FR2809405A1 - INSOLUBLE STATISTIC COPOLYMERS HAVING SPECIFIC AFFINITY TO A GIVEN PROTIST, USES THEREOF AND METHOD OF SELECTING THEM - Google Patents
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Abstract
Description
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La présente invention se rapporte à des copolymères statistiques insolubles présentant une affinité spécifique envers un protiste donné, à leurs utilisations, notamment pour la capture sélective dudit protiste, et à leur procédé de sélection. The present invention relates to insoluble random copolymers having a specific affinity towards a given protist, to their uses, in particular for the selective capture of said protist, and to their selection process.
Le milieu marin, en fonction du biotope local, de la température et de l'ensoleillement, peut être sujet, de façon épisodique et saisonnière, à des efflorescences de microorganismes planctoniques qui affectent l'environnement et qui sont parfois toxiques pour la faune marine locale et pour l'homme, consommateur final de poissons, mollusques et crustacés filtreurs de plancton. The marine environment, depending on local biotope, temperature and sunshine, may be subject, episodically and seasonally, to planktonic microorganisms that affect the environment and are sometimes toxic to local marine life. and for humans, the ultimate consumer of fish, shellfish and crustaceans filtering plankton.
On connaît par exemple les efflorescences de Phaeocystis, dont les métabolites soufrés corrompent l'eau, la rendent malodorante et la colorent, faisant fuir les bancs de poissons, ou encore les efflorescences d'Alexandrium minutum, dinoflagellé producteur de toxines paralysantes qui se concentrent dans les moules et les huîtres, et de Dinophysis, à l'origine de toxines diarrhéiques. For example, Phaeocystis blooms, whose sulfur metabolites corrode water, make it smelly and stain it, causing schools of fish to flee, or the efflorescence of Alexandrium minutum, a dinoflagellate that produces paralytic toxins that are concentrated in water. mussels and oysters, and Dinophysis, causing diarrheal toxins.
Le contrôle planctonique des eaux de mer s'impose donc pour des raisons de santé publique. Planktonic control of seawater is therefore necessary for reasons of public health.
Actuellement, la détection de tels microorganismes fait appel à des techniques d'observation microscopique à partir d'échantillons d'eau, analyses qui sont fastidieuses et souvent approximatives, ou à l'utilisation de sondes moléculaires spécifiques de l'espèce à détecter, méthode trop coûteuse pour pouvoir être utilisée industriellement et de façon routinière. Currently, the detection of such microorganisms uses techniques of microscopic observation from water samples, analyzes that are tedious and often approximate, or the use of specific molecular probes of the species to be detected, method too expensive to be used industrially and routinely.
D'autre part, aucun procédé satisfaisant pour le contrôle des efflorescences de microorganismes planctoniques n'a été décrit. En effet, une méthode chimique consistant à déverser dans l'eau des particules floculantes d'argile ou de limon, de façon à faire précipiter le plancton toxique, est utilisée au Japon et en Corée, mais cette technique n'est pas sélective et a un impact néfaste sur l'écosystème. On the other hand, no satisfactory method for the control of planktonic microorganisms efflorescence has been described. Indeed, a chemical method of flocculating clay or silt in water to precipitate toxic plankton is used in Japan and Korea, but this technique is not selective and has a harmful impact on the ecosystem.
Le but de l'invention est donc de pourvoir à des moyens de détection de microorganismes planctoniques présents dans de l'eau, tels que des microalgues, et à un procédé d'élimination sélective de ces microorganismes, qui soient utilisables aussi bien à l'échelle du laboratoire qu'à l'échelle industrielle, ainsi qu'au niveau de l'écosystème naturel, en milieu marin notamment. The object of the invention is therefore to provide means for detecting planktonic microorganisms present in water, such as microalgae, and a process for the selective elimination of these microorganisms, which can be used both at the same time. laboratory scale only on an industrial scale, as well as at the level of the natural ecosystem, especially in the marine environment.
A cette fin, les Inventeurs ont eu l'idée de rechercher si des copolymères du type de ceux décrits dans l'article de M. JOZEFOWICZ et J. JOZEFONVICZ, paru dans Biomaterials, 1997, 18, 1633-1644, pouvaient être utilisés en'tant que matériau présentant une affinité envers certains microorganismes planctoniques, cette affinité étant suffisamment importante et spécifique pour permettre la capture de ces microorganismes, que ce soit en vue de leur détection, de To this end, the inventors had the idea to investigate whether copolymers of the type described in the article by M. JOZEFOWICZ and J. JOZEFONVICZ, published in Biomaterials, 1997, 18, 1633-1644, could be used in as a material having an affinity towards certain planktonic microorganisms, this affinity being sufficiently important and specific to allow the capture of these microorganisms, whether for their detection,
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leur isolement ou de leur élimination. their isolation or their elimination.
La présente invention a pour objet un copolymère statistique insoluble comprenant un polymère synthétique dont les unités monomériques de base sont substituées par au moins un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé qui comprend les étapes suivantes : a) synthèse d'une librairie de copolymères insolubles par substitution statistique d'un polymère synthétique à l'aide d'acides aminés ou de leurs dérivés, b) préparation d'une culture cellulaire d'un protiste donné, c) mise en contact des copolymères préparés à l'étape a) avec une fraction de la culture cellulaire préparée à l'étape b), d) sélection et identification des copolymères qui présentent une affinité spécifique envers ledit protiste, et e) synthèse d'un copolymère identifié à l'issue de l'étape d). The subject of the present invention is an insoluble statistical copolymer comprising a synthetic polymer whose basic monomeric units are substituted by at least one amino acid or an amino acid derivative, characterized in that it is capable of being obtained by a process which comprises the following steps: a) synthesis of a library of insoluble copolymers by random substitution of a synthetic polymer with the aid of amino acids or their derivatives, b) preparation of a cell culture of a protist given, c) contacting the copolymers prepared in step a) with a fraction of the cell culture prepared in step b), d) selecting and identifying copolymers that have a specific affinity to said protist, and e) synthesis of a copolymer identified at the end of step d).
L'étape e) de synthèse d'un copolymère peut être effectuée en utilisant les techniques de chimie organique connues de l'Homme de l'art. Step e) of synthesis of a copolymer can be carried out using organic chemistry techniques known to those skilled in the art.
Le polymère synthétique mentionné ci-dessus est par exemple sélectionné dans le groupe constitué par les polymères vinyliques (tels que les acrylates ou le polystyrène), les polymères diéthyléniques, les polyuréthannes et les silicones. The synthetic polymer mentioned above is for example selected from the group consisting of vinyl polymers (such as acrylates or polystyrene), diethylenic polymers, polyurethanes and silicones.
On entend par protiste un microorganisme eucaryote unicellulaire autotrophe ou hétérotrophe. A titre d'exemples de protistes, on peut citer les microorganismes zooplanctoniques ou phytoplanctoniques, tels que les microalgues, ou encore les protozoaires. A protist is understood to mean an autotrophic or heterotrophic unicellular eukaryotic microorganism. As examples of protists, mention may be made of zooplankton or phytoplankton microorganisms, such as microalgae, or even protozoa.
Le copolymère défini ci-dessus peut être utilisé pour éliminer ledit protiste, dans le cas où il présente un risque pour l'environnement ou pour la santé. On peut citer par exemple les entités taxonomiques nuisibles suivantes : genres
Dinophysis, Alexandrium, Gonyaulax, Protogonyaitlac, Gambierdiscus, Ostreopsis, Ceratium, Prorocentrum, Gymnodinium, Gyrodinium, Heterosigma, Chatonella et Phaeocystis. Le copolymère peut également être utilisé pour isoler ou capturer ledit protiste, par exemple dans le but de récupérer des substances produites par ce dernier : certains protistes produisent en effet des métabolites d'intérêt industriel, par exemple en pharmacologie, ou dans les domaines alimentaire et technologique. A titre d'exemples, on peut citer les microalgues productrices d'acides gras polyinsaturés et les diatomées productrices de silice biominérale (Bacillariophycèes). The copolymer defined above can be used to eliminate said protist, in the case where it poses a risk to the environment or to health. Examples of harmful taxonomic entities include:
Dinophysis, Alexandrium, Gonyaulax, Protogonyaitlac, Gambierdiscus, Ostreopsis, Ceratium, Prorocentrum, Gymnodinium, Gyrodinium, Heterosigma, Chatonella and Phaeocystis. The copolymer may also be used for isolating or capturing said protist, for example for the purpose of recovering substances produced by the latter: certain protists in fact produce metabolites of industrial interest, for example in pharmacology, or in the food and technology. By way of examples, mention may be made of microalgae producing polyunsaturated fatty acids and diatoms producing biomineral silica (Bacillariophycèes).
Au cours de l'étape c) décrite ci-dessus, une association se forme During step c) described above, an association is formed
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entre ledit protiste et les copolymères qui présentent une affinité spécifique envers ce protiste. Les copolymères conformes à l'invention, sélectionnés par le procédé défini ci-dessus, présentent donc une affinité spécifique envers un protiste donné. Ce caractère biospécifique est dû à la fonctionnalisation statistique du copolymère, et provient également du procédé par lequel le copolymère est sélectionné. between said protist and copolymers which have a specific affinity towards this protist. The copolymers according to the invention, selected by the process defined above, therefore have a specific affinity towards a given protist. This biospecific character is due to the statistical functionalization of the copolymer, and also comes from the process by which the copolymer is selected.
De par sa fonctionnalisation statistique, le copolymère conforme à l'invention mime la structure d'un ligand naturel des récepteurs membranaires (tels que des facteurs de croissance, des glycopeptides, des lipopeptides) du protiste envers lequel il présente une affinité spécifique. Ainsi, le copolymère conforme à l'invention consiste avantageusement en un mimétique d'un peptide ou d'un dérivé de peptide. By virtue of its statistical functionalization, the copolymer according to the invention mimics the structure of a natural ligand of the membrane receptors (such as growth factors, glycopeptides, lipopeptides) of the protist to which it has a specific affinity. Thus, the copolymer according to the invention advantageously consists of a mimetic of a peptide or a peptide derivative.
Selon un mode de réalisation avantageux du copolymère conforme à l'invention, lesdites unités monomériques de base du polymère synthétique sont substituées, de façon statistique, par des groupements sulfonates et par de l'acide aspartique ou l'un de ses dérivés, de préférence un ester de l'acide aspartique (par exemple l'ester diméthylique). According to an advantageous embodiment of the copolymer according to the invention, said basic monomeric units of the synthetic polymer are randomly substituted with sulphonate groups and with aspartic acid or one of its derivatives, preferably an ester of aspartic acid (eg dimethyl ester).
Selon un autre mode de réalisation du copolymère conforme à l'invention, ledit acide aminé ou dérivé d'acide aminé est relié aux unités monomériques de base du polymère synthétique par une liaison chimique appropriée, par exemple une liaison sulfamide. According to another embodiment of the copolymer according to the invention, said amino acid or amino acid derivative is connected to the basic monomeric units of the synthetic polymer by a suitable chemical bond, for example a sulphonamide bond.
Selon un autre mode de réalisation du copolymère conforme à l'invention, ce dernier comprend, en pourcentages molaires : . entre 5 et 40% d'unités styrène non substituées, de préférence entre 25 et 31%, . entre 15 et 51% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, de préférence entre 21 et 25%, et . entre 44 et 55% d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, reliées auxdites unités styrène par une liaison sulfamide. According to another embodiment of the copolymer according to the invention, the latter comprises, in molar percentages: between 5 and 40% of unsubstituted styrene units, preferably between 25 and 31%, between 15 and 51% of styrene units substituted with sulphonate groups, preferably between 21 and 25%, and between 44 and 55% styrene units substituted by dimethyl esters of aspartic acid, connected to said styrene units by a sulfonamide linkage.
Un tel copolymère présente une affinité spécifique envers l'espèce Alexandrium minutum. Such a copolymer has a specific affinity for the species Alexandrium minutum.
Le copolymère conforme à l'invention peut par exemple comprendre, en pourcentages molaires, environ 29% d'unités styrène non substituées, environ 24% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, et environ 47% d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique. The copolymer according to the invention may for example comprise, in molar percentages, about 29% of unsubstituted styrene units, about 24% of styrene units substituted with sulphonate groups, and about 47% of styrene units substituted with dimethyl esters of aspartic acid.
L'invention a également pour objet l'utilisation du copolymère défini ci-dessus pour la capture sélective d'un protiste donné, en vue de la détection ou de l'élimination de cette espèce. The invention also relates to the use of the copolymer defined above for the selective capture of a given protist, for the detection or elimination of this species.
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Une telle utilisation est particulièrement utile pour capturer des protistes nuisibles. Such use is particularly useful for capturing harmful protists.
A titre d'exemples, on peut citer des espèces produisant des toxines endocellulaires qui se concentrent dans les produits de la mer au cours de la chaîne alimentaire et qui causent chez le consommateur humain divers désordres et intoxications de type gastrointestinal ou neurologique tels que : . des intoxications de type paralytique (PSP : Paralytic Shellfish Poisoning ) agissant sur le système nerveux central, occasionnées par des dinoflagellés comme Alexandrium catenella, Alexandrium minutum, Alexandrium
acatenella, Alexandrium cohorticula, Alexandrium fundyense, Alexandrium fraterculus, Alexandrium ostenfeldii, Alexandrium tamarense, Gymnodinium catenatum, Pyrodinium bahamense var. compressum, . des intoxications de type diarrhéique (DSP : Diarrhetic Shellfish Poisoning ), occasionnées par des espèces comme Dinophysis acuta, Dinophysis acuminata, Dinophysis norvegica, Dinophysis mitra, Dinophysis rotundata, Prorocentrum lima, Prorocentrum mexicanum, . des intoxications de type amnésique (ASP : Amnésie Shellfish Poisoning ), occasionnées par des espèces de diatomées comme Pseudo-nitzschia multiseries, Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima, Pseudo-nitzschia australis, ou de dinoflagellé comme Pfiesteria piscicida, . des intoxications de type ciguaterique (CFP : Ciguatera Fish Poisoning ), occasionnées par des espèces comme Gambierdiscus toxicus, Ostreopsis spp., Prorocentrum spp., . des intoxications de type neurotoxique (NSP : Neurotoxic Shellfish Poisoning ), occasionnées par des espèces comme Gymnodinium breve et Gymnodinium cf. breve,
On peut également citer les protozoaires dont une partie du cycle de vie comporte une ou plusieurs phases aquatiques (amibes, paramécies, trypanosomes, plasmodium, ...), dont l'ingestion entraîne une intoxication ou une parasitose. By way of examples, mention may be made of species producing endocellular toxins which are concentrated in seafood products during the food chain and which cause in the human consumer various gastrointestinal or neurological disorders and intoxications such as: paralytic poisoning (PSP: Paralytic Shellfish Poisoning) acting on the central nervous system, caused by dinoflagellates such as Alexandrium catenella, Alexandrium minutum, Alexandrium
Acatenella, Alexandrium cohorticula, Alexandrium fundyense, Alexandrium fraterculus, Alexandrium ostenfeldii, Alexandrium tamarense, Gymnodinium catenatum, Pyrodinium bahamense var. compressum,. Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP), caused by species such as Dinophysis acuta, Dinophysis acuminata, Dinophysis norvegica, Dinophysis mitra, Dinophysis rotundata, Prorocentrum lima, Prorocentrum mexicanum. Amnesic poisoning (ASP: Amnesia Shellfish Poisoning), caused by diatom species like Pseudo-nitzschia multiseries, Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima, Pseudo-nitzschia australis, or dinoflagellate like Pfiesteria piscicida,. Ciguatera poisoning (CFP: Ciguatera Fish Poisoning), caused by species such as Gambierdiscus toxicus, Ostreopsis spp., Prorocentrum spp.,. neurotoxic poisoning (NSP: Neurotoxic Shellfish Poisoning), caused by species such as Gymnodinium breve and Gymnodinium cf. breve,
It is also possible to mention protozoa whose part of the life cycle includes one or more aquatic phases (amoebae, paramecium, trypanosomes, plasmodium, etc.), the ingestion of which leads to intoxication or parasitosis.
On peut également citer des espèces qui ne sont pas toxiques pour le consommateur humain, mais qui occasionnent des pertes de cheptel aquacole importantes et induisent des perturbations considérables des écosystèmes côtiers, telles que la diatomée Chaetoceros convultus, les haptophycées comme Chrysochromulina polylepis, Phaeocystis pouchetii, Phaeocystis antartica, Prymnesium parvum et Prymnesium patelliferum, les dinolfagellés comme Gymnodinium mikimotoi et Gymnodinium corsicum, ainsi que les raphydophytes comme Heterosigma carterae, Chattonella antiqua, Chattonella marina et Species which are not toxic to the human consumer, but which cause significant losses of aquaculture stock and cause considerable disturbances of coastal ecosystems, such as the diatom Chaetoceros convultus, haptophyceae such as Chrysochromulina polylepis, Phaeocystis pouchetii, may also be mentioned. Phaeocystis antartica, Prymnesium parvum and Prymnesium patelliferum, dinolfagellates such as Gymnodinium mikimotoi and Gymnodinium corsicum, as well as rapophophytes such as Heterosigma carterae, Chattonella antiqua, Chattonella marina and
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Chattonella verrucolosa. Chattonella verrucolosa.
L'invention a également pour objet l'utilisation du copolymère décrit ci-dessus qui comprend, en pourcentages molaires, entre 5 et 40% d'unités styrène non substituées, entre 15 et 51% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, et entre 44 et 55% d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, pour la capture sélective de l'espèce Alexandrium minutum, en vue de la détection ou de l'élimination de cette espèce. The subject of the invention is also the use of the copolymer described above which comprises, in molar percentages, between 5 and 40% of unsubstituted styrene units, between 15 and 51% of styrene units substituted with sulphonate groups, and between 44 and 55% styrene units substituted with dimethyl esters of aspartic acid, for the selective uptake of the species Alexandrium minutum, for the detection or elimination of this species.
L'invention a également pour objet un dispositif de filtration d'eau pour en éliminer sélectivement au moins un protiste donné, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un copolymère tel que décrit précédemment, ledit copolymère comprenant de préférence, en pourcentages molaires, entre 5 et 40% d'unités styrène non substituées, entre 15 et 51% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, et entre 44 et 55% d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, tel que décrit ci-dessus, lorsque ledit protiste est l'espèce Alexandrium minutum. The invention also relates to a water filtration device for selectively removing at least one given protist, characterized in that it comprises at least one copolymer as described above, said copolymer preferably comprising, in molar percentages, between 5 and 40% of unsubstituted styrene units, between 15 and 51% of styrene units substituted by sulfonate groups, and between 44 and 55% of styrene units substituted with dimethyl esters of aspartic acid, such as described above, when said protist is the species Alexandrium minutum.
Grâce à ce dispositif, la concentration dudit protiste donné est diminuée de manière significative dans l'eau filtrée (eau douce ou eau de mer par exemple). With this device, the concentration of said given protist is significantly reduced in filtered water (freshwater or seawater for example).
Un tel dispositif de filtration d'eau peut par exemple se présenter sous la forme d'un filet ou d'une membrane filtrante. De manière générale, il est bien entendu que tout matériau d'une porosité donnée, dont la surface est revêtue du copolymère selon l'invention, pourrait être utilisée dans ce dispositif. Such a water filtration device may for example be in the form of a net or a filter membrane. In general, it is understood that any material of a given porosity, the surface of which is coated with the copolymer according to the invention, could be used in this device.
On pourrait également envisager l'utilisation des copolymères décrits ci-dessus en tant que phase stationnaire en chromatographie d'affinité sur colonne, toujours dans le but d'éliminer un protiste donné d'une source d'eau. The use of the copolymers described above as a stationary phase in column affinity chromatography could also be envisaged, always with the aim of eliminating a given protist from a source of water.
La présente invention a également pour objet un procédé de sélection de copolymères présentant une affinité spécifique envers un protiste donné, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) synthèse d'une librairie de copolymères insolubles, mimétiques de peptides ou de dérivés de peptides, par substitution statistique d'un polymère synthétique par des acides aminés ou leurs dérivés, b) préparation d'une culture cellulaire d'un protiste donné, c) mise en contact des copolymères préparés à l'étape a) avec une fraction de la culture cellulaire préparée à l'étape b), et d) sélection et identification des copolymères qui présentent une affinité spécifique envers ledit protiste. The present invention also relates to a method for selecting copolymers having a specific affinity towards a given protist, characterized in that it comprises the following steps: a) synthesis of a library of insoluble copolymers, mimetics of peptides or derivatives of peptides, by random substitution of a synthetic polymer with amino acids or their derivatives, b) preparation of a cell culture of a given protist, c) contacting the copolymers prepared in step a) with a fraction of the cell culture prepared in step b), and d) selection and identification of copolymers which have a specific affinity towards said protist.
Ledit protiste est tel que décrit précédemment. Il consiste par Said protist is as previously described. It consists of
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exemple en l'espèce Alexandrium minutum. example in this case Alexandrium minutum.
Le procédé selon l'invention peut comprendre, entre les étapes b) et c), une étape de marquage radioactif dudit protiste. Auquel cas, l'étape d) est effectuée par la détection des associations copolymère/protiste qui donnent lieu à une émission de radioactivité. The method according to the invention may comprise, between steps b) and c), a radioactive labeling step of said protist. In which case, step d) is carried out by the detection of the copolymer / protic associations which give rise to a radioactivity emission.
Le procédé selon l'invention peut également comprendre, entre les étapes c) et d), une étape d'élimination des cellules qui ne se sont pas associées aux copolymères, réalisée par tamisage. The process according to the invention may also comprise, between steps c) and d), a step of removing cells which have not associated with the copolymers, carried out by sieving.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de procédés de synthèse et de sélection de copolymères conformes à l'invention, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 représente le profil d'adhésion des cellules d'Alexandrium minutum en fonction de la composition de copolymères à base de polystyrène, comprenant différents taux de substitution en ester diméthylique de l'acide aspartique. Les abscisses représentent le taux de substitution des copolymères en ester diméthylique de l'acide aspartique. L'axe des ordonnées situé à gauche du graphique représente le taux d'adhésion des cellules sur les copolymères, exprimé en un rapport signal radioactif/bruit de fond (courbe -#-). L'axe des ordonnées situé à droite du graphique représente le taux de gonflement des copolymères dans le milieu f/2 (courbe-#-), - la figure 2 représente le profil d'adhésion des cellules d'Heterocapsa triquetra en fonction de la composition de ces mêmes copolymères à base de polystyrène, comprenant différents taux de substitution en ester diméthylique de l'acide aspartique. Les axes des abscisses et des ordonnées ont les mêmes significations que dans la figure 1. In addition to the foregoing, the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of methods for the synthesis and selection of copolymers according to the invention, as well as to the drawings in which: - Figure 1 shows the adhesion profile of Alexandrium minutum cells as a function of the composition of polystyrene-based copolymers, comprising different levels of substitution of dimethyl ester of aspartic acid. The abscissae represent the degree of substitution of the dimethyl ester copolymers of aspartic acid. The ordinate axis to the left of the graph represents the adhesion rate of the cells on the copolymers, expressed in a ratio radioactive signal / background noise (curve - # -). The ordinate axis on the right of the graph represents the swelling rate of the copolymers in the medium f / 2 (curve - # -), - Figure 2 represents the adhesion profile of the cells of Heterocapsa triquetra as a function of the composition of these same copolymers based on polystyrene, comprising different levels of substitution of dimethyl ester of aspartic acid. The axes of the abscissae and ordinates have the same meanings as in FIG.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the object of the invention, of which they in no way constitute a limitation.
EXEMPLE 1 : d'une librairie de copolymères mimétiques de dérivés de peptides. EXAMPLE 1: A Library of Mimetic Copolymers of Peptide Derivatives
1) Polymère synthétique utilisé. 1) Synthetic polymer used.
On utilise des microsphères de polystyrène réticulées avec 3% de divinylbenzène, commercialisées par Bio-Rad Laboratories (Richmond, Californie, USA) sous la dénomination BioBeads SX3. Polystyrene microspheres crosslinked with 3% divinylbenzene are commercially available from Bio-Rad Laboratories (Richmond, Calif., USA) under the name BioBeads SX3.
Afin d'en éliminer toute impureté résiduelle, ces microsphères de polystyrène sont lavées successivement à l'aide de soude 1M, d'eau déminéralisée, In order to remove any residual impurity, these microspheres of polystyrene are washed successively with 1M sodium hydroxide solution, demineralized water,
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d'acide chlorhydrique 1M et de nouveau à l'aide d'eau déminéralisée, chaque lavage étant effectué pendant 3 heures. A l'issue du dernier lavage, les microsphères de polystyrène sont filtrée, puis séchées sous vide à 50 C. 1M hydrochloric acid and again with demineralized water, each washing being carried out for 3 hours. At the end of the last washing, the polystyrene microspheres are filtered and then dried under vacuum at 50 ° C.
2) Protocole de substitution statistique du polystyrène. 2) Statistical substitution protocol for polystyrene.
Les substitutions choisies consistent en des sulfamides de l'ester méthylique de l'acide aspartique, de la leucine et de la phénylalanine. Le protocole qui suit est répété, pour ces trois familles de substituants, de façon à obtenir huit degrés de substitution différents. The substitutions selected consist of sulphonamides of the methyl ester of aspartic acid, leucine and phenylalanine. The following protocol is repeated, for these three families of substituents, so as to obtain eight different degrees of substitution.
# Chlorosulfonation. # Chlorosulfonation.
2,5 g de microsphères de polystyrène sèches sont gonflées dans
75 ml de dichlorométhane, pendant une nuit. On procède ensuite à une réaction de chlorosulfonation : les microsphères de polystyrène sont mises en contact avec un excès d'acide chlorosulfonique (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), pendant 60 minutes, à 40 C, sous agitation et sous reflux. Les microsphères de polystyrène chlorosulfonées sont lavées sous vide à l'aide, successivement, de dichlorométhane distillé, d'acétone distillée et de nouveau de dichlorométhane distillé, puis dispersées dans 100 ml de dichlorométhane. 2.5 g of dry polystyrene microspheres are swollen in
75 ml of dichloromethane overnight. A chlorosulfonation reaction is then carried out: the polystyrene microspheres are brought into contact with an excess of chlorosulphonic acid (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) for 60 minutes, at 40 ° C., with stirring and under reflux. The chlorosulfonated polystyrene microspheres are washed under vacuum using, successively, distilled dichloromethane, distilled acetone and distilled dichloromethane again, then dispersed in 100 ml of dichloromethane.
# Sulfamidation. # Sulfamidation.
Pour obtenir environ 10% de substitution du polystyrène, 0,11 moles d'acide aminé, sous forme de chlorhydrate d'ester monométhylique (dans le cas de la leucine et de la phénylalanine) ou diméthylique (dans le cas de l'acide aspartique), sont introduits par mole de polystyrène sec. La réaction est initiée par l'ajout de 2 équivalents molaires de triéthylamine, suivie d'une agitation douce du mélange pendant 48 heures, puis de nouveau par l'ajout d'1équivalent de triéthylamine, le milieu réactionnel étant maintenu sous agitation pendant 12 heures. Une fois la réaction de sulfamidation effectuée, les copolymères sont filtrés et lavés trois heures dans de l'éthanol pour éliminer les traces de dichlorométhane. To obtain about 10% substitution of polystyrene, 0.11 moles of amino acid, in the form of monomethyl ester hydrochloride (in the case of leucine and phenylalanine) or dimethyl (in the case of aspartic acid) ) are introduced per mole of dry polystyrene. The reaction is initiated by the addition of 2 molar equivalents of triethylamine, followed by gentle stirring of the mixture for 48 hours, then again by the addition of 1 equivalent of triethylamine, the reaction medium being stirred for 12 hours. . Once the sulfonidation reaction has been carried out, the copolymers are filtered and washed for three hours in ethanol to remove traces of dichloromethane.
A ce stade, on obtient donc trois familles de copolymères : . famille I : copolymères comprenant des unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, . famille II : comprenant des unités styrène substituées par des esters méthyliques de la phénylalanine, . famille III : copolymères comprenant des unités styrène substituées par des esters méthyliques de la leucine, les copolymères de ces trois familles présentant chacun des degrés variables en acides aminés sous forme d'esters, ainsi que des unités styrène non substituées et des unités styrène substituées par des groupements chlosulfonates. At this stage, three families of copolymers are thus obtained: family I: copolymers comprising styrene units substituted with dimethyl esters of aspartic acid, family II: comprising styrene units substituted with methyl esters of phenylalanine,. family III: copolymers comprising styrene units substituted with methyl esters of leucine, the copolymers of these three families each having varying degrees of amino acid in the form of esters, as well as unsubstituted styrene units and substituted styrene units; chlosulphonate groups.
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Dans le tableau 1 ci-après sont rassemblées, pour les familles de copolymères I à III, les quantités d'acide aminé sous forme d'ester utilisées lors de la réaction de sulfamidation (quantités exprimées en grammes pour 2,5 grammes de polystyrène sous forme sèche, et en pourcentage molaire pour 100 moles de polystyrène), ainsi que les quantités de triéthylamine utilisées (en millilitres) lors du premier ajout (2 équivalents) et du second ajout (1 équivalent). In Table 1 below, for the families of copolymers I to III, the amounts of amino acid in ester form used during the sulphonidation reaction (quantities expressed in grams per 2.5 grams of polystyrene under dry form, and in molar percentage per 100 moles of polystyrene), as well as the quantities of triethylamine used (in milliliters) during the first addition (2 equivalents) and the second addition (1 equivalent).
# Hydrolyse. # Hydrolysis.
Pour la famille de copolymères I, on procède ensuite à une réaction d'hydrolyse faible, au moyen de six lavages par de la soude 10-2 M, suivis de lavages à l'eau déminéralisée jusqu'à ce que le pH des bains de lavage reste constant. For the family of copolymers I, a weak hydrolysis reaction is then carried out, by means of six washes with 10-2 M sodium hydroxide, followed by washes with demineralized water until the pH of the baths of washing remains constant.
L'hydrolyse faible permet d'obtenir des copolymères comprenant, outre des unités styrène non substituées, des unités styrène substituées par des groupements sulfonates de sodium et des unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique. The low hydrolysis provides copolymers comprising, in addition to unsubstituted styrene units, styrene units substituted with sodium sulfonate groups and styrene units substituted with dimethyl esters of aspartic acid.
Pour les familles de copolymères II et III, on procède à une réaction d'hydrolyse forte à l'aide de soude 2M. Afin de minimiser le choc osmotique et de ne pas endommager les microsphères de polystyrène, on utilise un gradient croissant, puis décroissant pour la concentration de la soude (dans l'ordre : 10-2, 10-1, 1, 2, 1,
10-1, puis 10-2 M). L'hydrolyse forte permet d'obtenir des copolymères comprenant, outre des unités styrène non substituées, des unités styrène substituées par des groupements sulfonates de sodium et des unités styrène substituées par le sel sodé de la phénylalanine ou de la leucine. For families of copolymers II and III, a strong hydrolysis reaction is carried out using 2M sodium hydroxide. In order to minimize the osmotic shock and not to damage the polystyrene microspheres, we use a gradient increasing and decreasing for the concentration of sodium hydroxide (in the order: 10-2, 10-1, 1, 2, 1,
10-1, then 10-2 M). The strong hydrolysis provides copolymers comprising, in addition to unsubstituted styrene units, styrene units substituted with sodium sulfonate groups and styrene units substituted with the sodium salt of phenylalanine or leucine.
3) Caractérisation chimique des copolymères synthétisés. 3) Chemical characterization of the synthesized copolymers.
Le tableau II résume les taux de substitution des trois familles de copolymères, à savoir les taux en unités styrène non substituées (colonne styrène dans le tableau II), en unités styrène substituées par des groupements sulfonates de sodium (colonne sulfonate dans le tableau II), et en unités styrène substituées par des acides aminés, sous forme d'ester diméthylique dans le cas des copolymères de la famille 1 et sous forme de sel sodé dans le cas des copolymères des familles II et III (colonne acide aminé dans le tableau II). Table II summarizes the substitution rates of the three families of copolymers, namely the levels in unsubstituted styrene units (styrene column in Table II), in styrene units substituted with sodium sulfonate groups (sulfonate column in Table II). and in amino acid-substituted styrene units, in the form of dimethyl ester in the case of family 1 copolymers and in the form of soda salt in the case of the copolymers of families II and III (amino acid column in Table II). ).
Ces taux de substitution sont déduits de l'analyse élémentaire des copolymères en azote (analyseur Perkin-Elmer 2400 CHN), en soufre (analyseur coulométrique Tacussel de type Coulomatic S-Cl) et en chlore (analyseur Titrator DL 55 de Mettler Toledo), mesurée après passage des copolymères dans un four à 50 C, pendant un temps suffisant pour rester à poids constant. Dans le tableau I, l'analyse élémentaire en azote (N), en soufre (S) et en chlore (Cl) est donnée en pourcentage pondéral (c'est-à-dire en grammes pour 100 grammes de polystyrène sous forme These substitution rates are deduced from the elemental analysis of the nitrogen copolymers (Perkin-Elmer 2400 CHN analyzer), sulfur (Coulomatic S-Cl type Coulomatic coulometric analyzer) and chlorine (Mettler Toledo Titrator DL 55 analyzer). measured after passing the copolymers in an oven at 50 C, for a time sufficient to remain constant weight. In Table I, the elemental analysis of nitrogen (N), sulfur (S) and chlorine (Cl) is given in percent by weight (i.e., grams per 100 grams of polystyrene in the form of
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sèche). dried).
Le tableau II mentionne également le taux de gonflement des copolymères, mesuré par la différence entre le volume occupé par une quantité donnée de copolymère à l'état sec (sous forme de poudre) et le volume occupé par cette même quantité de copolymère placé dans du milieu Guillard f/2 tel que décrit par R.R.L. Table II also mentions the degree of swelling of the copolymers, measured by the difference between the volume occupied by a given quantity of copolymer in the dry state (in the form of powder) and the volume occupied by this same quantity of copolymer placed in Guillard medium f / 2 as described by RRL
Guillard (1983) dans l'ouvrage Culture of Marine Invertebrates, Selected Readings,
C.J. Berg Jr. Editor, pages 108-132. Ce milieu consiste en de l'eau de mer dans laquelle sont additionnés les sels nutritifs nécessaires à la croissance des microalgues
Alexandrium minutum et Heterocapsa triquetra. On constate que le taux de gonflement est d'autant plus important que le copolymère comprend un taux de substitution en groupements sulfonates de sodium élevé (groupements de nature hydrophile). Guillard (1983) in the book Culture of Marine Invertebrates, Selected Readings,
CJ Berg Jr. Editor, pages 108-132. This medium consists of seawater in which are added the nutritive salts necessary for the growth of microalgae
Alexandrium minutum and Heterocapsa triquetra. It is found that the degree of swelling is all the more important that the copolymer comprises a substitution rate of high sodium sulfonate groups (groups of hydrophilic nature).
EXEMPLE 2 : Culture de microalgues et marquage radioactif de ces dernières. EXAMPLE 2 Culture of microalgae and radioactive labeling of the latter.
1) Culture des microalgues. 1) Culture of microalgae.
Des souches d'Alexandrium minutum (souche AM89BM fournie par l'IFREMER) et d'Heterocapsa triquetra (souche CCMP 449 fournie par la société
CCMP, West Boothbay Harbour, USA) sont cultivées dans des conditions similaires à celles décrites par S. La Barre et al. dans Journal of Biotechnology, 1999,70,
207-212 : le milieu de culture consiste en 80 ml d'eau de mer (qui a été filtrée de façon à en éliminer les bactéries) enrichi de 3 ml de solution de Guillard f/2 exempte de silicium. Ce milieu est stérilisé à 120 C pendant 30 minutes, puis enrichi par des vitamines du groupe B à l'état de traces. Une solution antibactérienne commerciale (Life Technologies, Eragny, France) comprenant un mélange de pénicilline (5000 unités/ml) et de streptomycine (5000 unités/ml) est ajoutée à ce milieu, à raison de 1% en volume, avant son inoculation avec 105 cellules d'Alexandrium minutum ou d'Heterocapsa triquetra. Le milieu est complété à 100 ml par du milieu f/2 stérilisé, puis il est incubé à 17 C sous une alternance de lumière (85 E.s-1.m-2) et d'obscurité avec des cycles 12 heures/ 12 heures, une agitation douce étant effectuée deux fois par jour. Strains of Alexandrium minutum (strain AM89BM supplied by IFREMER) and Heterocapsa triquetra (strain CCMP 449 provided by the company
CCMP, West Boothbay Harbor, USA) are cultivated under conditions similar to those described by S. La Barre et al. in Journal of Biotechnology, 1999, 70,
207-212: The culture medium consists of 80 ml of seawater (which has been filtered to remove bacteria) enriched with 3 ml of silicon-free Guillard f / 2 solution. This medium is sterilized at 120 ° C. for 30 minutes and then enriched with trace group B vitamins. A commercial antibacterial solution (Life Technologies, Eragny, France) comprising a mixture of penicillin (5000 units / ml) and streptomycin (5000 units / ml) is added to this medium, at a rate of 1% by volume, before its inoculation with 105 cells of Alexandrium minutum or Heterocapsa triquetra. The medium is made up to 100 ml with sterilized f / 2 medium and is then incubated at 17 ° C. under alternating light (85 Es-1.m-2) and darkness with 12-hour / 12-hour cycles. gentle agitation being performed twice daily.
La courbe de prolifération (représentation du nombre de cellules par ml en fonction du temps) de la souche Alexandrium minutum révèle une période de latence de 2 jours, suivie d'une phase de multiplication exponentielle de 21 jours, puis d'une période stationnaire (plateau) au jour 23. La vitesse de division cellulaire à la moitié de la phase exponentielle de croissance (jour 14 après l'inoculation) est de 3,4 jours, en accord avec ce qui a été décrit dans l'article de S. La barre et al. (ibid). The proliferation curve (representation of the number of cells per ml as a function of time) of the strain Alexandrium minutum reveals a latency period of 2 days, followed by an exponential multiplication phase of 21 days, then a stationary period ( plateau) at day 23. The cell division rate at half the exponential growth phase (day 14 after inoculation) is 3.4 days, consistent with what was described in the article of S. The bar et al. (Ibid).
Heterocapsa triquetra présente un cycle de croissance plus rapide qu'Alexandrium minutum: la phase de latence est de 1,5 jours et celle de Heterocapsa triquetra has a faster growth cycle than Alexandrium minutum: the lag phase is 1.5 days and that of
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Tableau I
<tb>
<tb> Famille <SEP> de <SEP> Quantité <SEP> d'acide <SEP> aminé <SEP> Quantité <SEP> de <SEP> triéthylamine <SEP> (ml)
<tb> copolymères <SEP> g <SEP> % <SEP> molaire <SEP> premier <SEP> ajout <SEP> second <SEP> ajout
<tb> Famille <SEP> I
<tb> la <SEP> 0,521 <SEP> 11 <SEP> 0,73 <SEP> 0,36
<tb> Ib <SEP> 1,043 <SEP> 22 <SEP> 1,47 <SEP> 0,73
<tb> le <SEP> 1,564 <SEP> 33 <SEP> 2,20 <SEP> 1,10
<tb> Id <SEP> 2,086 <SEP> 44 <SEP> 2,94 <SEP> 1,47
<tb> le <SEP> 2,608 <SEP> 55 <SEP> 3,68 <SEP> 1,84
<tb> If <SEP> 3,129 <SEP> 66 <SEP> 4,41 <SEP> 2,20
<tb> Ig <SEP> 3,651 <SEP> 77 <SEP> 5,15 <SEP> 2,57
<tb> Ih <SEP> 4,173 <SEP> 88 <SEP> 5,88 <SEP> 2,94
<tb> Famille <SEP> II
<tb> IIa <SEP> 0,569 <SEP> 11 <SEP> 0,73 <SEP> 0,36
<tb> IIb <SEP> 1,138 <SEP> 22 <SEP> 1,47 <SEP> 0,73
<tb> IIc <SEP> 1,708 <SEP> 33 <SEP> 2,20 <SEP> 1,10
<tb> IId <SEP> 2,277 <SEP> 44 <SEP> 2,94 <SEP> 1,47
<tb> IIe <SEP> 2,847 <SEP> 55 <SEP> 3,68 <SEP> 1,84
<tb> IIf <SEP> 3,416 <SEP> 66 <SEP> 4,41 <SEP> 2,20
<tb> Ilg <SEP> 3,986 <SEP> 77 <SEP> 5,15 <SEP> 2,57
<tb> IIh <SEP> 4,555 <SEP> 88 <SEP> 5,88 <SEP> 2,94
<tb> Famille <SEP> III
<tb> IIIa <SEP> 0,479 <SEP> 11 <SEP> 0,73 <SEP> 0,36
<tb> IIIb <SEP> 0,959 <SEP> 22 <SEP> 1,47 <SEP> 0,73
<tb> IIIc <SEP> 1,438 <SEP> 33 <SEP> 2,20 <SEP> 1,10
<tb> IIId <SEP> 1,918 <SEP> 44 <SEP> 2,94 <SEP> 1,47
<tb> IIIe <SEP> 2,397 <SEP> 55 <SEP> 3,68 <SEP> 1,84
<tb> IIIf <SEP> 2,877 <SEP> 66 <SEP> 4,41 <SEP> 2,20
<tb> IIIg <SEP> 3,357 <SEP> 77 <SEP> 5,15 <SEP> 2,57
<tb> IIIh <SEP> 3,836 <SEP> 88 <SEP> 5,88 <SEP> 2,94
<tb> <Tb>
<tb> Family <SEP> of <SEP> Amount <SEP> of acid <SEP> amine <SEP> Amount <SEP> of <SEP> triethylamine <SEP> (ml)
<tb> copolymers <SEP> g <SEP>% <SEP> molar <SEP> first <SEP> addition <SEP> second <SEP> addition
<tb> Family <SEP> I
<tb><SEP> 0.521 <SEP> 11 <SEP> 0.73 <SEP> 0.36
<tb> Ib <SEP> 1.043 <SEP> 22 <SEP> 1.47 <SEP> 0.73
<tb> the <SEP> 1,564 <SEP> 33 <SEP> 2,20 <SEP> 1,10
<tb> Id <SEP> 2.086 <SEP> 44 <SEP> 2.94 <SEP> 1.47
<tb><SEP> 2.608 <SEP> 55 <SEP> 3.68 <SEP> 1.84
<tb> If <SEP> 3,129 <SEP> 66 <SEP> 4,41 <SEP> 2,20
<tb> Ig <SEP> 3,651 <SEP> 77 <SEP> 5,15 <SEP> 2,57
<tb> Ih <SEP> 4,173 <SEP> 88 <SEP> 5.88 <SEP> 2.94
<tb> Family <SEP> II
<tb> IIa <SEP> 0.569 <SEP> 11 <SEP> 0.73 <SEP> 0.36
<tb> IIb <SEP> 1.138 <SEP> 22 <SEP> 1.47 <SEP> 0.73
<tb> IIc <SEP> 1.708 <SEP> 33 <SEP> 2.20 <SEP> 1.10
<tb> IId <SEP> 2.277 <SEP> 44 <SEP> 2.94 <SEP> 1.47
<tb> Second <SEP> 2,847 <SEP> 55 <SEP> 3,68 <SE> 1,84
<tb> IIf <SEP> 3,416 <SEP> 66 <SEP> 4,41 <SEP> 2,20
<tb> Ilg <SEP> 3,986 <SEP> 77 <SEP> 5,15 <SEP> 2,57
<tb> IIh <SEP> 4.555 <SEP> 88 <SEP> 5.88 <SEP> 2.94
<tb> Family <SEP> III
<tb> IIIa <SEP> 0.479 <SEP> 11 <SEP> 0.73 <SEP> 0.36
<tb> IIIb <SEP> 0.959 <SEP> 22 <SEP> 1.47 <SEP> 0.73
<tb> IIIc <SEP> 1,438 <SEP> 33 <SEP> 2,20 <SEP> 1,10
<tb> IIId <SEP> 1,918 <SEP> 44 <SEP> 2.94 <SEP> 1,47
<tb> IIIe <SEP> 2,397 <SEP> 55 <SEP> 3,68 <SE> 1,84
<tb> IIIf <SEP> 2,877 <SEP> 66 <SEP> 4,41 <SEP> 2,20
<tb> IIIg <SEP> 3,357 <SEP> 77 <SEP> 5,15 <SEP> 2,57
<tb> IIIh <SEP> 3,836 <SEP> 88 <SEP> 5.88 <SEP> 2.94
<Tb>
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Tableau II
<tb> Famille <SEP> de <SEP> copolymères <SEP> Taux <SEP> (%) <SEP> en <SEP> unités <SEP> : <SEP> Taux <SEP> de <SEP> Analyse <SEP> élémentaire <SEP> (% <SEP> pondéral)
<tb> styrène <SEP> sulfonate <SEP> acide <SEP> aminé <SEP> gonflement <SEP> N <SEP> S <SEP> Cl
<tb> Famille <SEP> I
<tb> la <SEP> 27 <SEP> 64 <SEP> 9 <SEP> 150 <SEP> 0,67 <SEP> 12,31 <SEP> traces <SEP> (< <SEP> 0,01%) <SEP>
<tb> Ib <SEP> 27 <SEP> 54 <SEP> 17 <SEP> 142 <SEP> 1,17 <SEP> 11,76
<tb> le <SEP> 28 <SEP> 47 <SEP> 25 <SEP> 121 <SEP> 1,68 <SEP> 11,12
<tb> Id <SEP> 40 <SEP> 28 <SEP> 32 <SEP> 100 <SEP> 2,19 <SEP> 9,44
<tb> le <SEP> 31 <SEP> 25 <SEP> 44 <SEP> 100 <SEP> 2,69 <SEP> 9,69
<tb> If <SEP> 29 <SEP> 24 <SEP> 47 <SEP> 100 <SEP> 2,84 <SEP> 9,70
<tb> Ig <SEP> 25 <SEP> 21 <SEP> 54 <SEP> 100 <SEP> 3,08 <SEP> 9,73
<tb> Ih <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 68 <SEP> 100 <SEP> 3,49 <SEP> 9,91 <SEP> #
<tb> Famille <SEP> Il <SEP>
<tb> IIa <SEP> 21 <SEP> 73 <SEP> 6 <SEP> 210 <SEP> 0,43 <SEP> 13,09 <SEP> traces <SEP> (< <SEP> 0,01%) <SEP>
<tb> IIb <SEP> 21 <SEP> 65 <SEP> 14 <SEP> 187 <SEP> 0,48 <SEP> 12,29
<tb> Ile <SEP> 27 <SEP> 53 <SEP> 20 <SEP> 175 <SEP> 1,36 <SEP> 11,19
<tb> IId <SEP> 37 <SEP> 30 <SEP> 33 <SEP> 150 <SEP> 2,11 <SEP> 9,28
<tb> IIe <SEP> 27 <SEP> 37 <SEP> 36 <SEP> 150 <SEP> 2,18 <SEP> 10,07
<tb> IIf <SEP> 26 <SEP> 21 <SEP> 53 <SEP> 150 <SEP> 2,88 <SEP> 9,22
<tb> IIg <SEP> 21 <SEP> 19 <SEP> 60 <SEP> 150 <SEP> 3,07 <SEP> 9,29
<tb> IIh <SEP> 18 <SEP> 15 <SEP> 67 <SEP> 150 <SEP> 3,27 <SEP> 9,18
<tb> <tb> Family <SEP> of <SEP> Copolymers <SEP> Rate <SEP> (%) <SEP> in <SEP> Units <SEP>: <SEP> Rate <SEP> of <SEP> Analysis <SEP> Elemental <SEP> (% <SEP> by weight)
<tb> styrene <SEP> sulfonate <SEP> acid <SEP> amine <SEP> swelling <SEP> N <SEP> S <SEP> Cl
<tb> Family <SEP> I
<tb> the <SEP> 27 <SEP> 64 <SEP> 9 <SEP> 150 <SEP> 0.67 <SEP> 12.31 <SEP> traces <SEP>(<<SEP> 0.01%) <September>
<tb> Ib <SEP> 27 <SEP> 54 <SEP> 17 <SEP> 142 <SEP> 1,17 <SEP> 11,76
<tb> on <SEP> 28 <SEP> 47 <SEP> 25 <SEP> 121 <SEP> 1,68 <SEP> 11,12
<tb> Id <SEP> 40 <SEP> 28 <SEP> 32 <SEP> 100 <SEP> 2.19 <SEP> 9.44
<tb> the <SEP> 31 <SEP> 25 <SEP> 44 <SEP> 100 <SEP> 2.69 <SE> 9.69
<tb> If <SEP> 29 <SEP> 24 <SEP> 47 <SEP> 100 <SEP> 2.84 <SEP> 9.70
<tb> Ig <SEP> 25 <SEP> 21 <SEP> 54 <SEP> 100 <SEP> 3.08 <SEP> 9.73
<tb> Ih <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 68 <SEP> 100 <SEP> 3.49 <SEP> 9.91 <SEP>#
<tb> Family <SEP> It <SEP>
<tb> IIa <SEP> 21 <SEP> 73 <SEP> 6 <SEP> 210 <SEP> 0.43 <SEP> 13.09 <SEP> traces <SEP>(<<SEP> 0.01%) <September>
<tb> IIb <SEP> 21 <SEP> 65 <SEP> 14 <SEP> 187 <SEP> 0.48 <SEP> 12.29
<tb> Ile <SEP> 27 <SEP> 53 <SEP> 20 <SEP> 175 <SE> 1.36 <SEP> 11.19
<tb> IId <SEP> 37 <SEP> 30 <SEP> 33 <SEP> 150 <SEP> 2,11 <SEP> 9.28
<tb> Second <SEP> 27 <SEP> 37 <SEP> 36 <SEP> 150 <SEP> 2.18 <SEP> 10.07
<tb> IIf <SEP> 26 <SEP> 21 <SEP> 53 <SEP> 150 <SEP> 2.88 <SEP> 9.22
<tb> IIg <SEP> 21 <SEP> 19 <SEP> 60 <SEP> 150 <SEP> 3.07 <SEP> 9.29
<tb> IIh <SEP> 18 <SEP> 15 <SEP> 67 <SEP> 150 <SEP> 3.27 <SEP> 9.18
<Tb>
Famille III ######### ########'#############
Family III ######### ######## '#############
<tb> IIIa <SEP> 26 <SEP> 66 <SEP> 8 <SEP> 150 <SEP> 0,57 <SEP> 12,54 <SEP> traces <SEP> (< <SEP> 0,01%) <SEP>
<tb> IIIb <SEP> 21 <SEP> 60 <SEP> 19 <SEP> 150 <SEP> 1,29 <SEP> 12,23 <SEP> #
<tb> IIIc <SEP> 22 <SEP> 51 <SEP> 27 <SEP> 145 <SEP> 1,77 <SEP> 11,68
<tb> IIId <SEP> 20 <SEP> 44 <SEP> 36 <SEP> 124 <SEP> 2,23 <SEP> 11,29
<tb> IIIe <SEP> 18 <SEP> 30 <SEP> 52 <SEP> 110 <SEP> 2,94 <SEP> 10,65
<tb> IIIf <SEP> 20 <SEP> 18 <SEP> 62 <SEP> 100 <SEP> 3,37 <SEP> 10,04
<tb> IIIg <SEP> 20 <SEP> 9 <SEP> 71 <SEP> 100 <SEP> 3,75 <SEP> 9,62
<tb> IIIh <SEP> 13 <SEP> 4 <SEP> 83 <SEP> 100 <SEP> 4,06 <SEP> 9,72
<tb> <tb> IIIa <SEP> 26 <SEP> 66 <SEP> 8 <SEP> 150 <SEP> 0.57 <SEP> 12.54 <SEP> traces <SEP>(<<SEP> 0.01%) <September>
<tb> IIIb <SEP> 21 <SEP> 60 <SEP> 19 <SEP> 150 <SEP> 1.29 <SEP> 12.23 <SEP>#
<tb> IIIc <SEP> 22 <SEP> 51 <SEP> 27 <SEP> 145 <SE> 1.77 <SEP> 11.68
<tb> IIId <SEP> 20 <SEP> 44 <SEP> 36 <SEP> 124 <SEP> 2.23 <SEP> 11.29
<tb> IIIe <SEP> 18 <SEP> 30 <SEP> 52 <SEP> 110 <SEP> 2.94 <SEP> 10.65
<tb> IIIf <SEP> 20 <SEP> 18 <SEP> 62 <SEP> 100 <SEP> 3.37 <SEP> 10.04
<tb> IIIg <SEP> 20 <SEP> 9 <SEP> 71 <SEP> 100 <SEP> 3.75 <SEP> 9.62
<tb> IIIh <SEP> 13 <SEP> 4 <SEP> 83 <SEP> 100 <SEK> 4.06 <SEP> 9.72
<Tb>
<Desc/Clms Page number 12><Desc / Clms Page number 12>
multiplication exponentielle est de 7 jours, le plateau étant atteint au jour 8,5. La vitesse de division cellulaire est de 1,7 jours, c'est-à-dire deux fois plus rapide que celle d'Alexandrium minutum. Exponential multiplication is 7 days, the plateau being reached at day 8.5. The cell division rate is 1.7 days, that is to say twice as fast as that of Alexandrium minutum.
2) Marquage radioactifdes micro algues. 2) Radioactive labeling of microalgae.
Le marquage des cellules d'Alexandrium minutum ou d'Heterocapsa triquetra est également effectué conformément à S. La Barre et al. (ibid) : 100 ml de la culture d'Alexandrium minutum (âgée de 14 jours) ou la culture d'Heterocapsa triquetra (âgée de 5 jours) est incubée avec 250 Ci d'orthophosphate 33P dans 25 l d'acide chlorhydrique 10-2 M, commercialisé par la société Amersham (France), pendant 96 heures pour Alexandrium minutum ou pendant 41 heures pour Heterocapsa triquetra. Labeling of Alexandrium minutum or Heterocapsa triquetra cells is also performed according to S. La Barre et al. (ibid): 100 ml of the culture of Alexandrium minutum (14 days old) or the culture of Heterocapsa triquetra (5 days old) is incubated with 250 Ci of 33P orthophosphate in 25 l of hydrochloric acid. 2M, marketed by Amersham (France), for 96 hours for Alexandrium minutum or for 41 hours for Heterocapsa triquetra.
Le milieu est ensuite réduit à un volume de 20 ml par filtration sur une membrane de porosité égale à 5 micromètres (membrane Durapore commercialisée par Millipore), puis complété à 100 ml par ajout d'un nouveau volume de milieu f/2, ces opérations étant répétées 7 à 8 fois jusqu'à ce que l'on ne détecte plus qu'une radioactivité négligeable dans le filtrat, mesurée comme indiqué dans l'article de S. La Barre et al. (ibid). The medium is then reduced to a volume of 20 ml by filtration on a membrane of porosity equal to 5 microns (Durapore membrane marketed by Millipore), and then supplemented to 100 ml by adding a new volume of f / 2 medium, these operations being repeated 7 to 8 times until only negligible radioactivity in the filtrate is detected, as measured in the article by S. La Barre et al. (Ibid).
EXEMPLE 3 : Sélection des copolymères qui présentent une affinité spécifique envers Alexandrium minutum ou Heterocapsa triquetra. EXAMPLE 3 Selection of Copolymers Which Have a Specific Affinity Towards Alexandrium Minutum or Heterocapsa Triquetra
1) Cinétique d'adhésion cellulaire. 1) Kinetics of cell adhesion.
La mesure de la cinétique d'adhésion cellulaire permet d'évaluer le temps de contact optimal pour l'adhésion des cellules aux copolymères. Pour cette mesure, on utilise un copolymère test, par exemple un copolymère à base de polystyrène substitué à hauteur de 81% par des groupements sulfonates de sodium. Ce copolymère est préparé conformément au protocole décrit dans l'exemple 1, par une étape de chlorosulfonation suivie d'une réaction d'hydrolyse. The measurement of cell adhesion kinetics makes it possible to evaluate the optimal contact time for adhesion of the cells to the copolymers. For this measurement, a test copolymer is used, for example a polystyrene-based copolymer 81% substituted with sodium sulfonate groups. This copolymer is prepared according to the protocol described in Example 1, by a chlorosulfonation step followed by a hydrolysis reaction.
20 mg (poids sec) de ce copolymère test sont mis en suspension dans 200 l de milieu f/2. On y ajoute une quantité donnée (environ 105 cellules) de cellules d'Alexandrium minutum marquées au 33P conformément à l'exemple 2, le mélange étant ensuite complété jusqu'à 7 ml par du milieu f/2. On prépare 7 échantillons de ce mélange. 20 mg (dry weight) of this test copolymer are suspended in 200 l of f / 2 medium. A given amount (about 105 cells) of 33 P-labeled Alexandrium minutum cells according to Example 2 is added thereto, the mixture being then supplemented to 7 ml with f / 2 medium. Seven samples of this mixture are prepared.
Les sept échantillons sont placés sous agitation, à la vitesse de 10 rpm, pour des durées respectives de 4,8, 24,30, 50, 56 et 72 heures et à la température de 17 C. A l'issue de chacun de ces sept temps respectifs d'incubation, l'échantillon correspondant est filtré sur un tamis de nylon de trame égale à 60 m, de façon à retenir le copolymère et à éliminer les cellules qui n'ont pas adhéré au copolymère. La filtration est suivie de trois lavages par 1 ml de milieu f/2. The seven samples are placed under agitation, at the rate of 10 rpm, for durations of 4.8, 24.30, 50, 56 and 72 hours respectively and at a temperature of 17 C. At the end of each of these Seven respective incubation times, the corresponding sample is filtered through a 60-m-thick nylon sieve so as to retain the copolymer and remove the cells which have not adhered to the copolymer. Filtration is followed by three washes with 1 ml of f / 2 medium.
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Les mesures de radioactivité sur chaque échantillon sont réalisées comme suit : le filtre de nylon, avec le résidu de filtration, est placé dans une fiole de scintillation, auquel on ajoute 1 ml de soude 2M afin de lyser les cellules, puis 10 ml de fluide de scintillation (commercialisé par la société Fisher Chemicals sous la dénomination Wallac Optiphase Hisafe 2). Par ailleurs, pour contrôle, 200 l du filtrat contenant les cellules qui n'ont pas adhéré au copolymère sont placés dans une fiole de scintillation contenant 1 ml de soude 2M et 2 ml de fluide de scintillation. Le contenu des fioles est homogénéisé au vortex et l'émission de rayons ss est mesurée sur un appareil Wallac LKB 1214 de la société Rackbeta. The radioactivity measurements on each sample are carried out as follows: the nylon filter, together with the filtration residue, is placed in a scintillation vial, to which 1 ml of 2M sodium hydroxide is added in order to lyse the cells, then 10 ml of fluid scintillation (sold by Fisher Chemicals under the name Wallac Optiphase Hisafe 2). In addition, for control, 200 l of the filtrate containing the cells which did not adhere to the copolymer are placed in a scintillation vial containing 1 ml of 2M sodium hydroxide and 2 ml of scintillation fluid. The contents of the flasks are homogenized by vortexing and the ss emission is measured on a Wallac LKB 1214 device from Rackbeta.
Le même protocole est suivi avec les cellules d'Heterocapsa triquetra, les temps d'incubation des cellules avec le copolymère porteur de groupements sulfonates de sodium étant de 25, 32, 54, 68 et 72 heures. The same protocol is followed with the cells of Heterocapsa triquetra, the incubation times of the cells with the copolymer carrying sodium sulfonate groups being 25, 32, 54, 68 and 72 hours.
Pour chaque type de cellules, on obtient la cinétique d'adhésion cellulaire au copolymère testé : en fonction du temps, le nombre de cellules qui adhèrent au copolymère est d'abord croissant, puis atteint un plateau. Ce plateau est atteint à partir de 55 heures pour Alexandrium minutum et à partir de 32 heures pour Heterocapsa triquetra. Dans les expériences d'adhésion cellulaire qui suivent, dans le but de conserver une marge de sécurité, les temps d'incubation des différents copolymères avec les cellules d'Alexandrium minutum ou d'Heterocapsa triquetra seront respectivement de 72 heures et de 48 heures. For each cell type, the kinetics of cell adhesion to the tested copolymer are obtained: as a function of time, the number of cells adhering to the copolymer is first increasing and then reaches a plateau. This plateau is reached from 55 hours for Alexandrium minutum and from 32 hours for Heterocapsa triquetra. In the following cell adhesion experiments, in order to maintain a safety margin, the incubation times of the various copolymers with the Alexandrium minutum or Heterocapsa triquetra cells will be respectively 72 hours and 48 hours.
2) Adhésion cellulaire en fonction de la composition du copolymère. 2) Cell adhesion as a function of the composition of the copolymer.
20 mg (poids sec) de chacun des huit copolymères des familles I, II et III, préparés conformément au protocole décrit dans l'exemple 1 et mis en suspension dans du milieu f/2, sont mis en présence d'une quantité donnée (environ 105 cellules) de cellules d'Alexandrium minutum marquées au 33P conformément à l'exemple 2 (14250 cellules/ml, marquées à 15 cpm par cellule). A l'issue de 72 heures d'incubation à 17 C, on sépare le copolymère (auquel ont adhéré des cellules) des cellules libres en solution au moyen de l'étape de filtration décrite précédemment en rapport avec la mesure de la cinétique d'adhésion cellulaire. On mesure ensuite la radioactivité du copolymère, comme indiqué ci-dessus. 20 mg (dry weight) of each of the eight copolymers of families I, II and III, prepared according to the protocol described in Example 1 and suspended in medium f / 2, are brought into contact with a given amount ( about 105 cells) of 33 P-labeled Alexandrium minutum cells according to Example 2 (14250 cells / ml, labeled at 15 cpm per cell). After 72 hours of incubation at 17 C, the copolymer (to which cells have adhered) is separated from the free cells in solution by means of the filtration step described above in relation to the measurement of the kinetics of cellular adhesion. The radioactivity of the copolymer is then measured as indicated above.
On procède de la même façon à partir de cellules d'Heterocapsa triquetra, mises en présence des huit copolymères de la famille I pendant 48 heures. The procedure is similarly carried out using Heterocapsa triquetra cells, placed in the presence of the eight copolymers of family I for 48 hours.
La figure 1 représente le profil d'adhésion des cellules d'Alexandrium minutum en fonction de la composition des copolymères de la famille I. Les abscisses représentent le taux de substitution des copolymères de la famille I en ester diméthylique de l'acide aspartique. L'axe des ordonnées situé à gauche du graphique représente le taux d'adhésion des cellules sur les copolymères, FIG. 1 represents the adhesion profile of the Alexandrium minutum cells as a function of the composition of the copolymers of the family I. The abscissies represent the degree of substitution of the copolymers of the family I with the dimethyl ester of aspartic acid. The ordinate axis on the left of the graph represents the adhesion rate of the cells on the copolymers,
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exprimé par le rapport signal radioactif/bruit de fond (courbe -#-). L'axe des ordonnées situé à droite du graphique représente le taux de gonflement des copolymères dans le milieu il 2 (courbe -1 -). expressed by the ratio radioactive signal / background noise (curve - # -). The y-axis on the right of the graph represents the swelling rate of the copolymers in the medium II 2 (-1- curve).
On observe une zone d'adhésion non spécifique jusqu'à un taux de substitution des copolymères en ester diméthylique de l'acide aspartique d'environ
30%, la surface disponible pour l'adhésion des cellules étant plus importante pour les copolymères qui présentent un taux de substitution en acide aminé faible (copolymères qui présentent le taux de gonflement le plus important). A nonspecific adhesion zone is observed up to a degree of substitution of the dimethyl ester copolymers of aspartic acid of about
30%, the area available for cell adhesion being greater for copolymers which have a low amino acid substitution rate (copolymers which have the highest swelling rate).
Au-delà de 30% de substitution, le gonflement des copolymères reste stable, permettant des comparaisons entre les taux d'adhésion des cellules. Le pic marqué sur le graphique est significatif d'une adhésion cellulaire spécifique, qui a lieu pour les copolymères qui comprennent entre 44 et 55% d'ester diméthylique de l'acide aspartique. Beyond 30% substitution, the swelling of the copolymers remains stable, allowing comparisons between cell adhesion rates. The peak marked on the graph is indicative of specific cell adhesion, which occurs for copolymers which comprise between 44 and 55% dimethyl ester of aspartic acid.
D'autre part, les profils d'adhésion réalisés à partir des copolymères des familles II et III, en présence des cellules d'Alexandrium minutum, n'ont révélé aucune affinité spécifique entre ces copolymères et ces cellules. La spécificité des copolymères envers les cellules d'Alexandrium minutum apparaît donc dépendante de la composition du copolymère. Cette spécificité pourrait s'expliquer par le fait que les copolymères, de par l'arrangement statistique des différentes unités styrène, sulfonates et ester diméthylique de l'acide aspartique, présentent des sites de liaison spécifiques envers un ou plusieurs composants de la membrane plasmique des cellules. On the other hand, the adhesion profiles made from the copolymers of families II and III, in the presence of Alexandrium minutum cells, revealed no specific affinity between these copolymers and these cells. The specificity of the copolymers towards Alexandrium minutum cells thus appears to be dependent on the composition of the copolymer. This specificity could be explained by the fact that the copolymers, by the statistical arrangement of the various styrene, sulphonate and dimethyl ester units of aspartic acid, have specific binding sites towards one or more components of the plasma membrane of the cells.
La figure 2 représente le profil d'adhésion des cellules d'Heterocapsa triquetra en fonction de la composition des copolymères de la famille I. Les axes des abscisses et des ordonnées ont les mêmes significations que ceux de la figure 1. FIG. 2 represents the adhesion profile of the Heterocapsa triquetra cells as a function of the composition of the copolymers of the family I. The axes of the abscissae and the ordinates have the same meanings as those of FIG.
En présence des cellules d'Heterocapsa triquetra, contrairement à ce qui est observé avec Alexandrium minutum, les copolymères de la famille 1 ne donnent pas lieu à une interaction spécifique, bien que Heterocapsa triquetra soit également un dinoflagellé autotrophe, qui appartient à une famille taxonomique (Peridiniaceae) proche de celle d'Alexandrium minutum (Gonyaulacacea). Ces résultats montrent que l'affinité des copolymères de la famille I envers les cellules testées est spécifique de l'espèce Alexandrium minutum. In the presence of Heterocapsa triquetra cells, contrary to what is observed with Alexandrium minutum, the copolymers of family 1 do not give rise to a specific interaction, although Heterocapsa triquetra is also an autotrophic dinoflagellate, which belongs to a taxonomic family (Peridiniaceae) close to that of Alexandrium minutum (Gonyaulacacea). These results show that the affinity of the copolymers of the family I towards the cells tested is specific for the species Alexandrium minutum.
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