FR2757538A1 - Gene de glutenine a faible masse moleculaire, vecteur d'expression contenant ce gene, microorganisme modifie avec ce vecteur, plants transgeniques contenant ce gene, et proteine codee par ce gene - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un gène de gluténine à faible masse moléculaire, duquel sont décrits l'isolement et la caractérisation et qui code une gluténine à faible masse moléculaire, laquelle est en relation avec les caractéristiques de bonne qualité du son et de la semoule ou mouture de blé dur. L'invention concerne aussi la protéine codée par ce gène et un vecteur d'expression contenant ce gène, ainsi qu'un microorganisme modifié avec ce vecteur. L'invention concerne en outre des plants transgéniques dont les cellules contiennent ledit gène, ainsi que des semences, de la mouture et dû son obtenus à partir de ces plants transgéniques.

Description

Gène de gluténine à faible masse moléculaire, vecteur d'expression
contenant ce gène, microorganisme modifié avec ce vecteur, plants
transgéniques contenant ce gène, et protéine codée par ce gène
La présente invention concerne un gène cloné et séquencé qui code une gluténine à faible masse moléculaire, laquelle est en relation avec les caractéristiques de bonne qualité du son et de la semoule ou mouture de blé dur. La présente invention concerne aussi un vecteur recombiné comportant ce gène et un microorganisme modifié avec ce vecteur, ainsi que des plantes transgéniques contenant ce gène, et la protéine que code ce gène,
On sait que les protéines de réserve du blé jouent un rôle fondamental à l'origine des propriétés nutritives de la farine et de son aptitude à la fabrication de pâte à pain et de pain. On classe les principales protéines de réserve en gliadines et gluténines en fonction de leur solubilité dans des solvants aqueux, de leur masse moléculaire et de leur composition en acides aminés.

Les gliadines sont des molécules monomères à faible masse moléculaire (30 à 70 kD (kilodaltons)) que l'on peut séparer par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en milieu tampon acide, et on les classe en quatre catégories, oc, ss, y eut so, dans l'ordre de décroissance de la mobilité. D'après leur séquence N-terminale d'acides aminés, on les classe en trois types, oc, y et (o ; les gliadines des deux premiers types contiennent des résidus de cystéine qui établissent des ponts disulfures intermoléculaires, alors que les #-gliadines ne contiennent pas de résidus d'acides aminés soufrés.

D'autre part, les gluténines sont des agrégats protéiques de masse moléculaire élevée, constitués de diverses chaînes polypeptîdi- ques maintenues assemblées par des ponts disulfures intermoléculaires.

Après les avoir réduites et sépares par électrophorèse, on constate qu'elles sont constituées de sous-unités à haute masse moléculaire (HMW, 80-120 kD) ou "sous-unités lourdes" et de sous-unités à faible masse moléculaire (LMW, 40-55 kD) ou "sous-unités légères
Les sous-unités à hautc masse moléculaire sont différentes des gliadines, non seulemcnt par cette caractéristique, mais aussi par le fait qu'elles contiennent plus dc résidus dc glycine et moins de rcsidus de proline. Les sous-unités légères ressemblent aux gliadines par leur composition en acides aminés ct par leur masse moléculaire mais elles peuvent former des ponts disulfures intermoleculaires et se lier aux sous-unites lourdes de gluténine pour former des agrégats qui sont insolubles dans les solutions alcooliques.

Presque toutes les protéines dc réserve du blé participent à la constitution du gluten, mais il existe des preuves biochimiques et gé- nétiques du fait que les sous-unités lourdes et légères des glutènines jouent un rôle essentiel à l'origine des propriétés visco-élastiques du gluten.

En particulier, on a montré que la présence de certaines gluténines à faible masse moléculaire, appelées "LMW-2", est responsa- hle des caractéristiques de bonne qualité du blé dur (Pogna et coll., J.

Cereal. Sci., 11, 15-34 (1990)), alors que chez le blé tendre les caractéristiques dc qualité sont liées à la présence d'une paire d'allèles dc gluténincs à haulc masse moléculaire, appelée "Dx5-Dyl()" (Paync et coll., (1987)).

L'analyse des protéines de caryopses de plants de blé issus dc croisements entre variétés ct de lignecs aneuploides a permis dc loca- liser les gènes des protéines de réserve sur les chromosomes et de déterminer leur mode de transmission héréditaire. On a en particulier localisé les gènes codant les sous-unités lourdes de gluténine sur les bras longs des chromosomes 1A ct I B, dans des loci complexes appe- lés "Glu-Al" et "Glu-Bl".

Les gluténines à faible masse moléculaire sont commandées par de nombrcux gènes situés dans les loci Glu-3 sur le bras court des chromosomes du groupe I des deux génomes A et B ct strictement associés aux gènes de y-gliadinc (Gli-l).

Les gènes qui codent certaines protéines de masse moléculaire élevée et les gliadines a, ss et Y ont été récemment séquences.

L'analyse des gènes codant les sous-unités légères de gluténine se bor- nait à quelques membres de cette famille. En particulier, on n'avait pas encore isolé les gènes qui codent les protéines LMW-2.

Mais maintenant, on a isolé un gène qui se trouve en relation avec les sous-unités de gluténine appelées LMW-2. Ce gène code une protéine à faible masse moléculaire, strictement associée aux caractéristiques techniques du son et de la semoule de blé dur. On peut utiliser le gène de la présente invention dans des programmes de modification génétique du blé, en vue d'obtenir des lignées de blé présentant de meilleures caractéristiques de qualité.

Par conséquent, I'un des objets de cette invention est un gène cloné et séquencé, "Séquence nO 1" de la liste de séquences annexée, qui code une protéine à faible masse moléculaire, strictement associée aux caractéristiques techniques du son et de la semoule de blé dur. Cette protéine constitue elle-même un autre objet de la présente invention.

D'autres objets de cette invention sont - un vecteur d'expression dans des cellules hôtes, obtenu par recombinaison et contenant ledit gène, déposé sous fonne intégrée dans la souche E. coli LMW-1CL, qui porte le numéro de dépôt CBS 999.96 - un microorganisme hôte modifié à l'aide d'un tel vecteur - des plants transgéniques modifiés à l'aide d'un tel vecteur et portant dans leurs cellules ledit gène, ainsi que des semences, des moutures ou des sons obtenus à partir de ces plants.

D'autres objets de cette invention apparaîtront à la lecture dc la description qui suit et des exemples donnés plus loin.

Plus précisément, on a isolé le gène de la présente invention à partir de l'ADN du génome d'une lignée de blé dur (Triticum dunim L.) qui présente d'excellentes caractéristiques de qualité. Pour ce faire, on peut utiliser des méthodes connues, comme l'analyse de banques de gènes et l'amplification d'ADN par réactions en chaîne de polymérase (PCR).

Il est préférable d'isoler ce gène par amplification, par PCR. de l'ADN génomique obtenu chez Triticum durum L., en utilisant des oligonucléotides appropriés en guise d'amorces.

En opérant de la manière indiquée ci-dessus, on isole un frag- ment d'ADN long de 1107 pb, qui correspond à tout le domaine codant la protéine mature constituée de 369 résidus d'acides aminés, "Séquence n 2" de la liste de séquences annexée, dont la masse moléculaire vaut 42242 daltons.

On a comparé la séquence des nucléotides de ce gène avec les séquences d'autres gènes de LMW actuellement connues, et en particulier, avec les deux séquences disponibles pour le blé dur et publiées par Cassidy et Dovarak (Théoi. Appui. Genet, 81, 653-660 (1991)) et par D'Ovidio et coll. (Plant Mol. BioL, 18, 781-784 (1992)). On a également comparé les séquences d'acides aminés des protéines codées par ces gènes. D'après les résultats de ces comparaisons, il y a entre ces séquences un degré élevé d'homologie, aussi bien dans les séquences de nucléotides que dans les séquences d'acides aminés. Plus précisé- ment, quand on compare les séquences d'acides aminés, on constate que les taux d'identité aux clones pLMW21 (D'Ovidio et coll., 1992) et pTdUCD1 (Cassidy et Dovarak, 1991) valent respectivement 71 % et 73 %. Le point isoélectrique pI de la protéine de l'invention, qui vaut 8,32, est un peu plus élevé que ceux des deux autres protéines codées par les gènes LMW21 (pI = 7,86) et TdUCD1 (pI = 7,54).

Il est intéressanl de noter que les dimensions moléculaires de la protéine de l'invention sont plus grandes que celles des deux autres gluténines à faible masse moléculaire décrites jusqu'à présent dans la littérature. On peut attribuer le fait que ces dimensions soient plus grandes à la présence d'un long domaine répété entre les positions 56 et 169. En outre, la protéine codée par ce gène comporte un résidu dc cystéine dans le domaine répété, mais n'en comporte pas dans la zonc initiale de la région N-terminale, là où l'on en trouve chez les autres sous-unités légères LMW connues.

On peut cloner le gène de cette invention dans un vecteur qui en permet l'expression chez des plantes, en le plaçant sous le contrôle de séquences regulatrices particulières (promoteur et terminateur) des gènes codant les protéines de réserve.

On dispose en elïet de certains vecteurs qui contiennent des domaines promoteurs spécifiques d'origine endospermique et qu'on t employés avec succès pour modifier du blé avec des gènes codant des sous-unités lourdes de gluténine (Blechl et Anderson, Nature Bio- tech., 14, 1155-1159 (1996)).

On peut aussi utiliser le gène de cette invention comme sonde pour étudier la variabilité du matériel génétique et pour identifier dc nouvelles formes allèles.

On a déposé le plasmide pLMW-lCL, qui contient le gène de cette invention, sous forme intégrée dans la souche E. coli LMW-1CL. au Centraalbureau voor Schimmelcultures, où l'on a attribué à cette souche le numéro de dépôt CBS 999.96.

Afin de mieux faire comprendre la présente invention, on présente ci-dessous, à titre d'illustration, des exemples non limitatifs.

Exemple 1 : Isolement du gène
A) Extraction de l'ADN du génome
On introduit 5 g de feuilles d'une lignée de blé dur (Triticum durum L.) dans un tube de Corning de 50 ml qui contient 45 ml de solution A, dont la composition est la suivante : 0,5 M de saccharose.

10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 80 mM de KCI, 1 mM de spermidine.

4 mM de spermine, 10 mM d'EDTA.

On homogénéise le matériau végétal à température ambiante. en répétant l'opération à quatre reprises pendant 5 secondes à vitesse moyenne. On filtre le produit homogénéisé sur de la gaze et du papier Miracloth (Calbiochem), puis on le centrifuge à 1000 x g pendant 2() minutes à 4 OC, dans une centrifugeuse (S34, modèle Sorvall RC-5B).

On lave le culot ainsi obtenu avec 30 ml de solution B (solution A, additionnée de 0,5 % de Triions X-100), et après 2() minutes de centrifugation à 1()00 x g, on remet le culot en suspension dans 20 ml de solution B.

Après 15 minutes de centrifugation à 1000 x g, on récupère Ic culot, puis on le remet en suspension dans 1 ml de solution tampon C (50 mM de Tris-HCl (pH 8), 10 mM d'EDTA, 10 mM de NaCl) conte- nant 300 1ll de solution à 2 mg/ml de Protéinase K. On continue ci brasser modérément la suspension à 37 C, pendant 30 minutes, puis on y ajoute du dodécylsulfate de sodium (SDS) en une concontration finale de 1 % et l'on maintient le tout à 60 C pendant 30 minutes.

Après avoir provoqué la lyse des noyaux en ajoutant 4 ml de solution D (solution C additionnée de 0,5 % dc SDS), on brasse délicatement le produit et on le fait incuber à 60 C pendant 30 minutes. On extrait ensuite la solution avec un mélange dc phénol et de chloroforme. ct l'on fait ensuite précipiter l'ADN génomique dans de l'éthanol absolu refroidi à -20 C, puis on le recucillc en s'aidant d'unc baguette dc ve@@e et on le remet en suspension dans 1 ml de solution tampon TE (10 mM de
Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM d'EDTA). On évalue par spectrophotometrie la quantité d'ADN génomique présente, au moyen d'un spectrophotomètre (modèle 480 dc Perkin-Elmer), et l'on trouve qu'il y en a 1 mg/ml.

B) Amplification
Dans le but d'isoler les gènes codant les protéines à faible masse moléculaire appelées LMW-2, on amplifie l'ADN génomique obtenu de la manière indiquée ci-dessus dans l'étape (A), selon la technique de réactions en chaîne de polymérase (PCR), en suivant les indications fournies par Saiki et coll., Science, 239, 487-491 (1988). el en utilisant comme amorces les deux oligonucléotides suivants
1) 5' CGT TGC GGC GAC AAG TGC AA 3'
2) 5' GTA GGC ACC AAC TCC GGT GC 3'
On réalise cette amplification dans un appareil DNA Thermal Cycler# 480 (Perkin-Elmer Cetus), cn utilisant un mélange réactionnel (100 l) contenant 150 ng d'ADN génomique, 10 mM de Tris-HCI (pH 8,3), 1,5 mM de MgCl2, 50 mM dc KCI, 0,01 % (p/v) de gélatine, 25 < ) ng de chacunc des deux amorces, 200 M de chaque désoxyribonucléotide (dNTP), et 2,5 unités d'ADN polymérase Taq (Pcrkin-Elmer).

Après avoir ajouté une goutte d'huile minérale, on fait démarrer le programme cyclique qui comporte: - 1 minute à 94 C (dénaturation de l'ADN) - 1 minute à 62 C (hybridation des amorces) - 1 minute à 72 C (allongement des chaînes d'ADN).

On effectue 30 cycles au total, et l'on termine cette opération en laissant le mélange pendant 7 minutes à 72 C pour réaliser l'allongement final des chaînes d'ADN.

On traite le produit d'amplification ainsi obtenu avec un mélange 1/1 de phénol et de chloroforme, on le fait précipiter avec une solution 3 M d'acétate de sodium (1/10 en volume) et de l'éthanol (2 volumes), et on le remet en suspension dans 20 l d'eau. Après purification sur un gel à bas point de fusion (SeaPlaque, FMC BioProducts) à 1,0 %, on isole un fragment d'ADN d'environ 1 2()() pb.

On détermine ensuite la séquence de nucléotides des régions terminales de ce fragment, en séquençant directement le produit d'amplification. En se fondant sur les séquences ainsi obtenues, on synthé- tise deux oligonucléotides dont les séquences sont les suivantes
3) 5' AGC CAT ATC CCT GGT TTG GAG 3'
4) 5' CCG GAG TTG GTG CCT ACT TA 3'
On amplifie le fragment de I 200 bases, à l'aide de ces deux oligonucléotides qui se situent à quelques dizaines de bases en aval des deux premières amorces. On clone ensuite 100 ng du produit de cette amplification dans 50 ng du plasmide pGEM-T (Proméga), dans 1() l d'un mélange de réaction de ligature contenant I unité d'ADN ligase de T4. On laisse cette réaction se poursuivre à 15 C pendant 18 heures.

C) Modification d'Escherichia coli
On utilise 5 l de ce mélange de ligature pour modifier 2()() tii de cellules d'E. coli xL I -Blue-MRF' (Stratagene, Californie, USA). rendues compétentes au moyen de CaCl2 (Dagert et Ehrlich, Gene, 6 23 (1979)). On effectue la réaction de modification dans de la glace pendant 30 minutes, puis à 42 OC pendant 1,5 minute, puis de nouveau dans de la glace pendant 1() minutes.

On ajoute au mélange réactionnel 1 ml de milieu LB, conte- nant 10 g/I de Bactotryptone# (DIFCO), 10 g/l de NaCI et 5 g/l d'extrait de levure, et l'on fait incuber le tout à 37 C pendant 1 heure.

Après 30 minutes de centrifugation à 14 000 t/min, on recueille les cellules et on les remet en suspension dans 2(X) til de milieu LB. Avec cette suspension, on ensemence une plaque de milieu LB gélosé contenant 40 g/l de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-thiogalactopyranoside).

125 g/ml d'IPTG (isopropyl-ss-D-thiogalactopyranoside) et 100 g/ml d'ampicilline. On laisse la plaque incuber à 37 C pendant 16 heures.

D) Extraction de l'ADN plasmidique
On récolte les colonies blanches, résistantes à l'ampicilline. et on les inocule dans des tubes d'Eppendorf contenant 1,5 ml de milieu
LB additionné de 100 g/ml d'ampicilline. On laisse les tubes incube à 37 C pendant 18 heures, sous agitation modérée (2()() t/min).

On soumet la culture de bactéries à I minute de centrifuga- tion à 14 000 t/min. Après avoir jeté le surnageant, on remet Ic culot en suspension dans 15() ttl de solution tampon SET (50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM d'EDTA et 20 % de saccharose). Après y avoir ajouté 350 ,ul de solution lytique contenant (),2 M de NaOH et 1 'i; de SDS. on maintient les échantillons dans de la glace pendant 10 minutes.

On ajoute ensuite à chaque échantillon 250 l de solution 3 M d'acétate de potassium (pH 4,8) et l'on fait incuber le tout dans de la glace pendant 20 minutes, puis on le soumet à 10 minutes de contrilu- gation à 14 000 t/min. On ajoute de l'éthanol absolu au surnageant et on soumet le tout à 10 minutes de centrifugation à 14 000 t/min. Après décantation du surnageant, on récupère le culot et on le fait sécher pendant 10 minutes sous le vide d'une pompe, puis on le remet en suspension dans 2() ul de solution tampon TE (pH 8). On nomme LMW 1CL l'un des clones positifs.

Exemple 2
Pour vérifier la nalure des produits d'amplification et celle des plasmides recombinés, on effectue des expériences de transfert d'ADN (transfert de Southern) en utilisant comme sonde le clone pLMW2 1 qui comporte un gène de 856 pb, codant une sous-unité légère LMW-GS (R. D'Ovidio et coll., Point Mol. Biol., , 781-784 (1992)).

A) Préparation de la sonde
On amplifie par PCR le fragment correspondant au gène men tionné ci-dessus, en opérant de la façon indiquée dans l'Exemple I. et on le purifie à l'aide d'un système Quiaquick-spin# (Quiagen), en y ajoutant 0,5 volume de solution PB (solution tampon Binding) et en mettant la solution dans la colonne du système Quiaquick-spin. On soumet cette colonne à 60 secondes de centrifugation, puis on la lave avec de la solution de lavage PE (Quiagen). On élimine cette solution par centrifugation durant 60 secondes, et l'on élue l'ADN avec 5() Cil de solution 10 mM de Tris-HCl (pH 8,5).

En opérant selon une technique standard (Sambrook cl coll.,
Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), on marque par translation de coupure 700 ng de l'ADN ainsi purifié. On récupère par centrifugation l'ADN marqué, on le remet en suspension dans 50 l de solution tampon TE (1() mM de
Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM d'EDTA) ct on l'utilise dans des expériences d'hybridation.

B) Hybridations moléculaires
On amplifie par PCR, dans les conditions indiquées plus haut, les fragments d'ADN insérés dans les clones recombinés.

On dépose les mélanges réactionnels sur un gel d'agarose à 1,2 S, dans une solution tampon lxTBE (0,089 M de Tris-HCl, 0,089 M d'acide borique, 0,02 M d'EDTA) et on les soumet à une tension de 100 V pendant 2 heures. On rend visibles les bandes d'ADN par colo- ration au bromure d'éthidium (0,5 g/ml), puis on les transfere sur un filtre en nylon (Amersham) selon la technique de transfert de Southern (Maniatis et coll., Molecular Cloning : A Practical Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor, New York (1982)).

On réalise les réactions d'hybridation dans des boîtes de matière plastique, à 67 C, dans une solution contenant (),()2 % p/v dc
SDS, (), 1 '76 p/v de N-lauroylsarcosine, de la solution tampon 5xSSC ct 0,5 % p/v dc réactif de blocage (Boehringer).

On hybride les ADN présents sur les filtres avec la sonde marquée, en présence de digoxigénine Après hybridation, on lave les filtres à deux reprises avec de la solution tampon 2xSSC ((),3 M de
NaCl et 0,3 M de citrate de sodium, pH 7) additionnée de (), 1 'it,, p/v de
SDS, à la température ambiante pendant 5 minutes, puis à deux repri- ses avec de la solution tampon 1xSSC additionnée de (),1 % p/v de
SDS, à 67 C pendant 15 minutes.

On vérifie que l'hybridation des séquences homologues a bien eu lieu, à l'aide des solutions suivantes - solution 1:100 mM de Tris-HCl (pH 7,5) et 100 mM de NaCI - solution 2 : solution 1 additionnée de 1 % de réactif de blocage (Boehringer) - solution 3 100 mM de Tris-HCl (pH 9,5), 100 mM d'HCI et 50 mM
de MgCl2 - solution 4:10 mM de Tris-HCl (pH 8) et I mM d'EDTA.

On lave le filtre avec la solution 1, puis on le fait incuber pendant 30 minutes dans le solution 2, en présence d'un anticorps antidigoxigénine-AP (Boehringer), utilisé en une proportion de 1 l pour 10 ml de solution 2. On élimine l'excès d'anticorps en effectuant deux lavages de 15 minutes avec la solution 1, puis on équilibre le filtre pendant 3 minutes dans la solution 3. Toutes les opérations indiquées ci-dessus sont effectuées à la température ambiante et sous agitation.

On recouvre enfin le filtre d'une solution colorante (45 l de solution de NBT (nitrobleu de tétrazolium) et 35 l de solution de x-phosphate dans 10 ml de solution 3), on le met dans l'obscurité et on laisse la réaction se dérouler. A la fin, on élimine l'excès de solution colorante et on lave le filtre avec la solution 4. Une réaction d'hybridation avec la sonde donne un résultat positif.

Exemple 3 : Caractérisation du gène
On détermine la séquence de nucléotides en utilisant comme modèles le produit d'amplification du fragment de 1 200 pb et le clone de plasmide pLMW-lCL, à l'aide d'ADN polymérase de Taq, employée selon les indications du fabricant (Perkin-Elmer).

La séquence nucléotidique de ce gène comporte 1 107 pb et correspond à tout le domaine qui code la protéine mature (Séquence n 2). La séquence d'acides aminés qu'on en déduit est constituée de 369 résidus d'acides aminés ; la masse moléculaire de cette protéine vaut 42 242 daltons, et son point isoélectrique pI vaut 8,32.

En accord avec ce que l'on a déjà observé pour cette classe de protéines de réserve, I'analyse de la composition en acides aminés, indiquée dans le tableau 1, montre qu'il y a une forte proportion de residus de glutamine (36 %) et de proline (17 5S).

Tablcau I
Acide Nombre Pourcentage Acidc Nombre Pourcentage
aminé de résidus (%) aminé de résidus (%)
Ala 8 1,9 Leu 35
Arg 7 1,6 Lys 1 0,2
Asn 3 0,7 Met 5 1,2
Asp 0 () Phe 23 5,5
Cys 8 1,9 Pro 71 17,1
Gln 146 35,2 Ser 39 9,4
Glu 4 0,9 Thr 10 2,4
Gly 9 2,1 Trp 2 (),4
His 9 2,1 Tyr 4 0,9
lie 13 3,1 Val 17 4,1
On a comparé la séquence nucléotidique de ce gène LMW I CL avec les séquences d'autres gènes de LMW actuellemcnt connues, et en particulier, avec les deux séquences disponibles pour le blé dur et publiées par Cassidy et Dovarak (1991) et par D'Ovidio cl roll.

(1992). On a également comparé les séquences d'acides aminés des protéines codées par ces gènes D'après les résultats de ces analyses comparatives, il y a entre ces séquences un degré élevé d'homologie, aussi bien dans les séquences de nucléotides que dans les séquences d'acides aminés. En particulier, quand on compare les séquences d'acide des aminés, on constatc que les taux d'identité aux clones pLMW2 I (D'Ovidio et coll., 1992) et pTdUCD1 (Cassidy et Dovarak, 1991) valent respectivement 71 min et 73 %.

Le point isoélectrique pi de la protéine de l'invention est un peu plus élevé que ceux des deux autres protéines codées par les gènes
LMW21 (pI = 7,86) et TdUCD1 (pI = 7,54).

Il est intéressant de noter que les dimensions moléculaires de la protéine dc cette invention sont plus grandes que celles des deux autres gluténines à faible masse moléculaire décrites jusqu'à présent dans la littératurc. On peut attribuer Ic fait que ces dimcnsions soient plus grandes à la présence d'un long domaine répété entre les positions 56 et 194. En outre, la protéine codée par cc gène comporte un résidu dc cystéine dans le domaine répété, mais n'en comporte pas dans la zone initiale de la région N-terminale, là où l'on en trouve chez les autres sous-unités légères LMW connues.

La prcuve du fait qu'il existc une corrélation entre le gène de cette invention ct les sous-unités de gluténine LMW-2 découle des constatations suivantes - le produit d'amplification contenu dans le clone pLMW-1CL nc se trouve que dans les cultivars qui contiennent des sous-unités de gluténinc LMW-2; - la valeur de la masse moléculaire (42 242 daltons) de la protéine codée par ce gène concorde bien avec la valcur estimée, par électrophorèse en gel de polyacrylamide contenant du SDS (SDS-PAGE), pour les sous-unités de gluténine LMW-2 (45 00() daltons).

Annexe : Liste de Séquences
Nombre de séquences : 6
I) Informations sur la séquence n 1
1) Caractéristiques de cette séquence
a) longueur : 1 107 paires de base
b) type : acide nucléique
c) caténarité : monocaténaire
d) topologie : linéaire
2) Type de molécule: ADN (génomique)
11) Description de cette séquence :
AGCCATATCC CTGGTTTGGA GAGACCATCG CAGCAACAAC CATTACCACC 50
ACAACAAACA TTATCGCACC ACCACCAACA ACAACCCATC CAACAACAAC 100
CACACCAATT TCCACAACAG CAACCATGTT CACAGCAACA ACAACAACCA 150
CCATTATCGC AACAACAACA ACCACCATTT TCGCAGCAAC AACAACCACC 200
ATTTTCACAG CAACAACAAC CAGTTC
II) Informations sur la séquence n 2
1) Caractéristiques de cette séquence
a) longueur : 369 résidus d'acides aminés
b) type : protéine
c) caténarité : monocaténaire
d) topologie : linéaire
11) Description de cette séquence :
Ser His Ile Pro Gly Leu Glu Arg Pro Ser Gln Gln Gin Pro Leu Pro Pro Gin Gln Thr
5 10 15 20
Leu Ser His His His Gln Gln Gln Pro Ile Gln Gln Gln Pro His Gln Phe Pro Gln Gln
25 30 35 40
Gln Pro Gys Ser Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Leu Ser Gln Gln Gln Gln Pro Pro Phe
45 50 55 60
Ser Gln Gln Gln Gln Pro Pro Phe Ser Gln Gln Gln Gln Pro Val Leu Pro Gln Gln Pro
65 @0 75 80
Ser Phe Ser Gln Gln Gln Leu Pro Pro Phe Ser Gln Gln Gln Gln Pro Pro Phe Ser Gln
85 90 95 100
Gln Gln Gln Pro Val Leu Pro Gln Gln Pro Ser Phe Ser Gln Gln Gln Leu Pro Pro Phe
105 110 115 120
Ser Gln Gln Leu Pro Pro Phe Ser Gln G;n Gin Pro Val Leu Pro Gln Gin Pro Pro Phe
125 130 135 140
Ser Gln Gln Gln Pro Pro Pro Phe Ser Gln Gln Leu Pro Pro Phe Ser Gln Gln Gln Gln
145 150 155 160
Pro Val Leu Pro Gln Gln Pro Pro Phe Ser Gln Gln Gln Gln Gln Pro Ile Pro Pro Gln
165 170 175 180
Gln Pro Pro Phe Ser Gln Gln Gln Gln Pro Val Leu Leu Gln Gln Gln Ile Pro Phe Val
185 190 195 200
His Pro Ser Ile Leu Gln Gln Leu Asn Pro Cys Lys Val Phe Leu Gln Gln Gln Cys Ser
205 210 215 220
Pro Trp Ala Met Pro Gln Ser Leu Ala Arg Ser Gln Met Leu Gln Gin Ser Ser Cys His
225 230 235 240
Val Met Gln Gln Gln Cys Cys Gln Gln Leu Pro Gln Ile Pro Gln Gln Ser Arg Tyr Glu
245 250 255 260
Ala Ile Arg Ala Ile Val Tyr Ser Ile le Leu Gln Glu Gln Gln Gln Val Gln Gly Ser
265 270 275 280
Ile Gln Thr Gln Gln Gln Gln Pro Gln Gln Leu Gly Gln Cys Val Ser Gln Pro Gln Gln
285 290 295 300
Gln Ser Gln Gln Gln Leu Gly Gln Gln Pro Gln Gln Gln Gln Leu Ala His Gly Thr Phe
305 310 315 320
Leu Gln Pro His Gln Ile Ala Gln Leu Glu Val Met Thr Ser Ile Ala Leu Arg Thr Leu
325 330 335 340
Pro Thr Met Cys Asn Trp Asn Val Pro Leu Tyr Arg Thr Thr Thr Arg Val Pro Phe Gly
345 350 355 360
Val Gly Thr Gly Val Gly Ala Tyr Leu
365
III) Informations sur la séquence n 3
I ) Caractéristiques de cette séquence
a) longueur : 20 paires de base
b) type : acide nucléique
c) caténarité : monocaténaire
d) topologie: linéaire
2) Type de molécule : amorce
11) Description de cette séquence
CGTTGCGGCG ACAAGTGCAA 2()
IV) Informations sur la séquence n 4
1) Caractéristiques de celte séquence
a) longueur : 20 paires de base
b) type : acide nucléique
c) caténarité : monocaténaire
d) topologie : linéaire
2) Type de molécule : amorce
11) Description de cette séquence
GTAGGCACCA ACTCCGGTGC 2()
V) Informations sur la séquence n 5
1) Caractéristiques de cette séquence
a) longueur : 21 paires de base
b) type : acide nucléique
c) caténarité : monocaténaire
d) topologic : linéaire
2) Type de molécule: amorce
11) Description de cette séquence
AGCCATATCC CTGGTTTGGA G 21
VI) Inlèrmations sur la séquence n 6
I) Caractéristiques de cette séquence
a) longucur : 20 paires de base
b) type : acide nucléique
c) caténarité : monocaténaire
d) topologic : linéaire
2) Type de molécule : amorce
11) Description de cette séquence
CCGGAGTTGG TGCCTACTTA 20

Claims (7)

REVENDICATIONS

1. Gène isolé de l'ADN du génome de Triticum durum L. caractérisé en ce qu'il comporte la séquence de nucléotides appelée "Séquence n 1" dans la Liste de séquences annexée.

2. Vecteur d'expression obtenu par recombinaison, caractérise en ce qu'il contient un gène comportant la séquence de nucléotides appelée "Séquence n I" dans la Liste de séquences annexée.

3. Vecteur coniorrne à la revendication 2, déposé sous forme intégrée dans la souche E. coli LMW-1CL, qui porte le numéro de dépôt CBS 999.96.

4. Microorganisme modifie, caractérisé en ce quton l'a modifié avec un vecteur d'expression obtenu par recombinaison, conforme à la revendication 2.

5. Plants transgéniques, caractérisés en ce qu'ils portent, dans leurs cellules, un gène comportant la séquence de nucléotides appelée "Séquence n I" dans la Liste de séquences annexée.

6. Semences caractérisées en ce qu'on les a obtenues à partir de plants transgéniques conformes à la revendication 5.

7. Mouture et son, caractérisés en ce qu'on les a obtenus à partir de plants transgéniques conformes à la revendication 5.

X. Protéine caractérisée en ce qu'elle présente une masse moléculaire d'environ 42 242 daltons et un point isoélectrique de X.32. et en ce qu'elle comporte la séquence de résidus d'acides aminés appe- lée "Séquence n 2" dans la Liste de séquences annexée.