FR2798735A1 - Procede d'evaluation et de suivi du vieillissement tissulaire - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un procédé d'évaluation et de suivi du vieillissement tissulaire, en particulier pour les tissus cutanés et les phanères, notamment la matrice extracellulaire du derme.Procédé caractérisé en ce qu'il consiste à créer préalablement un modèle expérimental évolutif de simulation du tissu à étudier, puis à soumettre ce modèle, de manière contrôlée, à l'action de facteurs et/ ou d'agents induisant un phénomène de vieillissement tissulaire, notamment la glycation des protéines et, ensuite, à localiser et à quantifier les effets dudit vieillissement induit sur la base d'images du modèle ou d'au moins une partie du modèle après marquage d'au moins certains produits résultant dudit vieillissement.

Description

DESCRIPTION La présente invention concerne le domaine de la cosmétologie et de la pharmacologie, plus particulièrement la simulation des effets de substances actives sur des tissus, sans avoir recours à des organismes vivants et a pour objet un procédé d'évaluation et de suivi du vieillissement tissulaire mettant en oeuvre un modèle expérimental.

Ainsi, la présente invention concerne essentiellement la création d'un modèle ex vivo, reproduisant le vieillissement des protéines - et plus particulièrement le phénomène de glycation - in vivo dans les tissus cutanés et les phanères, dans lequel la glycation peut être révélée in situ, suivie quantifiée.

La réaction des sucres réducteurs (glucose ou xylose) avec les protéines lors de la stérilisation des aliments a été observée dès<B>1912</B> par Maillard L. (CR Acad. Sc. 154:68, 1912) : il s'agit de la réaction de brunissement.

Dans les années 1960, des protéines glyquées ont été identifiées pour la première fois chez l'homme au niveau de l'hémoglobine et, en 1981 (Science, 1981, 211, 491-493), Cerami A. a décrit la glycation des protéines ou glycosylation non enzymatique en opposition à la glycosylation enzymatique par la glucosyl transférase. Il a évoqué le rôle possible de cette glycation dans le vieillissement des tissus.

Le mécanisme biochimique de cette réaction est bien connu (Borel J.P. et al., CR biologie prospective, 145-149,<B>1993)</B> et se déroule deux phases. Tout d'abord une phase précoce comprenant la reaction de sucres réducteurs (glucose, fructose) avec les fonctions amines terminales ou latérales des protéines constitutives tissulaires pour produire des composés appelés "Bases de Schiff'. composés sont stabilisés ensuite par réarrangement d'Amadori, en cétonamine.

Ensuite, une phase tardive dans laquelle les fonctions cétonamine sont oxydées desoxyonose en présence d'oxygène et réagissent avec d'autres acides aminés basiques tels que l'arginine ou la lysine appartenant à d'autres protéines (albumine, lipoprotéines, immunoglobuline). Le résultat est la formation des complexes avec des pontages finaux du type cycles pentosidine ou 2-furoyl- 1,4-imidazole.

pontages réalisent des dérivés terminaux complexes et très stables dénommés AGE (= "Advanced Glycosylation Endproducts") ou produits avancés de la glycation. Cette phase tardive est très lente et irréversible. La glycation des protéines provoque la formation de ponts inter et intra moléculaires au niveau de protéines à renouvellement lent, puis le brunissement et l'insolubilité de ces protéines.

La glycation atteint particulièrement les protéines présentes dans les matrices extracellulaires, dont le renouvellement est lent.

AGE se forment dans le corps humain au cours du vieillissement et dans des conditions pathologiques ou dégénératives (diabète sucré, insuffisance rénale, maladie d'Alzheimer...) niveau cutané, les protéines endommagées par la glycation sont notamment : la fibronectine, la laminine, l'élastine et les différents types de collagène.

Récemment, il a été démontré que la kératine pouvait également être touchée par la glycation (Marova 1. et al., Acta Diabetologica, 32, 38-43, 1995). Les AGE provoquent des troubles variés - ils sont volumineux, donc les molécules qui les portent ont du mal à rester à leur place normale, - les molécules glyquées perdent de leur souplesse (rigidification tissus), - les molécules glyquées peuvent devenir plus résistantes à l'égard des enzymes assurant leur renouvellement et constituer ainsi des plages substances amorphes.

Dans la peau normale, les protéines glyquées sont éliminées par voie métabolique par voie cellulaire, notamment par digestion par les macrophages induisant un remodelage du derme.

Mais cette élimination diminue avec l'âge, entraînant accumulation ces protéines glyquées et un vieillissement accéléré et aggravé derme du fait de l'addition de plusieurs phénomènes - résistance aux protéases de renouvellement et diminution de la fibrillogénèse du collagène et donc de son renouvellement, réduction de activité de filtre dans la matrice extra-cellulaire et notamment dans la jonction dermo-épidermique après fixation de protéines étrangères (LDL, cholestérol albumine) provoquant son épaississement, - les protéines glyquées représentent une source potentielle de radicaux libres oxygénés. Ce phénomène, aggravé par les UV-A, entraîne une dégradation du collagène, - activation de protéases néfastes non spécifiques, - activation des macrophages et sécrétion de cytokines (TNF alpha), - finalement inflammation, puis fibrose et dépôts de lipofuscines. L'exposé qui précède met en valeur l'intérêt de l'utilisation de substances à effet anti-glycation, notamment dans la lutte et la prévention du vieillissement cutané et pileux en cosmétique.

La validation de ces substances passe par la réalisation de tests et d'expériences effectués sur des organismes vivants ou sur des extraits de tissus. Ainsi, différentes méthodes biochimiques, appliquées sur du collagène dermique extrait par des solutions aqueuses salines ou acides en présence de pepsine, sont déjà utilisées pour évaluer le taux de glycation du collagène.

Parmi ces méthodes biochimiques, nous pouvons citer - la fixation du tritium (apporté par le tétrahydroborate de sodium) sur les composés d'Amadori, puis mesure de la radioactivité des fractions séparées par chromatographie d'affinité (Miksik al., Mechanisms of ageing and development, 57, 2 :163-l74, 1991 [a]), - la révélation du 5-hydroxyméthylfurfural par la réaction à l'acide thiobarbiturique (Miksik et al., Journal of gerontology, 46, 3 : B 111-B 116, 1991 [b]), - la mesure de la fluorescence ' 440 nm (excitation à 370 nm) qui révèle la présence de bases de Schiff (Deyl et al., Mechanisms of ageing and development, 55, 1 : 39-47, 1990).

Ces méthodes ont démontré que le taux de glycation non enzymatique du collagène augmente en fonction de l'âge et en fonction de la glycémie dans le derme du rat (Deyl, 1990 - Miksik, 1991 [a]) et dans le derme de la peau humaine (Miksik, 1991 [b] ; Freitas et , Comptes rendus de la Société de biologie et de ses filiales,<B>191,</B> 2, 298, 1997).

Des techniques immunochimiques (test Elisa) utilisant des anticorps anti-AGE ont permis de quantifier le taux glycation dans l'aorte de rats diabétiques et dans le sérum de rats diabétiques, sans toutefois permettre de situer ou de visualiser le phénomène de glycation (Makita Z et al., Journal of biological chemistry, 267, 8 : 5<B>1</B>33-5138, 1992).

Des techniques immunohistochimiques ont été développées pour révéler des AGE chez l'homme, dans des tissus cutanés - tissus rénaux (Nishino T. et , Human pathology, 26, 3 : 308-313, 1995), - tissus cardiaques (Yoshida S., Chimical Nephrology, 49, 5 :<B>273-</B> <B>280,1998),</B> - cerveaux de patients souffrants de la maladie d'Alzheimer (Takeda A. et al., Acta Neuropathologica, 95, 6 : 555-558, 1998).

Ces immunomarquages n'ont pas été quantifiés (Nishino T., 1995 ; Takeda A., 1998) ou ont été estimés avec une échelle arbitraire (Yoshida S., 1998).

Très récemment, une étude immunohistochimique été réalisée sur la peau avec un anticorps polyclonal (6D12) reconnaissant la carboxyméthyl- lysine, un produit avancé de la glycation. L'immunomarquage ' ' estimé avec une échelle arbitraire (Mizatari K., J. Invest. Dermatol., 108 : - , 1997).

Toutefois, les méthodes biochimiques et Elisa précédemment citées ne permettent pas l'étude et le suivi in situ, du vieillissement des protéines, et plus particulièrement le phénomène de glycation dans la peau et ses annexes.

En outre, les méthodes immunohistochimiques surtout été utilisées pour l'étude des AGE dans des tissus non cutanés - lésions rénales chez le diabétique (Nishino T., 1995), - lésions cardiaques chez les dialysés (Yoshida S., 1998) - lésions cérébrales chez des patients atteints la maladie d'Alzheimer (Takeda A., l998).

plus, dans l'étude immunohistochimique réalisée la peau avec un anticorps polyclonal reconnaissant un produit avancé de glycation, l'immunomarquage a été estimé uniquement par une échelle arbitraire (Mizatari K., l997).

la validation de substances actives anti-vieillissement passe par l'utilisation de tests fiables et quantifiables, simulant le vieillissement in vivo des protéines.

Il existe donc actuellement le besoin de fournir un procédé d'évaluation de suivi du vieillissement tissulaire fiable, ne se limitant pas à la mise en oeuvre d'extraits des tissus à étudier et fournissant des renseignements globaux, tout en ne nécessitant pas le recours à des sujets d'expérimentation vivants.

présente invention a notamment pour but de répondre à ce besoin. En outre, le procédé à fournir doit également permettre de révéler, in situ, de suivre et de quantifier aisément le phénomène à étudier.

A cet effet, la présente invention a pour objet un procédé d'évaluation et de suivi du vieillissement tissulaire, en particulier pour les tissus cutanés et les phanères, notamment la matrice extracellulaire du derme, caractérisé en ce qu'il consiste à créer préalablement un modèle expérimental évolutif de simulation tissu à étudier, puis à soumettre ce modèle, de manière controlée, à l'action de facteurs et/ou d'agents induisant un phénomène de vieillissement tissulaire, notamment la glycation des protéines et, ensuite, à localiser et à quantifier effets dudit vieillissement induit sur la base d'images du modèle ou d'au moins une partie du modèle après marquage d'au moins certains produits résultant dudit vieillissement.

Conformément à un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé précité consiste plus précisément à réaliser un modèle expérimental reproduisant, ex vivo, le vieillissement tissulaire du tissu à étudier, à induire une glycation non enzymatique des protéines dans ce modèle au moins par incubation en présence d'au moins un sucre réducteur avec des paramètres d'induction contrôlés, ' révéler ensuite in situ le phénomène de glycation, préférentiellement sur des échantillons prélevés sur le modèle, par immunohistochimie au moyen d'un anticorps dirigé spécifiquement contre les produits avancés de la glycation induite, à localiser et à quantifier le phénomène de glycation, éventuellement à différents stades d'incubation du modèle, par analyse d'images visualisant l'immunomarquage révélant les produits avancés de la glycation et, éventuellement, à comparer les résultats obtenus avec ceux obtenus, dans des conditions similaires, sans induction provoquée de glycation ou avec induction de glycation avec des paramètres et/ou facteurs d'induction modifiés ou additionnels.

Le modèle expérimental peut être constitué de ou réalisé à partir de tissus choisis dans le groupe formé par la peau humaine, le cuir chevelu, les équivalents de peau humaine, les dermes desépidermisés, les dermes morts, les dermes reconstruits, les peaux reconstruites, les lattices de collagène et les dermes artificiels.

Toutefois, selon une variante de réalisation préférentielle, le modèle est réalisé a partir de dermes morts désépidermisés.

La phase d'incubation du modèle expérimental, préférentiellement formé à partir de biopsies dévitalisées et désépidermisées, est réalisee par trempage dans une solution saline tamponnée, sucrée par addition contrôlée de glucose ou d'un composé aldéhydique réducteur analogue, à une température, constante ou variable au cours de l'incubation, comprise entre 20 C et C, préférentiellement entre 37 C et 45 C.

Compte tenu de l'influence de certains agents physico-chimiques sur le vieillissement des protéines du derme de sujets humains, et pour lesquels y a donc lieu de simuler les actions pour obtenir des résultats de tests correspondant le plus possible à la réalité en termes d'exposition des tissus étudiés, le procédé selon l'invention peut mettre en oeuvre des facteurs d'induction additionnels, dont l'intensité est réglable ou au moins prédéterminée, et qui peuvent être choisis dans le groupe formé par un rayonnement UV-A, un rayonnement UV-B, un rayonnement constitué par un mélange de radiations UV-A et UV-B, un rayonnement solaire artificiel, un agent ou un mélange d'agents polluants solide, liquide ou gazeux et des agents d'agression induisant un phénomène stress.

A titre d'exemple général non limitatif, illustrant le déroulement du procédé selon l'invention, on décrira ci-après ses principales phases opératoires. procédé se déroule en trois phases successives : préparation des tissus, 2) induction de la glycation, 3) révélation et quantification des produits de la glycation.

La première phase concerne la préparation de tissus selon la technique de Prunieras et Regnier (Journal of Investigative Dermatology, 81 : 28s- 33s, 1983), qui généralement utilisée en vue d'obtenir des peaux reconstruites.

Préférentiellement, notre modèle utilisera des dermes morts désépidermisés préparés comme suit à partir de peau humaine peau humaine est dégraissée, aseptisée (elle pourra ' besoin être conservée congélation à - 70 C), de petites biopsies de quelques millimètres à quelques centimètres de côté sont réalisées à l'aide d'un scalpel (préférentiellement la taille biopsies sera de 0,5 à 1,5 centimètre de côté), ces biopsies sont dévitalisées par 2 à 15 cycles de congélation décongélation, préférentiellement de 5 à 10 cycles, correspondant à trempages rapides successifs dans l'azote liquide puis dans un bain-marie réglé à 37 C, les biopsies dévitalisées sont ensuite désépidermisées par grattage ou à l'aide de pinces fines, et, les dermes morts ainsi obtenus sont aseptisés par trempage durant 2 à 72 heures une solution d'antibiotiques.

Les antibiotiques pourront être choisis parmi ceux couramment employés en culture cellulaire par l'homme du métier<B>:</B> streptomycine, pénicilline, gentamycine, néomycine ou fungizone, par exemple.

La deuxième phase correspond à l'induction de la glycation dans les tissus.

L'induction de la glycation passe par une incubation des tissus, préférentiellement des dermes morts désépidermisés, dans une solution saline tamponnée sucrée, préférentiellement par du glucose ou tout autre composé aldéhydique réducteur. Le glucose est utilisé à la concentration de 0,1 à %, plus particulièrement de 0,3 à 3 % (en poids par rapport à la solution tampon).

Des antibiotiques choisis parmi ceux couramment employés en culture cellulaire (streptomycine, pénicilline, gentamycine, néomycine, fungizone, par exemple) et des antiprotéases choisis parmi les produits connus de l'homme du métier (aprotinine, EDTA, cystéine, ortho-phénanthroline, alpha-2- macroglobuline, alpha- 1-antitrypsine, par exemple) pourront être avantageusement ajoutés à la solution d'incubation.

L'homme du métier saura adapter leur concentration en fonction de la nature des tissus incubés (peaux humaines, équivalents de peaux, dermes désépidermisés, dermes morts, dermes reconstruits, peaux reconstruites lattices de collagène ou dermes artificiels, par exemple), de leur taille et de la durée d'incubation désirée.

Les dermes morts desépidermisés sont incubés dans la solution précitée durant 7 à 21 jours, en fonction du degré de glycation désiré, à une température constante ou variable comprise entre 20 et 45 C.

L'homme du métier pourra bien entendu adapter la température d'incubation, en accord avec la taille et la nature des tissus incubes, afin de garantir une bonne conservation des tissus.

Les tissus pourront également être irradiés avant ou cours de l'incubation par des UV-A, des UV-B, un mélange des deux ou un simulateur solaire par exemple.

A la fin de l'incubation dans le milieu sucré, les tissus glyqués sont immediatement congelés dans l'azote liquide.

3) La troisième phase correspond à la révélation et à la quantification des produits de glycation.

Pour révéler, suivre et quantifier la glycation au sein des tissus, les inventeurs ont développé spécifiquement une phase opératoire particulière comprenant une technique immunohistochimique couplée à de l'analyse d'images.

Des anticorps anti-AGE ont déjà été développés par la société Alteon Inc. (voir notamment demande de brevet PCT n WO 96/20958). Ils ont été produits par hybridomes et dénommés 4G9, 2G6, BH4, et permettent de détecter les dans des échantillons biologiques. De préférence, les inventeurs ont utilisé l'anticorps monoclonal 4G9.

Des coupes cryostat de 5 à 20 #tm d'épaisseur, de préférence de 8 à 15 d'épaisseur, sont réalisées et fixées avec un fixateur approprié, de préférence l'acétone. technique immunohistochimique mise en oeuvre est une technique classique, à savoir incubation dans l'anticorps primaire anti-AGE, dilué entre<B>115</B> et 1/l000, de préférence entre 1/50 et 1/200, pendant 16 à 20 heures à 4 C (l'homme du métier saura adapter la dilution en fonction de la durée d'incubation), amplification à la biotine avec révélation par de streptavidine couplée à la fluorescéine, contre-coloration pendant 10 minutes par le bleu Evans.

anticorps anti-AGE révèlent uniquement les produits finaux de la glycation et permettent leur localisation précise, in situ.

L'immunomarquage est observé et iconographié microscope confocal à balayage laser à raison de plusieurs images par condition.

Ces images sont ensuite transférées dans un analyseur d'images, où elles sont positionnées de telle sorte que la limite correspondant la jonction dermo-épidermique apparaisse en haut de l'écran.

Un masque délimitant une zone de mesure est tracé dans le derme à partir de la jonction dermo-épidermique et le pourcentage d'occupation de l'immunomarquage révélant les AGE est quantifié au sein de ce masque.

Ainsi, le modèle selon l'invention permet de reproduire ex vivo le phénomène de glycation, de le suivre et de le quantifier. Il permet également de tester des substances ou des molécules visant à prévenir le vieillissement des protéines, et plus particulièrement la glycation, de visualiser in situ leur action et de quantifier leur effet.

Afin que la simulation mettant en oeuvre le modèle selon l'invention reproduise le plus fidèlement possible les réactions des tissus vivants correspondant, exposés aux agressions habituelles, il peut être prévu que les paramètres et facteurs influençant le vieillissement tissulaire, notamment le phénomène de glycation, soient réglés en fonction de résultats d'études préalables correspondantes effectuées in vivo et in situ sur des tissus similaires à ceux ayant servi à l'élaboration du modèle expérimental.

En vue d'illustrer davantage l'intérêt du procédé selon l'invention, on décrira ci-après, de manière non limitative, différents exemples de mise en oeuvre pratique dudit procédé.

<U>Exemple 1</U> : Mise en oeuvre d'un modèle avec induction, révélation et quantification de la glycation sur derme humain mort.

On réalise successivement les opérations a), b), c) et d) suivantes a) obtention de dermes morts (d'après la technique de Prunieras et Regnier) - 'lèvement de peau humaine (abdomen d'une femme âgée 27 ans) en provenance d'opération chirurgicale, le prélèvement étant dégraissé, aseptisé puis congelé et conservé à - 70 C.

- Réalisation, à l'aide d'un scalpel, de petites biopsies de 1 cm côté.

- Dévitalisation de ces biopsies par plusieurs cycles de congélation décongélation obtenus par trempages rapides successifs dans l'azote liquide dans un bain-marie à 37 C.

- Les biopsies dévitalisées sont ensuite désépidermisées par grattage ou à l'aide de pinces fines.

- Les dermes morts ainsi obtenus sont aseptisés par trempage durant 2 à 72 heures dans une solution d'antibiotiques.

Les antibiotiques pourront être choisis parmi ceux couramment employés en culture cellulaire par l'homme de l'art : streptomycine, pénicilline, gentamycine, néomycine, fungizone, par exemple.

b) Incubation en présence de glucose - Les dermes morts sont incubés dans 4 ml d'une solution saline tamponnée, du PBS par exemple.

Dans cette solution sont ajoutés du glucose, à la concentration comprise entre 0,1 % et 10 %, de préférence de 0,3 à 3 % et des antibiotiques choisis parmi ceux couramment employés en culture cellulaire et connus de l'homme du métier.

- Les dermes morts sont incubés dans cette solution durant 14 à 21 jours à une température constante comprise entre 20 et 45 C.

Mise en évidence des AGE par immunohistochimie - Réalisation de biopsies au centre de la culture.

- Congélation immédiate dans l'azote liquide.

- Réalisation de coupes cryostat de 5 à 20 p.m d'épaisseur, de préférence entre 8 et 15 qm.

- Traitement des coupes avec un fixateur approprié, de préférence l'acétone.

- Mise en évidence de produits avancés de la glycation, par immunohistochimie. Incubation avec l'anticorps primaire monoclonal (Société Alteon Inc.), dilué entre 1/50 et 1/200, pendant 16 à 20 heures à 4 (l'homme du métier saura adapter la dilution en fonction de la durée d'incubation).

Amplification classique à la biotine avec révélation par de la streptavidine couplée à la fluorescéine.

- Contre-coloration au bleu Evans.

- Observation au microscope confocal à balayage laser. Quantification de l'immunomarquage Réalisation de quatre images en microscopie confocale par condition.

Les images sont ensuite transférées dans un analyseur d'images, où elles sont placées de telle sorte que la limite correspondant à la jonction dermo- épidermique apparaisse en haut de l'écran.

Un masque délimitant une zone de mesure est tracé dans le derme à partir de la jonction dermo-épidermique.

- Evaluation à l'analyseur d'images du pourcentage d'occupation de l'immunomarquage révélant les AGE au sein du masque de mesure dermique. Pour chaque condition, le pourcentage d'occupation dermique correspond à moyenne des quatre valeurs.

La figure 1 des dessins annexés représente, sous forme d'histogramme, les résultats de l'évaluation précitée, à savoir la mesure quantitative de la glycation dans un modèle de derme humain mort, par une technique immunohistochimique couplée à l'analyse d'image décrite ci-dessus (Statistiques : Moyenne de 4 valeurs +/- SEM ; U de Mann et Whitney ; * = p < 0,05).

En l'absence de glucose (= témoin), il n'y a quasiment pas de glycation (0,24 % d'occupation par les AGE) dans le derme.

Par contre, l'incubation des dermes pendant 21 jours en présence de glucose, induit une apparition, hautement significative, de produits avancés de la glycation par rapport au témoin incubé sans glucose.

Ce marquage AGE augmente significativement en fonction de l'augmentation du temps de contact avec le glucose : il est de 17,64 % à 14 jours et de 56,69 % à 21 jours.

<U>Exemple 2</U> : Evaluation de l'effet anti-glycation de l'aminoguanidine (Utilisation du modèle pour tester, ex vivo, l'effet anti-glycation de l'aminoguanidine). L'aminoguanidine est reconnue, par l'homme du métier, pour son action -glycation.

On réalise successivement les opérations suivantes - Prélèvement de peau humaine (abdomen d'une femme âgée de 31 provenance d'opération chirurgicale.

- Réalisation de dermes morts suivant la technique présentée dans l'exemple 1.

- Les dermes morts sont incubés dans du PBS en présence de glucose, d'antibiotiques (suivant la technique présentée dans l'exemple 1) et d'aminoguanidine à 0,01 %.

- Réalisation d'un témoin négatif sans glucose et sans actif, et d'un témoin positif avec du glucose seul.

- Mise en évidence par immunohistochimie et quantification des AGE suivant la technique présentée dans l'exemple 1.

La figure 2 des dessins annexés représente, sous forme d'un histogramme, l'ampleur du phénomène de glycation dans le modèle expérimental selon conditions d'incubation et met en évidence l'effet anti glycation de l'aminoguanidine (Statistiques : Moyenne de 4 valeurs +/- SEM ; de Mann et Whitney<B>;</B> * = p < 0,05).

En l'absence de glucose (= témoin), il n'y a quasiment pas de glycation (0,15 % d'occupation par les AGE) dans les dermes.

On a également démontré que les actifs utilisés seuls n'entraînent pas de glycation des protéines (résultat non présentés dans la figure 2).

Par contre, l'incubation de dermes pendant 21 jours, en présence de glucose, induit une apparition, hautement significative, de produits avancés de la glycation (l4,02 % d'occupation par l'immunomarquage AGE) par rapport au témoin incubé sans glucose (0,15 % d'occupation par les AGE).

Dans les dermes incubés pendant 21 jours dans du glucose en présence d'aminoguanidine à 0,01 %, l'immunomarquage révélant la présence des AGE est significativement réduit (l0,86 %) par rapport au derme incubé dans le glucose seul.

Le modèle, ex vivo, selon l'invention avec induction d'un vieillissement accéléré des protéines, permet de tester des actifs anti-glycation en visualisant in situ leur action et en quantifiant leur effet.

<U>Exemple 3</U> : Effet d'une irradiation de type solaire la glycation (Utilisation du modèle pour tester les effets d'une irradiation de solaire sur la glycation). On réalise successivement les opérations suivantes - Prélèvement de peau humaine (sein d'une femme âgée de 35 ans) en provenance d'opération chirurgicale.

- Réalisation de dermes morts suivant la technique présentée dans l'exemple 1.

- Les dermes morts sont incubés dans du PBS en présence de glucose, d'antibiotiques (suivant la technique présentée dans l'exemple 1).

Les dermes morts sont irradiés trois jours de suite par un simulateur solaire (UV = 7,6 J/cm2 et UV-B = 432 mJ/cm2).

Mise en évidence par immunohistochimie et quantification des AGE suivant technique présentée dans l'exemple 1.

figure 3 des dessins annexés représente, sous la forme d'un histogramme, l'ampleur du phénomène de glycation dans le modèle expérimental selon les conditions d'incubation et d'irradiation (Statistiques : Moyenne de 4 valeurs +/- ; U de Mann et Whitney; * = p < 0,05).

En l'absence de glucose (= témoin), il n'y a quasiment de glycation dans les dermes (0, 4 % d'occupation par l'immunomarquage AGE).

Par contre, l'incubation des dermes morts pendant 21 jours, en présence de glucose, induit une apparition significative de produits avancés la glycation (31,78 % d'occupation par l'immunomarquage AGE) par rapport au témoin incubé sans glucose.

Dans les dermes incubés pendant 21 jours en présence de glucose et irradiés, l'immunomarquage révélant la présence des AGE est significativement augmenté (55,71 % d'occupation par fimmunomarquage AGE) par rapport au derme incubé dans le glucose sans irradiation.

L'irradiation UV potentialise le phénomène de glycation.

Ainsi, le modèle expérimental décrit ci-dessus peut, dans le cadre du procédé selon l'invention, notamment être utilisé pour - l'étude du vieillissement intrinsèque et/ou actinique des protéines, visualiser, évaluer et quantifier l'action de molécules de substances actives visant à prévenir le vieillissement des protéines et plus particulièrement leur glycation dans les tissus cutanés, visualiser, évaluer et quantifier l'action de molécules ou de substances visant à prévenir la glycation au niveau du cuir chevelu.

- tester des molécules ou des substances luttant contre le vieillissement du cuir chevelu, plus particulièrement contre l'alopécie.

Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation décrit. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention.

Claims (12)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'évaluation et de suivi du vieillissement tissulaire en particulier pour les tissus cutanés et les phanères, notamment la matrice extracellulaire du derme, caractérisé en ce qu'il consiste à créer préalablement un modèle expérimental évolutif de simulation du tissu à étudier, puis à soumettre ce modèle, de manière contrôlée, à l'action de facteurs et/ou d'agents induisant un phénomène de vieillissement tissulaire, notamment la glycation des protéines et, ensuite, à localiser et à quantifier les effets dudit vieillissement induit sur la base d'images du modèle ou d'au moins une partie du modèle après marquage moins certains produits résultant dudit vieillissement.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste réaliser un modèle expérimental reproduisant, ex vivo, le vieillissement tissulaire du tissu à étudier, à induire une glycation non enzymatique des protéines dans ce modèle au moins par incubation en présence d'au moins un sucre réducteur avec des paramètres d'induction contrôlés, à révéler ensuite in situ le phénomène de glycation, préférentiellement sur des échantillons prélevés sur le modèle, par immunohistochimie au moyen d'un anticorps dirigé spécifiquement contre les produits avancés de la glycation induite, à localiser et à quantifier le phénomène de glycation, éventuellement à différents stades d'incubation du modèle, par analyse d'images visualisant l'immunomarquage révélant les produits avancés de glycation et, éventuellement, à comparer les résultats obtenus avec ceux obtenus, dans des conditions similaires, sans induction provoquée de glycation ou avec induction de glycation avec des paramètres et/ou facteurs d'induction modifiés ou additionnels.

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le modèle est constitué de ou réalisé à partir de tissus choisis le groupe formé par la peau humaine, le cuir chevelu, les équivalents de peau humaine, les dermes desépidermisés, les dermes morts, les dermes reconstruits les peaux reconstruites, les lattices de collagène et les dermes artificiels.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le modèle est réalisé à partir de dermes morts désépidermisés.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 4, caractérisé en ce que l'incubation est réalisée à une température, constante ou variable au cours de l'incubation, comprise entre 20 C et 56 C, préférentiellement entre 37 C et 45 C.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications à 5, caractérisé en ce que l'incubation du modèle expérimental, préférentiellement formé à partir de biopsies dévitalisées et désépidermisées, est réalisée par trempage dans une solution saline tamponnée, sucrée par addition controlée de glucose ou d'un composé aldéhydique réducteur analogue.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que les facteurs d'induction additionnels, dont l'intensité est reglable ou au moins prédéterminée, sont choisis dans le groupe formé par un rayonnement UV-A, un rayonnement UV-B, un rayonnement constitué par un 'lange de radiations UV-A et UV-B, un rayonnement solaire artificiel, un agent ou un mélange d'agents polluants solide, liquide ou gazeux et des agents d'agression induisant un phénomène de stress.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les paramètres et facteurs influençant le vieillissement tissulaire, notamment le phénomène de glycation, sont réglés en fonction de résultats d'études préalables correspondantes effectuées in vivo et in situ sur des tissus similaires à ceux ayant servi à l'élaboration du modèle expérimental.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le modèle expérimental est utilisé pour l'étude du vieillissement intrinsèque et/ou actinique des protéines.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications à 8, caractérisé en ce que le modèle expérimental est utilisé pour visualiser, évaluer et quantifier l'action de molécules et de substances actives visant à prévenir le vieillissement des protéines et plus particulièrement leur glycation dans tissus cutanés.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le modèle expérimental est utilisé pour visualiser, évaluer et quantifier l'action de molécules ou de substances visant à prévenir la glycation au niveau du cuir chevelu.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le modèle expérimental est utilisé pour tester des molécules ou des substances luttant contre le vieillissement du cuir chevelu, plus particulièrement contre l'alopécie.