FR2751972A1 - New amidinium-substituted carbamate derivatives of cholesterol or alkanolamine - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention concerne de nouveaux composés apparentés à la famille des amidiniums dont en particulier les guanidiniums, des compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications. The present invention relates to new compounds related to the amidinium family including in particular the guanidiniums, pharmaceutical compositions containing them and their applications.
Plus précisément, la présente invention se rapporte à des composés de formule générale I et leurs sels
dans laquelle:
- R1 représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino
NR'R" avec R' et R" représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22,
R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule générale II avec au moins l'un d'entre eux différent d'un atome d'hydrogène,
- R1 represents a derivative of cholesterol or an alkyl amino group
NR'R "with R 'and R" representing, independently of one another, an aliphatic radical, saturated or not, linear or branched in C12 to C22,
R2 and R3 represent, independently of one another, a hydrogen atom or a group of general formula II with at least one of them other than a hydrogen atom,
dans laquelle:
- n et m représentent indépendamment l'un de l'autre et de manière distincte entre les groupements R2 et R3 un entier compris entre 0 et 4,
- R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule III
- n and m represent, independently of one another and in a distinct manner between the groups R2 and R3, an integer between 0 and 4,
- R4 and R5 represent, independently of one another, a hydrogen atom or a group of formula III
dans laquelle
p et q représentent indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 4 et r est égal à O ou 1, avec pour r égal à 1
X représentant un groupement NH et x étant alors égal à 1 ou
X représentant un atome d'azote et x étant alors égal à 2.in which
p and q represent, independently of each other, an integer between 0 and 4 and r is equal to O or 1, with for r equal to 1
X representing an NH group and x then being equal to 1 or
X representing a nitrogen atom and x then being equal to 2.
avec p, q et r pouvant varier indépendamment entre les groupements R4 et R5. with p, q and r being able to vary independently between the groups R4 and R5.
A titre de sous-famille préférée, on citera plus particulièrement dans le cadre de
la présente invention les composés de formule générale I dans laquelle R2 ou R3
représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement
de formule IV
the present invention the compounds of general formula I in which R2 or R3
independently of one another represent a hydrogen atom or a group
of formula IV
dans laquelle
n, m et p sont définis comme précédemment et R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupement de formule V
n, m and p are defined as above and R4 represents a hydrogen atom or a group of formula V
avec q et r définis comme précédemment,
et avec m, n, p? q et r pouvant varier de manière indépendante entre les différents groupements R2 et R3.with q and r defined as previously,
and with m, n, p? q and r being able to vary independently between the various groups R2 and R3.
Ces nouveaux produits de formule générale (I) peuvent se présenter sous forme de sels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables. Ces sels non toxiques comprennent les sels avec les acides minéraux (acides chlorhydrique, sulfurique, bromhydrique, phosphorique, nitrique) ou avec les acides organiques (acides acétique, propionique, succinique, maléique, hydroxymaléique, benzoïque, fumarique, méthanesulfonique ou oxalique) ou avec les bases minérales (soude, potasse, lithine, chaux) ou organiques (amines tertiaires comme la triéthylamine, la pipéridine, la benzylamine). These new products of general formula (I) can be provided in the form of non-toxic and pharmaceutically acceptable salts. These non-toxic salts include salts with mineral acids (hydrochloric, sulfuric, hydrobromic, phosphoric, nitric acids) or with organic acids (acetic, propionic, succinic, maleic, hydroxymaleic, benzoic, fumaric, methanesulfonic or oxalic acids) or with mineral (soda, potash, lithine, lime) or organic bases (tertiary amines such as triethylamine, piperidine, benzylamine).
A titre représentatif des composés selon l'invention on peut plus particulièrement citer les composés de sous-formules générales suivantes:
(H2N)2+ C- NH - (CH2)2 -NH -COO- R1 VI
[(H2N)2+ C- NH - (CH2)3 ] [(H2N)2 C± NH - (CH2)4 ] -N-COO - R1 VII
[(H2N)2+ C- NH - (CH2)2 ] 2- N-( CH2)2 -NH -COO- R1 VIII
[(H2N)2+ C- (CH2)2]2 N - COO - R1 IX
[ [(H2N)2+ C- (CH2)2] 2- N-( CH2)2] 2N - COO - R1 X
dans lesquelles R1 possède la définition précédente.By way of representative of the compounds according to the invention, mention may more particularly be made of the compounds of the following general sub-formulas:
(H2N) 2+ C- NH - (CH2) 2 -NH -COO- R1 VI
[(H2N) 2+ C- NH - (CH2) 3] [(H2N) 2 C ± NH - (CH2) 4] -N-COO - R1 VII
[(H2N) 2+ C- NH - (CH2) 2] 2- N- (CH2) 2 -NH -COO- R1 VIII
[(H2N) 2+ C- (CH2) 2] 2 N - COO - R1 IX
[[(H2N) 2+ C- (CH2) 2] 2- N- (CH2) 2] 2N - COO - R1 X
where R1 has the previous definition.
A titre représentatif des guanidiniums et amidiniums revendiqués, on peut plus particulièrement citer les composés des sous formules précédentes VII ,VIII et IX avec R1 y représentant un groupement cholestéryle. Les trois composés seront respectivement identifiés ci-après sous la désignation BGSC ( Bis Guanidino
Spermidine Cholesterol) et BGTC (Bis Guanidino Tren Cholesterol) et B.A.D.C..(bis chlorhydrate de Bis Amidinium Diéthylènetriamine cholesterol). By way of representative of the guanidiniums and amidiniums claimed, mention may more particularly be made of the compounds of the preceding sub-formulas VII, VIII and IX with R1 representing a cholesteryl group therein. The three compounds will be respectively identified below under the designation BGSC (Bis Guanidino
Spermidine Cholesterol) and BGTC (Bis Guanidino Tren Cholesterol) and BADC (bis hydrochloride of Bis Amidinium Diethylenetriamine cholesterol).
Les composés revendiqués sont tout particulièrement intéressants sur le plan thérapeutique pour leurs caractères non toxiques et leur propriétés amphiphiles. The claimed compounds are very particularly advantageous from a therapeutic point of view for their non-toxic characters and their amphiphilic properties.
Compte -tenu de ces qualités, il peuvent notamment être utilisés pour la complexation d'acides nucléiques dans la perspective d'une transfection cellulaire de ceux-ci. Ces composés peuvent donc être avantageusement employés en thérapie génique.Taking these qualities into account, they can in particular be used for complexing nucleic acids with a view to their cell transfection. These compounds can therefore be advantageously used in gene therapy.
Les composés VII (BGSC) et VIII (BGTC) sont tout particulièrement intéressantS pour le transfert de gène in vivo. Ces deux composés se complexent avec l'ADN et le protègent contre la dégradation due aux variations de pH lors du transport vers la cellule. Compounds VII (BGSC) and VIII (BGTC) are very particularly useful for gene transfer in vivo. These two compounds complex with DNA and protect it against degradation due to changes in pH during transport to the cell.
L'invention concerne donc une composition pharmaceutique qui comprend au moins un composé selon l'invention. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention le composé est le Bis Guanidino Spermidine Cholesterol (BGSC) et dans un autre mode préféré le composé est le Bis Guanidino Tren Cholesterol (BGTC). The invention therefore relates to a pharmaceutical composition which comprises at least one compound according to the invention. In a preferred embodiment of the invention the compound is Bis Guanidino Spermidine Cholesterol (BGSC) and in another preferred embodiment the compound is Bis Guanidino Tren Cholesterol (BGTC).
La thérapie génique a pour principal objectif de corriger des maladies génétiques associées à un défaut d'expression et/ou une expression anormale, c'est à dire déficiente ou excessive, d'un ou plusieurs acides nucléiques. On tente de suppléer à ce type d'anomalies génétiques par le biais de l'expression cellulaire in vivo ou in vitro de gènes clonés. The main objective of gene therapy is to correct genetic diseases associated with a defect of expression and / or an abnormal expression, that is to say deficient or excessive, of one or more nucleic acids. An attempt is made to compensate for this type of genetic anomalies through the cellular expression in vivo or in vitro of cloned genes.
Aujourd'hui, plusieurs méthodes sont proposées pour la délivrance intracellulaire de ce type d'information génétique. L'une des technologies actuellement mises en oeuvre, repose précisément sur l'emploi de vecteurs chimiques ou biochimiques. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'ADN à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, à travers les deux membranes nucléaires. Today, several methods are proposed for the intracellular delivery of this type of genetic information. One of the technologies currently implemented is based precisely on the use of chemical or biochemical vectors. These synthetic vectors have two main functions, to compact the DNA to be transfected and to promote its cellular attachment as well as its passage through the plasma membrane and, where appropriate, through the two nuclear membranes.
Des lipides cationiques chargés positivement comme le chlorure de N-[1-(2,3- dioleyloxy)propyl] -N,N,N-triméthylammonium (DOTMA) ont ainsi été proposés.Positively charged cationic lipids such as N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) have thus been proposed.
Avantageusement, ils interagissent, sous la forme de liposomes ou de petites vésicules, spontanément avec de l'ADN, qui est lui chargé négativement, pour former des complexes lipides-ADN, capables de fusionner avec les membranes cellulaires, et permettent ainsi la délivrance intracellulaire de l'ADN. Toutefois, dans le cas particulier du DOTMA, sa bonne efficacité au niveau de la transfection demeure malheureusement associée à un défaut de biodégradabilité et un caractère toxique à l'égard des cellules.Advantageously, they interact, in the form of liposomes or small vesicles, spontaneously with DNA, which is itself negatively charged, to form lipid-DNA complexes, capable of fusing with cell membranes, and thus allow intracellular delivery. DNA. However, in the particular case of DOTMA, its good efficiency at the transfection level unfortunately remains associated with a lack of biodegradability and a toxic nature with regard to cells.
Depuis le DOTMA, d'autres lipides cationiques ont été développés sur ce modèle de structure: groupe lipophile associé à un groupement amino via un bras dit "spacer". Parmi ceux-ci, on peut plus particulièrement citer ceux comprenant à titre de groupement lipophile deux acides gras ou un dérivé du cholestérol, et comportant, en outre, le cas échéant, à titre de groupement amino, un groupement d'ammonium quaternaire. Les DOTAP, DOBT ou le ChOTB peuvent notamment être cités à titre représentatifs de cette catégorie de lipides cationiques. Since DOTMA, other cationic lipids have been developed on this structural model: lipophilic group associated with an amino group via a so-called "spacer" arm. Among these, mention may more particularly be made of those comprising, as lipophilic group, two fatty acids or a derivative of cholesterol, and further comprising, where appropriate, as amino group, a quaternary ammonium group. DOTAP, DOBT or ChOTB can in particular be mentioned as representative of this category of cationic lipids.
De part leur structure chimique et leur caractère biodégradable, les composés revendiqués répondent précisément aux exigences requises pour un vecteur de transfection d'acides nucléiques. By virtue of their chemical structure and their biodegradability, the claimed compounds precisely meet the requirements required for a nucleic acid transfection vector.
La présente invention vise donc également toute application de ces nouveaux composés dans la transfection in vitro, ex vivo et/ou in vivo de cellules et notamment pour la vectorisation d'acides nucléiques. Elle se rapporte en particulier à toute composition pharmaceutique comprenant, outre au moins un composé selon l'invention, un acide nucléique. The present invention therefore also relates to any application of these new compounds in the in vitro, ex vivo and / or in vivo transfection of cells and in particular for the vectorization of nucleic acids. It relates in particular to any pharmaceutical composition comprising, in addition to at least one compound according to the invention, a nucleic acid.
Dans les compositions de la présente invention, l'acide nucléique associé à au moins un composé revendiqué peut être aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences oligonucléotidiques ou polynucléotidiques d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt, d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Ils comportent de préférence un gène thérapeutique. In the compositions of the present invention, the nucleic acid associated with at least one claimed compound can be a deoxyribonucleic acid as well as a ribonucleic acid. They may be oligonucleotide or polynucleotide sequences of natural or artificial origin, and in particular genomic DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, hybrid sequences or synthetic or semi-synthetic sequences. synthetic. These nucleic acids can be of human, animal, plant, bacterial, viral, etc. origin. They preferably comprise a therapeutic gene.
Un autre objet de l'invention porte donc sur une composition pharmaceutique contenant en outre un acide nucléique. Préférentiellement cet acide nucléique est soit un acide désoxyribonucléique soit un acide ribonucléique. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique. Another subject of the invention therefore relates to a pharmaceutical composition additionally containing a nucleic acid. Preferably, this nucleic acid is either a deoxyribonucleic acid or a ribonucleic acid. In a preferred embodiment of the invention the nucleic acid comprises a therapeutic gene.
Au sens de l'invention, on entend par gène thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire. For the purposes of the invention, the term therapeutic gene is understood to mean in particular any gene encoding a protein product having a therapeutic effect. The protein product thus encoded can be a protein, a peptide, etc. This protein product can be homologous with respect to the target cell (that is to say a product which is normally expressed in the target cell when the latter does not present any pathology). In this case, the expression of a protein makes it possible, for example, to overcome insufficient expression in the cell or the expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or else to overexpress said protein. The therapeutic gene can also encode a mutant of a cellular protein, having increased stability, altered activity, etc. The protein product can also be heterologous with respect to the target cell. In this case, an expressed protein can for example complete or provide a deficient activity in the cell, allowing it to fight against a pathology, or stimulate an immune response.
Les lipides cationiques décrits dans la présente invention, et, en particulier, le
BGTC et le BGSC, sont capables de se complexer avec l'ADN, et représentent une alternative avantageuse aux vecteurs viraux pour le transfert d'acides nucléiques d'intérêt thérapeutique, in vitro, ex vivo ou in vivo. Du fait des propriétés chimiques des groupes guanidinium, et en particulier de leur pKa élevé, ces lipides cationiques sont capables de protéger les molécules d'ADN contre les dégradations dues aux variations de pH. Les résultats présentés dans les exemples montrent que ces composés permettent la transfection de nombreux types cellulaires, avec une grande efficacité. L'efficacité de la transfection dépend en particulier du rapport lipide cationique / ADN dans les complexes formés. Un rapport entre les deux composés particulièrement favorable pour la transfection consiste à avoir 6 à 8 groupes guanidinium pour un groupe phosphate sur l'ADN. The cationic lipids described in the present invention, and, in particular, the
BGTC and BGSC are capable of complexing with DNA, and represent an advantageous alternative to viral vectors for the transfer of nucleic acids of therapeutic interest, in vitro, ex vivo or in vivo. Due to the chemical properties of the guanidinium groups, and in particular their high pKa, these cationic lipids are able to protect DNA molecules against degradation due to variations in pH. The results presented in the examples show that these compounds allow the transfection of numerous cell types, with great efficiency. The efficiency of transfection depends in particular on the cationic lipid / DNA ratio in the complexes formed. A particularly favorable ratio between the two compounds for transfection consists in having 6 to 8 guanidinium groups for one phosphate group on the DNA.
L'efficacité de transfection des complexes lipide cationique /DNA peut en outre être améliorée par addition de lipide neutre, et formation de liposomes cationiques. The transfection efficiency of cationic lipid / DNA complexes can further be improved by addition of neutral lipid, and formation of cationic liposomes.
Ces liposomes sont formés par un complexe entre le lipide cationique et le lipide neutre. Celui-ci peut être choisi parmi
- la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE),
- l'oléoyl-palmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE),
- le di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamine
- leurs dérivés N-méthylés 1 à 3 fois;
- les phosphatidylglycérols,
- les diacylglycérols,
- les glycosyldiacylglycérols,
- les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides),
- les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines)
- et les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et GM2).These liposomes are formed by a complex between the cationic lipid and the neutral lipid. This can be chosen from
- dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE),
- oleoyl-palmitoylphosphatidylethanolamine (POPE),
- di-stearoyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidylethanolamine
- their N-methylated derivatives 1 to 3 times;
- phosphatidylglycerols,
- diacylglycerols,
- glycosyldiacylglycerols,
- cerebrosides (such as in particular galactocerebrosides),
- sphingolipids (such as in particular sphingomyelins)
- and asialogangliosides (such as in particular asialoGM1 and GM2).
On utilise préférentiellement la DOPE. DOPE is preferably used.
Préférentiellement, le composé de l'invention et le lipide neutre sont présents dans un rapport compris entre 1 et 5, plus préférentiellement 2 et 4. En outre le rapport lipide total (composé de l'invention plus lipide neutre) sur DNA est avantageusement choisi de sorte que le rapport net de charges positives soit compris entre 2 et 5. Particulièrement avantageusement, le rapport est de 3 environ. Preferably, the compound of the invention and the neutral lipid are present in a ratio of between 1 and 5, more preferably 2 and 4. In addition, the total lipid ratio (compound of the invention plus neutral lipid) to DNA is advantageously chosen. so that the net positive charge ratio is between 2 and 5. Particularly preferably, the ratio is about 3.
L'invention concerne donc également toute composition pharmaceutique comprenant un composé selon l'invention, un lipide neutre et un acide nucléique. The invention therefore also relates to any pharmaceutical composition comprising a compound according to the invention, a neutral lipid and a nucleic acid.
Préférentiellement le composé selon l'invention est choisi parmi le BGTC et le BGSC. Preferably, the compound according to the invention is chosen from BGTC and BGSC.
Tout aussi préférentiellement le lipide neutre est la DOPE. L'acide nucléique est soit un acide désoxyribonucléique soit un acide ribonucléique. Préférentiellement l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique.Equally preferentially, the neutral lipid is DOPE. Nucleic acid is either a deoxyribonucleic acid or a ribonucleic acid. Preferably the nucleic acid comprises a therapeutic gene.
Outre cette application des dérivés d'amidinium revendiqués, il est également possible d'envisager leur valorisation dans les applications suivantes: interférence au niveau d'interactions entre acides nucléiques et protéines résultant dans une inhibition ou stimulation de certains processus par exemple de régulation d'expression génétique ou d'activité enzymatique ( polymérase, transcriptase, etc....), complexation sélective d'espèces anioniques pour leur extraction, leur élimination ou leur détection à l'aide de sondes/électrodes à membrane par exemple. In addition to this application of the claimed amidinium derivatives, it is also possible to envisage their valorization in the following applications: interference at the level of interactions between nucleic acids and proteins resulting in an inhibition or stimulation of certain processes, for example of regulation of genetic expression or enzymatic activity (polymerase, transcriptase, etc.), selective complexation of anionic species for their extraction, their elimination or their detection using membrane probes / electrodes for example.
En conséquence, la présente invention a également pour objet toute application thérapeutique des dérivés d'amidinium tels que décrits précédemment, soit directement, soit au sein de compositions pharmaceutiques. Consequently, a subject of the present invention is also any therapeutic application of the amidinium derivatives as described above, either directly or in pharmaceutical compositions.
De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent également un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Preferably, the pharmaceutical compositions of the invention also contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for direct injection into the desired organ, or for topical administration (on the skin and / or mucous membrane). They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition, depending on the case, of sterilized water or physiological serum, allow the constitution of injectable solutions.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. The present invention will be more fully described with the aid of the examples and figures which follow, which should be considered as illustrative and not limiting.
FIGURES
Figure 1 Représentation schématique des protocoles opératoires de préparation du BGSC et BGTC.FIGURES
Figure 1 Schematic representation of the operating protocols for the preparation of BGSC and BGTC.
Figure 2 Représentation schématique des protocoles opératoires de préparation du BADC. Figure 2 Schematic representation of the operating protocols for the preparation of BADC.
Figure 3 : Mesure de l'efficacité de transfection en fonction du rapport composé lipidique/ADN. Figure 3: Measurement of transfection efficiency as a function of the lipid compound / DNA ratio.
Figure 4 : Mesure de l'efficacité de transfection en fonction du rapport lipides totaux / ADN
MATERIEL ET METHODES
A. Mesures physiques
Les spectres de résonance magnétique nucléaire du proton ( RMN 1H) ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker AC200. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm par rapport au TMS.Figure 4: Measurement of transfection efficiency as a function of the total lipids / DNA ratio
MATERIAL AND METHODS
A. Physical measurements
Proton nuclear magnetic resonance spectra (1 H NMR) were recorded on a Bruker AC200 spectrometer. The chemical shifts are expressed in ppm relative to TMS.
B. Chromatographies sur silice
.Les chromatographies sur couche mince (CCM) ont été effectuées sur des plaques de gel de silice Merck de 0,2 mm d'épaisseur
.Les chromatographies sur colonne ont été effectuées sur gel de silice 60 Merck de granulométrie 0,040-0,063mm.B. Chromatographies on silica
Thin layer chromatographies (TLC) were performed on Merck silica gel plates 0.2 mm thick
The column chromatographies were carried out on 60 Merck silica gel with a particle size of 0.040-0.063 mm.
EXEMPLE 1:
PREPARATION DU GUANIDINO SPERMIDINE CHOLESTEROL
BGSC
-1; Préparation du Di-Boc carbamate (1)
On ajoute une solution de chloroformate de cholesteryle(0,9g, 2mmol) et de
Et3N (0,214g, 2mmol) dans CH2Cl2 (40ml) à une solution de lN,8N-Boc2-spermidine (0,690g, 2mmol) dans CH2Cl2 (20ml). Après reflux pendant 5 heures, le mélange est lavé à l'eau (2x50ml), séché sur Na2SO4 et le solvant est évaporé. Le produit brut est purifié par chromatographie sur un gel de silice utilisant Cil2Cl2/MeOH 95/5 comme éluant pour donner du pur carbamate (1,3g, 86%). EXAMPLE 1:
PREPARATION OF GUANIDINO SPERMIDINE CHOLESTEROL
BGSC
-1; Preparation of Di-Boc carbamate (1)
A solution of cholesteryl chloroformate (0.9g, 2mmol) and
Et3N (0.214g, 2mmol) in CH2Cl2 (40ml) to a solution of lN, 8N-Boc2-spermidine (0.690g, 2mmol) in CH2Cl2 (20ml). After reflux for 5 hours, the mixture is washed with water (2x50ml), dried over Na2SO4 and the solvent is evaporated off. The crude product is purified by chromatography on silica gel using Cil2Cl2 / MeOH 95/5 as eluent to give pure carbamate (1.3 g, 86%).
'H NMR #(CDCl3, 200 Mhz); 0,5-2,5(m, structure de cholesteryl, Boc signal et groupes centraux CH2 depuis le spermidine), 3,1-3,3(m, 8H, N-CH2), 4,50(m,1H,H3α), 5,37(d,1H,H6). 'H NMR # (CDCl3, 200 MHz); 0.5-2.5 (m, cholesteryl structure, Boc signal and CH2 core groups from spermidine), 3.1-3.3 (m, 8H, N-CH2), 4.50 (m, 1H, H3 α), 5.37 (d, 1H, H6).
- 2. Préparation de I'aminocarbamate(2)
On dissout le composé (1) (1,3g) dans 20ml de CH2Cl2 et l'on ajoute à cette solution refroidie (lit de glace) 2ml de CF3CO2H fraîchement distillé pour libérer les groupes protecteurs BOC. Après agitation à température ambiante pendant 3 heures, on ajoute 50ml de 'N NaOH et le mélange est extrait avec CH2Cl2 Les couches organiques sont lavées à l'eau, séchées sur Na2SO4 et évaporées pour obtenir l'aminocarbamate (2) brut (0,945g, 98%).- 2. Preparation of the aminocarbamate (2)
Compound (1) (1.3g) is dissolved in 20ml of CH2Cl2 and to this cooled solution (bed of ice) 2ml of freshly distilled CF3CO2H is added to liberate the BOC protecting groups. After stirring at room temperature for 3 hours, 50ml of 'N NaOH is added and the mixture is extracted with CH2Cl2 The organic layers are washed with water, dried over Na2SO4 and evaporated to obtain the crude aminocarbamate (2) (0.945g) , 98%).
'H NMR. #(CDCl3, 200 Mhz) ; 0,5-2,5(m, structure de cholesteryl et groupes centraux depuis le spermidine), 2,7(m, 4H, CH2-N-C0-), 3,25 (large m,4H,N-CH2), 4,49(m,1H,H3α), 5,35(d,1H,H6). 'H NMR. # (CDCl3, 200Mhz); 0.5-2.5 (m, cholesteryl structure and core groups from spermidine), 2.7 (m, 4H, CH2-N-C0-), 3.25 (broad m, 4H, N-CH2) , 4.49 (m, 1H, H3 α), 5.35 (d, 1H, H6).
3.- Synthèse du BGSC. 3.- Synthesis of the BGSC.
On dissout le carbamate (2) brut (0,94g) dans 30ml de THF/MeOH 85/15. Puis on ajoute du lH-pyrazolecarboxamidine (0,495g, 3,4mmol) et du diisopropylethylamine (0,436, 3,4mmol) dans 30ml de THF/MeOH 85/15. Après agitation à température ambiante pendant 18 heures on ajoute lentement 250 ml de diethylether et on sépare le précipité obtenu par décantation. Le composé brut est mis en suspension trois fois dans du diethylether et séparé par décantation pour donner du
GSC pur (0,570g, 47%).The crude carbamate (2) (0.94 g) is dissolved in 30 ml of THF / MeOH 85/15. Then 1H-pyrazolecarboxamidine (0.495g, 3.4mmol) and diisopropylethylamine (0.436, 3.4mmol) in 30ml of THF / MeOH 85/15 are added. After stirring at room temperature for 18 hours, 250 ml of diethyl ether are slowly added and the precipitate obtained is separated by decantation. The crude compound is suspended three times in diethyl ether and separated by decantation to give
Pure GSC (0.570g, 47%).
1H NMR 6(DMSO d6) 200 Mils; 0,5-2,5(m, structure du cholesteryl et CH2 central), 3,1(m, 8H, N-CH2), 4,3(m,1H,H3α), 5,3(d,1H,H6) ; 7,2 (large s, 8H,NH2+), 7,8(s,2H,NH), Anal. Calc. pour C37H67N702,2HC1,C,62,15 ; H,9,67 ;N,13,71. 1H NMR 6 (DMSO d6) 200 Mils; 0.5-2.5 (m, structure of cholesteryl and central CH2), 3.1 (m, 8H, N-CH2), 4.3 (m, 1H, H3 α), 5.3 (d, 1H , H6); 7.2 (broad s, 8H, NH2 +), 7.8 (s, 2H, NH), Anal. Calc. For C37H67N702.2HC1, C, 62.15; H, 9.67; N, 13.71.
Résultat d'analvse élémentaire: C,62,28 ; H,9,81 ; N,13,15. Elementary analysis result: C, 62.28; H, 9.81; N, 13.15.
EXEMPLE 2:
PREPARATION DU GUANIDINO TREN CHOLESTEROL, BGTC
1.préparation de l'Aminocarbamate (5)
On ajoute lentement une solution de chloroformate de cholesteryle (1,8g, 4mmol) dans 100 ml de CH2Cl2 à une saturation de tris(2-aminoethyl)amine(TREN) (11,68 g, 80 mmol) dans 400 ml de CH2Cl2. Après agitation à température ambiante pendant deux heures, on libère l'amine inerte par lavage à l'eau (3xlOOml) et après séchage sur Na2SO4 on évapore le solvant. On isole (5) sous forme de trihydrochloride de la manière suivante : on dissout le produit brut dans 10ml de MeOH et l'on ajoute goutte à goutte une solution saturée de HCI methanolique (5ml) ; le précipité obtenu est séparé par décantation et, pour obtenir un composé pur, est mis en suspension trois fois dans MeOH et séparé par décantation. Après séchage sous vide le trihydrochloride (6) pur est obtenu (1,71g, 64%).EXAMPLE 2:
PREPARATION OF GUANIDINO TREN CHOLESTEROL, BGTC
1.Preparation of Aminocarbamate (5)
A solution of cholesteryl chloroformate (1.8g, 4mmol) in 100 ml of CH2Cl2 is slowly added to a saturation of tris (2-aminoethyl) amine (TREN) (11.68 g, 80 mmol) in 400 ml of CH2Cl2. After stirring at room temperature for two hours, the inert amine is released by washing with water (3 × 100 ml) and after drying over Na2SO4 the solvent is evaporated off. (5) is isolated in the form of trihydrochloride as follows: the crude product is dissolved in 10 ml of MeOH and a saturated solution of methanolic HCl (5 ml) is added dropwise; the precipitate obtained is separated by decantation and, in order to obtain a pure compound, is suspended three times in MeOH and separated by decantation. After drying under vacuum, pure trihydrochloride (6) is obtained (1.71 g, 64%).
1H NMR 6(CDC13 + gCDssOD. 200MHz). 0,5-2,4(m, structure de cholesteryl), 2,5(m,2H,CH2NHCO), 2,8(large s,4H,+HN-CH2), 3,06(large s,4H,CH2NH3+), 3,20(m,2H,+HN-CH2), 4,4(m,1H,H3α), 5,3(d,1H,H6), Anal. Calc. pour C34H62N402,3HC1 ;C,61,10 ; H,9,80 ; N,8,38. Résultat : C,61,25 ; H,9,96 ;N,8,22. 1H NMR 6 (CDC13 + gCDssOD. 200MHz). 0.5-2.4 (m, cholesteryl structure), 2.5 (m, 2H, CH2NHCO), 2.8 (broad s, 4H, + HN-CH2), 3.06 (broad s, 4H, CH2NH3 +), 3.20 (m, 2H, + HN-CH2), 4.4 (m, 1H, H3 α), 5.3 (d, 1H, H6), Anal. Calc. for C34H62N4O2.3HC1; C, 61.10; H, 9.80; N, 8.38. Result: C, 61.25; H, 9.96; N, 8.22.
2- Préparation du B.GTC
On ajoute lentement une solution de chloroformate de cholesteryle (2,24g,
Smmol) dans 100ml de CH2C12 à une large saturation de tris(2aminoéthyl)amine(TREN)(29,2g, 200mmol) dans 250ml de CH2Cl2. Après agitation à température ambiante pendant 2 heures, on libère l'amine inerte par lavage à l'eau (3x1 00ml) et après séchage sur Na2SO4, le solvant est évaporé. Le produit brut (3,2g) est dissous dans THF/MeOH 50/50 (20ml) ; puis l'on ajoute au mélange du 1Hpyrazole-1-carboximidine (1,465g,10mmol) et du diisopropylamine (1,3g, lOmmol). 2- Preparation of B.GTC
A solution of cholesteryl chloroformate (2.24g,
Smmol) in 100ml of CH2C12 to a broad saturation of tris (2 aminoethyl) amine (TREN) (29.2g, 200mmol) in 250ml of CH2Cl2. After stirring at room temperature for 2 hours, the inert amine is released by washing with water (3 × 100 ml) and after drying over Na2SO4, the solvent is evaporated off. The crude product (3.2g) is dissolved in THF / MeOH 50/50 (20ml); then 1Hpyrazole-1-carboximidine (1.465g, 10mmol) and diisopropylamine (1.3g, 10mmol) are added to the mixture.
Après agitation à température ambiante pendant 18 heures, on ajoute du diethylether et le précipité obtenu est séparé par décantation. Afin d'obtenir un échantillon pur, le composé brut est mis en suspension trois fois dans du diethylether et séparé par décantation (2,15g), 60% après séchage sous vide. After stirring at room temperature for 18 hours, diethyl ether is added and the precipitate obtained is separated by decantation. In order to obtain a pure sample, the crude compound is suspended three times in diethyl ether and separated by decantation (2.15 g), 60% after drying under vacuum.
1H NMR(DMSOd6, 200MHz) ; 0,5-2(m, structure du cholesteryl), 2,2(m,2H,N-CH2), 2,6(large s,4H,N-CH2), 3.0(d,2H,N-CH2), 3,2(large s,4H), 4,3(m,1H,H3α), 5,3(d,1H,H6), 7,3(large s,8H,NH2+), (7,8(large s,2H,NH). Anal. Calc. 1H NMR (DMSOd6, 200MHz); 0.5-2 (m, cholesteryl structure), 2.2 (m, 2H, N-CH2), 2.6 (broad s, 4H, N-CH2), 3.0 (d, 2H, N-CH2) , 3.2 (broad s, 4H), 4.3 (m, 1H, H3 α), 5.3 (d, 1H, H6), 7.3 (broad s, 8H, NH2 +), (7.8 (broad s, 2H, NH) Anal Calc.
pour C36H66N8O2,2HCl ; C,60,39 ; H,9,57 ; N,15,65. Résultat : C,60,38 ; H,9,67
N,15,56.for C36H66N8O2.2HCl; C, 60.39; H, 9.57; N, 15.65. Result: C, 60.38; H, 9.67
N, 15.56.
EXEMPLE 3:
PREPARATION DU BIS-CHLORHYDRATE DE BIS AMIDINIUM
BACD.EXAMPLE 3:
PREPARATION OF BIS AMIDINIUM BIS HYDROCHLORIDE
BACD.
1.Préparation du dinitrile
On ajoute une solution de chloroformate de cholestéryle (8,97g; 20mmol.) dans du CH2CI2 (100ml) goutte à goutte à une solution d'iminopropionitrile (2,46g, 20mmol.) et Et3N ( 2.02 g, 20 mmol dans du CH2Cl2 (100mi). Après agitation à la température ambiante, pendant 6 heures, on lave à l'eau (2x 100ml) et sèche sur
Na2SO4. Le solvant est évaporé et le produit brut (10,5g) est recristallisé dans le méthanol. (8,59g; 80%).1. Preparation of the dinitrile
A solution of cholesteryl chloroformate (8.97g; 20mmol.) In CH2Cl2 (100ml) is added dropwise to a solution of iminopropionitrile (2.46g, 20mmol.) And Et3N (2.02g, 20mmol in CH2Cl2. (100 ml). After stirring at room temperature for 6 hours, washed with water (2x 100ml) and dried over
Na2SO4. The solvent is evaporated off and the crude product (10.5 g) is recrystallized from methanol. (8.59g; 80%).
1H NMR #(CDCl3, 200MHz). 0,5-2,5(m, structure de cholesteryl), 2,7 (m, 4H; -CH2CN), 3,62 (m, 4H, -CH2-N-), 4,50 (m,1H,H3α), 5,39(d,1H,H6),
2. Préparation du dithioamide
Dans une solution du dinitrile, préparé comme décrit précédemment, (0,324g, 6mmol.) et de diéthylamine ( 0,884g; 12mmol) dans du DMF (30ml), maintenue à 50 C, on fait barboter pendant 2 heures un léger courant de H2S. On verse la solution bleue sur de la glace et on sépare le précipité ainsi obtenu par filtration. On dissout ce produit brut dans du CH2Cl2 et lave à l'eau (2x50ml). Après séchage sur Na2SO4, le solvant est évaporé et le produit obtenu recristallisé deux fois dans du méthanol (1,86g; 51,5%). 1H NMR # (CDCl3, 200MHz). 0.5-2.5 (m, cholesteryl structure), 2.7 (m, 4H; -CH2CN), 3.62 (m, 4H, -CH2-N-), 4.50 (m, 1H, H3 α), 5.39 (d, 1H, H6),
2. Preparation of dithioamide
In a solution of the dinitrile, prepared as described above, (0.324g, 6mmol.) And of diethylamine (0.884g; 12mmol) in DMF (30ml), maintained at 50 ° C., a slight stream of H2S is bubbled for 2 hours. . The blue solution is poured onto ice and the precipitate thus obtained is separated by filtration. This crude product is dissolved in CH2Cl2 and washed with water (2x50ml). After drying over Na2SO4, the solvent is evaporated off and the product obtained recrystallized twice from methanol (1.86 g; 51.5%).
1H NMR(DMSOd6. 200MHz) ; 0,5-2,5(m, structure du cholesteryl), 2,67(t,4H,N-CH2), 3,50(t,4H,S=C-CH2), 4,3(m,1H,H3α),5,33(d,1H,H6). 1H NMR (DMSOd6.200MHz); 0.5-2.5 (m, cholesteryl structure), 2.67 (t, 4H, N-CH2), 3.50 (t, 4H, S = C-CH2), 4.3 (m, 1H , H3 α), 5.33 (d, 1H, H6).
3. Préparation du bis-iodure de dithioamidate
A une solution de dithioamide (0,603g; Immol) dans de l'acétone (20ml), on ajoute de l'iodure de méthyle (2ml) et on laisse reposer à la température ambiante pendant 48 heures. On filtre le précipité obtenu (0,741g; 83,5%). Ce produit est utilisé directement sans purification annexe.3. Preparation of dithioamidate bis-iodide
To a solution of dithioamide (0.603g; Immol) in acetone (20ml), methyl iodide (2ml) is added and the mixture is left to stand at room temperature for 48 hours. The precipitate obtained is filtered (0.741 g; 83.5%). This product is used directly without additional purification.
4. Préparation du bis chlorhydrate de bis amidinium BADC. 4. Preparation of bis amidinium bis hydrochloride BADC.
Dans une suspension au reflux du bis-iodure (0,741g; 0,83mmol.), tel qu'obtenu précédemment, dans de lisopropanol (lOml) on fait barbotter un courant de
NH3 pendant 2 heures puis on continue de chauffer au reflux 4 heures supplémentaires.In a reflux suspension of bis-iodide (0.741g; 0.83mmol.), As obtained previously, in isopropanol (10ml) is bubbled a current of
NH3 for 2 hours and then heating at reflux for a further 4 hours.
On évapore l'isopropanol et le résidus est repris dans du méthanol (10ml). Après passage de cette solution sur une résine échangeuse d'ions basique, on fait passer un courant d'acide chlorhydrique dans l'éluant et on évapore à sec. Le bis chlorhydrate ainsi obtenu, est dissous dans le minimum d'éthanol ( environ 5ml). On filtre un léger insoluble et on rajoute au filtrat un large excès d'éther diéthylique. On obtient une poudre que l'on filtre et l'on sèche (320mg; 60%). Une recristallisation dans l'isopropanol permet d'isoler le produit attendu, sous une forme analytiquement pure.The isopropanol is evaporated off and the residue is taken up in methanol (10 ml). After passing this solution through a basic ion exchange resin, a stream of hydrochloric acid is passed through the eluent and evaporated to dryness. The bis hydrochloride thus obtained is dissolved in the minimum amount of ethanol (approximately 5 ml). A slight insoluble material is filtered off and a large excess of diethyl ether is added to the filtrate. A powder is obtained which is filtered and dried (320 mg; 60%). Recrystallization from isopropanol makes it possible to isolate the expected product, in an analytically pure form.
1H NMR(DMSOd6. 200MHz); ; 0,5-2,6(m, structure du cholesteryl et-CH2- amidinium), 3,57 (s, large 4H, N-CH2) 4,3(m, 1H,H3a),5,3(d, 1H,Hs), 8,64 (s, large; 2H; NH2), 9,07 (s; large; 1H; NH), 9,18 (s; large; 2H). 1H NMR (DMSOd6.200MHz); ; 0.5-2.6 (m, structure of cholesteryl and-CH2-amidinium), 3.57 (s, broad 4H, N-CH2) 4.3 (m, 1H, H3a), 5.3 (d, 1H, Hs), 8.64 (s, broad; 2H; NH2), 9.07 (s; broad; 1H; NH), 9.18 (s; broad; 2H).
Anal. Cal. Pour C34H56N402, 2HCl: C, 65,25. H, 9,32; N, 8,94. Résultat C, 65,40. H, 9,87; N, 9,55. Anal. Cal. For C34H56N4O2, 2HCl: C, 65.25. H, 9.32; N, 8.94. Result C, 65.40. H, 9.87; N, 9.55.
EXEMPLE 4 : ETUDES DES PROPRIETES DE TRANSFECTION DU
BGSC ET DU BGTC
1 - Preparation du BGSC et du BGTC
Le protocole utilisé pour la préparation de ces deux composés est identique à celle décrite dans les exemples 1 et 2.EXAMPLE 4: STUDIES OF TRANSFECTION PROPERTIES OF
BGSC AND BGTC
1 - Preparation of BGSC and BGTC
The protocol used for the preparation of these two compounds is identical to that described in Examples 1 and 2.
2 - Preparation des liposomes
Un mélange de lipide cationique et de DOPE (dans un rapport molaire de 3/2) dans du chloroforme (CHCl3) est évaporé sous vide et remis en suspension dans une solution de tampon HEPES 20 mM à PH 7,4, sous une atmosphère N2.2 - Preparation of liposomes
A mixture of cationic lipid and DOPE (in a molar ratio of 3/2) in chloroform (CHCl3) is evaporated in vacuo and resuspended in a solution of 20 mM HEPES buffer at pH 7.4, under an N2 atmosphere. .
La concentration finale en lipide est de 1,2 mg/ml. The final lipid concentration is 1.2 mg / ml.
Le mélange est vortexé pendant 5 mn, puis soniqué pendant 5 mn avec un sonificateur (Branson Ultrasonic 2210), enfin stocké a + 4"C pendant 24 h pour hydratation. The mixture is vortexed for 5 min, then sonicated for 5 min with a sonicator (Branson Ultrasonic 2210), finally stored at + 4 "C for 24 h for hydration.
La dispersion résultante est soniquée de nouveau (Sonifier Branson 450) pendant 5 à 10 mm pour former des liposomes. The resulting dispersion is sonicated again (Sonifier Branson 450) for 5-10 mm to form liposomes.
Après centrifugation, la solution est filtrée sur un filtre de diamètre de pore 0.22Cl (Millex GS, Millepore) et stockée à + 40C. After centrifugation, the solution is filtered through a 0.22Cl pore diameter filter (Millex GS, Millepore) and stored at + 40C.
La taille des liposomes contenant BGSC ou BGTC a été étudiée à l'aide d'un appareil à diffraction laser (Autosizer 4700, Malvern Instruments). Cette étude montre un pic unique correspondant à un diamètre moyen de 50nm en analyse multimodale par nombres. The size of the liposomes containing BGSC or BGTC was studied using a laser diffraction apparatus (Autosizer 4700, Malvern Instruments). This study shows a single peak corresponding to an average diameter of 50nm in multimodal number analysis.
3 - Cultures cellulaires
L'origine (espèce et tissus) de la plupart des lignées cellulaires utilisées pour les expériences de transfection est donnée dans la table I.3 - Cell cultures
The origin (species and tissues) of most of the cell lines used for the transfection experiments is given in Table I.
Les cellules de la lignée cellulaire HeLa (P Briand, ICGM Paris) sont dérivées d'un carcinome humain d'origine épitheliale cervicale. The cells of the HeLa cell line (P Briand, ICGM Paris) are derived from a human carcinoma of cervical epithelial origin.
Les cellules NIH 3 T3 (C Lagrou, Institut Pasteur, Lille) sont des fibroblastes de souris. NIH 3 T3 cells (C Lagrou, Institut Pasteur, Lille) are mouse fibroblasts.
La lignée cellulaire NB2A (C. Gouget, Paris) est derivée d'un neuroblastome de souris. The NB2A cell line (C. Gouget, Paris) is derived from a mouse neuroblastoma.
Toutes les cellules à l'exception des cellules AtT-20 et PC12, ont été cultivées dans du milieu Dulbecco modifié (DMEM, GIBCO) complementé avec 10 % de sérum de veau fetal (FCS; GIBCO), de la pénicilline à 100 unités/ml (GIBCO) et de la streptomycine (GIBCO) à 100g/ml. All the cells except the AtT-20 and PC12 cells were cultured in modified Dulbecco medium (DMEM, GIBCO) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS; GIBCO), penicillin at 100 units / ml (GIBCO) and streptomycin (GIBCO) at 100g / ml.
Les cellules AtT-20 ont été cultivées dans du DMEM/F12 (GIBCO) complementé avec 10 % de sérum de veau fetal. AtT-20 cells were cultured in DMEM / F12 (GIBCO) supplemented with 10% fetal calf serum.
Les cellules Pu 12 ont été cultivées dans du DMEM complementé avec 10 %
FCS et 5 % de sérum de cheval.Pu 12 cells were cultured in DMEM supplemented with 10%
FCS and 5% horse serum.
Toutes les cellules ont été maintenues en culture dans des boîtes plastiques (Falcon) sous atmosphère humide à 5 % de C02. All the cells were maintained in culture in plastic dishes (Falcon) under a humid atmosphere at 5% CO 2.
4 - Plasmides
Le plasmide pRSV-Luc (O. BENSAUDE, ENS, Paris), dans lequel le gêne marqueur de la luciferase est sous le contrôle transcriptionnel du LTRRSV (Rous
Sarcoma Virus), a été amplifié dans E. Coli et préparé par purification sur gradient CsC1 par des techniques standard.4 - Plasmids
The plasmid pRSV-Luc (O. BENSAUDE, ENS, Paris), in which the luciferase marker gene is under the transcriptional control of LTRRSV (Rous
Sarcoma Virus), was amplified in E. Coli and prepared by CsCl gradient purification by standard techniques.
5 - Protocole de transfection
Le jour précédent la transfection 2 X 105 cellules sont déposées par puits (plaques à 6 puits Falcon).5 - Transfection protocol
The day preceding the transfection 2 × 105 cells are deposited per well (6-well Falcon plates).
Chaque puits contient une lignée cellulaire différente. Each well contains a different cell line.
Ainsi au jour de la transfection les cellules sont a demi confluentes. Thus on the day of transfection the cells are semi-confluent.
L'ADN plasmidique (5llg) et la quantité désirée de lipide bis-guanidinium ont été chacun dilué dans 250 l de DMEM sans FCS et vortexé. Après environ 5 min les deux solutions ont été laissées à incuber à température ambiante pendant 15min. Le mélange de transfection est alors ajouté aux cellules (0,5 ml par puits) qui ont été lavées avec un milieu sans sérum. Après 4 à 6 heures d'incubation à 370C, 1 ml de milieu avec sérum est ajouté dans chaque puits sans que l'on enlève le mélange de transfection. 24 heures après la transfection, le milieu est remplacé par 1 ml de milieu de culture frais. Les cellules sont recueillies 2 jours après la transfection pour mesurer l'expression de la luciferase. Plasmid DNA (5 µg) and the desired amount of bis-guanidinium lipid were each diluted in 250 µl of DMEM without FCS and vortexed. After about 5 min the two solutions were left to incubate at room temperature for 15 min. The transfection mixture is then added to the cells (0.5 ml per well) which have been washed with serum-free medium. After 4 to 6 hours of incubation at 370C, 1 ml of medium with serum is added to each well without removing the transfection mixture. 24 hours after transfection, the medium is replaced with 1 ml of fresh culture medium. The cells are collected 2 days after transfection to measure the expression of luciferase.
Des transfections témoins ont été faites en utilisant des agents de transfections commercialisés:
- la lipopolyamine Transfectam 8 (JP Behr, Strasbourg, France) a été utilisée en solution alcoolique à un rapport optimum de charges ioniques
Transfectam (g)/DNA 6-8.Control transfections were made using commercially available transfecting agents:
- lipopolyamine Transfectam 8 (JP Behr, Strasbourg, France) was used in alcoholic solution at an optimum ratio of ionic charges
Transfectam (g) / DNA 6-8.
- la Lipofectin 8 (Life Technologies Inc., Cergy Pontoise, France) qui est une formulation de liposomes ayant pour lipide neutre la DOPE et pour lipide cationique le DOTMA. (N[ 1(2,3 -dioleyloxy) propyl]-N, N, N- trimethylammonium chloride). - Lipofectin 8 (Life Technologies Inc., Cergy Pontoise, France) which is a formulation of liposomes having DOPE as neutral lipid and DOTMA as cationic lipid. (N [1 (2,3 -dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride).
Les complexes ADN/Liposomes ont été obtenus dans les conditions standard recommandées par le fabricant. The DNA / Liposome complexes were obtained under the standard conditions recommended by the manufacturer.
- des cellules ont été transfectées par précipitation au phosphate de calcium. - cells were transfected by calcium phosphate precipitation.
(Keown, W.A., Campbell, C.R. ; Kucherlapati, R.S. (1990) Methods in Enzymology;
Academic Press : New York, 185, 527-537).(Keown, WA, Campbell, CR; Kucherlapati, RS (1990) Methods in Enzymology;
Academic Press: New York, 185, 527-537).
6 - Mesure de la luciferase
L'activité luciferase est mesurée 48 heures après transfection en utilisant une variante la procédure de De Wet et al. (De Wet, J.R., Wood, K.V., DeLuca, M., Helinski, D.R.6 - Measurement of luciferase
Luciferase activity is measured 48 hours after transfection using a variant of the procedure of De Wet et al. (De Wet, JR, Wood, KV, DeLuca, M., Helinski, DR
& Subramani, S. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 725-737.)
- on retire le milieu de culture
- les cellules sont lavées avec une solution saline de tampon phosphate froid
- puis elles sont lysées par incubation dans 250 ssl de tampon de lyse (25mM triphosphate pH7;8, 8 mM MgC12, lmM dithiotreitol, 15 % de glycerol et 1 % de triton X-100).& Subramani, S. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 725-737.)
- remove the culture medium
- cells are washed with cold phosphate buffered saline
- Then they are lysed by incubation in 250 ssl of lysis buffer (25 mM triphosphate pH7; 8.8 mM MgC12, lmM dithiotreitol, 15% glycerol and 1% triton X-100).
- on obtient un lysat clair après élimination des matériaux insolubles par centrifugation (15mm a + 40C) dans une microcentrifugeuse. - A clear lysate is obtained after removal of insoluble materials by centrifugation (15mm at + 40C) in a microcentrifuge.
- un Aliquot (20cul1) d'extrait cellulaire est dilué dans 100Cl1 de tampon de lyse auquel on ajoute 9ul d'ATP 25 mM (sigma) et 20R1 de luciferine 25mM (sigma). - An aliquot (20cul1) of cell extract is diluted in 100Cl1 of lysis buffer to which are added 9ul of 25 mM ATP (sigma) and 20R1 of 25mM luciferin (sigma).
- les échantillons sont placés dans un luminomètre (Lurmet LB9501 Berthold,
Nashua, NH) et on mesure l'émission lumineuse pendant 10 secondes.- the samples are placed in a luminometer (Lurmet LB9501 Berthold,
Nashua, NH) and the light emission is measured for 10 seconds.
L'étalonnage de la courbe RLU/Luciferase a été fait en utilisant differentes dilutions de luciferase de luciole purifiée (sigma) et montre que la partie linéaire de la courbe va de 104 a 107 RLU (relative light units). The calibration of the RLU / Luciferase curve was done using different dilutions of purified firefly luciferase (sigma) and shows that the linear part of the curve ranges from 104 to 107 RLU (relative light units).
La concentration en protéine a été mesurée par le test BCA (acide bicinchoninique) en utilisant la serumalbumine bovine comme témoin. The protein concentration was measured by the BCA (bicinchoninic acid) test using bovine serum albumin as a control.
Les données pour l'activité luciférase sont exprimées en RLU/mg de protéine. Data for luciferase activity are expressed as RLU / mg protein.
7 - Résultats
7.1 - Etude du rapport composé/ADN
Afin d'optimiser l'efficacité de transfection obtenue avec des agrégats
BGTC/ADN, la demanderesse a étudié l'influence du rapport BGTC/ADN sur le taux de transfection dans 3 types différents de cellules de mammifères connus pour leur relative sensibilité au méthodes de transfection classique (Fig. 3).7 - Results
7.1 - Study of the compound / DNA ratio
In order to optimize the transfection efficiency obtained with aggregates
BGTC / DNA, the Applicant has studied the influence of the BGTC / DNA ratio on the transfection rate in 3 different types of mammalian cells known for their relative sensitivity to conventional transfection methods (FIG. 3).
Des expériences de transfection ont donc été réalisées avec des fibroblastes murins 3 T3 des cellules épithéliales humaines HeLa et des neuroblastomes de souris
NB2A. Au cours de ces expériences une certaine quantité fixe de plasmide pRSV-Luc a été mise en contact avec des quantités variables de BGTCen solution. Pour déterminer la fourchette de rapport à étudier la demanderesse est partie du principe qu'un g d'ADN équivaut à 3 nm de phosphate chargé négativement et que seulement deux groupes guanidinium sont chargés positivement au pH neutre de formation des agrégats et de transfection. On mesure l'activité luciférase 48h après la transfection.Transfection experiments were therefore carried out with murine 3 T3 fibroblasts of human HeLa epithelial cells and mouse neuroblastomas.
NB2A. During these experiments a certain fixed amount of plasmid pRSV-Luc was brought into contact with varying amounts of BGTCen solution. To determine the ratio range to be studied, the Applicant started from the principle that one g of DNA is equivalent to 3 nm of negatively charged phosphate and that only two guanidinium groups are positively charged at neutral pH for formation of aggregates and transfection. Luciferase activity is measured 48 hours after transfection.
L'expression de la luciférase est maximale pour des agrégats contenant de 6 (cellules
HeLa) à 8 (cellules 3T3, NB2A) groupes guanidinium pour un groupe phosphate de l'ADN c'est à dire des agrégats ayant une charge positive importante.The expression of luciferase is maximal for aggregates containing 6 (cells
HeLa) with 8 (3T3 cells, NB2A) guanidinium groups for a phosphate group of DNA, ie aggregates with a significant positive charge.
7.2 - Etude de la transfection de différents types cellulaires. 7.2 - Study of the transfection of different cell types.
Le transfert de gènes par l'intermédiaire de lipides cationiques est une technique de transfection attractive non seulement du fait qu'elle ne nécessite pas d'intermédiaires mais aussi parce qu'elle permet de transfecter une très grande variété de cellules de tissus et d'organismes différents. Pour étudier l'étendue de l'efficacité du
BGTC comme agent de transfection plusieurs lignées cellulaires d'origines diverses ont été testées. Les résultats sont exposés dans la table 1 ci-après. Le rapport de charges a été choisi entre 6 et 8 pour une efficacité maximale. Afin d'établir une comparaison, des cellules des mêmes lignées ont également été transfectées en utilisant une lipopolyamine d'une part et d'autre part du phosphate de calcium. Les résultats montrent que le BGTC est normalement aussi efficace que le Transfectam et deux fois plus efficace que le phosphate de calcium.The transfer of genes via cationic lipids is an attractive transfection technique not only because it does not require any intermediates but also because it allows transfecting a very wide variety of cells, tissues and cells. different organizations. To study the extent of the effectiveness of
BGTC as a transfection agent several cell lines of various origins have been tested. The results are set out in Table 1 below. The charge ratio has been chosen between 6 and 8 for maximum efficiency. In order to establish a comparison, cells of the same lines were also transfected using a lipopolyamine on the one hand and calcium phosphate on the other hand. The results show that BGTC is normally as effective as Transfectam and twice as effective as calcium phosphate.
Expression de la luciferase dans differentes lignées cellulaires de mammifères transfectées soit par du BGTC, du phosphate de calcium ou du Transfectam (E).
<tb> <SEP> RLU/mg <SEP> de <SEP> protéines <SEP> cellulaires
<tb> Espèces <SEP> Lignées <SEP> Tissus <SEP> BGTC <SEP> Phosphate <SEP> Transfectam#
<tb> <SEP> cellulaire <SEP> de <SEP> Calcium
<tb> Humain <SEP> A549 <SEP> Carcinome <SEP> du <SEP> 4 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 7 <SEP> X <SEP> 103 <SEP> 3,1 <SEP> X <SEP> 105
<tb> <SEP> poumon
<tb> Singe <SEP> COS-7 <SEP> Rein <SEP> transformé <SEP> par <SEP> 2,1 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> 3,7 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 8,4 <SEP> X <SEP> 106
<tb> <SEP> SV40
<tb> Chien <SEP> MDCK-1 <SEP> Rein <SEP> 3 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 4,5 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 2,2 <SEP> X <SEP> 106
<tb> Rat <SEP> RIN-m5F <SEP> Cellule <SEP> tumorale <SEP> 2 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> 2 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 3,3 <SEP> X <SEP> 105
<tb> <SEP> d'ilot <SEP> pancreatique
<tb> <SEP> ROS <SEP> Osteosarcome <SEP> 4,,0 <SEP> X <SEP> 4,5 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 2,3 <SEP> X <SEP> 106
<tb> <SEP> 106
<tb> <SEP> PC12 <SEP> Pheochromocytome <SEP> 3 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> 1,7 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 6 <SEP> X <SEP> 106
<tb> Souris <SEP> AtT-20 <SEP> Tumeur <SEP> pituitaire <SEP> 2 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> 8 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 3 <SEP> X <SEP> 107
<tb> <tb><SEP> RLU / mg <SEP> of <SEP> cellular <SEP> proteins
<tb> Species <SEP> Lines <SEP> Tissues <SEP> BGTC <SEP> Phosphate <SEP> Transfectam #
<tb><SEP> cell <SEP> of <SEP> Calcium
<tb> Human <SEP> A549 <SEP> Carcinoma <SEP> of <SEP> 4 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 7 <SEP> X <SEP> 103 <SEP> 3.1 <SEP> X <SEP> 105
<tb><SEP> lung
<tb> Monkey <SEP> COS-7 <SEP> Kidney <SEP> transformed <SEP> by <SEP> 2.1 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> 3.7 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 8.4 <SEP> X <SEP> 106
<tb><SEP> SV40
<tb> Dog <SEP> MDCK-1 <SEP> Kidney <SEP> 3 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 4,5 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 2,2 <SEP> X <SEP> 106
<tb> Rat <SEP> RIN-m5F <SEP> Tumor <SEP> cell <SEP> 2 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> 2 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 3.3 <SEP > X <SEP> 105
Pancreatic islet <tb><SEP><SEP>
<tb><SEP> ROS <SEP> Osteosarcoma <SEP> 4,, 0 <SEP> X <SEP> 4,5 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 2,3 <SEP> X <SEP> 106
<tb><SEP> 106
<tb><SEP> PC12 <SEP> Pheochromocytoma <SEP> 3 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> 1.7 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 6 <SEP> X <SEP> 106
<tb> Mouse <SEP> AtT-20 <SEP> Pituitary tumor <SEP><SEP> 2 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> 8 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 3 <SEP> X <SEP> 107
<tb>
Toutes les transfections ont été faites au moins deux fois (n12). All transfections were done at least twice (n12).
7.3- Transfection en présence d'un lipide neutre
Le composé BGSC étant moins soluble en milieu aqueux que le BGTC la demanderesse a utilisé le premier sous forme de liposomes en présence d'un lipide neutre la DOPE (dioléoylphosphatidyléthanolamine). les formulations sont préparées dans un rapport molaire 3/2. Une deuxième préparation contenant cette fois ci du
BGTC a également été préparée avec de la DOPE dans les mêmes conditions.7.3- Transfection in the presence of a neutral lipid
Since the BGSC compound is less soluble in aqueous medium than BGTC, the applicant used the first in the form of liposomes in the presence of a neutral lipid, DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine). the formulations are prepared in a 3/2 molar ratio. A second preparation, this time containing
BGTC was also prepared with DOPE under the same conditions.
7.3.1 - Détermination du rapport lipide total / ADN. 7.3.1 - Determination of the total lipid / DNA ratio.
La demanderesse a tout d'abord déterminé le rapport lipide/ ADN au cours d'une expérience de transfection sur des cellules HeLa. La courbe obtenue est représentée figure 4. Les optima de transfection sont obtenus pour des rapports liposomes BGSC/ADN compris entre 1.5 et 5 avec un centre à 2.5 - 3. Les groupes guanidinium étant protonés à pH neutre les meilleurs agrégats BGSC-DOPE/ ADN ont une charge positive d'environ 3 (figure 4). The Applicant first determined the lipid / DNA ratio during a transfection experiment on HeLa cells. The curve obtained is shown in figure 4. The transfection optima are obtained for BGSC / DNA liposome ratios of between 1.5 and 5 with a center at 2.5 - 3. The guanidinium groups being protonated at neutral pH, the best BGSC-DOPE / DNA aggregates. have a positive charge of about 3 (Figure 4).
Les meilleurs rapports BGSC-DOPE/ADN sont donc inférieurs à ceux obtenus avec des agrégats de type BGTC/ADN (entre 6 et 8). La transfection en présence de liposome cationique est facilitée par la présence de DOPE et les propriétés fusogéniques de celle-ci. The best BGSC-DOPE / DNA ratios are therefore lower than those obtained with aggregates of the BGTC / DNA type (between 6 and 8). Transfection in the presence of a cationic liposome is facilitated by the presence of DOPE and the fusogenic properties thereof.
7.3.2 - Transfection de différentes lignées cellulaires par des liposomes cationiques. 7.3.2 - Transfection of different cell lines with cationic liposomes.
La demanderesse a procédé à des expériences de transfection dans différentes lignées cellulaires en utilisant des formulations de liposomes cationiques BGSC-DOPE et BGTC-DOPE dans des rapports molaires 3/2. Le rapport de charges guanidinium des lipides / phosphates de 1'ADN est d'environ 2.5 (-3) pour ces deux systèmes de transfert de gènes. Une transfection avec la LipofectinB sert de témoin. Les résultats sont exposés dans le tableau 2 ci-dessous. The Applicant has carried out transfection experiments in various cell lines using formulations of cationic liposomes BGSC-DOPE and BGTC-DOPE in 3/2 molar ratios. The guanidinium charge ratio of DNA lipids / phosphates is about 2.5 (-3) for these two gene transfer systems. Transfection with LipofectinB serves as a control. The results are shown in Table 2 below.
Ces résultats montrent que les dérivés du cholestérol portant des groupes guanidiniums sous forme de liposomes cationiques sont au moins aussi efficaces pour la transfection que la Lipofectin. Ces résultats peuvent bien entendu être optimisés pour chaque lignée cellulaire. These results show that the cholesterol derivatives bearing guanidinium groups in the form of cationic liposomes are at least as effective for transfection as Lipofectin. These results can of course be optimized for each cell line.
Expression de la luciferase dans différentes lignées cellulaires eukaryotiques transfectees au moyen de liposomes BGSC/DOPE. de liposomes BGTC/DOPE et de
Lipofectin #.
Lipofectin #.
<tb><tb>
<SEP> RLU/mg <SEP> de <SEP> protéines <SEP> cellulaires
<tb> Lignées <SEP> liposomes <SEP> BGSC <SEP> liposomes <SEP> BGTC <SEP> Lipofectin <SEP> OR <SEP>
<tb> Cellulaires
<tb> HeLa <SEP> 4,6 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 7,7 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 3,3 <SEP> X <SEP> 106
<tb> A <SEP> 549 <SEP> 6 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 2 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 4 <SEP> X <SEP> 106
<tb> COS-7 <SEP> ND <SEP> 1,4 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> 9,5 <SEP> X <SEP> 106
<tb> MDCK-1 <SEP> 1 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 7 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 1,9 <SEP> X <SEP> 106
<tb> ROS <SEP> ND <SEP> 9X106 <SEP> 6X106
<tb> NB2 <SEP> Aa <SEP> 1,5 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> 1,4 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> ND
<tb> NIH3T3a <SEP> 7X106 <SEP> 1,5 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> ND
<tb>
Toutes les transfections ont été faites au moins trois fois (n23)
mesure moyenne en RLU de l'activité luciferase pour 100 g/500 g de lysat total (n#4). <SEP> RLU / mg <SEP> of <SEP> cellular <SEP> proteins
<tb> Lines <SEP> liposomes <SEP> BGSC <SEP> liposomes <SEP> BGTC <SEP> Lipofectin <SEP> OR <SEP>
<tb> Cellular
<tb> HeLa <SEP> 4.6 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 7.7 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 3.3 <SEP> X <SEP> 106
<tb> A <SEP> 549 <SEP> 6 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 2 <SEP> X <SEP> 105 <SEP> 4 <SEP> X <SEP> 106
<tb> COS-7 <SEP> ND <SEP> 1.4 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> 9.5 <SEP> X <SEP> 106
<tb> MDCK-1 <SEP> 1 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 7 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 1.9 <SEP> X <SEP> 106
<tb> ROS <SEP> ND <SEP> 9X106 <SEP> 6X106
<tb> NB2 <SEP> Aa <SEP> 1.5 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> 1.4 <SEP> X <SEP> 107 <SEP> ND
<tb> NIH3T3a <SEP> 7X106 <SEP> 1.5 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> ND
<tb>
All transfections were done at least three times (n23)
average RLU measurement of luciferase activity per 100 g / 500 g of total lysate (n # 4).
Claims (22)
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