FR2789398A1 - Counting microorganisms in a solid material, especially a probiotic animal feed additive, includes separating the microorganisms by wet-grinding, sonication, centrifiltration and centrifugation - Google Patents
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Abstract
Description
Procédé de séparation rapide et de dénombrement deMethod for rapid separation and enumeration of
microorganismes incorporés dans un produit solide. microorganisms incorporated into a solid product.
L'invention concerne le domaine de la microbiologie ainsi que le The invention relates to the field of microbiology and the
domaine de l'alimentation animale.animal feed.
Plus précisément, l'invention se rapporte à un procédé permettant de dénombrer de façon rapide les microorganismes incorporés dans un produit solide. L'invention trouve tout particulièrement son application pour la séparation rapide et le dénombrement des bactéries, composantes de base d'un produit probiotique, stabilisées sur un support végétal destiné à l'alimentation animale. Toutefois, on comprendra que la présente invention pourra également être appliquée à d'autres types de produits solides que de tels additifs probiotiques. Les produits probiotiques peuvent être définis comme des produits incluant des microorganismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés dans un certain nombre, ont un effet bénéfique sur la santé. Les microorganismes répertoriés comme ayant des propriétés probiotiques sont essentiellement des bactéries et des champignons microscopiques appartenant à quelques espèces de différents genres. Ainsi, les lactobacilles qui sont des bactéries lactiques naturellement présentes dans le tractus gastro-intestinal des mammifères, sont très utilisées à titre de probiotiques pour leur aptitude à résister à l'ensemble des barrières More specifically, the invention relates to a method for rapidly enumerating the microorganisms incorporated in a solid product. The invention particularly finds its application for the rapid separation and enumeration of bacteria, basic components of a probiotic product, stabilized on a plant support intended for animal feed. However, it will be understood that the present invention can also be applied to other types of solid products than such probiotic additives. Probiotic products can be defined as products including living microorganisms which, when ingested in a number, have a beneficial effect on health. The microorganisms listed as having probiotic properties are essentially bacteria and microscopic fungi belonging to a few species of different genera. Lactobacilli, which are lactic acid bacteria naturally present in the gastrointestinal tract of mammals, are widely used as probiotics for their ability to resist all barriers
physiologiques lorsqu'elles intègrent l'organisme de l'hôte. physiological when they integrate the host organism.
Afin d'assurer une viabilité maximale des microorganismes probiotiques, les fabricants ont développé diverses approches. La première consiste à sélectionner des bactéries sporulées, c'est-à-dire naturellement protégées par leur endospore, comme certains Bacillus. Une deuxième approche consiste à protéger les cellules dans une coque protectrice par un procédé technologique dit d'encapsulation. Cette technique est très utilisée pour les levures. Encore une autre approche consiste à adapter les cellules de microorganismes aux chocs osmotiques par déshydratation progressive du milieu de culture puis à les stabiliser sur un support végétal présentant des micro-cavités dans lesquelles les In order to ensure maximum viability of probiotic microorganisms, manufacturers have developed various approaches. The first consists in selecting spore-forming bacteria, that is to say naturally protected by their endospore, like certain Bacillus. A second approach consists in protecting the cells in a protective shell by a technological process called encapsulation. This technique is widely used for yeasts. Yet another approach consists in adapting the cells of microorganisms to osmotic shocks by progressive dehydration of the culture medium and then stabilizing them on a plant support having micro-cavities in which the
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cellules de microorganismes se fixent. Une telle technique assure un taux de survie maximal de 90% des microorganismes au cours du stockage de l'additif probiotique et de 100% après son incorporation dans l'aliment fini. La présente invention se rapporte au dénombrement des microorganismes dans ce type d'additifs. En effet, il est reconnu que les microorganismes d'intérêt probiotiques doivent parvenir vivants dans l'intestin des animaux auxquels ils sont administrés, à une teneur minimale de 105 UFC (Unités Formant Colonies) par microorganism cells attach themselves. Such a technique ensures a maximum survival rate of 90% of the microorganisms during storage of the probiotic additive and 100% after its incorporation into the finished food. The present invention relates to the enumeration of microorganisms in this type of additive. Indeed, it is recognized that the microorganisms of probiotic interest must arrive alive in the intestine of the animals to which they are administered, at a minimum content of 105 CFU (Colony-forming Units) per
gramme pour procurer des effets bénéfiques. gram to provide beneficial effects.
Dans ce cadre, il a déjà été envisagé d'effectuer un dénombrement de ces microorganismes par microscopie à épifluorescence. Cette technique est d'ailleurs très utilisée pour le dénombrement des microorganismes pathogènes dans l'eau de boisson, pour le dénombrement de la " flore totale " dans le lait et, d'une manière générale pour le dénombrement de microorganismes contenus dans un liquide. Jusqu'ici la généralisation de cette technique aux produits solides s'est toutefois heurtée aux difficultés de filtration des suspensions et In this context, it has already been envisaged to carry out a count of these microorganisms by epifluorescence microscopy. This technique is also widely used for the enumeration of pathogenic microorganisms in drinking water, for the enumeration of the "total flora" in milk and, in general for the enumeration of microorganisms contained in a liquid. So far the generalization of this technique to solid products has however encountered the difficulties of filtering the suspensions and
d'élimination des débris solides avant la phase d'observation. solid debris removal before the observation phase.
Walls et al. ont proposé dans un article paru en 1990 dans "Letters in Applied Microbiology 10,23 - 26" de séparer les microorganismes de la viande crue par digestion enzymatique à l'alcalase. Rodriguez Szulc et al. ont quant à eux proposé, dans un article paru en 1996 dans "Journal of Applied Bacteriology , 673-680" de détacher les bactéries de la surface de la viande de boeuf par action enzymatique et centrifugation différentielle. Toutefois, ces différentes techniques utilisant des digestions enzymatiques et des centrifugations différentielles se sont révélées peu adaptées pour extraire rapidement les lactobacilles inclus à l'intérieur de la matrice complexe des additifs probiotiques stabilisés sur support végétal. Il a également été utilisé une séparation imunomagnétique mais une telle technique n'a pas été retenue car trop coûteuse Le principal objectif de la présente invention est donc de définir un procédé de séparation rapide et de dénombrement de microorganismes intégrés dans une matrice solide, tel que notamment un additif probiotique seul ou Walls et al. proposed in an article published in 1990 in "Letters in Applied Microbiology 10,23 - 26" to separate microorganisms from raw meat by enzymatic digestion with alkalase. Rodriguez Szulc et al. proposed in an article published in 1996 in "Journal of Applied Bacteriology, 673-680" to detach bacteria from the surface of beef by enzymatic action and differential centrifugation. However, these different techniques using enzymatic digestions and differential centrifugations have proved to be unsuitable for rapidly extracting the lactobacilli included inside the complex matrix of probiotic additives stabilized on plant support. An immunomagnetic separation has also been used but such a technique was not retained since it is too costly The main objective of the present invention is therefore to define a method for rapid separation and enumeration of microorganisms integrated in a solid matrix, such as including a probiotic additive alone or
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incorporé dans un mélange, dans le but de pouvoir effectuer facilement un dénombrement fiable et reproductible des microorganismes, notamment par épifluorescence. Cet objectif est atteint grâce à un procédé de séparation rapide et de dénombrement de microorganismes incorporés dans un produit solide caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à broyer un échantillon dudit produit solide dans un liquide de suspension, effectuer une sonification basse fréquence du broyat obtenu, effectuer une centri-filtration du broyat puis une centrifugation du filtrat, reprendre le culot obtenu lors de ladite étape de centrifugation dans un incorporated in a mixture, in order to be able to easily carry out a reliable and reproducible enumeration of microorganisms, in particular by epifluorescence. This objective is achieved by a process of rapid separation and enumeration of microorganisms incorporated in a solid product characterized in that it comprises the steps consisting in grinding a sample of said solid product in a suspension liquid, performing a low frequency sonication of the ground product obtained, carry out a centri-filtration of the ground material then centrifugation of the filtrate, take up the pellet obtained during said centrifugation step in a
liquide et effectuer un dénombrement desdits microorganismes. liquid and perform a count of said microorganisms.
Le procédé selon l'invention se caractérise essentiellement par l'utilisation d'une étape de sonification basse fréquence permettant de séparer les microorganismes du reste du produit solide sans abîmer ceuxci. Il est en effet impératif de ne pas tuer ces microorganismes lors des étapes préparatives audit The method according to the invention is essentially characterized by the use of a low-frequency sonication step making it possible to separate the microorganisms from the rest of the solid product without damaging them. It is indeed imperative not to kill these microorganisms during the preparatory stages of the audit.
dénombrement.enumeration.
Le procédé comprend également une étape de centrifiltration. Une telle étape de centrifiltration a été définie comme étant la plus efficace, en combinaison avec la sonification, pour extraire les cellules de microorganismes des cavités du produit solide en limitant la présence de grosses particules. Une telle étape de centrifiltration s'est avérée en effet plus efficace notamment The method also includes a centrifugation step. Such a centrifugation step has been defined as being the most effective, in combination with sonication, for extracting the cells of microorganisms from the cavities of the solid product while limiting the presence of large particles. Such a centrifugation step has proven to be more effective, in particular
comparativement à une décantation, une simple centrifugation ou une filtration. compared to decantation, simple centrifugation or filtration.
La combinaison de la centrifiltration avec la sonification permet de décrocher les microorganismes des particules de produits solides et de disperser efficacement les cellules en les séparant les unes des autres, en évitant ainsi la The combination of centrifugation with sonication makes it possible to unhook the microorganisms from the particles of solid products and efficiently disperse the cells by separating them from each other, thus avoiding
formation d'amas de microorganismes. formation of clusters of microorganisms.
Préférentiellement, cette étape de centrifilitration sera effectuée en utilisant un filtre en papier cellulosique. Il a en effet été constaté que ce type de Preferably, this centrifugation step will be carried out using a cellulosic paper filter. It has indeed been observed that this type of
filtre donnait les meilleurs résultats. filter gave the best results.
Comme indiqué ci-dessus, le procédé selon la présente invention sera particulièrement utile lorsque l'on envisagera d'effectuer un dénombrement des microorganismes par épifluorescence. Il pourra toutefois être utilisé As indicated above, the method according to the present invention will be particularly useful when it is envisaged to carry out a count of the microorganisms by epifluorescence. It can however be used
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préalablement à d'autres étapes de dénombrement, notamment un dénombrement prior to other enumeration steps, including enumeration
par ensemencement du culot sur milieu gélosé. by seeding the pellet on agar medium.
Egalement comme déjà mentionné ci-dessus, le procédé selon l'invention pourra être appliqué à différents types de produits solides.Toutefois, préférentiellement, ce produit solide sera un additif probiotique sur support végétal destiné à l'alimentation animale, c'est- à-dire un composé végétal présentant des cavités à l'intérieur desquelles sont logées des bactéries telles que Also as already mentioned above, the method according to the invention can be applied to different types of solid products. However, preferably, this solid product will be a probiotic additive on a vegetable support intended for animal feed, that is to say -to say a plant compound having cavities inside which bacteria such as
notamment des lactobacilles.especially lactobacilli.
En ce qui concerne les paramètres de fréquence de l'étape de sonification, ceux-ci pourront varier notamment en fonction du type de microorganismes contenus dans le produit solide auquel le procédé sera appliqué et en fonction du produit. Toutefois, lorsque le microorganisme en question sera un lactobacille et le produit solide un additif végétal, la sonification basse fréquence sera mise en oeuvre à une fréquence comprise entre 5 watts et 150 As regards the frequency parameters of the sonification step, these may vary in particular depending on the type of microorganisms contained in the solid product to which the process will be applied and depending on the product. However, when the microorganism in question will be a lactobacillus and the solid product a vegetable additive, the low frequency sonication will be implemented at a frequency between 5 watts and 150
watts. Préférentiellement cette fréquence sera de 40 watts. watts. Preferably this frequency will be 40 watts.
Ladite étape de centrifiltration sera quant à elle préférentiellement mise en oeuvre pendant au moins une minute à au moins 1000 tr/mn tandis que ladite étape de centrifugation sera mise en oeuvre préférentiellement pendant au moins Said centrifugation step will preferably be carried out for at least one minute at at least 1000 rpm while said centrifugation step will preferably be carried out for at least
une minute à au moins 10 000 tr/mn. one minute at least 10,000 rpm.
Afin d'optimiser le procédé on notera qu'une sonification sera également In order to optimize the process, it should be noted that a sonication will also be
effectuée lors de l'étape de reprise du culot. performed during the pellet recovery step.
Egalement selon une variante préférentielle du procédé, on ajoute dans le liquide de supension du broyat au moins un agent tensio-actif. L'ajout d'un tel agent tensioactif dans le liquide de suspension permet de limiter la réagrégation Also according to a preferred variant of the process, at least one surfactant is added to the ground material suspension liquid. The addition of such a surfactant in the suspension liquid makes it possible to limit the re-aggregation
des cellules et de bien les disperser sur la membrane de centrifiltration. cells and spread them well on the centrifuge membrane.
Le procédé selon la présente invention va maintenant être décrit en The process according to the present invention will now be described in
référence à un exemple non limitatif de réalisation de celle-ci. reference to a nonlimiting example of embodiment thereof.
Le procédé selon l'invention a été mis en oeuvre sur des échantillons d'additifs probiotiques préparés à partir d'un lait fermenté par deux souches sauvages de lactobacilles (Lactobacillus rhamnosus et Lactobacillus acidophilus). Ces souches sont déposées à l'Institut Pasteur de Paris The method according to the invention was implemented on samples of probiotic additives prepared from milk fermented by two wild strains of lactobacilli (Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus acidophilus). These strains are deposited at the Institut Pasteur in Paris
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respectivement sous les numéros de collection CNCM MA 27/6B et CNCM MA 27/6R. Ces bactéries sont incorporées sur un support végétal expansé constitué en partie par du maïs expansé.Cet additif probiotique se présente sous la forme respectively under the collection numbers CNCM MA 27 / 6B and CNCM MA 27 / 6R. These bacteria are incorporated on an expanded plant support partly consisting of expanded corn. This probiotic additive comes in the form
d'une poudre beige à gros grains.a coarse-grained beige powder.
10 g de cette poudre ont été introduits dans un sac plastique d'un broyeur 10 g of this powder were placed in a plastic bag of a grinder
de marque STOMACHER avec 90 ml de diluant. STOMACHER brand with 90 ml of thinner.
Ce diluant comprend un agent tensioactif constitué par le Tween 80 This diluent includes a surfactant consisting of Tween 80
permettant de limiter l'agrégation des bactéries. to limit the aggregation of bacteria.
Le produit solide ainsi dilué est homogénéisé pendant 2 minutes dans le The solid product thus diluted is homogenized for 2 minutes in the
broyeur.grinder.
ml de ce broyat sont ensuite transférés dans un tube plastique stérile et subissent une sonification à l'aide d'un sonificateur Vibracell (marque déposée) commercialisé par la société BIOBLOCK Scientific, pendant une durée de 10 ml of this ground material are then transferred into a sterile plastic tube and undergo sonification using a Vibracell sonicator (registered trademark) marketed by the company BIOBLOCK Scientific, for a period of 10
secondes à une fréquence de 40 watts. seconds at a frequency of 40 watts.
L'échantillon sonifié subit ensuite une centrifiltration pendant 1 mn à 1000 tr/mn dans un Chemfiltre (marque déposée) commercialisé par la société CHEMUNEX à Maison-Alfort. Cette centrifiltration a été effectuée sur papier The sonicated sample is then centrifuged for 1 min at 1000 rpm in a Chemfiltre (registered trademark) sold by the company CHEMUNEX in Maison-Alfort. This centrifugation was carried out on paper
cellulosique présentant des pores de 20 micromètres. cellulosic with pores of 20 micrometers.
La combinaison de la sonification de la centrifiltration permet d'optimiser l'extraction des cellules des cavités végétales du produit en limitant la présence de grosses particules et tout en maintenant un très grand degré de The combination of the sonication of the centrifugation optimizes the extraction of the cells from the plant cavities of the product by limiting the presence of large particles and while maintaining a very high degree of
viabilité desdites bactéries.viability of said bacteria.
Le filtrat récupéré lors de l'étape de centrifiltration est ensuite centrifugé dans un microtube pendant 1 mn à 10 000 tr/mn dans une centrifugeuse Sigma 3k10, commercialisée par la société BIOBLOCK Scientific. Cette centrifugation The filtrate recovered during the centrifugation step is then centrifuged in a microtube for 1 min at 10,000 rpm in a Sigma 3k10 centrifuge, sold by the company BIOBLOCK Scientific. This centrifugation
permet de récupérer les cellules bactériennes. helps recover bacterial cells.
Le culot de centrifugation est ensuite repris dans un diluant avec ou sans préincubation. Un traitement de sonification est nécessaire pour bien resuspendre ce culot pendant 5 secondes à 25 W. Le dénombrement des lactobacilles contenus dans le culot de centrifugation repris dans le diluant a été évalué par épifluorescence et par The centrifugation pellet is then taken up in a diluent with or without preincubation. A sonication treatment is necessary to properly resuspend this pellet for 5 seconds at 25 W. The enumeration of the lactobacilli contained in the centrifugation pellet taken up in the diluent was evaluated by epifluorescence and by
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dénombrement sur boîtes de culture. Le dénombrement sur boîtes a été effectué en réalisant une gamme de dilutions à partir de la suspension obtenue à partir du culot et en ensemençant celui-ci sur milieu gélosé spécifique à l'aide d'un count on culture dishes. The counting on boxes was carried out by carrying out a range of dilutions from the suspension obtained from the pellet and by inoculating the latter on specific agar medium using a
ensemenceur spirale.spiral seeder.
s Un comptage direct par épifluorescence a également été effectué en s A direct epifluorescence count was also carried out in
utilisant comme fluorochromes d'une part le DAPI (4',6-diaminidino-2-2- using DAPI as fluorochromes on the one hand (4 ', 6-diaminidino-2-2-
phénylindole-2HCI) et d'autre part le "Substrat de Viabilité" commercialisé par la société CHEMUNEX à Maison-Alfort. Le premier de ces composés colore en bleu l'ensemble des lactobacilles, morts et vivants tandis que le second ne colore phenylindole-2HCI) and on the other hand the "Viability Substrate" marketed by the company CHEMUNEX in Maison-Alfort. The first of these compounds colors all lactobacilli, dead and alive, in blue while the second does not color
que les vivants.than the living.
microlitres d'une solution de DAPI à 30 microgrammes par ml ont été ajoutés à 2ml de la solution contenant les lactobacilles. Le tout a été incubé mn à l'obscurité puis filtré à travers une membrane isopore. On a ensuite fait agir le " Substrat de Viabilité " avec une période d'incubation de 15 mn à l'obscurité. L'ensemble a été filtré sur membrane et rincé. La membrane a ensuite été séchée à l'air quelques minutes avant d'être déposée sur une lame de verre et les cellules ont été dénombrées au microscope (x 1000) à épifluorescence. Le comptage a été effectué en dénombrant 30 surfaces par membrane. Le mode de réalisation de l'invention ainsi décrite n'a pas pour objet de réduire la portée de celle-ci. En conséquence, il pourra y être apporté de nombreuses microliters of a DAPI solution at 30 micrograms per ml were added to 2ml of the solution containing the lactobacilli. The whole was incubated mn in the dark and then filtered through an isopore membrane. The "Viability Substrate" was then made to act with an incubation period of 15 min in the dark. The whole was filtered on a membrane and rinsed. The membrane was then air dried for a few minutes before being placed on a glass slide and the cells were counted under an epifluorescence microscope (x 1000). The counting was carried out by counting 30 surfaces per membrane. The embodiment of the invention thus described is not intended to reduce the scope thereof. As a result, there may be many
modifications sans sortir de son cadre. modifications without departing from its framework.
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| WO1985001892A1 (en) * | 1983-10-31 | 1985-05-09 | Unilever Nv | Manipulation of particles |
| GB2166659A (en) * | 1984-10-31 | 1986-05-14 | Unilever Plc | Processing particulate material |
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- 1999-02-08 FR FR9901588A patent/FR2789398B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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