FR2799467A1

FR2799467A1 - New monoclonal murine antibody specific for type 2 brevetoxins, useful for detection and quantification of these toxins in e.g. sea water or poisoned animals

Info

Publication number: FR2799467A1
Application number: FR9912943A
Authority: FR
Inventors: Jerome Naar; Serge Pauillac; Philippe Branaa
Original assignee: INST DE RECH S MEDICALES LOUIS
Current assignee: INST DE RECH S MEDICALES LOUIS
Priority date: 1999-10-06
Filing date: 1999-10-06
Publication date: 2001-04-13
Anticipated expiration: 2019-10-06
Also published as: FR2799467B1

Abstract

A monoclonal murine antibody, designated 1A11, which is an immunoglobulin (Ig) of type G1, k and recognizes specifically type 2 brevetoxins (I) and does not recognize type 1 brevetoxins, ciguatoxins or okadaic acid, is new. An Independent claim is included for the detection and immunopurification of (I) using 1A11.

Description

La présente invention concerne la production d'un anticorps monoclonal murin diriCMlctrnfM4t:ds brévétoxines de type 2 (PbTxs) (toxines responsables de l'intoxication neurologique par les fruits de mer, INFM) et son utilisation pour la détection et le dosage de ces toxines à l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique. Elle concerne également toute procédure immunochimique de purification et d'enrichissement (immunopurification par fixation covalente à des microbilles sur colonne ou en suspension) de ces toxines à l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique à partir de diverses matrices alimentaires (produits de pêche) et fluides biologiques humains ou animaux (sérum et urine). Son utilisation pouvant être étendue à des expériences de marquage des organes cibles ou de leurs récepteurs sur des préparations ou par injection de brévétoxines in vivo à des animaux de laboratoire. The present invention relates to the production of a murine monoclonal antibody diriCMlctrnfM4t: ds breetoxins type 2 (PbTxs) (toxins responsible for neurological intoxication by seafood, INFM) and its use for the detection and determination of these toxins using a specific monoclonal antibody. It also relates to any immunochemical purification and enrichment procedure (immunopurification by covalent attachment to microbeads on a column or in suspension) of these toxins using a specific monoclonal antibody from various food matrices (fishery products) and human or animal biological fluids (serum and urine). Its use can be extended to labeling experiments on target organs or their receptors on preparations or by injecting breetoxins in vivo in laboratory animals.

Pour des raisons de santé publique et d'intérêt économique, plusieurs voies de détection des brévétoxines ont été explorées auparavant Actuellement, la surveillance des coquillages est essentiellement assurée par des tests de toxicité aiguë sur animaux sensibles (souris) selon le protocole détaillé par Fernandez et Cembella (1995) dans le guide publié par la Commission Océanographique Intergouvernementale de l'UNESCO. La limite de détection de ce test est estimée à 10 unités souris pour 100 g de chair de coquillage (Fernandez et Cembella, 1995) soit 80 g de brévétoxines pour 100 g de chair de coquillage (Trainer et Baden, 1991). For reasons of public health and economic interest, several ways of detecting brevetoxins have been explored before. Currently, the monitoring of shellfish is mainly ensured by acute toxicity tests on sensitive animals (mice) according to the protocol detailed by Fernandez and Cembella (1995) in the guide published by the Intergovernmental Oceanographic Commission of UNESCO. The detection limit for this test is estimated at 10 mouse units per 100 g of shellfish flesh (Fernandez and Cembella, 1995), ie 80 g of brevetoxins for 100 g of shellfish flesh (Trainer and Baden, 1991).

Durant ces dernières années, plusieurs équipes ont travaillé sur la production et l'utilisation d'anticorps polyclonaux spécifiques des brévétoxines (Baden et coll., 1984 ;Poli et Hewetson, 1990 ; Trainer et Baden, 1990,1991 : Levine et Shimizu, 1992 : Melinek et coll., 1994 : Poli, 1995 Baden et coll., 1995). In recent years, several teams have worked on the production and use of polyclonal antibodies specific for brevetoxins (Baden et al., 1984; Poli and Hewetson, 1990; Trainer and Baden, 1990, 1991: Levine and Shimizu, 1992 : Melinek et al., 1994: Poli, 1995 Baden et al., 1995).

En dépit des recherches il n'existe pas actuellement d'anticorps monoclonaux spécifiques des brévétoxines ni de système de détection, de dosage, d'enrichissement ou de marquage de brévétoxines basé sur l'activité de tels anticorps. Despite the research, there are currently no monoclonal antibodies specific for brevetoxins, nor a detection, assay, enrichment or labeling system for brevetoxins based on the activity of such antibodies.

La présente invention permet de remédier à l'absence de source inépuisable de réactifs standards pour l'élaboration de systèmes de détection, de dosage, d'enrichissement ou de marquage de brévétoxines basés sur l'activité d'un anticorps monoclonal spécifique des brévétoxines The present invention makes it possible to remedy the absence of an inexhaustible source of standard reagents for the development of systems for detecting, assaying, enriching or labeling brevetoxins based on the activity of a monoclonal antibody specific for breetoxins

2 Les étapes réalisées pour l'obtention de ce produit biologique sont les suivantes :
1. Préparation de l'immunogène (conjugué PbTx - protéine porteuse) Les conjugués ont été préparés selon les technologies précédemment décrites (Pauillac et coll., 1998 ;Naar et coll., 1999)
1.1. Synthèse de l'hémisuccinate de PbTx-3 L'hémisuccinate de PbTx-3 a été préparé selon la technique suivante. Cinquante l de solution d'anydride succinique à 27 mg/ml (13,39 pmoles) en pyridine ont été incubés pendant 5 h à 65 C en présence de 400 g de PbTx-3 (0,446 mole L'hémisuccinate de PbTx-3 a été purifié à l'aide d'une chaîne HPLC (Kontron Instruments, Allemagne) munie d'une colonne à polarité inversée (C18 ODP, diamètre interne de 4,6 mm, longueur 250 mm , Asahipak Shodex, Prolabo, France) et sous un débit de 1 ml/mn de phase mobile (mélange CH3CN/H20, 80@20). L'élution a été contrôlée par un détecteur à absorption dans l'UV (# = 210 nm, facteur de sensibilité = 0,1
1.2. Conjugaison en milieu micellaire Le milieu micellaire a été obtenu en mélangeant sous agitation 1 ml de solution de BSA (5 mg/ml en tampon borate pH 10) avec 4 ml de solution d'AOT (0,5 M en heptane). La concentration finale en BSA dans la solution micellaire est de 1 mg/ml. La réaction d'activation de l'hémisuccinate de PbTx-3 a été effectuée dans un volume final de 21 l. L'hémisuccinate de PbTx-3 (0,446 pmoles) a été incubé 15 minutes avec 10,62 l de But3N diluée au 1/1 Oè en dioxanne anhydre (Vm=2381,5

pllmmoles) et 5,85 NI d'IBCC à la même dilution (Vm=1313,25 pllmmoles) ainsi que 5 pi de dioxanne. La conjugaison a été réalisée avec des rapports molaires initiaux haptène activé/protéine de 75. Après activation, 400 l de solution micellaire, soit 400 g de BSA (0,0059 mole, ont été introduits et incubés (12 h à température ambiante) en présence de l'hémisuccinate de PbTx-3. Les conjugués ont été récupérés par des précipitations à l'acétone. Les conjugués ont été repris dans 1 ml d'eau distillée, lyophilisés puis conservés à -20 C avant injection à une souris de laboratoire. Un deuxième conjugué a été produit dans les mêmes conditions expérimentales en remplaçant la BSA par l'OVA 2 The steps carried out to obtain this organic product are as follows:
1. Preparation of the immunogen (PbTx conjugate - carrier protein) The conjugates were prepared according to the technologies previously described (Pauillac et al., 1998; Naar et al., 1999)
1.1. Synthesis of PbTx-3 Hemisuccinate PbTx-3 hemisuccinate was prepared according to the following technique. Fifty l of succinic anydride solution 27 mg / ml (13.39 pmol) in pyridine were incubated for 5 h at 65 C in the presence of 400 g of PbTx-3 (0.446 mole PbTx-3a hemisuccinate been purified using an HPLC chain (Kontron Instruments, Germany) fitted with an inverted polarity column (C18 ODP, internal diameter of 4.6 mm, length 250 mm, Asahipak Shodex, Prolabo, France) and under a flow rate of 1 ml / min of mobile phase (CH3CN / H2O mixture, 80 @ 20) The elution was monitored by a UV absorption detector (# = 210 nm, sensitivity factor = 0.1
1.2. Conjugation in micellar medium The micellar medium was obtained by mixing, with stirring, 1 ml of BSA solution (5 mg / ml in borate buffer pH 10) with 4 ml of AOT solution (0.5 M in heptane). The final concentration of BSA in the micellar solution is 1 mg / ml. The activation reaction of PbTx-3 hemisuccinate was carried out in a final volume of 21 l. PbTx-3 hemisuccinate (0.446 pmol) was incubated for 15 minutes with 10.62 l of But3N diluted 1/1 Oè in anhydrous dioxane (Vm = 2381.5

pllmmoles) and 5.85 NI of IBCC at the same dilution (Vm = 1313.25 pllmmoles) as well as 5 μl of dioxane. Conjugation was carried out with initial molar ratios of activated hapten / protein of 75. After activation, 400 l of micellar solution, ie 400 g of BSA (0.0059 mole, were introduced and incubated (12 h at room temperature) in presence of PbTx-3 hemisuccinate. The conjugates were recovered by acetone precipitation. The conjugates were taken up in 1 ml of distilled water, lyophilized and then stored at −20 ° C. before injection into a laboratory mouse. A second conjugate was produced under the same experimental conditions by replacing BSA with OVA

3 2. Immunisation et production d'anticorps Une souris Balb/c a reçu un total de 5 injections intra péritonéales de 50 g de conjugué PbTx-3BSA espacées de 2 semaines et une dernière stimulation par voie intra splénique de 25 g de conjugué. Des saignées régulières ont été effectuées pour apprécier la cinétique de production des anticorps spécifiques par ELISA en utilisant le conjugué cible PbTx-OVA et d'autres conjugués contrôles. En fin d'immunisation, le titre en anticorps (dilution sérique correspondant à un rapport signal/bruit de fond de 3) déterminé par ELISA indirecte en utilisant le conjugué cible PbTx-3-OVA est de 1/16000. Des expériences conduites en ELISA de type compétitif ont révélé une IC50 de 1 x

10 M de PbTx-3. 3 2. Immunization and Antibody Production A Balb / ca mouse received a total of 5 intraperitoneal injections of 50 g of PbTx-3BSA conjugate spaced 2 weeks apart and a last intra spleen stimulation of 25 g of conjugate. Regular bleeding was carried out to assess the kinetics of production of specific antibodies by ELISA using the target conjugate PbTx-OVA and other control conjugates. At the end of immunization, the antibody titer (serum dilution corresponding to a signal / background noise ratio of 3) determined by indirect ELISA using the target conjugate PbTx-3-OVA is 1/16000. Competitive ELISA experiments revealed an IC50 of 1 x

10 M PbTx-3.

3. Production d'anticorps monoclonaux Une expérience de fusion des splénocytes de la souris immunisée par le conjugué PbTx-3-BSA avec les cellules du myélome P3-X63-Ag8 653 a été réalisée à l'aide d'un kit canadien (ClonaCell - HY, Stemcell Technologies Inc.) dans un rapport 5 :1. Surles 266 hybridomes obtenus en milieu sélectif semi-solide, la totalité a supporté l'étape de transfert en milieu liquide et 5 d'entre eux ont produit des anticorps reconnaissant spécifiquement le conjugué PbTx-3-OVA. Une étude approfondie de leur spécificité a montré la présence d'anticorps reconnaissant la PBTx-3 libre dans 2 surnageants. Les hybridomes correspondants (3A12 et 1A11) ont été sous-clonés et leur spécificité a été contrôlée. La population d'hybridome1A11 pure, secrète l'anticorps le plus affin qui fait l'objet de la présente invention. 3. Production of monoclonal antibodies An experiment of fusion of the splenocytes of the mouse immunized by the PbTx-3-BSA conjugate with the myeloma cells P3-X63-Ag8 653 was carried out using a Canadian kit (ClonaCell - HY, Stemcell Technologies Inc.) in a 5: 1 ratio. Of the 266 hybridomas obtained in a semi-solid selective medium, all supported the transfer step in liquid medium and 5 of them produced antibodies specifically recognizing the PbTx-3-OVA conjugate. A detailed study of their specificity showed the presence of antibodies recognizing the free PBTx-3 in 2 supernatants. The corresponding hybridomas (3A12 and 1A11) were subcloned and their specificity was checked. The population of pure hybridoma1A11 secretes the most refined antibody which is the subject of the present invention.

Le typage immunologique de cet anticorps monoclonal (1A11) réalisé à l'aide du kit Mouse Hybridoma Subtyping (Boehringer-Mannheim) a révélé qu'il s'agissait d'une IgG1,K

4. Spécificité de l'anticorps monoclonal 1A11 La spécificité de cet anticorps monoclonal a été évaluée par ELISA de type compétitif utilisant des concentrations croissantes d'inhibiteurs (brévétoxines de type 2, brévétoxine de type 1, ciguatoxine, acide okadaïque) solubilisées dans différentes matrices. Les puits des plaques de micro-titration ont été sensibilisés par incubation avec la solution OVA-PbTx-3 diluée en PBS à 250 ng/ml Après lavages (PBS), les sites de fixation restés libres ont été saturés par addition de PBSlait à 0,5 % (30 mn) Une nouvelle série de lavages en PBS-Tween 20 à 0,1% (PBS-T) étant effectuée, 25 l de solution d'anticorps en PBS-T contenant 0 5% de gélatine (PGT) mélangés à un The immunological typing of this monoclonal antibody (1A11) carried out using the Mouse Hybridoma Subtyping kit (Boehringer-Mannheim) revealed that it was an IgG1, K

4. Specificity of the monoclonal antibody 1A11 The specificity of this monoclonal antibody was evaluated by competitive type ELISA using increasing concentrations of inhibitors (brevetoxins of type 2, brevetoxin of type 1, ciguatoxin, okadaic acid) dissolved in different matrices . The wells of the micro-titration plates were sensitized by incubation with the OVA-PbTx-3 solution diluted in PBS to 250 ng / ml After washing (PBS), the binding sites which remained free were saturated by addition of PBS milk at 0 0.5% (30 min) A new series of washes in PBS-Tween 20 at 0.1% (PBS-T) being carried out, 25 l of antibody solution in PBS-T containing 0.5% of gelatin (PGT) mixed with a

volume identique de solution d'inhibiteur sont ajoutés Après lavages (PBS-T), une incribatiurï avec la solution d'anticorps de chèvre anti-Ig de souris couplés à la (i-galactosidase (GAM-a-gal) au 1/2000ème en PGT est réalisée Enfin, après élimination de l'excès de conjugués anticorps-enzyme (PBS-T), la présence d'anticorps spécifiques a été révélée par incubation (20 mn) avec le substrat

fluorogénique (MUG ou 4-méthyl umbellyféryl f3-D-galactoside ; le, = 365 nm et le, = 450 nm) à saturation en tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2. La réaction a été arrêtée par addition de 50 l de Na2C032 M avant lecture (MicroFLUOR Reader, Dynatech, USA).

identical volume of inhibitor solution are added After washes (PBS-T), an incorporation with the solution of goat anti-mouse Ig antibodies coupled to (i-galactosidase (GAM-a-gal) at 1 / 2000th in PGT is carried out Finally, after elimination of the excess of antibody-enzyme conjugates (PBS-T), the presence of specific antibodies was revealed by incubation (20 min) with the substrate

fluorogenic (MUG or 4-methyl umbellyferyl f3-D-galactoside; le, = 365 nm and le, = 450 nm) at saturation in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.2. The reaction was stopped by adding 50 l of Na2C032 M before reading (MicroFLUOR Reader, Dynatech, USA).

Dans tous les cas, l'anticorps 1A11a montré une réactivité exclusive pour les brévétoxines de type 2 et n'a réagi avec aucun autre composé. In all cases, the 1A11 antibody showed exclusive reactivity for type 2 brevetoxins and did not react with any other compound.

La gamme utile de dosage (20-80% d'inhibition) des PbTxs de type 2 est de 128-2000 ng/ml de solution soit, dans notre format ELISA compétitif (ou autres utilisant des systèmes d'amplification basés sur des principes chromogéniques, fluorogéniques, luminométriques ou radioimmunométriques), de 64-1000 ng de toxine. The useful dosage range (20-80% inhibition) of PbTxs type 2 is 128-2000 ng / ml of solution either, in our competitive ELISA format (or others using amplification systems based on chromogenic principles , fluorogenic, luminometric or radioimmunometric), of 64-1000 ng of toxin.

La limite de détection des PbTxs par le test de référence actuel (test-souris) est de 4000 ng. Cet anticorps monoclonal permet donc de détecter et de doser des quantités de toxine de 4 à 60 fois plus faibles. The limit of detection of PbTxs by the current reference test (mouse test) is 4000 ng. This monoclonal antibody therefore makes it possible to detect and measure quantities of toxin from 4 to 60 times lower.

1) Comme il va de soi et comme il en résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes notamment celles dans lesquelles les anticorps monoclonaux pourraient être utilisés d'une manière ou d'une autre pour la détection, le dosage, ou l'immunopurification (colonne d'affinité ou autre procédé) à partir de diverses matrices alimentaires (produits de la pêche) ou biologiques (sérum et urine) ou échantillons environnementaux (eau de mer), le marquage d'organe cibles (cellules nerveuses et leurs récepteurs) lors d'intoxications animales, et la préparation d'une composition immunothérapeutique visant à neutraliser l'action des brévétoxines dans les systèmes sanguins.1) As goes without saying and as already follows from the above, the invention is in no way limited to those of its modes of application and embodiments which have been more especially envisaged; on the contrary, it embraces all the variants, in particular those in which the monoclonal antibodies could be used in one way or another for the detection, the assay, or the immunopurification (affinity column or other method) from various food (fishery products) or biological matrices (serum and urine) or environmental samples (sea water), the labeling of target organs (nerve cells and their receptors) during animal intoxication, and the preparation of a immunotherapeutic composition intended to neutralize the action of brevetoxins in the blood systems.

Claims

5 CLAIMS 1) Murine monoclonal antibody characterized in that it is an immunoglobulin of the IgG1, K type, called lA 11, characterized in that it specifically recognizes the brevetoxins of type 2 and does not react with the brevetoxins of type 1, ciguatoxins, okadaic acid, and characterized by its affinity.

2) Use of the murine monoclonal antibody 1A11 according to claim 1 in an immunological technique using a specific antibody (conventional technique of competitive, direct, sandwich or other ELISA type using amplification systems based on chromogenic, fluorogenic, radioimmunometric or luminometric) which allows the dosage or detection of type 2 brevetoxins.

3) Use of the murine monoclonal antibody 1A11 according to claim 1 for carrying out methods of immunopunification of breetoxins (by covalent attachment to microbeads on a column or in suspension) from various food (fishery products) and biological matrices (serum and urine) 4) Use of the murine monoclonal antibody 1A11 according to claim 1 for the assay and detection of breetoxins in environmental samples (sea water).

5) Use of the murine monoclonal antibody 1A11 according to claim 1 for the in vitro detection of brevetoxins fixed on the target organs or their receptors during animal intoxication.

6) Use of the monoclonal munn antibody 1A11 according to claim 1 for the preparation of an immunotherapeutic composition aimed at neutralizing the action of brevetoxins in the blood systems