutes the cell lysate was harvested and

centrifuged at 14,000 rpm for 15 minutes at 4 cl.

Pour effectuer la mesure de l'activité ss-galactosidase, 10-15nul de surnageant ont été mélangés avec 100 ni de tampon de réaction CPRG (4,5 ml/ml de CPRG, 80 mM de tampon phosphate à pH 7,4, 0,7 % de ss-mercaptoéthanol et 9 mM de MgCl2) dans des plaques de 96 puits qui ont été incubées pendant 20 à 40 minutes à 37Oc. To perform the measurement of ss-galactosidase activity, 10-15 µl of supernatant was mixed with 100 µl of CPRG reaction buffer (4.5 ml / ml CPRG, 80 mM phosphate buffer pH 7.4.0 , 7% ss-mercaptoethanol and 9 mM MgCl2) in 96-well plates which were incubated for 20 to 40 minutes at 37Oc.

La mesure de l'activité ss-galactosidase a été réalisée par lecture de l'absorption à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre automatique (Dynatech Laboratories). La concentration en protéine totale de chaque lysat a été quantifiée par rapport à une courbe étalon effectuée pour la sérum albumine bovine (BSA). The ss-galactosidase activity was measured by reading the absorption at 570 nm using an automatic spectrophotometer (Dynatech Laboratories). The total protein concentration of each lysate was quantified against a standard curve performed for bovine serum albumin (BSA).

B) Résultats B-1) Détermination du rapport optimal plasmide/dendrimère
Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 4a sur laquelle l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) est exprimée en fonction des rapports plasmide/dendrimère. B) Results B-1) Determination of the optimal plasmid / dendrimer ratio
The results obtained are shown in FIG. 4a in which the ss-galactosidase activity (URL / g of protein) is expressed as a function of the plasmid / dendrimer ratios.

Différents rapports plasmide/dendrimère allant de 1/1 à 1/50 ont été testés, afin de déterminer quel était le rapport conduisant, en l'absence d'ON36L, aux meilleurs résultats de transfection. Different plasmid / dendrimer ratios ranging from 1/1 to 1/50 were tested, in order to determine which ratio was leading, in the absence of ON36L, to the best transfection results.

Ainsi que cela apparaît sur la figure 4a, le rapport optimal plasmide/dendrimère est compris entre 1/5 et 1/20. Toutes les expériences suivantes

ont donc été réalisées dans un rapport d'environ 1/10 (0, 5 ig de plasmide pour 6 ug de ZD dendrimère). As shown in Figure 4a, the optimum plasmid / dendrimer ratio is between 1/5 and 1/20. All of the following experiences

were therefore carried out in a ratio of approximately 1/10 (0.5 μg of plasmid for 6 μg of dendrimer ZD).

B-2) Détermination du rapport optimal plasmide/ON36L/dendrimère
Les résultats obtenus sont reportés à la figure 4b sur laquelle l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) est exprimée en fonction de la quantité d'ON36L en ug. B-2) Determination of the optimal plasmid / ON36L / dendrimer ratio
The results obtained are shown in FIG. 4b in which the ss-galactosidase activity (URL / g of protein) is expressed as a function of the amount of ON36L in μg.

Ces résultats montrent qu'avec un rapport plasmide/dendrimère d'environ 1/10, l'activité ss-galactosidase est fortement améliorée pour des quantités d'ON36L comprises entre 1 et 3 lug avec les dendrimères PG3 à Pug5, avec une activité maximale pour 1,5 jug d'ON36L. These results show that with a plasmid / dendrimer ratio of approximately 1/10, the ss-galactosidase activity is greatly improved for quantities of ON36L of between 1 and 3 µg with the dendrimers PG3 to Pug5, with maximum activity. for 1.5 jug of ON36L.

Ces résultats montrent également que la quantité optimale de plasmide à utiliser lorsque le dendrimère est le SuperFect&commat; est de l'ordre deter
Ces résultats permettent donc de conclure que les quantités optimales d'ON36L et de dendrimère à utiliser pour 1 ag de plasmide sont respectivement de 1-3 u. g et de 12 g. These results also show that the optimum amount of plasmid to use when the dendrimer is SuperFect &commat; is of the order of deter
These results therefore make it possible to conclude that the optimum quantities of ON36L and of dendrimer to be used for 1 ag of plasmid are respectively 1-3 u. g and 12 g.

B-3) Rôle de l'ON36L lors de la transfection
L'activité ss-galactosidase de cellules transfectées par le complexe plasmide/dendrimère, en présence ou en l'absence de l'oligonucléotide, a été étudiée. B-3) Role of ON36L during transfection
The ss-galactosidase activity of cells transfected with the plasmid / dendrimer complex, in the presence or absence of the oligonucleotide, was studied.

Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 5a sur laquelle l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) est exprimée en fonction des différentes quantités de plasmide, d'ON36L et de dendrimère utilisées, ainsi que sur la figure 5b sur laquelle l'activité ss-galactosidase (URL/g de protéine) est exprimée en fonction des différentes quantités de plasmide et de dendrimère utilisées. The results obtained are shown in FIG. 5a in which the ss-galactosidase activity (URL / g of protein) is expressed as a function of the different amounts of plasmid, ON36L and dendrimer used, as well as in FIG. 5b in which ss-galactosidase activity (URL / g of protein) is expressed as a function of the different amounts of plasmid and dendrimer used.

Ces résultats montrent que pour une quantité égale de plasmide et de dendrimère utilisée, la présence d'un oligonucléotide (dans les proportions relatives déterminées précédemment) permet de multiplier le rendement de transfection par un facteur variant entre 10 et plus de 100 environ. These results show that for an equal quantity of plasmid and dendrimer used, the presence of an oligonucleotide (in the relative proportions determined previously) makes it possible to multiply the transfection yield by a factor varying between 10 and more than approximately 100.

La même expérience réalisée sur des cellules NIH 3T3 a conduit à des résultats similaires. The same experiment performed on NIH 3T3 cells led to similar results.

Par conséquent, l'utilisation d'oligonucléotides tels que définis selon la présente invention permet d'augmenter de manière très importante la capacité (ou rendement) qu'ont les complexes dendrimère/plasmide à transfecter des cellules cibles. Consequently, the use of oligonucleotides as defined according to the present invention makes it possible to increase very significantly the capacity (or yield) that the dendrimer / plasmid complexes have to transfect target cells.

Claims

1. Use of at least one oligonucleotide with a phosphodiester bond, linear, comprising from 20 to 60 bases, in a process for transfection of eukaryotic cells in vitro with a nucleic acid sequence of interest, which process using at least a dendrimer and at least one nucleic acid of interest, to improve the transfection of said cells.

2. Use according to claim 1, characterized in that the dendrimers are spherical or denatured by heat treatment.

3. Use according to claim 2, characterized in that the thermally denatured dendrimers are chosen from dendrimers of polyamidoamine type, of the fifth to tenth generation, in which the central nucleus is an ammonium or an ethylenediamine.

4. Use according to claim 2, characterized in that the spherical dendrimers are chosen from polycationic phosphorus dendrimers consisting of: - a central layer in the form of a central Po core comprising from 2 to 8 functionalized groups, - of n intermediate layers, identical or different, each of said intermediate layers consisting of PI units corresponding to the following formula (I):

in which :

L is an oxygen, phosphorus or sulfur atom,

M represents one of the following groups:. a di-, tri- or tetrasubstituted aromatic group with alkyl groups,

alkoxy groups, unsaturated groups of the C 1 -C 12 olefinic type, azo, c acetylenic, all these groups possibly incorporating or not c phosphorus, oxygen, nitrogen, sulfur or halogen atoms, or

. an alkyl or alkoxy group comprising several substituents as defined when M is an aromatic group,

RI and R2, which may be identical or different, represent a hydrogen atom or one of the following groups: alkyl, alkoxy, aryl, whether or not comprising phosphorus, oxygen, sulfur, nitrogen or halogens with R2 being most often different from RI, n is an integer between 1 and 11,

E is an oxygen, sulfur or nitrogen atom, said nitrogen atom possibly being bonded to an alkyl, alkoxy or aryl group, all of these groups possibly incorporating phosphorus, oxygen or carbon atoms or not. nitrogen, sulfur or halogens, - an outer layer made up of P2 units, identical or different, and corresponding to the following formula II:

in which: Rs represents a hydrogen atom or one of the following groups: alkyl, alkoxy, aryl, these groups whether or not comprising phosphorus, oxygen, nitrogen, sulfur or halogen atoms,

W represents one of the following groups: alkyl, alkoxy, aryl, all these groups whether or not comprising phosphorus, oxygen, nitrogen, sulfur or halogen atoms,

R3 and R4, identical or different, represent an alkyl group in C.-C5,

X represents a hydrogen atom or a C1-C5 alkyl group or is absent, and

Z represents a halide ion, an alkylCOO ′ group or any other anionic group comprising carbon, oxygen, sulfur, nitrogen, phosphorus or halogen atoms or is absent.

5. Use according to claim 4, characterized in that the

central nucleus Po of these dendrimers is selected from the group consisting of the ZD group of general formula ma: zz

and the group of general formula IIIb:

formula 1 represents the following group: ZD

R2 1 0 CH = N-N-P X \: y s S and the group of formula II is in particular the following group:

with p = 1 to 5.

6. Use according to claim 4 or 5, characterized in that the dendrimers are chosen from compounds containing: - terminal units of formula II, in which X represents a hydrogen atom, p is equal to 2, R3 and R4 are the same and represent ethyl groups, Z is a chloride ion and n is an integer between 1 and 11; or

- terminal units of formula II, in which X is empty, p is equal to 2, R3 and R4 are identical and represent ethyl groups, Z is empty and n is an integer between 1 and 11; or else - terminal units of formula II, in which X represents a methyl group, p is equal to 2, R3 and R4 are identical and represent ethyl groups, Z is an iodide ion and n is an integer between 1 and 11; or else - terminal units of formula II, in which X represents a methyl group, p is equal to 2, R3 and R4 are identical and represent ethyl groups, Z is a CH3COO- group and n is an integer between 1 and 11.

7. Use according to claim 6, characterized in that the dendrimers are chosen from compounds containing terminal units of formula II, in which X represents a hydrogen atom, p is equal to 2, R3 and R4 are identical and represent ethyl groups, Z is a chloride ion and n is an integer between 1 and 11.

8. Use according to any one of the preceding claims, characterized in that the dendrimers are spherical and that the oligonucleotide comprises from 20 to 40 bases.

9. Use according to claim 8, characterized in that the oligonucleotide comprises 36 bases.

10. Use according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the dendrimers are thermally denatured and that the oligonucleotide comprises 45 to 55 bases.

He. Use according to any one of the preceding claims, characterized in that the nucleic acid / oligonucleotide / dendrimer weight ratio varies between 0.5/2/10 and 1/6/14.

12. Use according to claim 11, characterized in that

the dendrimer used is spherical and that for 1 µg of nucleic acid to be transfected, 2 to 6 µg of ON and 10 to 14 µg of dendrimer are used.

13. Use according to claim 11, characterized in that the dendrimer used is thermally denatured, and that one uses: - 2.5 μg of oligonucleotide for 1 μg of nucleic acid and 12 μg of dendrimer or else

- 3 u. g of oligonucleotide per 0.5 µg of nucleic acid and 6 µg of dendrimer.

14. Mixture for transfection of eukaryotic cells with a nucleic acid sequence of interest, characterized in that it comprises, in a physiologically acceptable medium: - at least one dendrimer, - at least one oligonucleotide with a phosphodiester bond, linear , comprising from 20 to 60 bases, and - at least said nucleic acid of interest.

15. Transfection mixture according to claim 14, characterized in that it results from the mixture: - of at least one composition A containing dendrimers in solution in a physiologically acceptable medium, and - of at least one composition B containing said oligonucleotides and the nucleic acids of interest in solution in a physiologically acceptable medium.

16. Transfection mixture according to claim 14 or 15, characterized in that the physiologically acceptable medium consists of a sodium chloride solution at a physiological concentration of 150 mM.

17. Transfection mixture according to any one of

claims 14 to 16, characterized in that it comprises: a) from 5 to 7 u. g of spherical dendrimers, b) from 1 to 3 µg of oligonucleotides, and c) from 0.4 to 0.6 µg of nucleic acids.

18. Transfection mixture according to claim 17, characterized in that it consists of a solution of: a) 6 g of spherical dendrimers, b) 1.5 μg of oligonucleotides, and c) 0.5 μg of nucleic acids, in 150 u. I of 150 mM sodium chloride.

19. Transfection mixture according to any one of claims 14 to 16, characterized in that it comprises:

a) 12 µg of thermally denatured dendrimers, b) 2.5 µg of oligonucleotides and c) 1 µg of nucleic acids; or a) 6 µg of thermally denatured dendrimers, b) 3 µg of oligonucleotides and c) 0.5 g of nucleic acids.

20. Process for transfection of eukaryotic cells in vitro characterized in that it consists in bringing said cells into contact with a transfection mixture as defined in any one of claims 14 to 19.