FR2815356A1 - Gene 77 de champignon phytopathogene et son utilisation pour l'identification de composes fongicides - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un nouveau fragment d'acide nucléique du génome du champignon pathogène du riz Magnaporthe grisea comprenant un gène codant pour une protéine (désignée ci-après protéine 77) dont la présence et l'intégrité sont indispensables à la pathogénie de ce champignon vis-à-vis du riz et de l'orge.Elle concerne également la séquence codant pour la protéine 77, la protéine 77 et leurs utilisations pour la recherche de cibles biologiques potentielles pour de nouvelles molécules fongicides. Elle concerne enfin les composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène 77.

Description

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Gène 77 de champignon phytopathogène et son utilisation pour l'identification de composés fongicides
La présente invention concerne un nouveau gène 77 indispensable à la pathogénie du champignon. L'invention a pour objet des polynucléotides 77, des polypetides 77, des organismes hôtes exprimant un polypeptide 77 et leurs utilisations pour l'identification de nouvelles molécules antifongiques.

Le principe d'employer des gènes de champignons pathogènes, entièrement ou en partie, dans des tests pour identifier de nouvelles molécules actives contre ces champignons est connu en soi (in Antifungal Agents : Discovery and Mode of Action.

Dixon GK, Coppong LG and Hollomon DW eds, BIOS Scientific publisher Ldt, Oxford, UK). Dans ce but, la connaissance du génome d'un champignon pathogène donné constitue une étape importante pour la réalisation de tels tests. Toutefois, la simple connaissance d'un gène donné n'est pas suffisante pour atteindre cet objectif, encore faut-il que le gène choisi comme cible de molécules fongicides potentielles soit essentiel à la vie du champignon, son inhibition par la molécule fongicide entraînant la mort du champignon, ou essentiel à la pathogénie du champignon, son inhibition n'étant pas létale pour le champignon mais inhibant simplement son pouvoir pathogène. Cette deuxième catégorie de gènes cibles potentielles de molécules fongicides est particulièrement importante pour le développement d'une nouvelle génération de produits fongicides plus respectueux de l'environnement, s'attaquant de manière spécifique au seul pouvoir pathogène des champignons pathogènes. L'identification des gènes indispensables à la pathogénie du champignon est donc nécessaire au développement de nouveaux produits fongicides.

La présente invention concerne l'identification et le clonage d'un nouveau gène nommé 77 indispensable à la pathogénie du champignon. Un mutant Rev77 de Magnaporthe grisea, dans lequel le gène est inactivé, a une pathogénie réduite de 97% à 100% par rapport à une souche sauvage. L'invention concerne également l'utilisation du gène 77 pour identifier de nouvelles molécules antifongiques.

Description de la liste de séquences SEQ ID No. 1 : Cadre ouvert de lecture du gène 77 de Magnaporthe grisea SEQ ID No. 2 : Polypeptide 77 de Magnaporthe grisea SEQ ID No. 3 : Amorce PCR

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SEQ ID No. 4 : Amorce PCR

Description de l'invention Poiynucléotides La présente invention concerne des polynucleotides comprenant un gène 77 de champignon. Le gène 77 peut être isolé chez les champignons phytopathogènes comme par exemple Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculans, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum et Venturi inaequalis. De manière avantageuse, le gène 77 est isolé chez les champignons phytopathogènes du genre Magnaporthe. De préférence, les polynucléotides de l'invention comprennent un gène 77 de Magnaporthe grisea. Préférentiellement, les polynucléotides de la présente invention comprennent la séquence codante d'un gène 77 de Magnaporthe grisea.

Le terme"polynucléotides 77"désigne l'ensemble des polynucléotides de la présente invention, de préférence, les polynucléotides de la séquence génomique de 77, les polynucléotides de la séquence de l'ADNc de 77, ainsi que les polynucléotides codant pour les polypeptides 77 de la présente invention. Le terme"polynucléotides 77"désigne également des polynucléotides recombinants comprenant les dits polynucléotides.

Selon la présente invention, on entend par"polynucléotide"une chaine nucléotidique simple brin ou son complémentaire ou une chaine nucléotidique double brin pouvant être de type ADN ou ARN. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Le terme"polynucléotide"désigne également les oligonucléotides et les polynucléotides modifiés.

Les polynucléotides de la présente invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. De préférence, les polynucléotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. (voir Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989) ou par synthèse biochimique.

L'invention concerne des polynucléotides comprenant le cadre ouvert de lecture du gène 77 de Magnaporthe grisea de la SEQ ID No. 1.

L'invention s'étend également aux polynucléotides comprenant un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) le polynucléotide de la SEQ ID No. 1 ;

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b) un polynucléotide homologue à un polynucléotide tel que défini en a) ; c) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective à un polynucléotide tel que défini en a).

Par"homologue"on entend selon l'invention un polynucléotide présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence de référence. Ces modifications peuvent être des délétions, des additions ou des substitutions d'un ou plusieurs nucléotides de la séquence de référence. De manière avantageuse, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% et de préférence d'au moins 98% et plus préférentiellement d'au moins 99% par rapport à la séquence de référence. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul et al., J. Mol. Evol.

36 : 290-300,1993 ; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 : 403-10,1990). De préférence on utilisera les paramètres par défaut. L'invention concerne donc des polynucléotides comprenant des polynucléotides présentant au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec un polynucléotide de la SEQ ID No. 1. De préférence l'invention concerne un polynucléotide comprenant un polynucléotide d'au moins 50,100, 200,300, 400,500, 1000 nucléotides présentant au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec un polynucléotide de la SEQ ID No. 1. De préférence, les polynucléotides homologues à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence.

Par"séquence capable de s'hybrider de manière sélective", on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier. En général la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5 C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement la température d'hybridation est d'au moins 30 C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 60 C pour un polynucléotide de plus

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de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant : 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7. 5), 1 mM EDTA, 0. 02% PVP, 0. 02% Ficoll, 0. 02% BSA, 500 ug/ml denatured salmon sperrt DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0, 1% SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01% SDS et à forte stringence dans un tampon O, 1X SSC, 0, 1% SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989). L'invention concerne donc des polynucléotides comprenant un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective avec un polynucléotide de la SEQ ID No. 1. De préférence, l'invention concerne un polynucléotide comprenant un polynucléotide d'au moins 50,100, 200,300, 400,500, 1000 nucléotides capable de s'hybrider de manière sélective avec un polynucléotide de la SEQ ID No. 1.

De préférence, les polynucléotides s'hybridant de manière sélective à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence.

De préférence, les polynucléotides de la présente invention conservent la fonction du gène 77 de Magnaporthe grisea et codent pour un polypeptide essentiel à la pathogénie du champignon.

Préférentiellement, les polynucléotides de la présente invention complémentent un révertant ou mutant 77 de Magnaporthe grisea et restaurent sa pathogenicité pour le riz et l'orge. Un Rev77 selon l'invention est un mutant de Magnaporthe grisea dans lequel le gène 77 de la SEQ ID No. 1 est inactivé par des techniques bien connues de l'homme du métier.

La présente invention concerne également des variants allèliques du gène 77 de

Magnaporthe grisea.

La présente invention concerne également l'identification et le clonage de gènes homologues au gène 77 de Magnaporthe grisea chez d'autres champignons phytopathogènes. De préférence, ces gènes homologues sont susceptibles d'être isolés ou clonés à partir d'un champignon phytopathogène choisi parmi Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum

lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculans, Fusarium oxysporum, YSP Fusarium graminearum et Venturia inaequalis. L'invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un polynucléotide ou d'un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID NO. 1 selon l'invention pour l'identification de gènes homologues dans d'autres champignons

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phytopathogènes. Les techniques permettant le clonage de gènes 77 homologues chez d'autres champignons phytopathogènes sont bien connues de l'homme du métier. Le clonage s'effectue par exemple par criblage de banques d'ADNc ou de banques d'ADN génomique avec un polynucléotide ou un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID NO. 1. Ces banques peuvent également être criblées par PCR à l'aide d'oligonucléotides spécifiques ou dégénérés dérivés de la SEQ ID No. l. Les techniques de construction et de criblage de ces banques sont bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989). Des gènes 77 de champignon phytopathogène peuvent également être identifiés dans les bases de données par BLAST nucléotidique ou protéique à l'aide des SEQ ID NO. 1-2.

De préférence, les gènes clonés conservent la fonction du gène 77 de Magnaporthe grisea et codent pour un polypeptide essentiel à la pathogénie des champignons. Les techniques permettant d'établir qu'un gène connu est essentiel à la pathogénie d'un champignon sont connues de l'homme du métier. Par exemple, le gène étudié est inactivé dans le champignon par des techniques classiques de biologie moléculaire, on citera notamment le remplacement du gène par un gène marqueur par recombinaison homlogue. La réduction de la pathogénie du champignon comportant le gène inactivé est analysée par des tests phénotypiques. D'autres techniques bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées afin d'établir que les polynucléotides de l'invention conservent la fonction du gène 77 de Magnaporthe grisea. On citera notamment la complémentation de mutants 77 suivis de tests de restauration de la pathogénie du champignon.

La présente invention concerne également un polynucléotide comprenant un polynucléotide antisens de la séquence codante du gène 77. Par séquence antisens on entend selon l'invention une séquence codant pour une séquence antisens totale ou partielle de la séquence codante du polypeptide 77.

L'expression de cette séquence dans un champignon, et en particulier Magnaporthe grisea permet d'inhiber l'expression du polypeptide 77 et la pathogénicité du champignon.

Les techniques d'inhibition de l'expression d'une protéine par un antisens sont bien connues de l'homme du métier et largement décrites dans la littérature, notamment Judelson et al. (1993, Gene 133 : 63-69) ainsi que Prokish et al. (1997, Mol. Gen. Genet.

256 : 104-114).

L'invention a également pour objet des polynucléotides comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide choisi parmi les polypeptides suivants :

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a) le polypeptide de la SEQ ID No. 2 ; b) un polypeptide homologue à un polypeptide de la SEQ ID No. 2 ; c) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide tel que défini en a) ou b).

Polypeptids
La présente invention concerne également des polypeptides 77 de champignon phytopathogène et plus particulièrement de Magnaporthe grisea. Le terme"polypeptides 77"désigne l'ensemble des polypeptides de la présente invention ainsi que les polypeptides

pour lesquels codent les polynucléotides de la présente invention. Le terme"polypeptides 77"désigne également des protéines de fusion, des protéines recombinantes ou des protéines chimères comprenant ces polypeptides. Dans la présente description le terme "polypeptide"désigne également des protéines et des peptides ainsi que des polypeptides modifiés.

Les polypeptides de l'invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel.

Les polypeptides peuvent être préparés au moyen de différents procédés. Ces procédés sont notamment la purification à partir de sources naturelles telles que des cellules exprimant naturellement ces polypeptides, la production de polypeptides recombinants par des cellules hôtes appropriées et leur purification ultérieure, la production par synthèse chimique ou, enfin, une combinaison de ces différentes approches. Ces différents procédés de production sont bien connus de l'homme du métier. Ainsi, les polypeptides 77 de la présente invention peuvent être isolés à partir de champignons exprimant des polypeptides 77. De préférence, les polypeptides 77 de la présente invention sont isolés à partir d'organisme hôtes recombinants exprimant un polypeptide 77 hétérologue. Ces organismes sont préférentiellement choisis parmi les bactéries, les levures, les champignons, les cellules animales ou d'insectes.

La présente invention a pour objet un polypeptide comprenant un polypeptide 77 de Magnaporthe grisea de la SEQ ID No. 2. Le polypeptide 77 de la SEQ ID No. 2 comprend un NLS (signal d'adressage au noyau) compris entre la position 240 et 256 de la SEQ ID No. 2. L'invention concerne également des polypeptides comprenant un fragment biologiquement actif ou un homologue du polypeptide 77 de la SEQ ID No. 2.

Le terme"fragment"d'un polypeptide désigne un polypeptide comprenant une partie mais pas la totalité du polypeptide dont il est dérivé. L'invention concerne un polypeptide

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comprenant un fragment d'au moins 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200 acides aminés d'un polypeptide de la SEQ ID No. 2.

Le terme"fragment biologiquement actif désigne un fragment d'un polypeptide conservant la fontion du polypeptide dont il est dérivé. Les fragments biologiquement actifs du polypeptide de la SEQ ID No. 2 conservent ainsi la fonction du polypeptide 77 de Magnaporthe grisea. Ces fragments biologiquement actifs ont donc une activité essentielle à la pathogénie du champignon. De préférence, ils comprennent un signal d'adressage au noyau.

Le terme"homologue"désigne un polypeptide pouvant présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé. L'invention a pour objet un polypeptide présentant au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et préférentiellement au moins 99% d'homologie avec un polypeptide de la SEQ ID No. 2. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre polypeptides ou protéines sont connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple le package UWGCG et le programme BESTFITT pour calculer les homologies (Devereux et al., Nucleic Acid Res.

12,387-395, 1984). De préférence, on utilise les paramètres par défaut.

De préférence, ces polypeptides homologues conservent la même activité biologique que le polypeptide 77 de Magnaporthe grisea de la SEQ ID No. 2. Préférentiellement, ces polypeptides ont donc une activité essentielle à la pathogénie du champignon. Dans un mode de réalisation préféré, ces polypeptides homologues comprennent un signal d'adressage au noyau.

L'invention a également pour objet un polypeptide de fusion comprenant un polypeptide 77 tel que décrit ci-dessus fusionné à un polypeptide rapporteur. Le polypeptide rapporteur permet la détection rapide de l'expression d'un polypeptide 77 dans un champignon ou dans un autre organisme hôte. Parmi les polypeptides pouvant ainsi être fusionés avec un polypeptide 77 on citera notamment la GFP (green fluorescent protein) et la protéine GUS (p-glucuronidase).

Cassettes d'expression, vecteurs et organismes hôtes
Le gène 77 peut être exprimé dans différents organismes hôtes tels que les bacteries, les levures, les champignons, les cellules animales ou d'insectes.

Cassettes d'expression

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Selon un mode de réalisation de l'invention, un polynucléotide codant pour un polypeptide 77 est inséré dans une cassette d'expression en utilisant des techniques de clonage bien connues de l'homme du métier. Cette cassette d'expression comprend les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction des séquences codant pour le polypeptide 77. Avantageusement, cette cassette d'expression comprend à la fois des éléments permettant de faire produire un polypeptide 77 par une cellule hôte et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression. Dans un premier mode de réalisation, les cassettes d'expression selon l'invention comprennent, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, le gène 77 ou la séquence codante du gène 77 et une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.

Préférentiellement, la cassette d'expression comprend, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucléotides codant pour le polypeptide 77 de la SEQ ID No. 2 ou pour un fragment biologiquement actif du polypeptide 77 de la SEQ ID No. 2 ; b) un polynucléotide de la SEQ ID No. 1 ; c) un polynucléotide homologue à un polynucléotide tel que défini en b) ; d) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière spécifique à un polynucléotide tel que défini en b) ; et une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.

Tout type de séquence promotrice peut être utilisée dans les cassettes d'expression selon l'invention. Le choix du promoteur dépendra notamment de l'organisme hôte choisi pour l'expression du gène d'intérêt. Certains promoteurs permettent une expression constitutive alors que d'autres promoteurs sont au contraire inductibles. Parmi les promoteurs fonctionnels dans les champignons, on citera notamment celui de glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase d'Aspergillus nidulans (Roberts et al., Current Genet. 15 : 177-180,1989). Parmi les promoteurs fonctionnels dans les bactéries, on citera notamment celui de la RNA polymérase du bacteriophage T7 (Studier et al., Methods in enzymology 185 : 60-89,1990). Parmi les promoteurs fonctionnels dans les levures, on citera notamment celui du gène Gall (Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA. 88 : 1731-1735, 1991) ou les promoteurs GAL4 et ADH de S. cerevisiae. Parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules d'insectes, on citera notamment le promoteur de la polyhédrine de baculovirus AcMNPV (Weyer et al., J. Gene. Virol. 72 : 2967-2974,1991).

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Parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules animales on citera le promoteur de la metallothionein et les promoteurs de virus et d'adénovirus. Tous ces promoteurs sont décrits dans la littérature et bien connus de l'homme du métier.

Dans un autre mode de réalisation, la cassette d'expression selon l'invention comprend dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un champignon, en particulier Magnaporthe grisea, la séquence antisens de la séquence codante du gène 77 et une séquence terminatrice fonctionnelle dans ledit champignon.

Les cassettes d'expression, selon la présente invention, peuvent en outre inclure toute autre séquence nécessaire à l'expression du gène 77 ou d'un gène hétérologue, comme par exemple des éléments de régulation ou des séquences signal permettant l'adressage du polypeptide 77. On peut notamment utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expression de la séquence codante insérée dans ladite cassette d'expression. Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"). Comme signal d'adressage membranaire dans les organismes hôtes on citera notamment celui de la proteine A chez les bactéries (Nilsson et al., Methods in Enzymology 198 : 3,1991).

Une grande variété de séquences terminatrices sont utilisables dans les cassettes d'expression selon l'invention, ces séquences permettent la terminaison de la transcription et la polyadénylation de l'ARNm. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte sélectionné peut être utilisée.

La présente invention a également pour objet un polynucléotide comprenant une cassette d'expression selon l'invention, avantageusement les cassettes d'expression selon la présente invention sont insérées dans un vecteur.

Vecteurs
La présente invention concerne donc également des vecteurs de réplication ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte comprenant au moins un polynucléotide 77 ou une cassette d'expression selon la présente invention. Ce vecteur peut notamment être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus dans lequel est inséré un polynucléotide 77 ou une cassette d'expression selon l'invention. Les techniques de construction de ces vecteurs et d'insertion d'un polynucléotide de l'invention dans ces vecteurs sont bien connues de l'homme du métier. De manière générale, tout

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vecteur capable de se maintenir, de s'autorépliquer ou de se propager dans une cellule hôte et notamment afin d'induire l'expression d'un polynucléotide ou d'un polypeptide peut être utilisé. Avantageusement, les vecteurs selon l'invention comprennent au moins une origine de réplication pour leur réplication dans un organisme hôte. De manière préférée, les vecteurs de l'invention comprennent également au moins un marqueur de sélection tel qu'un gène de résistance à un antibiotique. On citera notamment des vecteurs tels que pBluescript (Stratagene, La Jolla, Ca), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, Ca) et des des vecteurs d'expression derivés de baculovirus tels que ceux dérivés du virus de la polyhédrine d'Autographica californica (AcMNPV). Un système préfère combinant un baculovirus et une cellule d'insecte est le système baculovirus pVII1392/cellules Sf21 (Invitrogen, la Jolla, Ca). Pour l'expression dans les cellules animales on utilise notamment des vecteurs dérivés d'adénovirus. L'homme du métier choisira les vecteurs appropriés notamment en fonction de l'organisme hôte à transformer et en fonction de la technique de transformation mise en oeuvre. Les méthodes de transformation des organismes hôtes sont bien connus de l'homme du métier (Inoue et al., Gene 96 : 23-28, 1990 ; Fincham, Microbiological Reviews 53 : 148-170, 1989) Les vecteurs de la présente invention sont notamment utilisés pour transformer un organisme hôte en vue de la réplication du vecteur et/ou de l'expression d'un polypeptide 77 dans ledit organisme hôte. L'invention concerne une méthode pour préparer un polypeptide 77 comprenant les étapes suivantes : - on transforme un organisme hôte avec un vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression selon l'invention, - on cultive l'organisme hôte transformé dans des conditions permettant l'expression du polypeptide 77, - on isole les polypeptides 77 produits par l'organisme hôte.

Les polypeptides 77 recombinants produits par un organisme hôte transformé avec un polynucléotide peuvent être purifiés ou isolés selon des méthodes connues de l'homme du métier. Les polypeptides 77 peuvent être exprimés dans un organisme hôte sous la forme de protéines de fusion. On citera notamment les vecteurs pGEX pour l'expression de protéines de fusion comprenant la glutathione S-transférase (GST). Ces protéines de fusion sont facilement purifiées par adsorption sur des billes de glutathione-agarose. Le groupement GST peut ensuite être éliminé par digestion avec la protéase Xa. D'autres systèmes pour l'expression et la purification de protéines de fusion sont connues de

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l'homme du métier. On citera également les protéines de fusion comprenant un polypeptide rapporteur tel que la GFP ou la protéine GUS. L'expression de ces protéines de fusion est facilement mesurée.

Organismes hôtes La présente invention a également pour objet, un procédé de transformation d'un organisme hôte par intégration dans ledit organisme hôte d'au moins un polynucléotide 77 ou d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon l'invention. Le polynucléotide peut être intégré dans le génome de l'organisme hôte ou se repliquer de manière stable dans l'organisme hôte. Les méthodes de transformation des organismes hôtes sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature (Inoue et al., Gene 96 : 23-28, 1990 ; Fincham, Microbiological Reviews 53 : 148-170, 1989).

La présente invention concerne également un organisme hôte transformé avec un polynucléotide 77, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Par organisme hôte, on entend en particulier selon l'invention tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, en particulier choisi parmi les bactéries, les levures, les champignons, les cellules animales et les cellules d'insectes. De manière avantageuse, les bactéries sont choisies parmi Escherichia coli et Bacillus subtilis, les levures sont choisies parmi Pichca pasaoois et Saccharomyces cerevisae, les cellules d'insectes sont choisis parmi Spodopterafrugiperda et Drosophila melanogaster, les cellules animales sont choisis parmi les cellules CHO, HeLa et COS.

Les techniques de construction de vecteurs, de transformation d'organismes hôtes et d'expression de polynucléotides et de polypeptides hétérologues dans ces organismes sont largement décrites dans la littérature (Ausubel F. M. et al.,"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes 1 et 2, Greene Publishing Associates et Wiley-Interscience, 1989 ; T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning A laboratory Handbook, 1982).

La présente invention concerne également l'utilisation de polynucléotides 77 et de polypeptides 77 pour l'identification de nouvelles molécules fongicides inhibitrices de la pathogénie des champignons.

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Inhibition de la pathogénie des champignons Des champignons dans lesquels le gène 77 est inactivé ou inhibé ont une pathogénie réduite de 97% à 100%. L'invention concerne des procédés pour inhiber la pathogénie des champignons en inactivant ou en inhibant l'expression du gène 77. De préférence, les champignons sont choisis parmi Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculans, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum et Venturia inaequalis.

De manière préférée, l'invention concerne des procédés pour inhiber la pathogénie d'un champignon, les dits procédés comprenant l'inhibition de l'expression d'un polynucléotide 77 selon l'invention dans ledit champignon, ou l'inhibition de l'expression d'un polypeptide 77 selon l'invention dans ledit champignon ou l'inhibition de l'activité biologique d'un polypeptide 77 selon l'invention dans ledit champignon. De préférence, cette inhibition affecte spécifiquement l'expression du gène 77 et l'activité biologique du polypeptide 77. L'invention ne concerne donc pas les procédés comprenant l'inhibition générale de l'expression des gènes dans le champignon. On comprendra que l'inhibition de l'expression du gène 77 peut cependant entrainer l'inhibition d'autres gènes appartenant par exemple à la même voie de signalisation ou au même complexe membranaire.

Différentes méthodes bien connues de l'homme du métier peuvent être mises en oeuvre pour inhiber la pathogénie des champignons en inhibant l'expression du gène 77 dans ces champignons. Dans un mode de réalisation de l'invention, le gène 77 est inactivé par mutagenèse insertionnelle ou par recombinaison homologue (techniques de remplacement de gène ou de"knock out"). Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'expression d'un polypeptide 77 est inhibé par l'expression d'un polynucléotide antisens du gène 77 dans les champignons. Dans un troisième mode de réalisation de l'invention, l'expression du gène 77 est inhibée par un composé inhibiteur.

Le niveau d'expression d'un polynucléotide 77 ou d'un polypeptide 77 dans les champignons peut être mesuré selon des techniques décrites dans la littérature. On citera notamment le Northem blot, la PCR et les DNA arrays (puces à ADN) pour les polynucléotides et le Western blot pour les polypeptides.

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Identification de nouvelles molécules fongicides inhibitrices de la pathogénie des champignons L'inactivation du gène 77 chez Magnaporthe grisea, champignon pathogène du riz, entraine une perte de la pathogénie de ce champignon. Par conséquent, des composés inhibiteurs de l'expression du gène 77 ou de l'activité biologique du polypeptide 77 dans les champignons pourraient être utilisés pour inhiber la pathogénie des champignons.

L'invention concerne donc des procédés pour l'identification de composés inhibant la pathogénie des champignons comprenant une étape d'identification d'un composé inhibant spécifiquement l'expression d'un polynucléotide 77 dans ledit champignon, ou une étape d'identification d'un composé inhibant l'expression d'un polypeptide 77 dans ledit champignon ou une étape d'identification d'un composé inhibant l'activité biologique d'un polypeptide 77 dans ledit champignon.

De préférence, les champignons sont choisis parmi Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculans, Fusarium ox orum, YSP Fusarium graminearum et Venturi inaequalis.

Les polynucléotides 77, les polypeptides 77, les vecteurs et les organismes hôtes de la présente invention peuvent ainsi être utilisés dans différents tests de criblage afin d'identifier de nouveaux composés antifongiques.

Identification d'inhibiteurs se fixant sur la protéine 77 de champignon Des molécules inhibant directement l'activité du polypeptide 77 pourraient inhiber la pathogénie du champignon et conduire au développement de nouveaux fongicides.

L'invention concerne donc un procédé pour l'identification de composés inhibant la pathogénie des champignons comprenant les étapes suivantes : - mettre en contact ledit composé avec un polypeptide 77, et - détecter la fixation dudit composé audit polypeptide.

Préférentiellement, le procédé comprend également une étape dans laquelle on détermine si ledit composé inhibe la pathogénie des champignons.

Toute méthode permettant de préparer un polypeptide 77 et de le purifier ou de l'isoler peut être utilisée dans les procédés de la présente invention. De préférence, le polypeptide 77 est exprimée dans un système d'expression hétérologue (par exemple bactérie, levure, cellule animale ou d'insecte) au moyen d'un polynucléotide 77 selon l'invention, la purification simplifiée du polypeptide 77 permet ensuite d'identifier de

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nouvelles molécules se fixant sur la protéine 77. L'identification des dites molécules se fait par des méthodes bien connues de l'homme du métier, notamment des méthodes de détection physique de la fixation des composés testés sur la protéine 77 (système BIACORE ; Karlson & al., J. of Biomolecular Interaction Analysis, spécial issue Drug Discovery : 18-22).

La présente invention concerne donc un procédé pour identifier des composés inhibant la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène 77, ledit procédé consistant à soumettre un composé, ou un mélange de composés, à un test approprié pour l'identification des composés inhibiteurs de ladite pathogénie des champignons et à sélectionner les composés réagissant de manière positive audit test, le cas échéant à les isoler, puis à les identifier.

De manière préférentielle, le test approprié est un test tel que défini ci-dessus.

De manière préférée, un composé identifie selon ces procédés est ensuite testé pour ces propriétés anti-fongiques et pour sa capacité à inhiber la pathogénie du champignon pour les plantes selon des méthodes connues de l'homme du métier. Préférentiellement, le composé est évalué à l'aide de tests phénotypiques tels que des essais de pathogénie sur feuilles ou sur plantes entières.

Par composé on entend selon l'invention tout composé chimique ou mélange de composés chimiques, y compris les peptides et les protéines.

Par mélange de composés on comprend selon l'invention au moins deux composés différents, comme par exemple les (dia) stéréoisomères d'une molécule, des mélanges d'origine naturelle issus de l'extraction de matériel biologique (plantes, tissus végétaux, culture bactériennes, cultures de levures ou de champignons, insectes, tissus animaux, etc.) ou des mélanges réactionnels non purifiés ou purifiés totalement ou en partie, ou encore des mélanges de produits issus de techniques de chimie combinatoire.

La présente invention concerne enfin de nouveaux composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène 77, notamment les composés identifiées par les procédés selon l'invention et/ou les composés dérivés des composés identifiés par les procédés selon l'invention.

De manière préférentielle, les composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène 77 ne sont pas des inhibiteurs généraux d'enzymes. De manière également préférentielle, les composés selon l'invention ne sont

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pas des composés déjà connus pour avoir une activité fongicide et/ou une activité sur la pathogénie des champignons.

L'invention a également pour objet un procédé pour traiter des plantes contre un champignon phytopathogène caractérisé en ce qu'il comprend le traitement desdites plantes avec un composé identifié par un procédé selon l'invention.

La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un composé inhibiteur de la pathogénie des champignons, ledit procédé comprenant les étapes d'identification d'un composé inhibant la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène 77 par le procédé d'identification selon l'invention, puis de préparation dudit composé identifié par les méthodes usuelles de synthèse chimique, de synthèse enzymatique et/ou d'extraction de matériel biologique. L'étape de préparation du composé peut être précédée le cas échéant par une étape dite d'optimisation par laquelle on identifie un composé dérivé du composé identifié par le procédé d'identification selon l'invention, ledit composé dérivé étant ensuite préparé par les méthodes usuelles.

Les exemples ci-après permettre d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée. Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes 1 et 2, Ausubel F. M. et al, publiés par Greene Publishing Associates et Wiley-Interscience (1989) ou dans Molecular cloning, T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook (1982). Les méthodes spécifiques des champignons sont décrites dans Sweigard et al. (Fungal Genetics Newletter. 44 : 52-53,1997) pour les vecteurs de transformation fongiques utilisés, dans Orbach (Gene 150 : 159-162,1994) pour la construction d'une banque cosmidique, dans Sweigard et al. (Fungal Genetics Newletter. 37 : 4-5,1990) pour la préparation d'ADN génomiques fongiques et dans Agnan et al. (Fungal Genetics and Biology 21 : 292-301, 1997).

L'homme du métier sera à même de reproduire l'invention, isoler et cloner les polynucléotides selon l'invention, totalement ou en partie, notamment la séquence codante

de la protéine 77 sur la base des information et séquences contenues dans la présente

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demande brevet, notamment au moyen des techniques de biologie moléculaire usuelles dans le domaine technique comme la PCR (revue sur l'utilisation de ces techniques chez les champignons : Agnan et al., Fungal Genetics and Biology 21 : 292-301,1997).

Description des figures Figure 1 : Analyse moléculaire du Rev77 (l : BamHI, 2 : BglII, 3 : EcoRI, 4 : HindIII, 5 : NcoI, 6 : SalI, 7 : Spiel, 8 : XbaI, 9 : XmaI).

Figure 2 : Analyse moléculaire des cosmides comprenant les séquences de Rev77.1 : cosmide 1,2 : cosmide 2.9 pistes pour chaque cosmide : BamHI, BglI, EcoRI, HindIII, NotI, NotI/SalI, SalI, Smal, Sphl.

EXEMPLES
L'identification d'un gène de pathogénie par mutagénèse insertionnelle requiert d'abord la création d'une banque de mutants. La méthode que nous avons choisi d'utiliser repose sur la transposition d'un élément mobile capable de s'insérer dans des gènes d'intérêt. Le transposon choisi est impala, un élément de classe II caractérisé chez Fusarium oxysporum (Langin et al., 1995) et dont la démonstration de la transposition chez Magnaporthe grisea a été obtenue au laboratoire (WO 00/56902). Brièvement, le transposon est inséré dans le gène codant la nitrate reductase (niaD) aspergillus nidulans au niveau de son promoteur. Ce construit (niaD : : impala) porté par un vecteur est utilisé pour tranformer une souche de M grisea auxotrophe pour le nitrate (souche G 11. 174 ; Daboussi et al., Curr. Genet., 14 : 453-456,1989). La transposition de l'élément permet de restaurer la prototrophie à l'égard du nitrate ce qui permet d'isoler des révertants Nia+ sur milieu minimum en présence de NaNO3 comme seule source d'azote. La réinsertion du transposon dans le génome de ces révertants permet de rechercher des mutants devenus non pathogènes vis à vis de l'orge et du riz. La caractérisation du gène de pathogénie passe alors par la récupération de la séquence nucléotique dans laquelle impala s'est inséré et la démonstration de son implication dans le pouvoir infectieux du champignon.

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Exemple 1 Mutagénèse insertionnelle par transposition
La démonstration de la transposition d'impala chez M grisea a permis d'isoler un cotransformant portant une seule copie du vecteur pNiL160 (WO 00/56902), dans lequel se trouve le construit niaD : : impala et donnant 100% de réinsertion du transposon après excision du promoteur du gène niaD. Ce cotransfonnant a été utilisé pour générer une collection de révertants Nia+. Pour cela le cotransformant est repiqué sur un milieu solide à base de farine de riz, à partir duquel il est possible de récolter des conidies du champignons. Ces conidies sont récoltées dans de l'eau stériles et ensemencées sur milieu minimum TNK (milieu préparé d'après la solution B de Tanaka décrite par Ou et al. (Blast In : C. M. Institute, Rice diseases, CAB International, Kew, UK, 109-201,1985) sans extrait de levure et en présence d'agarose ultra pure à 8 g. l-'). Après environ deux semaines d'incubation à 26 C, des colonies à l'aspect dense et aérien typique des champignons Nia+ sur ce milieu apparaissent témoignant de la transposition d'impala. Ces colonies sont prélevées et purifiées par isolement de spores sous loupe binoculaire. Elles constituent la collection de révertants à analyser.

Exemple II A) Essais de pathogénie sur feuilles en survie
Les essais de pathogénie ont été réalisés parallèlement sur orge et riz (variétés Express et Sariceltik respectivement). Le riz a été cultivé à 25 C le jour, 15 C la nuit avec une hygrométrie supérieur à 70%, l'orge en conditions froides (20-22 C). Des fragments de feuilles (2,5 cm) de riz et d'orge ont été prélevées dans la partie médiane de la plus jeune feuille de plants agés d'une vingtaine de jours. Ces fragments ont été déposés dans des boîtes multi-compartimentées contenant de l'eau gélosée à 1% additionné de 2 mg. l'' de kinétine.

Les conditions de sporulation et de la préparation d'inoculum de spores de M grisea sont décrites par Silué et al. (Physiol. Mol. Plant Pathol., 53 : 239-251,1998).

L'inoculation a été réalisée à l'aide d'un coton de tige humide trempé dans une suspension de spores et passé sur les fragments de feuilles en survie. La quatité de spores a été estimée en déposant une goutte de la suspension sur une lame de verre. Les symptômes ont été observés après 4-7 jours d'incubation à 24 cm. Chaque tranformant a été testé sur quatre fragments d'orge et quatre fragments de riz. Le révertant 77 présente dans ces conditions

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d'inoculation une réduction de pathogénie quantifiée à 97 % du nombre de lésions causées par la souche sauvage Nia-Gl 1. 174 (voir tableau ci-dessous). Le révertant 77 a été inoculé une seconde fois sur feuilles d'orge afin de confirmer son phénotype avec une suspension

de spores à 3. 104 spores. ml-'en déposant des gouttes de 30 al de cette suspension. Dans ces conditions d'inoculation la réduction de pathogénie est totale. Tableau 1 : test d'infection sur feuilles de riz et d'orge en survie

<tb>
<tb> G <SEP> 11. <SEP> 174 <SEP> Révertant <SEP> 77 <SEP> Diminution <SEP> par
<tb> (souche <SEP> pathogène) <SEP> rapport <SEP> à <SEP> G <SEP> 11. <SEP> 174
<tb> Riz <SEP> 39 <SEP> lesions/feuille <SEP> 1 <SEP> lésion/feuille-97%
<tb> Orge <SEP> 29 <SEP> lesions/feuille <SEP> 1 <SEP> lesion/feuille-97%
<tb>
B) Essais de pathogénie sur plantes entières
Pour confirmer le phénotype mutant de ce révertant des plantes entières d'orge et de riz ont été inoculées avec les spores de ce mutant. Pour cela les plantes ont été cultivées dans les conditions décrites ci-dessus et traitées 30 à 35 jours après semis, selon leur degré de maturation. Les suspensions de spores du révertant 77 et de la souche G 11. 174 non transformée ont été calibrée à 3. 104 spores. ml-', réalisées dans une solution de gélatine à 0,3 % dans l'eau et pulvérisée sur trois plants de d'orge et de riz. Une feuille de chacune de ces plantes a été collectée pour comptage du nombre de lésions après développement de celles-ci (5 à 7 jours).

Tableau II : Test d'infection sur plantes entières

<tb>
<tb> G11. <SEP> 174 <SEP> Révertant <SEP> 77 <SEP> Dimunition <SEP> par
<tb> (souche <SEP> pathogène) <SEP> rapport <SEP> à <SEP> G <SEP> 11. <SEP> 174
<tb> Riz <SEP> 13 <SEP> lesions/feuille <SEP> 0 <SEP> lésion-100%
<tb> Orge <SEP> 14 <SEP> lesions/feuille <SEP> 0 <SEP> lésion-100%
<tb>

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Exemple III Analyse phénotypique du révertant 77
Selon le mode d'infection considéré, le révertant 77 est affecté d'une réduction de pathogénie quantifiée entre 97 et 100% par rapport à la souche G 11. 174 non transformée alors que sa capacité à sporuler n'a pas été amoindrie. Le révertant 77 a une physiologie et une morphologie des conidies et du mycélium apparemment normales. Sa capacité à différencier des appressoria sur épiderme d'orge comme sur des surfaces hydrophobes artificielles (PVC, PET) n'est pas différente de la souche sauvage Gel 1. 174.

Un essai d'infection sur feuilles bléssées a été conduit avec ce mutant. L'analyse cytologique de l'infection montre que le mutant parviens à pénétrer à travers la paroi des cellules épidermique de l'orge et à coloniser les tissus de l'hôte, poursuivant ainsi normalement son cycle infectieux. Les nécroses occasionnées par le révertant 77 sont alors de même aspect et de mêmetaille que celles provoquées par la souche G 11. 174. Ce résultat suggère que le révertant 77 est incapable de produire des appressoria fonctionnels. Il explique également pourquoi, selon le mode d'infection considéré la quantification de la réduction de la pathogénie diffère sensiblement.

Exemple IV Clonage et caractérisation du gène de pathogénie 77
La technique d'amplification par polymérisation en chaîne inversée (IPCR) a été employée pour cloner les régions génomiques situées au point d'insertion du transposon.

Afin d'identifier un fragment génomique contenant impala et possédant une taille compatible avec son traitement par IPCR, l'ADN génomique du révertant 77 a été digéré par des enzymes de restriction ne coupant pas dans l'élément mobile (Figure 1). La digestion par l'enzyme BamHI a été sélectionnée car elle génère un fragment de 2,2 kb qui permettra d'amplifier au finale 0,9 kb de séquences flaquant le point d'insertion du

transposon. 3 ug d'ADN génomique du révertant 77 ont été digérés par cet enzyme. Après son élimination par une étape au phénol/chloroforme, l'ADN a été repris dans 40 III d'eau. 8 III ont été utilisés pour réaliser une ligation des fragments d'ADN sur eux même à l'aide du kit de ligation"Rapid DNA ligation"commercialisé par Roche Molecular Biochemicals.

Après une étape au phénol/chlorophorme, l'ADN est repris dans 1 oil d'eau et inclus dans le volume réactionnel de la IPCR. Les amorces (ImpE5' : ggc att gaa aac gcg gtc cc et ImpE3' : cag cag caa aac agc tgc cc) sont utilisées à une concentration finale de 500 nM. Elles se

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placent aux extrémités du transposon en orientation divergeante, leurs extremités 3'en direction de l'ADN génomique. La réaction est conduite en présence de dNTPs (100 uM final), de Taq appligène (0, 75 u), du tampon correspondant IX concentré, dans un volume final de 50 u. l. Le programme d'amplification comprend une étape de dénaturation de 5 minutes à 95 C, 30 cycles comprenant une étape de 40 secondes à 95 C, une étape de 40 secondes à 60 C et une étape d'une minute et trente secondes à 72 C. Puis le programme s'achève par une étape de 10 minutes à 72 C. Un produit d'environ 1000pb compatible avec la taille attendue a été amplifié et cloné dans le vecteur pGEM-T easy (Promega). La présence de séquences appartenant à impala aux extrémités de ce produit comfirme la spécificité de l'amplification. Ce produit PCR a été utilisé pour cribler une banque d'ADN génomique de M grisea (souche 96/0/76) construite dans le vecteur pMOCosX (Dioh et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 13 : 217-227, 2000). Deux clones présentant le même profil de restriction ont été isolés. Le produit IPCR hybride avec un seul fragment de 8,5 kb

issus de la double digestion du cosmide par les enzymes Notl et SalI (Figure 2). Ce fragment a été cloné et en partie séquencé autour du site d'insertion du transposon. Le séquençage a fait apparaître une ORF de 1719 pb entièrement comprise dans un sous fragment NotI-EcoRI de 3 kb et codant une protéine de 573 acides aminés. La séquence de l'ORF est donnée à la SEQ ID No. 1 et sa traduction en acides aminés apparaît à la SEQ ID No 2. Chez le révertant 77, le transposon est inséré au niveau de la sérine en position 386.

La recherche de protéines homologues à celle de p77 a été réalisée avec le programme d'alignement de séquences Blastp 2.0. 8 (Altschull et al., J. Mol. Biol., 215 : 403-410, 1990) dans toutes les bases de données disponibles en utilisant les paramètres par défaut. Aucune protéine présente dans ces bases n'a montré une homologie significative avec p77. L'utilisation de logiciels d'analyse appropriés suggère que cette protéine n'aurait pas de peptide signal et présenterait un signal d'adressage au noyau (bipartite nuclear targeting sequence) entre les AA 240 et 256 donnés à la SEQ ID No. 2 (RR-10 acides aminé aléatoires-KKRRRR).

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Exemple V Restauration du pouvoir pathogène du révertant 77
Afin de prouver que la protéine 77 correspond au produit du gène de pathogénie affecté chez le révertant 77 et que ce gène est effectivement etiqueté par impala, le fragment NotI-EcoRI de 3 kb comprenant la totalité de la séquence codante a été cloné dans le vecteur pCB1530 (Sweigard et al., Fungal Genet. Newsl., 44 : 52-53, 1997). Ce vecteur (pCBNE77) comprend également le gène Bar conférant la résistance au glufosinate. Des protoplastes obtenus à partir du révertant 77 ont été transformés par ce plasmide et les colonies résistantes à l'herbicide ont été testées sur feuilles d'orge en survie dans les conditions décrites précédemment. Parmi 10 transformant testés, 9 se sont avérés aussi pathogènes que la souche G 11. 174. Ce résultat confirme que le gène de pathogénie muté chez le révertant code la protéine p77 et qu'il est étiqueté par le transposon.

Exemple VI Expression du gène de pathogénie
Un northem-blot a été réalisé en déposant 10 ug d'ARN totaux extraits de mycélium cultivé sur milieu complet, de spores, de spores incubées sur téflon pendant 2,6, 8,16, 24 et 48h, ainsi que d'orge infecté récoltés et broyés 2,8, 24 et 48 heures après le début de l'infection. La sonde utilisée correspond à la totalité de l'ORF caractérisé chez le révertant 77, amplifié par PCR. Un signal correspondant à un ARN messager dont la taille a été estimée à 2,7 kb a été détecté dans les pistes correspondant aux ARN des spores incubées 6 et 8 heures sur téflon. Sa taille est compatible avec ce qu'on connaît sur la fin de l'ARNm (donné par l'extrémié 3'de l'ADNc) et la position du début de l'ORF caractérisé chez le révertant 77. Ceci suggère que l'expression du gène de pathogénie est transitoire et concomitante à la différenciation appressoriale. Aucun signal n'a été détecté à partir d'ARN extraits de plantes infectées. Considérant la faible intensité du signal observé chez les spores germées, il est possible que le niveau d'expression du gène de pathogénie soit trop peu important pour que l'ARNm correspondant soit détecté dans un mélange d'ARN totaux où les ARN provenant du champignon sont très largement sous-représentés.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend la séquence codante du gène 77 de la SEQ ID No. 1.

2) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective à un polynucléotide de la SEQ ID NO. 1 ; et b) un polynucléotide homologue à 80% au polynucléotide de la SEQ ID NO. 1.

3) Polynucléotide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il code pour un gène essentiel pour la pathogénie des champignons.

4) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide de la SEQ ID NO. 2 ou pour un fragment biologiquement actif d'un polypeptide de la SEQ ID NO. 2.

5) Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend le polypeptide 77 de la SEQ ID No. 2 ou un fragment biologiquement actif du polypeptide 77 de la SEQ ID No. 2.

6) Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide homologue à au moins

80% au polypeptide 77 de la SEQ ID No. 2.

7) Polypeptide selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'il est indispensable à la pathogénie des champignons.

8) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend dans le sens de la transcription : a) un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte ; et b) un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4 ; et c) une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.

9) Vecteur comprenant au moins un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4 et

8.

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10) Organisme hôte transformé avec un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4,

8 et/ou avec un vecteur selon la revendication 9.

11) Procédé pour l'identification de composés inhibant la pathogénie des champignons comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact ledit composé avec un polypeptide selon l'une des revendications 5-7 ; et b) détecter la fixation dudit composé audit polypeptide ; et c) déterminer si ledit composé inhibe la pathogénie des champignons.

12) Procédé pour l'identification de composés inhibant la pathogénie des champignons comprenant une étape d'identification d'un composé inhibant spécifiquement l'expression d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4 dans ledit champignon, ou une étape d'identification d'un composé inhibant l'expression d'un polypeptide selon l'une des revendications 5-7 dans ledit champignon ou une étape d'identification d'un composé inhibant l'activité biologique d'un polypeptide selon l'une des revendications 5-7 dans ledit champignon.

13) Procédé selon l'une des revendications 11-12 comprenant une étape dans laquelle on détennine si ledit composé inhibe la pathogénie du champignon.

14) Utilisation d'un polynucléotide, d'un polypeptide, d'un vecteur et/ou d'un organisme hôte selon l'une des revendications 1-10, pour l'identification de nouvelles molécules fongicides inhibitrices de la pathogénie des champignons.