FR2792638A1 - New peptide fragments of vasostatin I, useful as antimycotic agents, effective against filamentous fungi and yeasts, are not hemolytic - Google Patents
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Abstract
Description
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La présente invention se rapporte à des peptides dérivés de la vasostatine I et à leur utilisation comme antifongiques. The present invention relates to peptides derived from vasostatin I and to their use as antifungals.
La vasostatine I est un peptide naturel dérivé de la chromogranine A (CGA), laquelle appartient à la famille des glycophosphoprotéines sécrétoires acides, protéines largement exprimées dans de nombreuses cellules endocrines, neuroendocrines et dans les neurones (Simon, J. P. et al. (1989) Biochem. J 262,1-13, Helle, K. B. (1990) Neurochem. Int. 17,165-175, Huttner, W. B. et al. (1991) Trends Biochem. Sci. 16,27-30, Winkler, H. et al. (1992) Neuroscience 49,497-528). Les chromogranines, notamment les chromogranines A et B, sont considérées comme des précurseurs qui sont dégradés en peptides à l'intérieur des granules de sécrétion des cellules chromaffines de la médullo-surrénale (Simon, J. P. et al. (1989) déjà cité ; Dillen, L. et al. (1993) Neurochem. Int. 22, 315-352 ; Metz-Boutigue, M. H. et al. Vasostatin I is a natural peptide derived from chromogranin A (CGA), which belongs to the family of acid secretory glycophosphoproteins, proteins widely expressed in many endocrine, neuroendocrine cells and in neurons (Simon, JP et al. (1989) Biochem, J 262,1-13, Helle, KB (1990) Neurochem, Int. 17,165-175, Huttner, WB et al. (1991) Trends Biochem. Sci. 16,27-30, Winkler, H. et al. (1992) Neuroscience 49, 497-528). Chromogranins, in particular chromogranins A and B, are considered to be precursors which are degraded into peptides inside the secretion granules of the chromaffin cells of the adrenal medulla (Simon, JP et al. (1989) already cited; Dillen , L. et al. (1993) Neurochem, Int. 22, 315-352; Metz-Boutigue, MH et al.
(1993) Eur. J Biochem. 217,247-257 ; Strub J. M. et al. (1995) Eur. J. Biochem. 229, 356-368 ; Soszynski, D. et al. (1993) J Neuroendocrinol. 5, 655-662). (1993) Eur. J Biochem. 217,247-257; Strub J. M. et al. (1995) Eur. J. Biochem. 229, 356-368; Soszynski, D. et al. (1993) J Neuroendocrinol. 5, 655-662).
La vasostatine I, hautement conservée pendant l'évolution, est composée de 76 résidus qui correspondent au fragment N-terminal de la CGA et présente un pont disulfure entre les cystéines C17 et C38. Ce fragment correspond à CGA1-76 (SEQ ID N 1 à SEQ ID N 4). Vasostatin I, highly conserved during evolution, is composed of 76 residues which correspond to the N-terminal fragment of CGA and presents a disulfide bridge between the cysteines C17 and C38. This fragment corresponds to CGA1-76 (SEQ ID N 1 to SEQ ID N 4).
CGA1-76 présente une grande stabilité face aux enzymes protéolytiques de la matrice intragranulaire comme par exemple les pro-hormone convertases, la trypsine et les carboxypeptidases. CGA1-76 has great stability against proteolytic enzymes of the intragranular matrix such as, for example, pro-hormone convertases, trypsin and carboxypeptidases.
Elle est essentiellement localisée dans la matrice des granules de sécrétion des cellules chromaffines de la médullo-surrénale et libérée avec les catécholamines dans le milieu extracellulaire après stimulation (Metz-Boutigue, M. H., et al. (1993) déjà cité ; Helle, K. B,. et al. (1993) J. Neuroendocrinol. 5, 413-420). Elle est également libérée par les terminaisons nerveuses en réponse à une stimulation (Liang, F., et al. (1995) Acta Physiol. Scand. 155,23-30), ce qui suggère que la vasostatine I pourrait jouer un rôle important in vivo. It is essentially localized in the matrix of secretion granules of the chromaffin cells of the adrenal medulla and released with catecholamines in the extracellular medium after stimulation (Metz-Boutigue, MH, et al. (1993) already cited; Helle, K. B ,. et al. (1993) J. Neuroendocrinol. 5, 413-420). It is also released from nerve endings in response to stimulation (Liang, F., et al. (1995) Acta Physiol. Scand. 155,23-30), suggesting that vasostatin I may play an important role in vivo.
Dès 1992 il a été établi que la vasostatine I exerce un effet relaxant sur la veine saphène humaine en inhibant la vasoconstriction induite par l'endothéline-1 (Aardal, S. et al. (1992) Regul. Pept. 41,9-18 ; Aardal, S. et al. (1993) J Neuroendocrinol. 5, 405-412). As early as 1992, it was established that vasostatin I exerts a relaxing effect on the saphenous vein by inhibiting endothelin-1-induced vasoconstriction (Aardal, S. et al. (1992) Regul. Pept. 41,9-18 ; Aardal, S. et al. (1993) J Neuroendocrinol. 5, 405-412).
Différentes études ont ensuite montré que la vasostatine I possède d'autres activités biologiques ; ainsi elle est capable d'inhiber la sécrétion de l'hormone parathyroïdienne (Russel, J., et al. (1994) Endocrinology 133,337-342), de réguler l'adhésion des cellules (Gasparri, A., et al. (1997) J. Biol. Chem. 272,20835- Different studies have then shown that vasostatin I has other biological activities; thus it is able to inhibit the secretion of the parathyroid hormone (Russel, J., et al. (1994) Endocrinology 133,337-342), to regulate the adhesion of cells (Gasparri, A., et al. (1997 ) J. Biol. Chem. 272.20835-
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20843) et d'induire la neurotoxicité observée dans les cocultures de neurones et de cellules microgliales (Ciesielski-Treska, J. et al. (1998) J Biol. Chem. 273,14339- 14346). 20843) and to induce the neurotoxicity observed in the cocultures of neurons and microglial cells (Ciesielski-Treska, J. et al. (1998) J Biol. Chem. 273, 14339-14346).
Plus récemment, les Inventeurs ont montré que la vasostatine 1 et d'autres peptides naturels dérivés des chromogranines A et B, qui sont libérés pendant la sécrétion, possèdent une puissante activité antibactérienne vis-à-vis de bactéries à Gram-positif et à Gram-négatif (Strub, J. M., et al. (1995) Eur. J Biochem. 229,356- 368 ; Strub, J. M., et al. (1996) FEBS Lett. 379,273-278 ; Strub, J. M., et al. (1996) J Biol. Chem. 271, 28533-28540 ; Goumon, Y., et al. (1996) Eur. J Biochem. 235, 516-525 ; Metz-Boutigue, M. H., et al. (1998) Cell. Mol. Neurobiol. 18, 249-266). More recently, the inventors have shown that vasostatin 1 and other natural peptides derived from chromogranins A and B, which are released during secretion, have a potent antibacterial activity against Gram-positive and Gram bacteria. -negative (Strub, JM, et al. (1995) Eur. J Biochem. 229,356-368; Strub, JM, et al. (1996) FEBS Lett. 379,273-278; Strub, JM, et al. (1996) J Biol. Chem. 271, 28533-28540; Goumon, Y., et al. (1996) Eur. J Biochem. 235, 516-525; Metz-Boutigue, MH, et al. (1998) Cell. Mol. Neurobiol. 18, 249-266).
Les mycoses représentent encore à l'heure actuelle une cause importante de morbidité et de mortalité chez l'homme et chez l'animal, malgré la présence dans leur organisme de substances naturelles capables de développer des mécanismes de défense et malgré l'existence de nombreuses substances synthétiques à activité antifongique. Mycoses are still an important cause of morbidity and mortality in humans and animals, despite the presence in their bodies of natural substances capable of developing defense mechanisms and despite the existence of numerous synthetic substances with antifungal activity.
L'incidence des infections fongiques a connu une nette progression au cours de ces dernières années, d'une part par l'augmentation des localisations mycosiques profondes viscérales et septicémiques et d'autre part par l'importation fréquente de mycoses viscérales exotiques. The incidence of fungal infections has increased sharply in recent years, on the one hand by the increase in deep visceral and septicemic mycotic locations and on the other hand by the frequent import of exotic visceral mycoses.
Les premières sont dues à des champignons très répandus dans la nature, habituellement saprophytes, ne devenant pathogènes que dans certaines conditions : usage croissant des antibiotiques à large spectre, corticothérapie, chimiothérapie, thérapeutiques immunosuppressives, patients atteints du SIDA, greffes et abords cardiovasculaires ; on parle de mycoses iatrogènes. Elles sont causées par des champignons opportunistes qui sont soit levuriformes (Candida, Cryptococcus, Torulopsis), soit filamenteux (Aspergillus, Cephalosporum, Mucor). The first are due to fungi very widespread in nature, usually saprophytic, becoming pathogenic only under certain conditions: increasing use of broad spectrum antibiotics, corticotherapy, chemotherapy, immunosuppressive therapies, AIDS patients, grafts and cardiovascular approaches; we are talking about iatrogenic mycoses. They are caused by opportunistic fungi which are either yeast-like (Candida, Cryptococcus, Torulopsis) or filamentous (Aspergillus, Cephalosporum, Mucor).
Les secondes sont dues à des champignons pathogènes se développant dans des pays chauds et qui sont importés à la faveur du tourisme et des brassages de populations. Ces mycoses exotiques sont l'histoplasmose, la coccidioïdomycose, les blastomycoses et les mycétomes. The second are due to pathogenic fungi growing in hot countries and which are imported through tourism and the mixing of populations. These exotic mycoses are histoplasmosis, coccidioidomycosis, blastomycosis and mycetomas.
Si le traitement des mycoses superficielles cutanées ou touchant les muqueuses ne présente pas de réelles difficultés, il en est tout autrement des mycoses profondes ; celles-ci présentent toujours un caractère de gravité et sont rapidement évolutives car elles surviennent sur un terrain affaibli ou immunodéprimé. If the treatment of superficial mycoses cutaneous or touching the mucous membranes does not present real difficulties, it is quite different from the deep mycoses; these always have a serious nature and are rapidly evolving because they occur on weakened or immunocompromised terrain.
De plus chez les patients immunodéficients, on constate souvent soit un échec du traitement antifongique, soit l'apparition de souches résistantes aux In addition, in immunodeficient patients, there is often either a failure of antifungal treatment or the appearance of strains resistant to
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différents antifongiques utilisés, notamment Candida albicans. Ces échecs thérapeutiques ont donné récemment un regain d'intérêt à la recherche dans le domaine des antifongiques. different antifungals used, including Candida albicans. These therapeutic failures have recently given renewed interest to research in the field of antifungals.
De nombreux peptides naturels antifongiques ont été décrits dans les plantes (Tailor R .H. et al. (1997), J. Biol. Chem., 272,24480-24487), les insectes (notamment les cécropines, Boman H. G. et al. (1972) Nature, 237,232-235 ; Boman H. G. et al. (1994) in Phylogenetic perspectives in immunity : the insect host defense Hoffmann J. A., Janeway C.A., Natori S. Eds., 3-17, R. G. Landes Company, Austin) et les invertébrés (WO 98/07440). Many natural antifungal peptides have been described in plants (Tailor R .H. Et al. (1997), J. Biol. Chem., 272,24480-24487), insects (especially cecropins, Boman HG et al. (1972) Nature, 237, 232-235; Boman HG et al. (1994) in Phylogenetic perspectives in immunity: the insect host defense Hoffmann JA, Janeway CA, Natori S. Eds., 3-17, RG Landes Company, Austin) and invertebrates (WO 98/07440).
Le développement d'antifongiques se heurtent à trois obstacles : - une faible activité in vivo au regard de l'activité in vitro, - une mauvaise diffusion à travers la paroi des champignons qui est composée de chitine, de phospholipides et de stérols ; ces constituants, absents de la paroi des bactéries, expliquent pourquoi la plupart des antibactériens ne sont pas des antifongiques ; en effet, pour pouvoir pénétrer dans la membrane, les antifongiques doivent présenter une forte hydrophobie et - une toxicité importante, obstacles qui rendent nécessaire le développement de nouveaux peptides antifongiques qui soient actifs in vivo, aptes à agir efficacement sur les cellules et peu toxiques. The development of antifungal agents comes up against three obstacles: - weak activity in vivo with regard to activity in vitro, - poor diffusion through the wall of fungi which is composed of chitin, phospholipids and sterols; these constituents, absent from the wall of bacteria, explain why most antibacterials are not antifungals; in fact, in order to be able to penetrate the membrane, the antifungals must have a high hydrophobicity and - significant toxicity, obstacles which make it necessary to develop new antifungal peptides which are active in vivo, capable of acting effectively on the cells and little toxic.
Or les Inventeurs ont montré de manière surprenante que la vasostatine I et des peptides dérivés de la vasostatine I présentent une activité antifongique remarquable, en l'absence d'activité lytique sur les érythrocytes. The inventors have surprisingly shown that vasostatin I and peptides derived from vasostatin I exhibit remarkable antifungal activity, in the absence of lytic activity on erythrocytes.
Aussi les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à des peptides antifongiques qui soient actifs in vivo, aptes à agir efficacement sur les cellules et peu toxiques. The inventors have therefore set themselves the goal of providing antifungal peptides which are active in vivo, capable of acting effectively on cells and which are not very toxic.
La présente invention concerne des peptides représentant un fragment de la séquence de la vasostatine I et répondant : - soit à la séquence de formule (I) a-(SEQ ID N 14)-b (I) dans laquelle a est soit nul, soit représente la séquence (SEQ ID N 15) de formule
X,LPVNSPMXZKGDTX3VMKCX4EVISDXSLSKPSPMPVSX6ECX,ETLX$GDE où X, est nul ou représente une séquence comprenant de 1 à 10 acides aminés, X2 représente N ou T, X3 représente E ou K, X4 représente IV ou VL, X5 représente T ou S, X6 représente K, P ou Q, X7 représente F ou L, X8 représente R ou Q, et où les deux résidus cystéine (C) sont éventuellement reliés par un pont disulfure, The present invention relates to peptides representing a fragment of the sequence of vasostatin I and corresponding: - either to the sequence of formula (I) a - (SEQ ID N 14) -b (I) in which a is either zero or represents the sequence (SEQ ID N 15) of formula
X, LPVNSPMXZKGDTX3VMKCX4EVISDXSLSKPSPMPVSX6ECX, ETLX $ GDE where X, is zero or represents a sequence comprising from 1 to 10 amino acids, X2 represents N or T, X3 represents E or K, X4 represents IV or VL, X5 represents T or S, X6 represents K, P or Q, X7 represents F or L, X8 represents R or Q, and where the two cysteine residues (C) are optionally linked by a disulfide bridge,
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SEQ ID N 14 représente RX9LSILRHQNLLKE, où X9 représente 1 ou V, et b soit est nul, soit représente la séquence (SEQ ID N 16) de formule
LQDLALQGAKERXIOXI1QQX,Z où X,o représente T, A ou S, XII représente H ou Q et X12 est nul ou représente KK ou polyQ, pourvu que a-(SEQ ID N 14)-b soit différent de SEQ ID N 1, de SEQ ID N 2, de SEQ ID N 3, de SEQ ID N 4 et de SEQ ID N 5, - soit à la séquence de formule (II) : c-(SEQ ID N 17)-d (II) dans laquelle, c soit est nul, soit représente la séquence (SEQ ID N 18) de formule, X,LPVNSPMX2KGDTX3 où X1, X2 et X3sont tels que définis précédemment, SEQ ID N 17 représente VMKCX4EVISDXsLSKPSPMPVSX6ECX7E, où X4, X5, X6 et X7 sont tels que définis précédemment et où les deux résidus cystéine (C) sont éventuellement reliés par un pont disulfure, et d est soit nul, soit représente la SEQ ID N 19 de formule
TLXgGDELSILRHQNLLKELQDLALQGAKERXIOXIQQX1z où Xg, X9, XIO, XII et X12 sont tels que définis précédemment, pourvu que c-(SEQ ID N 17) -d soit différent de SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 et SEQ ED N 6, ainsi que leurs équivalents fonctionnels. SEQ ID N 14 represents RX9LSILRHQNLLKE, where X9 represents 1 or V, and b either is zero or represents the sequence (SEQ ID N 16) of formula
LQDLALQGAKERXIOXI1QQX, Z where X, o represents T, A or S, XII represents H or Q and X12 is zero or represents KK or polyQ, provided that a- (SEQ ID N 14) -b is different from SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 and SEQ ID N 5, - either to the sequence of formula (II): c- (SEQ ID N 17) -d (II) in which, c is either zero or represents the sequence (SEQ ID N 18) of formula, X, LPVNSPMX2KGDTX3 where X1, X2 and X3 are as defined above, SEQ ID N 17 represents VMKCX4EVISDXsLSKPSPMPVSX6ECX7E, where X4, X5, X6 and X7 are such defined above and where the two cysteine residues (C) are optionally linked by a disulfide bridge, and d is either zero or represents the SEQ ID N 19 of formula
TLXgGDELSILRHQNLLKELQDLALQGAKERXIOXIQQX1z where Xg, X9, XIO, XII and X12 are as defined above, provided that c- (SEQ ID N 17) -d is different from SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 and SEQ ED N 6, as well as their functional equivalents.
Au sens de la présente invention, on entend par peptides représentant un fragment'de la séquence de la vasostatine I, aussi bien les fragments naturels obtenus par digestion enzymatique ou par coupure chimique de la vasostatine I, que les fragments synthétiques obtenus par les techniques classiques de synthèse peptidique, et notamment par la technique de synthèse en phase solide décrite par Merrifield R. B. For the purposes of the present invention, the term peptides representing a fragment ′ of the sequence of vasostatin I, both the natural fragments obtained by enzymatic digestion or by chemical cleavage of vasostatin I, as well as the synthetic fragments obtained by conventional techniques of peptide synthesis, and in particular by the solid phase synthesis technique described by Merrifield RB
(1963), J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154 ou par des techniques d'ADN recombinant (Corti, A., et al. (1997) Eur. J. Biochem. 248,692-699) ou par combinaison de ces deux types de techniques. (1963), J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154 or by recombinant DNA techniques (Corti, A., et al. (1997) Eur. J. Biochem. 248,692-699) or by a combination of these two types of techniques.
Au sens de la présente invention, on entend par équivalents fonctionnels, des séquences d'aminoacides comprenant des délétions, ou des additions, des modifications ou des substitutions conservatives ou une combinaison de celles-ci, au niveau de un ou plusieurs aminoacides, de manière à ce que la structure tertiaire et l'activité antifongique ne soient pas altérées. For the purposes of the present invention, the term functional equivalents means amino acid sequences comprising deletions, or additions, modifications or conservative substitutions or a combination thereof, at the level of one or more amino acids, so that the tertiary structure and the antifungal activity are not altered.
Les modifications comprennent notamment celles résultant des processus posttraductionnels ou des modifications chimiques réalisées par des The modifications include in particular those resulting from post-translational processes or chemical modifications carried out by
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techniques classiques connues de l'homme du métier (acylation, fixation de lipides, de nucléotides, cyclisation ...). conventional techniques known to those skilled in the art (acylation, fixing of lipids, nucleotides, cyclization, etc.).
Les modifications comprennent également celles résultant d'un couplage des peptides, par des liaisons covalentes, ioniques ou faibles à une molécule susceptible d'augmenter leur affinité pour un type de cellule particulier, notamment des couplages avec des peptides vecteurs. The modifications also include those resulting from coupling of the peptides, by covalent, ionic or weak bonds to a molecule capable of increasing their affinity for a particular cell type, in particular couplings with vector peptides.
Les substitutions conservatives bien connues de l'homme du métier, comprennent notamment la substitution d'un aminoacide par un autre aminoacide ayant même charge (aminoacides acides : Asp et Glu ; aminoacidesbasiques : Lys, Arg et ornithine ; aminoacides polaires neutres : Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, His et Trp), même taille, même caractère hydrophile (aminoacides hydrophobes : Ala, Val, Leu Ile, Pro, Phe et Met), même aromaticité (Phe et Tyr) et/ou même capacité à former des hélices. Conservative substitutions well known to those skilled in the art, include in particular the substitution of an amino acid with another amino acid having the same charge (acid amino acids: Asp and Glu; basic amino acids: Lys, Arg and ornithine; neutral polar amino acids: Gly, Ser , Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, His and Trp), same size, same hydrophilicity (hydrophobic amino acids: Ala, Val, Leu Ile, Pro, Phe and Met), same aromaticity (Phe and Tyr) and / or same ability to form propellers.
Il est bien entendu que les équivalents fonctionnels comprennent également comme aminoacides, ceux qui sont des énantiomères et des diastéréoisomères des aminoacides naturels de conformation D, les aminoacides rares, notamment l'hydroxyproline, la méthyllysine et la diméthyllysine et les aminoacides synthétiques, notamment l'ornithine, la norleucine, la cyclohexylalanine et les omégaaminoacides. Les équivalents fonctionnels recouvrent également les rétropeptides. It is understood that the functional equivalents also include as amino acids, those which are enantiomers and diastereoisomers of natural amino acids of conformation D, rare amino acids, in particular hydroxyproline, methyllysine and dimethyllysine and synthetic amino acids, in particular ornithine, norleucine, cyclohexylalanine and omegaamino acids. Functional equivalents also cover retropeptides.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les peptides de formule (I) et (II) sont constitués par des aminoacides non oxydés. According to a preferred embodiment of the invention, the peptides of formula (I) and (II) consist of non-oxidized amino acids.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, les peptides sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences suivantes : SEQ ID N 7 qui correspond au fragment CGA47-60 d'origine bovine, humaine et porcine, SEQ ID N 8 qui correspond au fragment CGA47-60 de rat , SEQ ID N 9 qui correspond au fragment CGA41-70 d'origine bovine, humaine et porcine, SEQ ID N 10 qui correspond au fragment CGA41-70 de rat, SEQ ID N 11 qui correspond au fragment
CGAI4-4o d'origine bovine, SEQ ID N 12 qui correspond au fragment CGAI4-40 d'origine humaine et porcine, SEQ ID N 13 qui correspond au fragment CGA14-40 de rat. According to another preferred embodiment of the invention, the peptides are selected from the group consisting of the following sequences: SEQ ID N 7 which corresponds to the CGA47-60 fragment of bovine, human and porcine origin, SEQ ID N 8 which corresponds to the CGA47-60 fragment of rat, SEQ ID N 9 which corresponds to the CGA41-70 fragment of bovine, human and porcine origin, SEQ ID N 10 which corresponds to the CGA41-70 fragment of rat, SEQ ID N 11 which corresponds to fragment
CGAI4-4o of bovine origin, SEQ ID N 12 which corresponds to the CGAI4-40 fragment of human and porcine origin, SEQ ID N 13 which corresponds to the CGA14-40 fragment of rat.
La présente invention concerne également l'utilisation des peptides dérivés de la vasostatine I de formules (I) ou (II) comme antifongiques. The present invention also relates to the use of the peptides derived from vasostatin I of formulas (I) or (II) as antifungal agents.
La présente invention concerne également des compositions pharmaceutiques antifongiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un peptide dérivé de la vasostatine I, de formule (I) ou de formule (II), associé à au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. The present invention also relates to antifungal pharmaceutical compositions, characterized in that they comprise at least one peptide derived from vasostatin I, of formula (I) or of formula (II), associated with at least one pharmaceutically acceptable excipient.
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Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les compositions pharmaceutiques selon l'invention comprennent au moins un peptide dont la séquence est choisie dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 11, SEQ ID N 12 et SEQ ID N 13. In a preferred embodiment of the invention, the pharmaceutical compositions according to the invention comprise at least one peptide whose sequence is chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 11, SEQ ID N 12 and SEQ ID N 13.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un peptide dont la séquence est choisie dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6, pour la préparation d'un médicament utile comme antifongique. The present invention also relates to the use of a peptide whose sequence is chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 and SEQ ID N 6, for the preparation of a drug useful as an antifungal.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont adaptées à l'administration systémique, notamment par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale, à l'administration orale notamment sous forme de comprimés, de gélules et de capsules, à l'administration topique, notamment sous forme de gel, de lotion et de crème, à l'administration rectale, notamment sous forme de suppositoires ou de pommade, à l'administration vaginale, notamment sous forme de capsule ou de gelée, à l'administration pulmonaire, notamment sous forme d'aérosol, à l'administration nasale, notamment sous forme de gouttes ou de pommade nasale, à l'administration oculaire, notamment sous forme de collyre ou de pommade ophtalmique et à l'administration buccale, notamment sous forme de bain de bouche ou de pâte dentifrice. The pharmaceutical compositions according to the invention are suitable for systemic administration, in particular by the intravenous, subcutaneous, intramuscular or intraperitoneal route, for oral administration in particular in the form of tablets, capsules and capsules, for topical administration. , especially in the form of a gel, lotion and cream, for rectal administration, especially in the form of suppositories or ointment, for vaginal administration, especially in the form of a capsule or jelly, for pulmonary administration, especially in aerosol form, for nasal administration, especially in the form of drops or nasal ointment, for ocular administration, especially in the form of eye drops or ophthalmic ointment and for oral administration, especially in the form of mouth or toothpaste.
Les peptides selon l'invention, la vasostatine 1 et les peptides de SEQ ID N 5 et de SEQ ID N 6, peuvent être utilisés dans le traitement ou la prévention de maladies causées par différents types de champignons filamenteux, notamment par Neurospora crassa, Aspergillus sp, notamment Aspergillus fumigatus, Alternaria sp, notamment Alternaria brassicola, Trichoderma sp, notamment Trichoderma viride, Nectria haematococca, Fusarium culmorum et Fusarium oxyporum ou par des levures, notamment par Candida sp et par Saccharomyces cerevisiae. The peptides according to the invention, vasostatin 1 and the peptides of SEQ ID N 5 and SEQ ID N 6, can be used in the treatment or prevention of diseases caused by different types of filamentous fungi, in particular by Neurospora crassa, Aspergillus sp, in particular Aspergillus fumigatus, Alternaria sp, in particular Alternaria brassicola, Trichoderma sp, in particular Trichoderma viride, Nectria haematococca, Fusarium culmorum and Fusarium oxyporum or by yeasts, in particular by Candida sp and by Saccharomyces cerevisiae.
Selon un mode préféré d'utilisation selon l'invention, dans le traitement ou la prévention des maladies causées par différents types de champignons filamenteux ou par des levures, on utilisera les peptides de SEQ ID N 1 à 4. According to a preferred mode of use according to the invention, in the treatment or prevention of diseases caused by different types of filamentous fungi or by yeasts, the peptides of SEQ ID N 1 to 4 will be used.
Les peptides selon l'invention, la vasostatine 1 et les peptides de SEQ ID N 5 et de SEQ ID N 6, peuvent être utilisés dans le traitement ou la prévention des mycoses superficielles à localisation cutanée, des mycoses cutanéomuqueuses qu'elles soient cutanées, oropharyngées ou digestives et des mycoses profondes, notamment dans les cas de candidoses disséminées au niveau oculaire, ostéoarticulaire, cardiaque, urinaire, génital, pulmonaire, cérébral ou septicémique, et dans tous les cas de mycoses au niveau oculaire, ostéoarticulaire, cardiaque, urinaire, pulmonaire, The peptides according to the invention, vasostatin 1 and the peptides of SEQ ID N 5 and of SEQ ID N 6, can be used in the treatment or prevention of superficial mycoses with cutaneous localization, of cutaneous-mucous mycoses that they are cutaneous, oropharyngeal or digestive and deep mycoses, in particular in the cases of disseminated candidiasis at the ocular, osteoarticular, cardiac, urinary, genital, pulmonary, cerebral or septicemic level, and in all cases of mycoses at the ocular, osteoarticular, cardiac, urinary level, pulmonary,
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cérébral ou septicémique. cerebral or septicemic.
Les peptides selon l'invention, la vasostatine I et les peptides de SEQ ID N 5 et de SEQ ID N 6 peuvent être utilisés de manière avantageuse chez des patients immunodéprimés, notamment chez les malades atteints du SIDA ou chez des patients traités par immunothérapie ou par chimiothérapie, ou chez des patients soumis à une antibiothérapie prolongée ainsi qu'en néonatologie. The peptides according to the invention, vasostatin I and the peptides of SEQ ID N 5 and SEQ ID N 6 can be used advantageously in immunocompromised patients, in particular in patients suffering from AIDS or in patients treated with immunotherapy or by chemotherapy, or in patients subjected to prolonged antibiotic therapy as well as in neonatology.
Les peptides selon l'invention, la vasostatine I et les peptides de SEQ ID N 5 et de SEQ ID N 6, peuvent être utilisés seuls ou en association avec d'autres principes actifs, notamment avec des antibiotiques. The peptides according to the invention, vasostatin I and the peptides of SEQ ID N 5 and SEQ ID N 6, can be used alone or in combination with other active ingredients, in particular with antibiotics.
Les peptides selon l'invention peuvent également être utilisés dans le cadre d'un traitement ciblé, notamment lorsqu'ils ont été préalablement modifiés par couplage, par des liaisons covalentes, ioniques ou faibles à une molécule susceptible d'augmenter leur affinité pour un type de cellule particulier. The peptides according to the invention can also be used in the context of targeted treatment, in particular when they have been modified beforehand by coupling, by covalent, ionic or weak bonds to a molecule capable of increasing their affinity for a type. of particular cell.
Les peptides selon l'invention peuvent également être utilisés dans le cadre d'une thérapie génique, notamment par injection d'une cellule préalablement modifiée pour exprimer un peptide selon l'invention in vivo. The peptides according to the invention can also be used in the context of gene therapy, in particular by injection of a cell previously modified to express a peptide according to the invention in vivo.
La présente invention concerne également les acides nucléiques codant pour les peptides de formule (I) et de formule (II) telles que définies précédemment. The present invention also relates to the nucleic acids coding for the peptides of formula (I) and of formula (II) as defined above.
Selon un mode préféré de réalisation, les acides nucléiques codent pour les séquences choisies dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 11, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13. According to a preferred embodiment, the nucleic acids code for the sequences chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 11, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13.
La présente invention concerne également des anticorps immunospécifiques des peptides de formule (I) et de formule (II). The present invention also relates to immunospecific antibodies of the peptides of formula (I) and of formula (II).
Selon un mode de réalisation avantageux desdits anticorps, ils consistent en anticorps polyclonaux. According to an advantageous embodiment of said antibodies, they consist of polyclonal antibodies.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits anticorps, ils consistent en anticorps monoclonaux. According to another advantageous embodiment of said antibodies, they consist of monoclonal antibodies.
Les anticorps polyclonaux sont avantageusement obtenus par immunisation d'un animal approprié (notamment un mammifère ou un gallinacé) avec un peptide selon l'invention, éventuellement couplé à une protéine convenablement choisie telle que la sérum albumine bovine (SAB) ou la KLH (Keyhole limpet hemocyanin) notamment selon les techniques décrites par Goumon Y. et. al. (1998), J. The polyclonal antibodies are advantageously obtained by immunization of a suitable animal (in particular a mammal or a gallinaceous) with a peptide according to the invention, optionally coupled to a suitably chosen protein such as bovine serum albumin (BSA) or KLH (Keyhole limpet hemocyanin) in particular according to the techniques described by Goumon Y. et. al. (1998), J.
Biol. Chem., 273,29847-29856 et par El-Majdoubi M., (1996), J. Neuro. Cytol., 25, 405-416. Biol. Chem., 273.29847-29856 and by El-Majdoubi M., (1996), J. Neuro. Cytol., 25, 405-416.
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Les anticorps monoclonaux anti-fragments peptidiques peuvent être avantageusement obtenus de manière connue en soi, notamment par fusion des cellules spléniques de souris immunisées avec un antigène consistant en un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, éventuellement couplé à une protéine convenable telle que SAB ou KLH avec des cellules myélomateuses appropriées. The monoclonal antibodies against peptide fragments can advantageously be obtained in a manner known per se, in particular by fusion of the spleen cells of immunized mice with an antigen consisting of a peptide fragment as defined above, optionally coupled to a suitable protein such as SAB or KLH with appropriate myeloma cells.
La présente invention a également pour objet un réactif pour le la détection d'un peptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps antipeptidique selon l'invention. The present invention also relates to a reagent for the detection of a peptide according to the invention, characterized in that it comprises at least one antipeptide antibody according to the invention.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit réactif, il est constitué d'anticorps polyclonaux. According to an advantageous embodiment of said reagent, it consists of polyclonal antibodies.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection d'un peptide selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle on met en contact l'échantillon biologique avec un réactif conforme à l'invention et une étape dans laquelle on détecte une interaction spécifique entre ledit réactif et une ou plusieurs des séquences peptidiques telles que définies ci-dessus et présentes dans l'échantillon. The present invention also relates to a method for detecting a peptide according to the invention, in a biological sample, characterized in that it comprises a step in which the biological sample is brought into contact with a reagent in accordance with the invention. invention and a step in which a specific interaction is detected between said reagent and one or more of the peptide sequences as defined above and present in the sample.
Un tel procédé permet notamment de mettre en évidence l'absence de ces peptides chez les patients immunodéprimés et de mettre en oeuvre une thérapie adaptée, notamment l'administration d'une composition selon l'invention. Such a method makes it possible in particular to demonstrate the absence of these peptides in immunosuppressed patients and to implement suitable therapy, in particular the administration of a composition according to the invention.
La détection de l'interaction entre ledit réactif et une ou plusieurs des séquences peptidiques selon l'invention, en particulier la détection du complexe antigène-anticorps peut être réalisée par des méthodes connues de l'homme du métier, notamment grâce à des tests immunoenzymatiques, immunofluorescents, radioimmunologiques ou par des tests d'immunoprécipitation. The detection of the interaction between said reagent and one or more of the peptide sequences according to the invention, in particular the detection of the antigen-antibody complex can be carried out by methods known to those skilled in the art, in particular by means of enzyme-linked immunosorbent assays , immunofluorescent, radioimmunological or by immunoprecipitation tests.
La présente invention a en outre pour objet une trousse ou un coffret ou un ensemble coordonné prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de détection selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en #uvre de ladite détection, des doses appropriées d'un ou plusieurs anticorps conformes à l'invention et un échantillon biologique de référence. The present invention further relates to a kit or a box or a coordinated unit ready for use for the implementation of the detection method according to the invention, characterized in that it comprises, in addition to quantities of buffers and reagents suitable for carrying out said detection, appropriate doses of one or more antibodies in accordance with the invention and a reference biological sample.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples illustrés par les figures dans lesquelles : - la figure 1 illustre la purification par chromatographie liquide haute pression (HPLC) du peptide naturel CGA1-76 de bovin (SEQ ID N 1). Les peptides sont isolés selon la technique décrite dans l'exemple 1. Le système de solvant utilisé comprend de l'acide trifluoroacétique à 0,1 % dans l'eau (solvant A) et de l'acide Other characteristics and advantages of the invention appear in the following description and examples illustrated by the figures in which: - Figure 1 illustrates the purification by high pressure liquid chromatography (HPLC) of the natural peptide CGA1-76 from cattle (SEQ ID N 1). The peptides are isolated according to the technique described in Example 1. The solvent system used comprises 0.1% trifluoroacetic acid in water (solvent A) and acid.
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trifluoroacétique à 0,1 % dans l'acétonitrile (solvant B). L'absorption est mesurée à 214 nm et l'élution est réalisée selon le gradient linéaire représenté sur l'échelle de droite. La flèche indique la fraction contenant la vasostatine 1 de bovin. 0.1% trifluoroacetic in acetonitrile (solvent B). The absorption is measured at 214 nm and the elution is carried out according to the linear gradient represented on the right scale. The arrow indicates the fraction containing bovine vasostatin 1.
- la figure 2 illustre l'analyse en spectrométrie de masse selon la technique MALDI-TOF (mesure du temps de vol après désorption laser assistée par matrice) des peptides dérivés des fragments N-terminaux. (A) CGA1-76 de bovin ; (B) recombinant humain VS-1 (SEQ ID N 5) ; (C) peptide synthétique CGA7-57 de rat (SEQ ID N 6), - la figure 3 illustre l'activité antifongique du peptide naturel vasostatine 1 de bovin (SEQ ID N 1), du recombinant humain VS-1 (SEQ ID N 5), du peptide synthétique CGA7-57 de rat (SEQ ID N 6) avec ou sans pont disulfure, du
peptide synthétique CGA4,~bo de bovin (SEQ ID N 7) et du peptide synthétique CGA4,~,o de bovin (SEQ ID N 9). L'activité antifongique est mesurée selon la technique décrite dans l'exemple 2. MIC (jM) représente la concentration minimale efficace capable d'inhiber la croissance des champignons et des levures ; - signifie que le peptide est inactif à une concentration de 50 M ; NT signifie que le peptide n'a pas été testé sur cette souche. FIG. 2 illustrates the analysis in mass spectrometry according to the MALDI-TOF technique (measurement of the time of flight after laser assisted desorption by matrix) of the peptides derived from the N-terminal fragments. (A) CGA1-76 from cattle; (B) human recombinant VS-1 (SEQ ID N 5); (C) synthetic peptide CGA7-57 from rat (SEQ ID N 6), - Figure 3 illustrates the antifungal activity of the natural peptide vasostatin 1 from bovine (SEQ ID N 1), from the human recombinant VS-1 (SEQ ID N 5), synthetic peptide CGA7-57 from rat (SEQ ID N 6) with or without disulfide bridge,
synthetic peptide CGA4, ~ bovine bovine (SEQ ID N 7) and synthetic peptide CGA4, ~, bovine bovine (SEQ ID N 9). The antifungal activity is measured according to the technique described in Example 2. MIC (µM) represents the minimum effective concentration capable of inhibiting the growth of fungi and yeasts; - means that the peptide is inactive at a concentration of 50 M; NT means that the peptide has not been tested on this strain.
EXEMPLE 1: Matériel et méthodes utilisées pour la purification et l'identification des peptides
1. Purification du peptide naturel vasostatine 1 de bovin (SEQ ID N 1)
Les granules de sécrétion sont isolés de la glande surrénale de bovin selon la technique décrite par Smith, A. D., et al. (1967) Biochem. J. 103,483-492. Les protéines solubles sont séparées après lyse des membranes et centrifugation, selon la technique décrite par Aunis, D., et al. (1977) J. Neurochem. 29,439-447. CGA1-76 est purifié par chromatographie liquide haute pression, sur une colonne Macherey Nagel Nucleosil 300-5C18 (4x250 mm ; des particules 5 m et taille des pores 100 nm) en utilisant le système Applied Biosystems HPLC 140 B. L'absorption est mesurée à 214 nm et le système de solvant utilisé comprend de l'acide trifluoroacétique à 0,1% dans l'eau (solvant A) et de l'acide trifluoroacétique à 0,1% dans l'acétonitrile (solvant B). L'élution est réalisée à une vitesse de 0,7 ml/min en utilisant successivement un gradient 0-30 % de B dans A pendant 15 minutes, puis un gradient 30-50 % pendant 40 minutes puis finalement un gradient 50-100 % pendant 10 minutes. Les fractions sont collectées manuellement et évaporées à sec. EXAMPLE 1 Material and Methods Used for the Purification and Identification of Peptides
1. Purification of the natural peptide vasostatin 1 from bovine (SEQ ID N 1)
The secretory granules are isolated from the bovine adrenal gland according to the technique described by Smith, AD, et al. (1967) Biochem. J. 103,483-492. The soluble proteins are separated after lysis of the membranes and centrifugation, according to the technique described by Aunis, D., et al. (1977) J. Neurochem. 29,439-447. CGA1-76 is purified by high pressure liquid chromatography, on a Macherey Nagel Nucleosil 300-5C18 column (4x250 mm; particles 5 m and pore size 100 nm) using the Applied Biosystems HPLC 140 B system. The absorption is measured at 214 nm and the solvent system used comprises 0.1% trifluoroacetic acid in water (solvent A) and 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile (solvent B). Elution is carried out at a speed of 0.7 ml / min using successively a 0-30% gradient of B in A for 15 minutes, then a 30-50% gradient for 40 minutes then finally a 50-100% gradient for 10 minutes. The fractions are collected manually and evaporated to dryness.
2. Synthèse dupeptide recombinant humain VS-1 (SE ID N 5) :
Le peptide recombinant humain VS-1 est cloné, purifié et caractérisé 2. Synthesis of the human recombinant peptide VS-1 (SE ID N 5):
The human recombinant peptide VS-1 is cloned, purified and characterized
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selon la technique décrite par Corti, A., et al. (1997) Eur. J Biochem. 248,692-699. Ce peptide correspond à la séquence CGA1-78 humaine et comporte le tripeptide STA à l'extrêmité N-terminale. according to the technique described by Corti, A., et al. (1997) Eur. J Biochem. 248,692-699. This peptide corresponds to the human CGA1-78 sequence and comprises the tripeptide STA at the N-terminal end.
3. Synthèse peptidique : a) mode opératoire ~général :
Les peptides synthétiques sont préparés selon la technique décrite par Atherton, E. et al. (1989) in "Solid phase peptide synthesis : a practical approach." (Rickwood, D and Hames, B. D., eds) IRL press en utilisant un synthétiseur de peptides ABI 431A (Applied Biosystems).
b) formation des ponts disulfiires :
La formation des ponts disulfures entre les résidus cystéine est obtenue en présence de N-éthyl-diisopropylamine à pH 8,5, en laissant le mélange réactionnel pendant 24 heures à l'air libre, jusqu'à ce que la réaction, mesurée selon le test d'Ellman décrit par Deakin, H. et al. (1963) Biochem. J. 89,296-304 soit complète. c) ablation des résidus cystéine :
L'alkylation (S-pyridylation) des résidus cystéine est obtenue en traitant les peptides par de la 4-vinylpyridine, selon la technique décrite par Tarr, G. E. (1986) in "Methods of protein microcharacterization" 162, Shively, J. E. ed (Humana press, Clifton, NJ), après réduction du pont disulfure en présence de guanidine-HCl 8 M, dans du tampon Tris-HCl à pH 8,5 contenant de l'EDTA 4 mM suivi d'une élimination des réactifs en excès, par chromatographie liquide haute pression avec un gradient tel que celui décrit dans l'exemple 1 paragraphe 1. d) oxydation des peptides :
Pour réaliser l'oxydation de la vasostatine I de bovin et celle du peptide recombinant humain VS-1, un agent oxydant est préparé par addition d'acide formique à du peroxyde d'hydrogène à 30 % (v/v ; 9/1) suivie d'une agitation du mélange pendant 45 minutes à la température ambiante. L'acide performique résultant est refroidi sur de la glace à 0 C. 100 l d'agent oxydé ainsi préparé, sont ajoutés à la protéine à traiter. Le milieu réactionnel est laissé pendant 30 minutes à 0 C, dilué par 500 l d'eau, évaporé et concentré à sec. Cette étape de lavage est réalisée trois fois de suite, afin d'éliminer l'excès des réactifs. 3. Peptide synthesis: a) general operating mode:
The synthetic peptides are prepared according to the technique described by Atherton, E. et al. (1989) in "Solid phase peptide synthesis: a practical approach." (Rickwood, D and Hames, BD, eds) IRL press using an ABI 431A peptide synthesizer (Applied Biosystems).
b) formation of the disulfide bridges:
The formation of disulfide bridges between the cysteine residues is obtained in the presence of N-ethyl-diisopropylamine at pH 8.5, leaving the reaction mixture for 24 hours in the open air, until the reaction, measured according to the Ellman test described by Deakin, H. et al. (1963) Biochem. J. 89,296-304 is complete. c) ablation of cysteine residues:
The alkylation (S-pyridylation) of the cysteine residues is obtained by treating the peptides with 4-vinylpyridine, according to the technique described by Tarr, GE (1986) in "Methods of protein microcharacterization" 162, Shively, JE ed (Humana press, Clifton, NJ), after reduction of the disulfide bridge in the presence of 8 M guanidine-HCl, in Tris-HCl buffer at pH 8.5 containing 4 mM EDTA followed by removal of excess reagents, by high pressure liquid chromatography with a gradient such as that described in example 1 paragraph 1. d) oxidation of the peptides:
To carry out the oxidation of bovine vasostatin I and that of the human recombinant peptide VS-1, an oxidizing agent is prepared by adding formic acid to 30% hydrogen peroxide (v / v; 9/1) followed by stirring the mixture for 45 minutes at room temperature. The resulting performic acid is cooled on ice to 0 C. 100 l of oxidized agent thus prepared are added to the protein to be treated. The reaction medium is left for 30 minutes at 0 ° C., diluted with 500 l of water, evaporated and concentrated to dryness. This washing step is carried out three times in succession, in order to remove the excess of the reagents.
4. Analyse des séquences :
Les séquences des peptides sont déterminées par dégradation d'Edman à l'aide d'un séquenceur Applied Biosystems 473A. Les échantillons préalablement purifiés par chromatographie liquide haute pression sont analysés selon 4. Sequence analysis:
The peptide sequences are determined by degradation of Edman using an Applied Biosystems 473A sequencer. The samples previously purified by high pressure liquid chromatography are analyzed according to
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la technique décrite par Metz-Boutigue, M. H., et al.. (1993) Eur. J. Biochem. 217, 247-257. the technique described by Metz-Boutigue, M. H., et al .. (1993) Eur. J. Biochem. 217, 247-257.
5. Analyse par spectrométrie de masse :
Elle est réalisée selon la technique MALDI-TOF (mesure du temps de vol après désorption laser assistée par matrice) telle que décrite par Vorm, O. et al. 5. Analysis by mass spectrometry:
It is carried out according to the MALDI-TOF technique (measurement of the time of flight after laser assisted desorption by matrix) as described by Vorm, O. et al.
(1994) J. Am. Soc. Mass. Spec. 5,955-958 et Vorm, O. et al. (1994) Anal. Chem. 66, 3281-3287, en utilisant un spectrographe de masse Bruker BIFLEX TM. (1994) J. Am. Soc. Mass. Spec. 5,955-958 and Vorm, O. et al. (1994) Anal. Chem. 66, 3281-3287, using a Bruker BIFLEX TM mass spectrograph.
EXEMPLE 2: Matériel et méthodes utilisés pour mesurer l'activité antifongique
1. Culture des champignons filamenteux :
Ils sont cultivés sur un milieu de culture comprenant un milieu à cinq céréales et les spores sont collectés selon la technique décrite par Broekaert, W. F. et al. (1990) FEMSMicrobiol. Lett. 69, 55-60. EXAMPLE 2 Material and Methods Used to Measure Antifungal Activity
1. Culture of filamentous fungi:
They are cultivated on a culture medium comprising a medium with five cereals and the spores are collected according to the technique described by Broekaert, WF et al. (1990) FEMSMicrobiol. Lett. 69, 55-60.
Les souches suivantes ont été utilisées : Alternaria brassicola, (MUCL 20297 déposée à la Mycothèque de l'Université catholique de Louvain), Trichoderma viride, (MUCL 29724 déposée à la Mycothèque de l'Université catholique de Louvain), Nectria haematococca, (160.2.2), Fusarium culmorum (MUCL 30162), Fusarium oxyporum, (MUCL 909 déposée à la Mycothèque de l'Université catholique de Louvain), Botrytis cinerea (MUCL 30158 déposée à la Mycothèque de l'Université catholique de Louvain), Neurospora crassa (CBS 327-54 déposée au Centraalbureau voor Schimmelcultures) et Aspergillus fumigatus. The following strains were used: Alternaria brassicola, (MUCL 20297 deposited at the Mycotheque of the Catholic University of Louvain), Trichoderma viride, (MUCL 29724 deposited at the Mycotheque of the Catholic University of Louvain), Nectria haematococca, (160.2 .2), Fusarium culmorum (MUCL 30162), Fusarium oxyporum, (MUCL 909 deposited at the Mycotheque of the Catholic University of Louvain), Botrytis cinerea (MUCL 30158 deposited at the Mycotheque of the Catholic University of Louvain), Neurospora crassa (CBS 327-54 filed at Centraalbureau voor Schimmelcultures) and Aspergillus fumigatus.
2. Cultures de levures :
Les cellules sont précultivées sur un milieu de Sabouraud. 2. Yeast cultures:
The cells are precultured on a Sabouraud medium.
Les souches suivantes ont été utilisées : Saccharomyces cerevisiae (TGY481 pJM600) et Candida albicans. The following strains were used: Saccharomyces cerevisiae (TGY481 pJM600) and Candida albicans.
3. Mesure de l'activité antifongique :
Les spores sont mis en suspension de manière à avoir une concentration finale de 104 spores/ml, dans un milieu de culture contenant du dextrose de pomme de terre. 3. Measurement of antifungal activity:
The spores are suspended so as to have a final concentration of 104 spores / ml, in a culture medium containing potato dextrose.
Les levures sont suspendues dans un milieu de Sabouraud, à une concentration telle qu'on obtienne une absorption de 0,001 à 620 nm. The yeasts are suspended in a Sabouraud medium, at a concentration such that an absorption of 0.001 at 620 nm is obtained.
On ajoute à ces milieux de culture de la tétracycline (10 g/ml) et de la céfotaxime (0,1 g/ml). Tetracycline (10 g / ml) and cefotaxime (0.1 g / ml) are added to these culture media.
La croissance des champignons est évaluée après un temps d'incubation approprié, spécifique de chaque champignon (24 à 48 heures à 30 C). The growth of the fungi is evaluated after an appropriate incubation time, specific to each fungus (24 to 48 hours at 30 C).
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Des fractions aliquotes de 20 l des peptides purifiés sont incubées sur des plaques de microtitration avec 80 l de spores de champignons ou des levures. Aliquots of 20 l of the purified peptides are incubated on microtiter plates with 80 l of fungal or yeast spores.
Les concentrations finales en peptides sont comprises entre 1 pM et 10 M. The final peptide concentrations are between 1 pM and 10 M.
EXEMPLE 3: Caractérisation structurale et biologique de l'activité antifongique de la vasostatine 1 (SEQ ID N 1)
1. Purification et caractérisation de la vasostatine 1 (SEO ID N 1) a) Purification
Après séparation par chromatographie liquide haute pression selon la technique décrite dans l'exemple 1, on observe un pic élué par un solvant contenant 47 % de solvant B (figure 1).
b) caractérisation --.Jj.9.g
Le séquençage du peptide contenu dans cette fraction selon la technique décrite dans l'exemple 1, révèle une séquence unique qui correspond à la séquence N-terminale de la chromogranine A de bovin. EXAMPLE 3 Structural and biological characterization of the antifungal activity of vasostatin 1 (SEQ ID N 1)
1. Purification and characterization of vasostatin 1 (SEO ID N 1) a) Purification
After separation by high pressure liquid chromatography according to the technique described in Example 1, a peak is observed eluted with a solvent containing 47% of solvent B (FIG. 1).
b) characterization - Jj.9.g
Sequencing of the peptide contained in this fraction according to the technique described in Example 1 reveals a unique sequence which corresponds to the N-terminal sequence of bovine chromogranin A.
L'analyse de ce fragment selon la technique MALDI-TOF décrite dans l'exemple 1, permet de définir 3 pics correspondant à des masses de 8583,9 Da, 4289,8 Da et 2860,3 Da (Figure 2A). Analysis of this fragment according to the MALDI-TOF technique described in Example 1, makes it possible to define 3 peaks corresponding to masses of 8583.9 Da, 4289.8 Da and 2860.3 Da (Figure 2A).
Ces résultats sont en accord avec la masse théorique du peptide CGA1-76 égale à 8584,9 Da. These results are in agreement with the theoretical mass of the peptide CGA1-76 equal to 8584.9 Da.
2. Activité antifongique de la vasostatine 1 (SEO ID N 1)
Les résultats sont rassemblés dans la figure 3.
a) sffét sur les champignons Slamenteux :
Ce peptide inhibe la croissance de Nectria haematococca et de Fusarium culmorum avec une concentration active minimale de 1 M ; il inhibe la croissance de Neurospora crassa, Alternaria brassicola et de Trichoderma viride avec une concentration active minimale de 3 M ; il inhibe la croissance de Aspergillus fumigatus avec une concentration active minimale de 5 M et il inhibe la croissance de Fusarium oxyporum avec une concentration active minimale de 10 M. 2. Vasostatin 1 antifungal activity (SEO ID N 1)
The results are collated in FIG. 3.
a) sffet on Slamentous mushrooms:
This peptide inhibits the growth of Nectria haematococca and Fusarium culmorum with a minimum active concentration of 1 M; it inhibits the growth of Neurospora crassa, Alternaria brassicola and Trichoderma viride with a minimum active concentration of 3M; it inhibits the growth of Aspergillus fumigatus with a minimum active concentration of 5 M and it inhibits the growth of Fusarium oxyporum with a minimum active concentration of 10 M.
Il est sans effet sur Botrytis cinerea dans les conditions de l'expérience. b) effet sur les levures :
Ce peptide inhibe la croissance de Saccharomyces cerevisiae et de
Candida albicans avec une concentration active minimale de 10 M. It has no effect on Botrytis cinerea under the conditions of the experiment. b) effect on yeasts:
This peptide inhibits the growth of Saccharomyces cerevisiae and
Candida albicans with a minimum active concentration of 10 M.
3) Activité antifongique de la forme alkylée (S-pvridvlated form) de la vasostatine 1 (SEO ID N 1)
Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. 3) Antifungal activity of the alkylated form (S-pvridvlated form) of vasostatin 1 (SEO ID N 1)
The results are collated in FIG. 3.
<Desc/Clms Page number 13> <Desc / Clms Page number 13>
Ce peptide inhibe la croissance de Neurospora crassa avec une concentration active minimale de 3 M. This peptide inhibits the growth of Neurospora crassa with a minimum active concentration of 3 M.
Ces résultats montrent que la présence du pont disulfure n'est pas obligatoire pour l'activité antifongique. These results show that the presence of the disulfide bridge is not compulsory for antifungal activity.
4) Activité antifongique de la forme oxydée de la vasostatine 1 (SEO ID N 1)
Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. 4) Antifungal activity of the oxidized form of vasostatin 1 (SEO ID N 1)
The results are collated in FIG. 3.
Après oxydation par l'acide performique selon la technique décrite dans l'exemple 1, tous les résidus cystéine et les résidus méthionine sont oxydés, ainsi que le révèlent les analyses de spectrométrie de masse. After oxidation with performic acid according to the technique described in Example 1, all the cysteine residues and the methionine residues are oxidized, as revealed by mass spectrometry analyzes.
Ce peptide oxydé inhibe la croissance de Neurospora crassa avec une concentration active minimale de 30 M. This oxidized peptide inhibits the growth of Neurospora crassa with a minimum active concentration of 30 M.
Ces résultats montrent que l'oxydation par l'acide performique induit une diminution significative de l'activité antifongique. These results show that oxidation with performic acid induces a significant decrease in antifungal activity.
EXEMPLE 4: Caractérisation structurale et biologique de l'activité antifongique du peptide recombinant humain VS-1 (SEQ ID N 5)
1. Caractérisation du peptide recombinant humain VS-1 (SEQ ID N 5)
L'analyse de ce fragment selon la technique MALDI-TOF décrite dans l'exemple 1, permet de définir 3 pics correspondant à des masses de 9069,7 Da, 4536,1 Da et 3024,1 Da (Figure 2B). EXAMPLE 4 Structural and biological characterization of the antifungal activity of the human recombinant peptide VS-1 (SEQ ID N 5)
1. Characterization of the human recombinant peptide VS-1 (SEQ ID N 5)
Analysis of this fragment according to the MALDI-TOF technique described in Example 1, makes it possible to define 3 peaks corresponding to masses of 9069.7 Da, 4536.1 Da and 3024.1 Da (Figure 2B).
Ces résultats sont en accord avec la masse théorique du peptide égale à 9069,5 Da. These results are in agreement with the theoretical mass of the peptide equal to 9069.5 Da.
2. Activité antifongique du peptide recombinant humain VS-1
Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. a) effet sur les champignons filamenteux :
Ce peptide inhibe la croissance de Alternaria brassicola avec une concentration active minimale de 1 M ; il inhibe la croissance de Nectria haematococca avec une concentration active minimale de 3 M ; il inhibe la croissance de Fusarium culmorum avec une concentration active minimale de 5 M et il inhibe la croissance de Neurospora crassa avec une concentration active minimale de 10 M. 2. Antifungal activity of the human recombinant peptide VS-1
The results are collated in Figure 3. a) effect on filamentous fungi:
This peptide inhibits the growth of Alternaria brassicola with a minimum active concentration of 1 M; it inhibits the growth of Nectria haematococca with a minimum active concentration of 3M; it inhibits the growth of Fusarium culmorum with a minimum active concentration of 5 M and it inhibits the growth of Neurospora crassa with a minimum active concentration of 10 M.
Il est sans effet sur Trichoderma viride, Aspergillus fumigatus, Fusarium oxyporum et sur Botrytis cinerea dans les conditions de l'expérience.
b effet sur les levures : b) ff.L.l~J!.- : It has no effect on Trichoderma viride, Aspergillus fumigatus, Fusarium oxyporum and on Botrytis cinerea under the conditions of the experiment.
b effect on yeasts: b) ff.Ll ~ J! .-:
<Desc/Clms Page number 14> <Desc / Clms Page number 14>
Ce peptide n'inhibe ni la croissance de Saccharomyces cerevisiae, ni celle de Candida albicans dans les conditions de l'expérience.
3) Activité antifongique de la forme alkylée (S-pyrLdylated form) du peptide recombinant humain VS-1
Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. 3) Antifungal activity of the alkylated form (S-pyrLdylated form) of the human recombinant peptide VS-1
The results are collated in FIG. 3.
Ce peptide inhibe la croissance de Neurospora crassa avec une concentration active minimale de 5 M. This peptide inhibits the growth of Neurospora crassa with a minimum active concentration of 5 M.
Ces résultats confirment que la présence du pont disulfure n'est pas obligatoire pour l'activité antifongique. These results confirm that the presence of the disulfide bridge is not compulsory for antifungal activity.
3) Activité antifongique de la forme oxydée du peptide recombinant humain VS-1 :
Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. 3) Antifungal activity of the oxidized form of the human recombinant peptide VS-1:
The results are collated in FIG. 3.
Ce peptide oxydé inhibe la croissance de Neurospora crassa avec une concentration active minimale de 20 M. This oxidized peptide inhibits the growth of Neurospora crassa with a minimum active concentration of 20 M.
Ces résultats confirment que l'oxydation par l'acide performique diminue l' activité antifongique. These results confirm that oxidation with performic acid decreases the antifungal activity.
EXEMPLE 5: Caractérisation structurale et biologique de
l'activité antifongique du peptide synthétique CGA,~5, de rat (SEQ ID N 6) 1. Caractérisation du peptide synthétique CGA,~S de rat
L'analyse de ce fragment selon la technique MALDI-TOF décrite dans l'exemple 1, permet de définir 2 pics correspondant à des masses de 5654,4 Da, et de 2827,1 Da (Figure 2C). EXAMPLE 5 Structural and biological characterization of
the antifungal activity of the synthetic peptide CGA, ~ 5, from rat (SEQ ID N 6) 1. Characterization of the synthetic peptide CGA, ~ S from rat
Analysis of this fragment according to the MALDI-TOF technique described in Example 1, makes it possible to define 2 peaks corresponding to masses of 5654.4 Da, and 2827.1 Da (Figure 2C).
Ces résultats sont en accord avec la masse théorique du peptide égale à 5655,7 Da. These results are in agreement with the theoretical mass of the peptide equal to 5655.7 Da.
2. Activité antifongique du peptide synthétique CGA7-57 de rat avant un pont disulfure
Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. a) effet sur les champignons filamenteux :
Ce peptide inhibe la croissance de Nectria haematococca et de Neurospora crassa avec une concentration active minimale de 20 M ; il inhibe la croissance de Alternaria brassicola, Fusarium culmorum et de Trichoderma viride avec une concentration active minimale de 30 M. 2. Antifungal Activity of the Synthetic Peptide CGA7-57 Before a Disulfide Bridge
The results are collated in Figure 3. a) effect on filamentous fungi:
This peptide inhibits the growth of Nectria haematococca and Neurospora crassa with a minimum active concentration of 20 M; it inhibits the growth of Alternaria brassicola, Fusarium culmorum and Trichoderma viride with a minimum active concentration of 30 M.
Il est sans effet sur Aspergillus fumigatus, Fusarium oxyporum et sur Botrytis cinerea dans les conditions de l' expérience. b) effet sur les levures : It has no effect on Aspergillus fumigatus, Fusarium oxyporum and on Botrytis cinerea under the conditions of the experiment. b) effect on yeasts:
<Desc/Clms Page number 15> <Desc / Clms Page number 15>
Ce peptide n'inhibe ni la croissance de Saccharomyces cerevisiae, ni celle de Candida albicans dans les conditions de l'expérience. This peptide neither inhibits the growth of Saccharomyces cerevisiae, nor that of Candida albicans under the conditions of the experiment.
3) Activité antifongique de la forme alkylée du peptide synthétique CGA7-57 derat
Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. a) effet sur les champignons filamenteux :
Ce peptide inhibe la croissance de Neurospora crassa et de Fusarium culmorum avec une concentration active minimale de 50 M. 3) Antifungal activity of the alkylated form of the synthetic peptide CGA7-57 derat
The results are collated in Figure 3. a) effect on filamentous fungi:
This peptide inhibits the growth of Neurospora crassa and Fusarium culmorum with a minimum active concentration of 50 M.
Il est sans effet sur Aspergillus fumigatus, Alternaria brassicola, Trichoderma viride, Nectria haematococca, Fusarium oxyporum et sur Botrytis cinerea dans les conditions de l'expérience. It has no effect on Aspergillus fumigatus, Alternaria brassicola, Trichoderma viride, Nectria haematococca, Fusarium oxyporum and on Botrytis cinerea under the conditions of the experiment.
Ces résultats confirment que la présence du pont disulfure n'est pas obligatoire pour l'activité antifongique. b) effet sur les~levures :
Ce peptide n'inhibe ni la croissance de Saccharomyces cerevisiae, ni celle de Candida albicans dans les conditions de l'expérience. These results confirm that the presence of the disulfide bridge is not compulsory for antifungal activity. b) effect on ~ yeasts:
This peptide neither inhibits the growth of Saccharomyces cerevisiae, nor that of Candida albicans under the conditions of the experiment.
EXEMPLE 6: Mesure de l'activité antifongique du peptide CGA47-60
Les résultats sont rassemblés dans la figure 3.
a) .ff!.rJ~hp.i.Ic1:JU! :
Ce peptide inhibe la croissance de Neurospora crassa, de Alternaria brassicola, et de Nectria haematococca avec une concentration active minimale de 7 M et il inhibe la croissance de Fusarium culmorum avec une concentration active minimale de 20 M. EXAMPLE 6 Measurement of the Antifungal Activity of the CGA47-60 Peptide
The results are collated in FIG. 3.
a) .ff! .rJ ~ hp.i.Ic1: JU! :
This peptide inhibits the growth of Neurospora crassa, Alternaria brassicola, and Nectria haematococca with a minimum active concentration of 7 M and it inhibits the growth of Fusarium culmorum with a minimum active concentration of 20 M.
Il est sans effet sur Aspergillus fumigatus, Trichoderma viride, , Fusarium oxyporum et sur Botrytis cinerea dans les conditions de l'expérience. b) effet sur les levures :
Ce peptide n'inhibe ni la croissance de Saccharomyces cerevisiae, ni celle de Candida albicans dans les conditions de l'expérience. It has no effect on Aspergillus fumigatus, Trichoderma viride,, Fusarium oxyporum and on Botrytis cinerea under the conditions of the experiment. b) effect on yeasts:
This peptide neither inhibits the growth of Saccharomyces cerevisiae, nor that of Candida albicans under the conditions of the experiment.
EXEMPLE 7: Mesure de l'activité antifongique du peptide CGA41-70
Les résultats sont rassemblés dans la figure 3.
a) .ff!.rJ.hp.~l1.fJ!!! : Ce peptide inhibe la croissance Nectria haematococca et de EXAMPLE 7 Measurement of the Antifungal Activity of the CGA41-70 Peptide
The results are collated in FIG. 3.
a) .ff! .rJ.hp. ~ l1.fJ !!! : This peptide inhibits the growth of Nectria haematococca and
<Desc/Clms Page number 16><Desc / Clms Page number 16>
Fusarium culmorum avec une concentration active minimale de 3 M ; il inhibe la croissance de Alternaria brassicola avec une concentration active minimale de 5 M ; il inhibe la croissance de Neurospora crassa, avec une concentration active minimale de 7 M ; il inhibe la croissance de Aspergillus fumigatus, avec une concentration active minimale de 10 M et il inhibe la croissance de Fusarium oxyporum avec une concentration active minimale de 30 M. Fusarium culmorum with a minimum active concentration of 3M; it inhibits the growth of Alternaria brassicola with a minimum active concentration of 5 M; it inhibits the growth of Neurospora crassa, with a minimum active concentration of 7 M; it inhibits the growth of Aspergillus fumigatus, with a minimum active concentration of 10 M and it inhibits the growth of Fusarium oxyporum with a minimum active concentration of 30 M.
Il est sans effet sur Trichoderma viride et sur Botrytis cinerea dans les conditions de l'expérience.
b effet sur les levures : ) les levures
Ce peptide n'inhibe ni la croissance de Saccharomyces cerevisiae, ni celle de Candida albicans dans les conditions de l'expérience. It has no effect on Trichoderma viride and on Botrytis cinerea under the conditions of the experiment.
b effect on yeasts:) yeasts
This peptide neither inhibits the growth of Saccharomyces cerevisiae, nor that of Candida albicans under the conditions of the experiment.
L'ensemble de ces résultats confirment que les peptides selon l'invention pourraient être utiles comme antifongiques dans le traitement ou la prévention de mycoses profondes ou superficielles causées par des champignons filamenteux et des levures. All of these results confirm that the peptides according to the invention could be useful as antifungal agents in the treatment or prevention of deep or superficial yeast infections caused by filamentous fungi and yeasts.
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