FR2801677A1 - Analyzing aqueous samples for Legionella, by detection with and without preliminary immunocapture, allows identification of bacteria inside protozoal cells - Google Patents
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Abstract
Description
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PROCEDE D'ANALYSE D'UN ECHANTILLON POUR LA PRESENCE EVENTUELLE DE LEGIONELLES COMPRENANT UNE ETAPE D'IMMUNOCAPTURE. METHOD FOR ANALYZING A SAMPLE FOR THE POSSIBLE PRESENCE OF LEGIONELLA INCLUDING AN IMMUNOCAPTURE STAGE.
La présente invention se rapporte au domaine de l'analyse de l'eau et plus particulièrement à la détection de légionnelles. Elle a pour objet de fournir un nouveau procédé d'analyse d'un échantillon pour la présence éventuelle de légionelles, facile à mettre en #uvre, rapide et sure, susceptible d'être utilisée sur des eaux d'origine très diverse. The present invention relates to the field of water analysis and more particularly to the detection of Legionella. Its purpose is to provide a new method for analyzing a sample for the possible presence of legionella, easy to implement, quick and safe, capable of being used on waters of very diverse origin.
Les légionelles sont des bactéries Gram négatif en bâtonnets, ubiquitaires des milieux hydriques et telluriques. Elles se diffusent et prolifèrent via les systèmes de distribution et d'utilisation de l'eau chaude, et via les systèmes de climatisation. Ainsi, les sites à risques sont les douches, les climatiseurs, et les bassins utilisés pour la détente. Les lieux d'expositions sont les établissements de soins, les stations thermales, les hôtels et campings, et par extension toutes les collectivités. De plus certaines amibes et autres protozoaires ciliés entrent en symbiose avec les légionelles. Ces amibes sont alors de véritable réservoirs pouvant contenir de 1 à 1000 légionelles. Les légionelles libres ou intra-amibienne se transmettent à l'homme par voie aérienne via de fines gouttelettes d'aérosols. Legionella are rod-negative Gram-negative bacteria, ubiquitous from water and telluric environments. They spread and proliferate via hot water distribution and use systems, and via air conditioning systems. Thus, the risk sites are showers, air conditioners, and pools used for relaxation. The exhibition sites are healthcare establishments, spas, hotels and campsites, and by extension all communities. In addition, certain amoebas and other ciliated protozoa enter into symbiosis with legionella. These amoebas are then real reservoirs that can contain from 1 to 1000 legionella. Free or intra-amoebic legionella are transmitted to humans by air via fine aerosol droplets.
Suivant l'état immunitaire de la personne contaminée et la souche de légionelles, deux tableaux cliniques sont décrits. La fièvre de Pontiac qui est un syndrome grippal bénin et la légionellose, pneumopathie aiguë pouvant être mortelle (80% de létalité chez les immuno-déprimés et 15% chez les immuno-compétants). Le sérogroupe Legionella peumophila 1 est responsable de la plupart des cas de légionelloses. Depending on the immune status of the infected person and the legionella strain, two clinical pictures are described. Pontiac fever which is a mild flu syndrome and legionellosis, acute pneumonia can be fatal (80% lethality in immunosuppressed and 15% in immunocompetents). The Legionella peumophila 1 serogroup is responsible for most cases of legionellosis.
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On désigne sous le terme de Legion ella, les bactéries en batonnets, non sporogènes, Gram-, aérobies, flagéllées ou non, exigeantes en L-cystéine, caractérisées par leur richesse en acides gras ramifiés, qui est une propriété très inhabituelle pour des germes Gram-. Comme indiqué ci-dessus, certaines souches de cette bactérie pathogène opportuniste peuvent causer des infections chez l'homme (légionellose ou fièvre de Pontiac). On désigne sous le terme de Legionella pneumophila, les Legionella répondant à la définition ci-avant, donnant une réaction positive en présence d'un sérum anti-L. pneumophila, et responsable, comme indiqué ci-dessus, de la plupart des cas de légionelloses. Par commodité, Legionella pneumophila et Legionella, seront aussi désignés conjointement ci-après légionelles. The term Legion ella is used to denote rod bacteria, non-sporogenic, Gram-, aerobic, flagellated or not, requiring L-cysteine, characterized by their richness in branched fatty acids, which is a very unusual property for germs. Gram-. As indicated above, certain strains of this opportunistic pathogenic bacteria can cause infections in humans (legionellosis or Pontiac fever). The term Legionella pneumophila is used to denote Legionella corresponding to the definition above, giving a positive reaction in the presence of an anti-L serum. pneumophila, and responsible, as noted above, for most cases of legionellosis. For convenience, Legionella pneumophila and Legionella will also be referred to hereafter as legionella.
Il existe une méthode normalisée de recherche et dénombrement du genre Legion ella et de l'espèce L. pneumophila (Norme NF T 90-431). Cette méthode de détection quantitative de référence utilise des milieux sélectifs et repose sur une caractérisation immunologique de L. pneumophila. Basée sur des milieux sélectifs, elle peut être appliquée à tous les types d'eaux, et génère un résultat définitif en 10 à 15 jours. Le taux moyen de recouvrement de cette méthode est d'environ 40%. Ce taux peut s'expliquer par le stress que constitue les étapes de concentration et de traitement de l'échantillon de milieux de culture très sélectifs. En présence d'une flore bactérienne interférente dense (Pseudomonas, Xanthomonas, Bacillus, etc...) et en dépit des étapes de pré-traitement de l'échantillon destinées à éliminer plus ou moins spécifiquement cette flore, la méthode normalisée ne permet pas toujours la détection des Legionella. En effet, dans ce cas, la culture est envahie par ces autres bactéries. En outre, les légionelles intra-amibienne ne sont pas toujours détectées par cette méthode. Lorsqu'elles le sont, une There is a standardized method for finding and counting the genus Legion ella and the species L. pneumophila (Standard NF T 90-431). This reference quantitative detection method uses selective media and is based on an immunological characterization of L. pneumophila. Based on selective media, it can be applied to all types of water, and generates a final result in 10 to 15 days. The average recovery rate for this method is around 40%. This rate can be explained by the stress that constitutes the stages of concentration and processing of the sample of very selective culture media. In the presence of a dense interfering bacterial flora (Pseudomonas, Xanthomonas, Bacillus, etc ...) and in spite of the pre-treatment steps of the sample intended to eliminate more or less specifically this flora, the standardized method does not allow still detecting Legionella. Indeed, in this case, the culture is invaded by these other bacteria. In addition, intra-amoebic legionella is not always detected by this method. When they are, a
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amibe, qui peut contenir 1000 légionelles, ne générera qu'un colonie sur le milieu de culture. Dans ces cas précis, les résultats issus de la méthode normalisée sousestime la concentration en légionelles et donc le risque sanitaire. Cette lacune est particulièrement, lorsqu'il s'agit d'apprécier l'efficacité d'une désinfection par exemple d'une canalisation par un choc au chlore. En effet, le traitement par le chlore est sans effet sur les légionelles intra-amibiennes, et, dans ce cas, la mise en #uvre de la méthode normalisée conduit à un résultat faussement négatif. amoeba, which can contain 1000 legionella, will only generate one colony on the culture medium. In these specific cases, the results from the standardized method underestimate the concentration of legionella and therefore the health risk. This is particularly deficient when it comes to assessing the effectiveness of disinfection, for example of a pipe by a chlorine shock. In fact, the treatment with chlorine has no effect on the intra-amoebic legionella, and, in this case, the implementation of the standardized method leads to a false negative result.
Il a également été proposé une méthode alternative basée sur la détection semi-quantitive par PCR d'une séquence d'ARN 5S spécifique du genre Legionella et d'une séquence du gène mip spécifique de l'espèce L. pneumophila. La demande de brevet européen publiée sous le numéro 533 854 décrit cette méthode et les séquences des amorces mises en oeuvre pour les étapes d'amplification par PCR. Des kits pour la mise en #uvre de cette méthode ont été commercialisés sous les dénominations "EnviroAmp sample prep kit", "EnviroAmp Legionella PCR amplification kit" et "EnviroAmp Legionella PCR detecion kit" par la Société Perkin-Elmer. L'analyse d'un liquide mettant en #uvre cette méthode comprend une concentration des bactéries par filtration de 10 à 100 ml d'eau, puis extraction de l'ADN par une lyse à la chaleur, suivie d'une amplification simultanée des deux séquences cibles citées ci-dessus. La détection est réalisée par hybridation immuno-enzymatique et les résultats sont rendus en 24 à 48 heures. La méthode de détection par PCR permet de détecter comme Legionella : L. anisa, birminghamensi, bozemanii, cherii, cincinnatiensis, erythra, dumoffi, feelii, gormanii, gratiana, jamestowniensis, jordanis, longbeachae, maceachernii, micdadei, moravica, oakridgensis, parisiensis, tucsonesis, wadsworthii, et si >10E4/mL An alternative method has also been proposed based on semi-quantitative detection by PCR of a 5S RNA sequence specific for the genus Legionella and a sequence for the mip gene specific for the species L. pneumophila. The European patent application published under number 533 854 describes this method and the sequences of the primers used for the PCR amplification steps. Kits for the implementation of this method have been marketed under the names "EnviroAmp sample prep kit", "EnviroAmp Legionella PCR amplification kit" and "EnviroAmp Legionella PCR detecion kit" by the company Perkin-Elmer. Analysis of a liquid using this method comprises a concentration of bacteria by filtration of 10 to 100 ml of water, then extraction of the DNA by heat lysis, followed by simultaneous amplification of the two target sequences cited above. Detection is carried out by immuno-enzymatic hybridization and the results are reported in 24 to 48 hours. The PCR detection method makes it possible to detect, like Legionella: L. anisa, birminghamensi, bozemanii, cherii, cincinnatiensis, erythra, dumoffi, feelii, gormanii, gratiana, jamestowniensis, jordanis, longbeachae, maceachernii, micdadei, moravica, oakridgensis, oakridgensis tucsonesis, wadsworthii, and if> 10E4 / mL
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spiritensis, quinvanii, sainthelensi, Altermonas rubra, et comme Legionella pneumophila : L. pneumophilla sérogroupes 1 à 15 et L. hackelia. spiritensis, quinvanii, sainthelensi, Altermonas rubra, and like Legionella pneumophila: L. pneumophilla serogroups 1 to 15 and L. hackelia.
Le principal intérêt de détecter et de semiquantifier les Legionella et L. pneumophila par PCR est de largement diminuer la durée de l'analyse. En effet, la méthode normalisée de détection des légionelles par culture sur milieux, nécessite 10 à 15 jours afin d'obtenir un résultat, contre 24 à 48 h si l'analyse est réalisée par PCR. Cette rapidité de résultat permet la mise en place immédiate de protocole de désinfection et le contrôle de leur efficacité. En outre, la méthode par PCR permet de déceler la présence de toutes les légionelles de l'échantillon analysé, qu'elles soient libres ou intraamibiennes. Cette analyse donne donc des résultats plus proches de l'état sanitaire réel que la méthode normalisée. Toutefois, cet avantage est aussi un inconvénient dans la mesure où les résultats de la méthode par PCR ne sont pas comparables à ceux de la méthode de référence qui demeure la méthode normalisée décrite précédemment. The main advantage of detecting and semiquifying Legionella and L. pneumophila by PCR is to greatly reduce the duration of the analysis. Indeed, the standardized method of detecting legionella by culture on media requires 10 to 15 days to obtain a result, against 24 to 48 h if the analysis is carried out by PCR. This rapid result allows the immediate implementation of disinfection protocol and control of their effectiveness. In addition, the PCR method makes it possible to detect the presence of all the legionella in the sample analyzed, whether free or intra-amoebic. This analysis therefore gives results closer to the actual health status than the standardized method. However, this advantage is also a disadvantage insofar as the results of the PCR method are not comparable to those of the reference method which remains the standardized method described above.
En outre, la méthode par PCR présente l'inconvénient de ne pas être toujours applicable à des eaux non traitées, comme les eaux thermales, qui contiennent souvent des inhibiteurs de la polymérase nécessaire aux amplifictions PCR. Les inhibiteurs de la polymérase sont nombreux. Dans les échantillons de l'environnement, on retrouve par exemple, des acides humiques qui sont des complexants du magnésium. In addition, the PCR method has the disadvantage of not always being applicable to untreated waters, such as thermal waters, which often contain inhibitors of the polymerase necessary for PCR amplifications. There are many inhibitors of polymerase. In environmental samples, for example, we find humic acids which are magnesium complexing agents.
Il apparaît donc utile de disposer d'une méthode adaptée à l'ensemble des eaux, offrant des résultats équivalents à ceux de la méthode normalisée mais plus rapide. It therefore seems useful to have a method suitable for all waters, offering results equivalent to those of the standardized method but faster.
Ce but est atteint grâce à un procédé d'analyse d'un échantillon de liquide pour la présence éventuelle de This object is achieved by a method of analyzing a sample of liquid for the possible presence of
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légionelles, du type comprenant éventuellement une filtration de l'échantillon puis une détection des légionelles dans ledit échantillon, caractérisé en ce qu'après filtration éventuelle, l'échantillon est soumis à une étape d'immunocapture des légionelles éventuellement présentes et en ce que l'on détecte par tout moyen approprié les légionelles immunocapturés. legionella, of the type optionally comprising a filtration of the sample then a detection of the legionella in said sample, characterized in that after optional filtration, the sample is subjected to a step of immunocapture of the legionella possibly present and in that the 'immunocaptured legionella are detected by any appropriate means.
La filtration n'est en effet pas nécessaire pour l'analyse d'échantillons fortemant contaminés (par exemple supérieur à 100 000 légionelles/L). Filtration is indeed not necessary for the analysis of heavily contaminated samples (for example greater than 100,000 legionella / L).
La méthode de l'invention est remarquable en ce qu'elle peut être mise en #uvre avec toute méthode de détection qualitative ou quantitative connue dans l'art antérieur. En effet, l'étape d'immuncapture après filtration de l'échantillon est adaptée à une détection : - par culture sur milieux sélectifs et caractérisation immunologique, ou - par PCR et caractérisation par électrophorèse, hybridation ou par toute autre technique de détection instantanée des amplicons, par exemple du type "Taqman", ou encore - par utilisation d'anticorps marqués. The method of the invention is remarkable in that it can be implemented with any qualitative or quantitative detection method known in the prior art. Indeed, the immunapture step after filtration of the sample is suitable for detection: - by culture on selective media and immunological characterization, or - by PCR and characterization by electrophoresis, hybridization or by any other instant detection technique of amplicons, for example of the "Taqman" type, or else - by the use of labeled antibodies.
Dans le cadre d'une détection par PCR, l'étape d'immuncapture du procédé de l'invention permet d'éliminer les inhibiteur de polymérase et confère donc à l'analyse une meilleur répétabilité et une meilleur robustesse notamment par rapport à la nature des eaux analysées (réseau, surface, thermales...). Le seuil de détection est maintenue à 50-100 L. pneumophila/litre quelque soit la nature de l'eau analysée. Par ailleurs, l'étape d'immunocapture, élimine les légionelles intra-amibiennes et permet d'obtenir avec le procédé d'analyse de l'invention mis en #uvre avec une détection par PCR, des résultats qui peuvent être comparés avec ceux obtenus par la méthode normalisée. Il est aussi possible de réaliser In the context of a detection by PCR, the immuno-capture step of the method of the invention makes it possible to eliminate the polymerase inhibitors and therefore gives the analysis better repeatability and better robustness in particular with respect to nature. analyzed waters (network, surface, thermal ...). The detection threshold is maintained at 50-100 L. pneumophila / liter whatever the nature of the water analyzed. Furthermore, the immunocapture step eliminates the intra-amoebic legionella and makes it possible to obtain, with the analysis method of the invention implemented with detection by PCR, results which can be compared with those obtained. by the standardized method. It is also possible to realize
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dans le cadre du procédé de l'invention comprenant une détection par PCR, une analyse différentielle, c'est à dire avec et sans immuno-capture, de façon à mettre en évidence la présence les légionelles intra-amibiennes qui ne sont pas détectées pas la méthode normalisées utilisant des milieux de culture. in the context of the process of the invention comprising detection by PCR, differential analysis, that is to say with and without immuno-capture, so as to demonstrate the presence of intra-amoebic legionella which are not detected the standardized method using culture media.
Dans le cadre d'une détection sur milieux de culture et caractérisation immunologique, l'étape d'immuncapture du procédé de l'invention permet d'éviter les risques d'envahissement des cultures par d'autres bactéries, risques que l'on rencontre avec la méthode normalisée de l'art antérieur. Les étapes de pré-traitement peuvent alors être évitées, ce qui permet un gain de temps important et rend l'étape de concentration moins stressante pour les légionelles. In the context of a detection on culture media and immunological characterization, the immuno-capture step of the method of the invention makes it possible to avoid the risks of invasion of the cultures by other bacteria, risks which are encountered with the standardized method of the prior art. The pre-treatment stages can then be avoided, which saves significant time and makes the concentration stage less stressful for legionella.
L'étape d'immunocapture peut être mise en #uvre sur tout type de support sur lequel est fixé des anticorps ou parties d'anticorps, identiques ou différents, spécifiques de tout ou partie des bactéries du genre Legionella, puis l'on lave ledit support pour éliminer les composés de l'échantillon non fixés spécifiquement sur ledit support. Le support mis en #uvre pour l'étape d'immunocapture est avantageusement constitué de billes paramagnétique, mais peut être aussi une membrane, une colonne, une microplaque ou tout autre support permettant la fixation des anticorps avant ou après la formation du complexe avec les légionelles. Il est ainsi possible d'éliminer par lavage ou rinçage tous les composés non fixés présents dans l'échantillon. The immunocapture step can be carried out on any type of support on which antibodies or parts of antibodies, identical or different, specific to all or part of bacteria of the genus Legionella are fixed, then said wash support for removing the compounds of the sample not specifically fixed on said support. The support used for the immunocapture step advantageously consists of paramagnetic beads, but may also be a membrane, a column, a microplate or any other support allowing the fixing of the antibodies before or after the formation of the complex with the legionella. It is thus possible to remove by washing or rinsing all the unbound compounds present in the sample.
Des anticorps spécifiques de nombreuses espèces dont l'espèce L. pneumophila sont disponibles dans le commerce, mais peuvent aussi être préparés par les techniques d'immunisation et/ou de fusion connue de l'homme du métier à partir d'un antigène portant un épitope commun l'espèce L. pneumophila ou au genre Legionella. Toutefois, Antibodies specific for many species including the species L. pneumophila are commercially available, but can also be prepared by the immunization and / or fusion techniques known to those skilled in the art from an antigen carrying a common epitope the species L. pneumophila or in the genus Legionella. However,
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le procédé d'analyse selon l'invention rapporté dans les exemples ci-après est tout particulièrement adapté à l'espèce L. pneumophila. the analysis method according to the invention reported in the examples below is very particularly suitable for the species L. pneumophila.
L'échantillon liquide sur lequel est pratiqué le procédé d'analyse de l'invention est par exemple un échantillon d'eau, thermale, de consommation, de récréation (piscines, baignades, bains à remous, etc...), de process (eau chaude sanitaire, condensats de climatisation ou de tours aéroréfrigérantes, etc...), à usage médical (assistance respiratoire, etc...) et de surface (lacs, rivières, etc...). The liquid sample on which the analysis method of the invention is practiced is for example a sample of water, spa, consumption, recreation (swimming pools, baths, whirlpools, etc.), of process (domestic hot water, air conditioning condensates or cooling towers, etc.), for medical use (respiratory assistance, etc.) and surface (lakes, rivers, etc.).
La mise en oeuvre du procédé d'analyse selon l'invention comprenant une détection par PCR est basée comme proposée dans l'art antérieur sur la détection d'une séquence d'ARN 5S spécifique du genre Legionella et d'une séquence du gène mip spécifique de l'espèce L. pneumophila dont les amorces spécifiques sont décrites dans les brevets US No. 5 491 225 et 5 614 388. The implementation of the analysis method according to the invention comprising detection by PCR is based as proposed in the prior art on the detection of a 5S RNA sequence specific for the genus Legionella and a sequence of the mip gene specific for the species L. pneumophila, the specific primers of which are described in US Pat. Nos. 5,491,225 and 5,614,388.
Le principe général du procédé de l'invention comprenant une détection par PCR et caractérisation des amplicons par électrophorèse comprend les étapes suivantes: - filtration de l'échantillon de liquide, et décrochage des légionelles éventuellement présente du filtre, - centrifugation de la suspension obtenue à l'étape précédente et remise en suspension du culot afin de réaliser l'immunocapture, - concentration et lyse des légionelles éventuellement présentes afin de libérer leur ADN, - à partir de cet ADN extrait, amplification par PCR de gènes spécifiques du genre Legionella et de l'espèce L. pneumophila, The general principle of the method of the invention comprising detection by PCR and characterization of the amplicons by electrophoresis comprises the following stages: - filtration of the liquid sample, and detachment of any legionella possibly present from the filter, - centrifugation of the suspension obtained at the previous step and resuspension of the pellet in order to carry out the immunocapture, - concentration and lysis of the legionella possibly present in order to release their DNA, - from this extracted DNA, amplification by PCR of specific genes of the genus Legionella and of the species L. pneumophila,
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simultanément à la détection des gènes spécifiques de l'étape ci-dessus, amplification d'un ADN synthétique constituant un contrôle interne calibré, - détection et quantification des produits d'amplification par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide ou hybridation avec des sondes spécifiques. simultaneously with the detection of the specific genes of the above step, amplification of a synthetic DNA constituting a calibrated internal control, - detection and quantification of the amplification products by electrophoresis on a polyacrylamide gel or hybridization with specific probes.
Ce procédé peut être détaillé de la façon suivante : - Après filtration d'un litre d'eau, les légionelles sont décrochées du filtre par ultrasons et vortex. This process can be detailed as follows: - After filtration of a liter of water, the legionella are removed from the filter by ultrasound and vortex.
- La suspension est alors centrifugée et le culot remis en suspension dans 1 ml d'eau afin de réaliser l'immuno-capture. - The suspension is then centrifuged and the pellet resuspended in 1 ml of water in order to carry out the immuno-capture.
- Les légionelles concentrées dans un volume minimale sont ensuite lysées afin de libérer leur ADN. - The legionella concentrated in a minimum volume are then lysed in order to release their DNA.
- A partir de cet ADN extrait, une amplification par PCR de gènes spécifiques du genre Legionella (ARNr 5S) et de l'espèce L. pneumophila (mip), est réalisée. - From this extracted DNA, PCR amplification of specific genes of the genus Legionella (5S rRNA) and of the species L. pneumophila (mip) is carried out.
- Simultanément à la détection des gènes spécifiques, un contrôle interne calibré (ADN synthétique) est amplifié afin de valider les résultats et de déterminer de manière semi-quantitative la concentration en légionelles dans l'échantillon. - Simultaneously with the detection of specific genes, a calibrated internal control (synthetic DNA) is amplified in order to validate the results and to semi-quantitatively determine the concentration of legionella in the sample.
- La détection et la semi-quantification des produits d'amplification est réalisée par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide ou hybridation avec des sondes spécifiques. - The detection and semi-quantification of the amplification products is carried out by electrophoresis on a polyacrylamide gel or hybridization with specific probes.
Comme indiqué précédemment, il est aussi possible de réaliser dans le cadre du procédé de l'invention comprenant une détection par PCR, une analyse différentielle, c'est à dire avec et sans immuno-capture, de façon à mettre en évidence la présence les légionelles intra-amibiennes qui ne sont pas détectées pas la méthode As indicated previously, it is also possible to carry out, within the framework of the method of the invention comprising a detection by PCR, a differential analysis, that is to say with and without immuno-capture, so as to highlight the presence of intra-amoebic legionella which are not detected by the method
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normalisées utilisant des milieux de culture. L'invention se rapporte donc aussi à un procédé caractérisé en ce que l'on réalise une première analyse avec détection par PCR comprenant une étape d'immunocapture et une seconde analyse avec détection par PCR ne comprenant pas d'étape d'immunocapture, et en ce que l'on compare les résultats des deux analyses pour mettre en évidence la présence des légionelles intra-parasitaires, plus particulièrement intra-amibiennes. standardized using culture media. The invention therefore also relates to a method characterized in that a first analysis with detection by PCR comprising an immunocapture step is carried out and a second analysis with detection by PCR not comprising an immunocapture step, and in that we compare the results of the two analyzes to highlight the presence of intra-parasitic legionella, more particularly intra-amoebic.
L'invention concerne aussi un kit pour la mise en #uvre du procédé ci-dessus comprenant une étape d'immunocapture et une détection par PCR. Un tel kit comprend : - les éventuelles membranes de filtration, - le système de fixation des anticorps à un support tel que défini précédemment et les tampons correspondant, - les réactifs nécessaires à la lyse bactérienne et à l'extraction et éventuellement purification de l'ADN, - les réactifs d'amplification PCR (tampon, amorces, UNG, Taq polymérase, ADN synthétique servant de contrôle interne calibré, éventuellement les composés nécessaires à la détection instantanée des amplicons), - les réactifs nécessaires aux contrôles négatifs et positifs, - éventuellement, un système de révélation par hybridation. The invention also relates to a kit for carrying out the above method comprising an immunocapture step and a detection by PCR. Such a kit includes: - any filtration membranes, - the system for attaching the antibodies to a support as defined above and the corresponding buffers, - the reagents necessary for bacterial lysis and for the extraction and possibly purification of the DNA, - PCR amplification reagents (buffer, primers, UNG, Taq polymerase, synthetic DNA used as calibrated internal control, possibly the compounds necessary for the instant detection of amplicons), - the reagents necessary for negative and positive controls, - possibly a revelation system by hybridization.
La mise en oeuvre du procédé d'analyse selon l'invention comprenant une détection par culture sur milieux sélectifs et caractérisation immunologique est basée comme proposée dans l'art antérieur sur la détection de colonies caractéristiques de légionelles capables de The implementation of the analysis method according to the invention comprising detection by culture on selective media and immunological characterization is based as proposed in the prior art on the detection of colonies characteristic of legionella capable of
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cultiver sur le milieu GVPC ou équivalent, suivi d'une caractérisation biochimique sommaire basée sur la capacité de culture sur milieu BCYE sans cystéine et gélose au sang ou équivalent. Les colonies reconnues alors comme appartenant au genre Legionella sont caractérisées par immunofluorescence afin de déterminer si elles possèdent des épitopes spécifiques de l'espèce L. pneumophila. cultivate on GVPC medium or equivalent, followed by a summary biochemical characterization based on the capacity for culture on BCYE medium without cysteine and blood agar or equivalent. The colonies then recognized as belonging to the genus Legionella are characterized by immunofluorescence in order to determine whether they have epitopes specific for the species L. pneumophila.
Le principe général du procédé de l'invention comprenant une détection par culture sur milieux sélectifs et caractérisation immunologique comprend les étapes suivantes : - filtration de l'échantillon de liquide, et décrochage des légionelles éventuellement présentes sur le filtre, - centrifugation de la suspension obtenue à l'étape précédente et remise en suspension du culot afin de réaliser l'immunocapture, - le concentrat est étalé sur milieu GVPC ou équivalents ; ce milieu est incubé à 37 C, 2,5% de CO2, - après 3,5 et 10 jours d'incubation les colonies caractéristiques sont dénombrées et repiquées sur milieu BCYE, BCYE sans cystéine et gélose au sang ou équivalents, - après 3 jours d' incubation à 37 C, 2,5% CO2, les colonies cultvant uniquement sur le milieu BCYE sont considérées comme appartenant au genre Legionella, - un test d'immunofluorescence est réalisée sur ces colonies de Legionella afin de déterminer leur appartenance à l'espèces L. pneumophila. The general principle of the method of the invention comprising detection by culture on selective media and immunological characterization comprises the following steps: - filtration of the liquid sample, and detachment of legionella possibly present on the filter, - centrifugation of the suspension obtained in the previous step and resuspension of the pellet in order to carry out the immunocapture, - the concentrate is spread on GVPC medium or equivalent; this medium is incubated at 37 ° C., 2.5% CO2, - after 3.5 and 10 days of incubation, the characteristic colonies are counted and subcultured on BCYE medium, BCYE without cysteine and blood agar or the like, - after 3 days of incubation at 37 ° C., 2.5% CO2, the colonies growing only on BCYE medium are considered to belong to the genus Legionella, - an immunofluorescence test is carried out on these Legionella colonies in order to determine their belonging to the 'species L. pneumophila.
Ce procédé peut être détaillé de la façon suivante : - Après filtration d'un litre d'eau, les légionelles sont décrochées du filtre par ultrasons. This process can be detailed as follows: - After filtration of one liter of water, the legionella are removed from the filter by ultrasound.
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- La suspension est alors centrifugée et le culot remis en suspension dans 1 ml d'eau afin de réaliser l'immuno-capture. - The suspension is then centrifuged and the pellet resuspended in 1 ml of water in order to carry out the immuno-capture.
- Les légionelles concentrées dans un volume minimale de 100 (IL sont ensuite ensemencées par étalement sur milieu GVPC ou équivalent ; milieu est incubé à 37 C, 2,5% de CO2, - après 4,7 et 10 jours d'incubation les colonies caractéristiques sont dénombrées et repiquées sur milieu BCYE, BCYE sans cystéine et gélose au sang ou équivalents, - après 3 jours d' incubation à 37 C, 2,5% CO2, les colonies cultvant uniquement sur le milieu BCYE sont considérées comme appartenant au genre Legionella, - un test d'immunofluorescence est réalisée sur ces colonies de Legionella afin de déterminer leur appartenance à l'espèces L. pneumophila. - Legionella concentrated in a minimum volume of 100 (IL are then seeded by spreading on GVPC medium or equivalent; medium is incubated at 37 C, 2.5% CO2, - after 4.7 and 10 days of incubation the colonies characteristics are counted and subcultured on BCYE medium, BCYE without cysteine and blood agar or equivalent, - after 3 days of incubation at 37 ° C., 2.5% CO2, the colonies growing only on BCYE medium are considered to belong to the genus Legionella, - an immunofluorescence test is carried out on these Legionella colonies in order to determine their belonging to the species L. pneumophila.
L'invention concerne aussi un kit pour la mise en #uvre du procédé ci-dessus comprenant une détection par culture sur milieux sélectifs et caractérisation immunologique. Un tel kit comprend : - les éventuelles membranes de filtraton, - les systèmes de fixation des anticorps à un support comme défini précédemment. The invention also relates to a kit for implementing the above method comprising detection by culture on selective media and immunological characterization. Such a kit includes: - any filtration membranes, - systems for attaching antibodies to a support as defined above.
La mise en oeuvre du procédé d'analyse de l'invention comprenant une détection par l'utilisation d'anticorps marquée est basée, comme proposée dans l'art antérieur, sur la détection d'épitopes spécifiques du genre Legionella, de l'espèce L. pneumophila ou de tout autre espèce ou ensemble d'espèce caractérisé par un épitope spécifique commun. The implementation of the analysis method of the invention comprising detection by the use of labeled antibodies is based, as proposed in the prior art, on the detection of specific epitopes of the genus Legionella, of the species L. pneumophila or any other species or group of species characterized by a specific common epitope.
Le principe général du procédé de l'invention comprenant une détection par des anticorps marqués comprend les étapes suivantes : The general principle of the method of the invention comprising detection by labeled antibodies comprises the following steps:
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filtration éventuelle de l'échantillon de liquide et décrochage des légionelles éventuellement présentes sur le filtre, centrifugation de la suspension obtenue à l'étape précédente et remise en suspension du culot afin de réaliser l'immunocapture, - application sur le concentrat d'anticorps couplés à un composé fluorescent, à une enzyme ou à tout autre système permettant la détection spécifique des légionelles par observation microscopique, absorptiométrie ou colorimétrie. possible filtration of the liquid sample and detachment of legionella possibly present on the filter, centrifugation of the suspension obtained in the previous step and resuspension of the pellet in order to carry out the immunocapture, - application to the concentrate of coupled antibodies a fluorescent compound, an enzyme or any other system allowing the specific detection of legionella by microscopic observation, absorptiometry or colorimetry.
Cette technique a pour avantage d'être extrêmement facile à mettre en #uvre et très rapide. The advantage of this technique is that it is extremely easy to implement and very fast.
Cependant son seuil de détection est élevée (< 10 000 Legionella /litre), la quantification reste donc approximative et la sensibilité relative. However, its detection threshold is high (<10,000 Legionella / liter), the quantification therefore remains approximate and the sensitivity sensitive.
L'invention concerne aussi un kit pour la mise en oeuvre du procédé de détection par des anticorps marqués ci-dessus. Un tel kit comprend : - les éventuelles membranes de filtration, - le système de fixation des anticorps à un support comme défini précédemment, et les tampons correspondant, - les anticorps marqués permettant la détection spécifique des bactéries du genre Legionella, de l'espèce L. pneumophila ou de tout autre espèce ou ensemble d'espèces caractérisé par un épitope commun, - les réactifs nécessaires au contrôles négatifs et positifs. The invention also relates to a kit for implementing the method of detection by antibodies labeled above. Such a kit includes: - any filtration membranes, - the system for attaching antibodies to a support as defined above, and the corresponding buffers, - labeled antibodies allowing the specific detection of bacteria of the genus Legionella, of species L pneumophila or any other species or set of species characterized by a common epitope, - the reagents necessary for negative and positive controls.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent qui se rapportent à la mise en #uvre d'un procédé d'analyse d'un échantillon d'eau pour la présence éventuelle de légionelles selon le procédé de l'invention comprenant une Other advantages and characteristics of the invention will appear in the examples which follow which relate to the implementation of a method of analysis of a sample of water for the possible presence of legionella according to the method of l invention comprising a
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étape d'immunocapture et avec une détection par PCR (exemple 1). immunocapture step and with detection by PCR (example 1).
EXEMPLE 1. EXAMPLE 1.
I - Équipement et matériel requis. I - Equipment and materials required.
1) Filtration de l'échantillon et extraction de l'ADN. 1) Sample filtration and DNA extraction.
- Filtration : . bouteille à usage unique d'1 L (contenant du thiosulfate de sodium 20 mg) . entonnoirs en plastiques (Pack Microfil 100 ml) (Millipore MZ HAWG 101) filtres Millipore 0,45 m HV (Durapore Membrane Filters) rampe de filtration reliée au système d'aspiration (pompe péristaltique)
2 pinces stériles une paire de petits ciseaux stériles - Immuno-capture :
L'immunocapture est décrite ci-après dans la section mode opératoire. - Filtration:. 1 L single use bottle (containing 20 mg sodium thiosulfate). plastic funnels (100 ml Microfil Pack) (Millipore MZ HAWG 101) Millipore 0.45 m HV filters (Durapore Membrane Filters) filtration manifold connected to the suction system (peristaltic pump)
2 sterile forceps a pair of small sterile scissors - Immuno-capture:
Immunocapture is described below in the procedure section.
- Extraction : une série de tubes Eppendorf 2 ml une série de tubes Eppendorf 1,5 ml . un lot de Pipetman et cônes stériles à filtre deux blocs chauffants à 100 C et à 70 C (Bioblock) un vortex Heildolph Top-Mix 94323 (Bioblock Scientific) une centrifugeuse "Sigma 2MK" (Bioblock Scientific) système d'aspiration comportant : fiole à vide, tuyau, bouchon, pompe à vide et pipettes Pasteur - Extraction: a series of 2 ml Eppendorf tubes a series of 1.5 ml Eppendorf tubes. a batch of Pipetman and sterile filter cones two heating blocks at 100 C and 70 C (Bioblock) a Heildolph Top-Mix 94323 vortex (Bioblock Scientific) a "Sigma 2MK" centrifuge (Bioblock Scientific) suction system comprising: flask vacuum, hose, cap, vacuum pump and Pasteur pipettes
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2) Amplification génique. 2) Gene amplification.
. un lot de Pipetman avec les cônes stériles adéquats . une série de tubes 0. 2 ml (autoclavables) MicroAmpReaction (Perkin-Elmer : Part. No. 801-0540) un thermocycler Gene Amp PCR system 9700 (Perkin-Elmer Applied Biosystems
3) Montage du gel. . a batch of Pipetman with the appropriate sterile cones. a series of 0. 2 ml tubes (autoclavable) MicroAmpReaction (Perkin-Elmer: Part. No. 801-0540) a Gene Amp PCR system 9700 thermocycler (Perkin-Elmer Applied Biosystems
3) Mounting of the gel.
- une petite et une grande plaque en verre - un support à vis - deux spacers - un joint (caoutchouc) - un socle pour fixer les supports à vis et pour couler les gels (Bio-Rad) - un peigne (10 puits) - une cuve de migration avec son support de migration (où se trouvent les électrodes) (Bio-Rad Miniprotean II) - un générateur pour électrophorèse (Bio-Rad Power/Pac 300)
4) Coloration et révélation. cuve de coloration en plastique (avec couvercle) - agitateur (Heildorf VIBRAMAX 100) gel doc 1000 avec le programme Molecular Analyst pour la lecture du gel aux UV. - a small and a large glass plate - a screw holder - two spacers - a seal (rubber) - a base for fixing the screw holders and for pouring the gels (Bio-Rad) - a comb (10 wells) - a migration tank with its migration support (where the electrodes are located) (Bio-Rad Miniprotean II) - a generator for electrophoresis (Bio-Rad Power / Pac 300)
4) Coloring and revelation. plastic staining tank (with lid) - agitator (Heildorf VIBRAMAX 100) gel doc 1000 with the Molecular Analyst program for reading the gel using UV.
II - Préparation des réactifs. II - Preparation of reagents.
1) Réactifs nécessaires à l'immuno-capture. 1) Reagents required for immuno-capture.
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L'immunocapture est décrite ci-après dans la section mode opératoire. Immunocapture is described below in the procedure section.
2) Réactifs nécessaires à l'extraction de l'ADN. 2) Reagents required for DNA extraction.
- Réactif de lyse: . 50 mM Tris pH 7,7 . Thyocyanate de guanidine 4,75 M . EDTA.Na2 (H20) 25 mM . Tween 20: 1% qsp au volume avec de l'eau PCR
Soit pour 80 ml de réactif de lyse: . 132,8 mg de Trizma Base . 457,6 mg de Trizma HCl . 44,916 g de Thyocyanate de Guanidine . 744,4 mg de EDTA.Na2 (H20) . 800 l de Tween 20
Conservation de -20 C à 30 C. - Lysis reagent:. 50 mM Tris pH 7.7. Guanidine thyocyanate 4.75 M. EDTA.Na2 (H2O) 25 mM. Tween 20: 1% qsp by volume with PCR water
Or for 80 ml of lysis reagent:. 132.8 mg of Trizma Base. 457.6 mg of Trizma HCl. 44.916 g of Guanidine Thyocyanate. 744.4 mg of EDTA.Na2 (H2O). 800 l of Tween 20
Storage from -20 C to 30 C.
- Isopropanol 75% (V/V). - Isopropanol 75% (V / V).
Dilution dans de l'eau PCR. Dilution in PCR water.
Conserver à température ambiante, pendant au maximum 4 mois. Store at room temperature for a maximum of 4 months.
- Réactif transporteur : RNA 4 mg/ml. - Carrier reagent: RNA 4 mg / ml.
Dissoudre dans du PBS stérile, et stériliser par filtration. Conservation de -20 à température ambiante. Dissolve in sterile PBS, and sterilize by filtration. Storage of -20 at room temperature.
- Solution de BSA à 0.03%. - 0.03% BSA solution.
Dissoudre dans de l'eau de PCR, faire une solution stock à 3%, et stériliser par filtration.Diluer la solution stock à 0,03% dans de l'eau PCR. Dissolve in PCR water, make a 3% stock solution, and sterilize by filtration. Dilute the stock solution to 0.03% in PCR water.
3) Préparation des premix d'amplification. 3) Preparation of the amplification premixes.
- Diluer les IPC dans de l'eau de PCR, de façon à obtenir une quantité d'ADN cible (IPC), qui après amplification génère un signal sur gel d'électrophorèse équivalent à celui obtenu suite à l'analyse, selon la même - Dilute the IPCs in PCR water, so as to obtain a quantity of target DNA (IPC), which after amplification generates a signal on electrophoresis gel equivalent to that obtained following the analysis, according to the same
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procédure, d'un échantillon contenant 100 Legionella pneumophila par litre. procedure, of a sample containing 100 Legionella pneumophila per liter.
- Mise en solution et dilution des amorces dans de l'eau de PCR: pour pT69 et pT70 : 38.5 M. pour pTl81, 87,161, 163, et pT165 : 19 M. - Dissolution and priming of the primers in PCR water: for pT69 and pT70: 38.5 M. for pTl81, 87,161, 163, and pT165: 19 M.
- Tous les réactifs PCR sont conservés à -20 C, les placer dans la glace après décongélation. - All PCR reagents are stored at -20 C, place them in ice after thawing.
Pour la préparation des premix PCR, introduire dans un tube Eppendorf stérile les réactifs dans l'ordre décrit ci-dessous. For the preparation of the PCR premixes, introduce the reagents in a sterile Eppendorf tube in the order described below.
- Préparer les prémix en mix-commun, puis aliquoter dans des microtubes de 0. 2 ml ; volume final d'un premix est de 50 {IL. - Prepare the premixes in a common mix, then aliquot in 0.2 ml microtubes; final volume of a premix is 50 {IL.
Conserver ces microtubes à -20 C jusqu'au moment de leurs utilisations. Store these microtubes at -20 C until ready to use.
Si cette solution est correctement conservée, elle sera valable jusqu'à la première date de péremption d'un des réactifs du premix. If this solution is correctly stored, it will be valid until the first expiration date of one of the premix reagents.
Premix de détection du genre Legionella . Premix for detecting the genus Legionella.
. 2,52 fil d'eau PCR . 10 [il de Tampon xlO
10 l IPC genre Legionella dilution équivalente à 100 Leg/L. . 2.52 wire PCR water. 10 [of Buffer xlO
10 l IPC genus Legionella dilution equivalent to 100 Leg / L.
. 2 l d' amorce pT 161 . 2 l d'amorce pT 163 . 2 {il d'amorce pT 165 . 2 l d' amorce pT 87 . 4 , 6 {il dATP . 4 , 6 fil dGTP . 4,6 l dCTP . 2,3 l dUTP . 2 l Uracyl N-glycosylase (UNG) . 1,38 (il amplitaq . 2 l of primer pT 161. 2 l of primer pT 163. 2 {primer pT 165. 2 l of primer pT 87. 4, 6 {il dATP. 4, 6 dGTP wire. 4.6 l dCTP. 2.3 l of UTP. 2 l Uracyl N-glycosylase (UNG). 1.38 (he amplitaq
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Premix de détection de l'espèce Legionella pneumophila . 4,52 l d'eau PCR . 10 l de Tampon xlO
10 l IPC l'espèce Legionella pneumophila dilution équivalente à 100Lp/L. Premix for the detection of Legionella pneumophila. 4.52 l of PCR water. 10 l of xlO Buffer
10 l IPC the species Legionella pneumophila dilution equivalent to 100Lp / L.
. 2 (il d'amorce pT 69
2 )il d'amorce pT 70 . 2 l d'amorce pT 181 . 4 , 6 fil dATP . 4 , (il dGTP . 4,6 l dCTP
2.3 {il dUTP . 2 (il Uracyl N-glycosylase (UNG) . 1,38 l AmpliTaq
4) Préparation des réactifs nécessaire à la détection. . 2 (primer pT 69
2) it initiates pT 70. 2 l of pT 181 primer. 4, 6 wire of ATP. 4, (it dGTP. 4.6 l dCTP
2.3 {he dUTP. 2 (il Uracyl N-glycosylase (UNG). 1.38 l AmpliTaq
4) Preparation of the reagents necessary for detection.
- Tampon TBE 1x
Diluer avec de l'eau milliQ+. Conserver à température ambiante. - 1x TBE buffer
Dilute with milliQ + water. Store at room temperature.
- APS 10%
Diluer dans de l'eau PCR. - APS 10%
Dilute in PCR water.
- Solution de bleu de bromophénol-xylène de cyanol : . 4 ml de glycérol . 6 ml d'eau PCR
25 mg de Bleu de bromophénol . 15 mg xylène de cyanol
Aliquoter et conserver à 4 C. - Bromophenol-xylene cyanol blue solution:. 4 ml glycerol. 6 ml PCR water
25 mg bromophenol blue. 15 mg xylene cyanol
Aliquot and store at 4 C.
- Solution de largage
50% de glycérol dans du TBE lx. - Drop solution
50% glycerol in TBE lx.
Conserver à +4 C . Store at +4 C.
III - Mode opératoire. III - Procedure.
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1) Protocole de préparation de l'échantillon. 1) Sample preparation protocol.
- Allumer le bloc chauffant à 99 C +/-5 C dans la salle d'extraction. - Switch on the heating block at 99 C +/- 5 C in the extraction room.
- Mettre le réactif de lyse à température ambiante, afin d'éliminer les cristaux. - Bring the lysis reagent to room temperature to remove the crystals.
Préparer les tubes stériles de 2 ml et 1,5 ml. Prepare the 2 ml and 1.5 ml sterile tubes.
1. 1) Concentration par filtration couplée ou non à l'immuno-capture. 1. 1) Concentration by filtration coupled or not with immuno-capture.
1. 1.1) Concentration des légionelles par filtration et immuno-capture. a) Préparation de l'échantillon. 1.1.1) Concentration of legionella by filtration and immuno-capture. a) Preparation of the sample.
- filtrer l'échantillon sur filtre en polycarbonate de 0,22 m de porosité. - filter the sample on a 0.22 m polycarbonate filter with a porosity.
- récupérer le filtre dans un flacon carré contenant 5 ml d'échantillon - soniquer pendant 3 min - vortexer pendant 2 min transférer le liquide dans un tube de 15 ml - bien rincer le flacon avec 5 ml d'eau stérile et mettre le liquide de lavage dans le tube falcon - centrifuger 10 min à 5000 rpm - retirer le surnageant jusqu'à ce qu'il en reste 1 ml - resuspendre le culot - transférer les cellules dans un eppendorf 1,5 ml. b) Préparation des billes. - collect the filter in a square bottle containing 5 ml of sample - sonicate for 3 min - vortex for 2 min transfer the liquid to a 15 ml tube - rinse the bottle well with 5 ml of sterile water and put the washing in the falcon tube - centrifuge 10 min at 5000 rpm - remove the supernatant until 1 ml remains - resuspend the pellet - transfer the cells to a 1.5 ml eppendorf. b) Preparation of the beads.
Lavage : i) resuspendre les billes en vortexant doucement Washing: i) resuspend the beads by gently vortexing
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ii) transférer la quantité de billes nécessaire dans un tube de lavage (2 5[il - 1,65.107) iii) ajouter 1001 de tampon de lavage (PBS/BSA) iv) placer le tube 2 min sur le Dynal MPC et pipetter le liquide v) enlever le tube du Dynal MPC et resuspendre les billes dans 100(il de PBS/BSA vi) répéter l'opération 1 fois à partir de (iv)
Traitement : i) ajouter 5 g d'anticorps (11) ii) vortexer brièvement iii) incuber pendant 30 min à température ambiante avec une légère rotation constante iv) placer le tube dans le Dynal MPC pendant 2 min. v) Pipetter le surnageant sans déranger les billes vi) enlever le tube du Dynal MPC et resuspendre les billes dans du PBS/BSA (100 l) vii) répéter 5 à 6 fois l'opération à partir de (iv) c) Isolement. i) ajouter les billes à la suspension bactérienne (lml) : volume final : 1,1 ml ; en billes : 1,5.107 billes/ ml ii) incuber 20 min à 4 C en agitant doucement iii) placer le tube dans le Dynal MPC et le laisser pendant 2 min iv) retirer le surnageant alors que les cellules cibles sont collées à la paroi du tube v) Enlever le tube du Dynal MPC et laver les cellules en les mettant en suspension dans 1 ml tampon d'isolement (PBS/Tween 20) ii) transfer the quantity of beads required in a washing tube (2 5 [il - 1.65.107) iii) add 1001 of washing buffer (PBS / BSA) iv) place the tube for 2 min on the Dynal MPC and pipette the liquid v) remove the tube from the Dynal MPC and resuspend the beads in 100 (il of PBS / BSA vi) repeat the operation 1 time from (iv)
Treatment: i) add 5 g of antibody (11) ii) briefly vortex iii) incubate for 30 min at room temperature with a slight constant rotation iv) place the tube in the Dynal MPC for 2 min. v) Pipette the supernatant without disturbing the beads vi) remove the Dynal MPC tube and resuspend the beads in PBS / BSA (100 l) vii) repeat the operation 5 to 6 times from (iv) c) Isolation. i) add the beads to the bacterial suspension (lml): final volume: 1.1 ml; in beads: 1.5.107 beads / ml ii) incubate 20 min at 4 C with gentle shaking iii) place the tube in the Dynal MPC and leave it for 2 min iv) remove the supernatant while the target cells are stuck to the wall from the tube v) Remove the tube from the Dynal MPC and wash the cells by suspending them in 1 ml isolation buffer (PBS / Tween 20)
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vi) Reprendre 2 fois à partir de (iii) et reprendre les cellules dans 400 l de réactif de lyse pour la PCR
1. 1.2) Concentration de l'échantillon par filtration uniquement. vi) Resume 2 times from (iii) and take up the cells in 400 l of lysis reagent for PCR
1. 1.2) Concentration of the sample by filtration only.
Placer les entonnoirs sur les frittés. Place the funnels on the frits.
Laisser une sortie libre pour pouvoir rétablir une pression normale. Leave a free outlet to restore normal pressure.
- Placer, avec une pince stérile, un filtre HVLP (Millipore) de 0,45 m de porositée, sur chaque fritté utilisé. - Place, with sterile forceps, an HVLP filter (Millipore) of 0.45 m porosity, on each frit used.
- Filtrer 1 litre de chaque échantillon d'eau, puis environ 100 ml d'eau osmosée stérile. - Filter 1 liter of each water sample, then around 100 ml of sterile reverse osmosis water.
- Placer à proximité les tubes Eppendorf stériles de 2 ml contenant 600 {il de réactif de lyse sans cristaux. - Place the 2 ml sterile Eppendorf tubes containing 600 μl of lysis reagent without crystals nearby.
- Manipuler le filtre en évitant de toucher la partie où les bactéries ont été recueillies. Il faut alors tenir la membrane avec les pinces uniquement sur sa partie périphérique. - Handle the filter, avoiding touching the part where the bacteria have been collected. It is then necessary to hold the membrane with the clamps only on its peripheral part.
- Découper en deux le filtre. Enrouler la première moitié, côté bactéries à l'intérieur, et le placer dans son tube. Puis enrouler la seconde partie du filtre de façon très serrée, et la placer à l'intérieur du filtre, au centre du tube. - Cut the filter in half. Wrap the first half, bacteria side inside, and place it in its tube. Then wind the second part of the filter very tightly, and place it inside the filter, in the center of the tube.
1.2) Extraction de l'ADN. i) Transférer les concentrats dans leur réactif de lyse dans la salle d'extraction. ii) Vortexer 2 min. iii) Incuber 20 min à 99 C +/- 5 C dans le bloc chauffant. iv) Centrifuger 30 sec à 12000 g, soit environ 10000 tours/min. 1.2) DNA extraction. i) Transfer the concentrates to their lysis reagent in the extraction room. ii) Vortex 2 min. iii) Incubate 20 min at 99 C +/- 5 C in the heating block. iv) Centrifuge for 30 sec at 12,000 g, or approximately 10,000 rpm.
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v) Dans un Eppendorf de 1,5 ml stérile, contenant 400 (il d'isopropanol à 100 %, ajouter 400 )il de réactif de lyse en contact avec le filtre (ADN bactérien). vi) Ajouter 10 (il de réactif transporteur ("carrier reagent"). vii) Mélanger le contenu des tubes par plusieurs inversions. viii) Incuber 10 min à température ambiante. ix) Centrifuger 10 min à 12000 g, en orientant les tubes afin de repérer le culot. x) Retirer le surnageant de chaque tube , avec le système d'aspiration . v) In a sterile 1.5 ml Eppendorf, containing 400 μl of 100% isopropanol, add 400 μl of lysis reagent in contact with the filter (bacterial DNA). vi) Add 10 (of carrier reagent). vii) Mix the contents of the tubes by several inversions. viii) Incubate 10 min at room temperature. ix) Centrifuge for 10 min at 12,000 g, orienting the tubes to locate the pellet. x) Remove the supernatant from each tube, with the suction system.
Il n'est pas nécessaire de changer de pipette pasteur entre chaque échantillon, si l'on aspire à la surface uniquement. Après aspiration de la série d'échantillon, aspirer quelques ml d'eau de javel. xi) Ajouter 500 l d'isopropanol à 75 %. xii) Vortexer doucement. xiii) Répéter l'opération à partir de (ix), en mettant 160 l d'une solution de BSA 0,03% à la place de l'isopropanol. xiv) Vortexer 10 sec, vérifier que le culot soit bien resuspendu. xv) Incuber les échantillons à 70 C +/-2 C pendant 3 min. xvi) Diluer 1/10 l'ADN de chaque échantillon dans la solution de BSA 0,03%, si l'amplification a déjà été inhibé. It is not necessary to change the pasteur pipette between each sample, if only aspirating to the surface. After aspirating the sample series, aspirate a few ml of bleach. xi) Add 500 l of 75% isopropanol. xii) Gently vortex. xiii) Repeat the operation from (ix), putting 160 l of a 0.03% BSA solution in place of isopropanol. xiv) Vortex 10 sec, check that the base is well resuspended. xv) Incubate the samples at 70 C +/- 2 C for 3 min. xvi) Dilute 1/10 the DNA of each sample in the 0.03% BSA solution, if the amplification has already been inhibited.
Si on ne peut pas amplifier l'ADN directement, les échantillons doivent être conservé à 2-8 C durant 5 jours maximum, ou à -20 C durant 2 semaines maximum. If DNA cannot be amplified directly, samples should be stored at 2-8 C for up to 5 days, or at -20 C for up to 2 weeks.
2) Protocole d'amplification par PCR. 2) PCR amplification protocol.
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- Dégeler un nombre suffisant de tubes de 0,2 ml contenant les prémix, pour les échantillons et les contrôles. - Thaw a sufficient number of 0.2 ml tubes containing the premixes, for samples and controls.
- Faire un plan des tubes sur la feuille prévue à cet effet . - Make a plan of the tubes on the sheet provided for this purpose.
- Il faut débuter la PCR dans les 30 minutes après avoir ajouté la solution de MgCl2. - PCR must be started within 30 minutes after adding the MgCl2 solution.
- Vortexer vigoureusement la solution de MgCl2. - Vortex vigorously the MgCl2 solution.
- Ajouter 15 l de MgCl2 25 mM dans chaque tubes de 0,2 ml. - Add 15 l of 25 mM MgCl2 to each 0.2 ml tube.
- Ajouter 35 l du tube contenant l'ADN de l'échantillon, dans les tubes contenant 0,2 ml de prémix. - Add 35 l of the tube containing the sample DNA to the tubes containing 0.2 ml of premix.
- Pour le contrôle négatif : ajouter 35 fil d'eau de PCR (gene amp PCR water ). - For the negative control: add 35 wire of PCR water (gene amp PCR water).
- Fermer les tubes hermétiquement. - Close the tubes tightly.
- Les placer dans le bloc de PCR, avec la roulette passer sur les tubes pour les fermer. - Place them in the PCR block, with the roller pass over the tubes to close them.
- Lancer le programme d'amplification sur le thermocycleur 9700 de Perkin-Elmer, et réaliser le cycle suivant : 10 min 45 C ; 10 min à 95 C ; 35 fois : 15s à 95 C à 63 C ; puis 7 min à 72 C et maintenir autant de temps que nécessaire à 4 C . - Start the amplification program on the Perkin-Elmer 9700 thermal cycler, and perform the following cycle: 10 min 45 C; 10 min at 95 C; 35 times: 15s at 95 C to 63 C; then 7 min at 72 C and maintain as long as necessary at 4 C.
La PCR dure environ 2 heures. Mais l'ADN peut être conservé 4h de plus dans le bloc avec le programme 23 (4 C) . The PCR takes approximately 2 hours. However, DNA can be kept for an additional 4 hours in the block with program 23 (4 C).
- Sortir les tubes du bloc. - Take the tubes out of the block.
- Si on ne peut pas réaliser le protocole de détection immédiatement, on peut conserver les échantillons amplifiés à -20 C. Mais éviter de les mettre dans le compartiment des réactifs d'amplification. - If the detection protocol cannot be carried out immediately, the amplified samples can be stored at -20 C. But avoid putting them in the amplification reagent compartment.
3) Séparation et révélation des séquences spécifiques des Legionella ou des Legionella pneumophila par migration en gel de polyacrylamide. 3) Separation and revelation of specific sequences of Legionella or Legionella pneumophila by migration in polyacrylamide gel.
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3.1) Montage du support à vis nécessaire à la polymérisation du gel. 3.1) Mounting of the screw support necessary for the polymerization of the gel.
-Orienter le support à vis de façon à ce que les pointes soient vers le haut et les vis vers l'arrière. -Orient the screw support so that the points are upwards and the screws backwards.
-Glisser ensuite la grande plaque dans l'espace prévu, puis, glisser la petite plaque (devant la grande). -Slide the large plate in the space provided, then slide the small plate (in front of the large).
-Placer, à chaque extrémité, les spacers de manière à obtenir l'espace nécessaire pour couler le gel. -Place, at each end, the spacers so as to obtain the space necessary to pour the gel.
-Serrer d'abord les vis du haut, puis, après avoir vérifié que tout est droit en bas, serrer celles du bas. -Tighten the top screws first, then, after checking that everything is straight at the bottom, tighten the bottom ones.
-Sceller ensuite le tout sur le socle à l'aide du joint. - Then seal everything on the base using the gasket.
3. 2) Préparation du gel de polyacrylamide à 10% (w/v) 29:1(B/A) 3. 3% de C. 3. 2) Preparation of the polyacrylamide gel at 10% (w / v) 29: 1 (B / A) 3. 3% of C.
Dans un petit tube de 15ml , mettre pour un gel :
4,875 ml de TBE lx . 1,625 ml de polyacrylamide 40%(w/v) 29:1(B/A) 3,3% de C. In a small 15ml tube, put for a gel:
4.875 ml of TBE lx. 1.625 ml of polyacrylamide 40% (w / v) 29: 1 (B / A) 3.3% of C.
(cette solution, conservée à +4 C, est à homogénéiser avant utilisation) - 32,5 {il d'APS à 10%. (this solution, stored at + 4 ° C., is to be homogenized before use) - 32.5 {il of 10% PSA.
- ajouter extemporanément 6,5 [il de TEMED - Bien homogénéiser le mélange par plusieurs retournements du tube. - immediately add 6.5 [il of TEMED - Thoroughly homogenize the mixture by several inversion of the tube.
- Couler rapidement le gel. Mettre en place, sans attendre, le peigne en évitant la formation de bulles. - Pour the gel quickly. Put the comb in place without delay, avoiding the formation of bubbles.
- Laisser polymériser 30 à 45 min. - Let polymerize 30 to 45 min.
- Après polymérisation, enlever le peigne, rincer 2x les puits à l'eau osmosée et lx au TBE lx (afin d'enlever les restes de gel qui n'ont pas polymérisé). - After polymerization, remove the comb, rinse 2x the wells with reverse osmosis water and lx with TBE lx (in order to remove the gel remains which have not polymerized).
- Préparer ensuite la chambre en "U" comme suit. - Then prepare the U-shaped chamber as follows.
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3. 3) Préparation de la chambre en "U". 3. 3) Preparation of the U-shaped chamber.
- La préparation de cette chambre consiste à placer, de part et d'autre du socle de migration, un support à vis. - The preparation of this chamber consists in placing, on either side of the migration base, a screw support.
- Pour fixer les supports à vis: - placer les supports sur le socle de le cuve : la petite plaque vers le joint étant bloquée par l'encoche. - To fix the screw supports: - place the supports on the base of the tank: the small plate towards the joint being blocked by the notch.
- pour enclencher : pousser de part et d'autre avec les pouces et tirer avec les indexs. - to engage: push on both sides with your thumbs and pull with the index fingers.
- Remarque :
Si la manipulation ne nécessite qu'un gel : on disposera : - d'un support à vis avec le gel polymérisé - d'un support à vis avec une petite plaque uniquement
Les deux supports seront fixés de la même manière que précédemment. - Note :
If the handling requires only a gel: we will have: - a screw support with the polymerized gel - a screw support with a small plate only
The two supports will be fixed in the same way as above.
- Immerger ensuite le haut et le bas du gel dans du TBE lx
Il faut toujours utiliser le même TBE lx pour la migration et la préparation du gel. - Then immerse the top and bottom of the gel in TBE lx
Always use the same TBE lx for migration and gel preparation.
3. 4) Dépôt des échantillons et migration. 3. 4) Deposit of samples and migration.
Le volume maximal de chargement d'un puits est de 30 l. The maximum loading volume of a well is 30 l.
- Prélever 221 d'ADN amplifié (de l'échantillon voulu) et ajouter 10 l de solution de largage (=SL= glycérol 50% dans du TBE lx). - Take 221 of amplified DNA (from the desired sample) and add 10 l of release solution (= SL = 50% glycerol in TBE lx).
- On dépose également, par gel, un marqueur moléculaire (=MM= mass ruler) et un marqueur de migration préparés comme suit : - 6 (il de marqueur de migration + 5 [il de SL - We also deposit, by gel, a molecular marker (= MM = mass ruler) and a migration marker prepared as follows: - 6 (II of migration marker + 5 [II of SL
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- 1 (il de MM + 10 (il de SL
MM, marqueur de migration et SL sont conservés à +4 C . - 1 (il de MM + 10 (il de SL
MM, migration marker and SL are stored at +4 C.
- Remarques :
En général, lorsqu'il n'y a qu'un seul gel, le marqueur de migration est déposé à une extrémité du gel et le MM au centre. - Notes:
In general, when there is only one gel, the migration marker is deposited at one end of the gel and the MM in the center.
Si toute fois, il y a plusieurs gels, on fait varier la position du MM afin de reconnaître les gels, lors de la lecture. If, however, there are several gels, the position of the MM is varied in order to recognize the gels during reading.
- La migration s'effectue à environ 200 V jusqu'à ce que le bleu de xylène de cyanol se situe en bas du gel. - Migration takes place at around 200 V until the xylene cyanol blue is at the bottom of the gel.
3. 5) Coloration et lecture du gel. 3.5) Coloring and reading of the gel.
- Lorsque la migration est finie, verser le tampon de migration (TBE lx) dans le bac de coloration (200 ml environ). - When the migration is finished, pour the migration buffer (TBE lx) into the staining tank (approximately 200 ml).
- Démouler le gel en utilisant les spacers comme levier. - Unmold the gel using the spacers as a lever.
Placer ensuite le gel dans le bac de coloration et ajouter 10 (il de BET (Bromure d'éthidium) (port des gants obligatoire). Then place the gel in the staining tank and add 10 (of BET (ethidium bromide) (wearing of gloves compulsory).
Laisser en contact 15 mn à température ambiante et sous agitation. Leave in contact for 15 minutes at room temperature and with stirring.
- La lecture du gel s'effectue sous UV dans l'appareil Gel doc 1000 avec le programme Molecular analyst. Ce logiciel permet de comparer l'intensité des bandes d'ADN spécifiques des produits d'amplification et donc de déterminer à un facteur de 10 près la concentration en Legionella dans l'échantillon. - The gel is read under UV in the Gel doc 1000 device with the Molecular analyst program. This software makes it possible to compare the intensity of the specific DNA bands of the amplification products and therefore to determine the concentration of Legionella in the sample to a factor of 10.
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