FR2750825A1

FR2750825A1 - Animal transgenique non humain dans lequel l'expression de l'un au moins des genes codant pour les recepteurs aux opiaces est modifiee

Info

Publication number: FR2750825A1
Application number: FR9608810A
Authority: FR
Inventors: Brigitte Kieffer; Hans Matthes; Frederic Herve Simonin; Andree Dierich; Marianne Lemeur
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1996-07-15
Filing date: 1996-07-15
Publication date: 1998-01-16
Anticipated expiration: 2016-07-15
Also published as: WO1998002534A3; WO1998002534A2; FR2750825B1; US20010047519A1; US6632977B2

Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain dont l'expression du gène codant pour un récepteur aux opiacés est modifiée, notamment dans les tissus nerveux par rapport à une expression normale, notamment dans les tissus nerveux, pour la détermination d'un médicament actif sur les pathologies impliquant les récepteurs aux opiacés, notamment les douleurs sévères aiguës ou chroniques, la toxicomanie, ou la prévention ou le traitement des rejets de greffe.

Description

ANIMAL TRANSGENIQUE NON HUMAIN DANS LEQUEL
L'EXPRESSION DE L'UN AU MOINS DES GENES CODANT POUR LES
RECEPTEURS AUX OPIACES EST MODIFIEE
L'invention a pour objet un animal transgénique non humain dans lequel l'expression de l'un au moins des gènes codant pour les récepteurs aux opiacés est modifiée.

Les opiacés - dont le prototype est la morphine - sont les analgésiques les plus puissants dont dispose la médecine aujourd'hui. Leur utilisation est toutefois limitée par un ensemble d'effets secondaires dont les effets sur les fonctions autonomes (constipation, dépression respiratoire, hypotension, diurèse) et les effets psychotropes.

L'ensemble des actions des opiacés est médiée par des récepteurs membranaires du système nerveux qui reconnaissent et fixent spécifiquement ces composés. I1 y a 20 ans ces récepteurs ont été mis en évidence par des études pharmacologiques. Trois récepteurs ont été identifiés : les récepteurs mu, delta et kappa. I1 existe aujourd'hui des ligands sélectifs des 3 classes de récepteurs et l'étude de l'action de ces composés suggère
- que le récepteur mu constitue la cible privilégiée de la morphine-opiacé prototypique et qui est l'analgésique le plus utilisé pour le traitement de douleurs sévères,
- le récepteur mu constitue également la cible principale de l'héroïne l'un des narcotiques les plus redoutés dans le contexte de la toxicomanie
- le récepteur delta serait également impliqué dans le contrôle de la douleur et l'état affectif (bien-être), mais dans une moindre mesure,
- le récepteur kappa, comme les deux autres récepteurs, jouerait un rôle dans l'action analgésique des opiacés. Par contre, et contrairement à mu et delta, il aurait une action psychotrope dysphorisante, action qui a été considérée comme un avantage pour la mise au point d'analgésiques puissants dépourvus de potentiel toxicomanogène.

Toutes les stratégies élaborées depuis 20 ans par les industries pharmaceutiques pour la mise au point d'un analgésique idéal sont basées sur ces données pharmacologiques. Celles-ci comprennent l'analyse in vitro et in vivo de l'effet d'agonistes ou d'antagonistes opiacés. L'interprétation des résultats est tributaire de la sélectivité mu/delta/kappa des produits étudiés et de leurs propriétés pharmacocinétiques pour les études in vivo.

Un ensemble de résultats pharmacologiques semble indiquer l'existence de plusieurs récepteurs dans chacune des classes mu, delta ou kappa et qui pourraient constituer des cibles distinctes pour les agonistes de chacune des classes de récepteurs. La question de savoir s'il existe trois récepteurs seulement ou plusieurs récepteurs mu (u), delta (6) et kappa (K) n'est pas résolue aujourd'hui.

Trois gènes codant pour ces récepteurs ont été clonés très récemment.

Chacun d'eux correspond à l'une des classes de récepteurs précédemment définis par la pharmacologie. Ont donc été caractérisés au niveau moléculaire un gène mu, un gène delta et un gène kappa. L'implication de ces gènes dans l'action biologique des substances opiacées in vivo n'a pas été définie.

Les gènes codant pour les récepteurs aux opiacés ont été clonés très récemment (Kieffer B. (1995) Cellular and Molecular Neurobiology 15:615635.).

Dans ce qui suit, on désigne par MOR, le gène du récepteur ,u, par DOR le gène du récepteur 6 et par KOR le gène du récepteur K.

L'un des aspects de l'invention est de fournir un modèle expérimental permettant de cibler des médicaments présentant les propriétés d'analgésiques puissants, sans présenter les effets secondaires des opiacés du type morphine.

L'un des aspects de l'invention est de fournir des animaux mammifères transgéniques non humains dans lesquels l'un au moins des gènes des récepteurs aux opiacés n'est plus exprimé.

L'un des aspects de l'invention est de fournir des animaux mammifères transgéniques non humains dans lesquels le gène du récepteur CL n'est plus exprimé.

L'un des aspects de l'invention est de fournir des animaux mammifères transgéniques non humains dans lesquels le gène du récepteur 8 n'est plus exprimé.

L'un des aspects de l'invention est de fournir des animaux mammifères transgéniques non humains dans lesquels le gène du récepteur K n est plus exprimé.

L'un des autres aspects de l'invention est de fournir un modèle animal susceptible de cribler des médicaments actifs sur des pathologies impliquant l'un au moins des récepteurs aux opiacés.

L'invention a pour objet l'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain dont l'expression de l'un au moins des gènes codant pour les récepteurs aux opiacés est modifiée, notamment supprimée dans les tissus ou cellules du cerveau, par rapport à une expression normale, notamment dans les tissus ou cellules du cerveau, pour la détermination d'un médicament actif sur les pathologies impliquant les récepteurs aux opiacés.

Plus précisément, l'invention a pour objet l'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain dont l'expression du gène codant pour un récepteur aux opiacés est modifiée, notamment dans les tissus nerveux par rapport à une expression normale, notamment dans les tissus nerveux, pour la détermination d'un médicament actif sur les pathologies impliquant les récepteurs aux opiacés, notamment les douleurs sévères aiguës ou chroniques, la toxicomanie, ou la prévention ou le traitement des rejets de greffe.

Le terme "mammifère" inclut tous les mammifères à l'exception des humains, avantageusement les rongeurs et notamment les souris.

Par "animal transgénique", on désigne non seulement un animal dans le génome duquel on a introduit un gène exogène, mais également un animal dans lequel on a délété l'expression d'un gène endogène, soit par interruption du gène endogène, soit par remplacement d'un gène endogène ou d'un fragment de celui-ci par une construction telle qu'elle ne permette plus l'expression du gène endogène. On désignera de tels animaux par animaux "knock-out" ou déficients en susdit gène endogène.

L'expression normale de l'un des récepteurs aux opiacés peut être définie par plusieurs méthodes:
1) Détermination de 1 'ARNm correspondant à l'un des gènes des récepteurs aux opiacés : ceci est possible par la technique de transfert d'ARN (Northern blot) dans laquelle les ARNm sont séparés sur gel d'agarose dénaturant par électrophorèse, puis les ARN sont transférés et fixés sur une membrane de type nitrocellulose ou Nylon. Pour révéler la présence des ARN correspondant à l'un des gènes des récepteurs aux opiacés, on peut utiliser une sonde correspondant à la totalité ou à un fragment de 1 'ADNc du gène en question.

2) Détermination de la quantité de protéine correspondant à l'un des
récepteurs aux opiacés : ceci est possible en étudiant la liaison d'un ligand
opiacé (agoniste ou antagoniste) tel que diprénorphine non sélectif vis-à-vis
des récepteurs opiacés, DAGO (sélectif vis-à-vis de jeu), naltrindole (sélectif
vis-à-vis de b) et CI977 (sélectif vis-à-vis de K) marquée, aux récepteurs
présents dans un homogénat de tissu (cerveau). S'agissant des définitions
respectives de ces ligands, elles sont indiquées dans la légende de la figure 2.

En particulier, la constante de dissociation Kd de plusieurs ligands
spécifiques de l'un des récepteurs aux opiacés est connue et est de l'ordre de
1 nanomolaire pour les ligands généralement utilisés. On sait, par ailleurs,
que le Bmax pour les ligands ci-dessus est de l'ordre de 0. 1 picomole/mg de
protéine membranaire pour les récepteurs y et 6 et 0,02 picomoles/mg de
protéine membranaire pour le récepteur K s'agissant du cerveau de souris. On
sait donc qu'une courbe de saturation avec ce ligand sur des extraits de
membranes contenant les trois récepteurs aux opiacés préparés à partir de
cerveau et l'analyse par la méthode de Scatchard (détermination du nombre
de sites du récepteur) des résultats obtenus à partir des courbes de saturation,
doit donner des valeurs d'affinité de Bmax divisé par deux chez des
hétérozygotes et des valeurs de Bmax nulles (non mesurables) chez des
homozygotes.

Ceci permet donc de quantifier la quantité correspondant à l'un des récepteurs aux opiacés.

Selon un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain qui n'exprime plus le gène du récepteur ,u, ou du récepteur K OU du récepteur 6.

La modification et l'absence d'expression de l'un de ces gènes peut être déterminée de la façon suivante.

1) Des souris où le gène du récepteur aux opiacés a été modifié de telle sorte qu'il ne puisse plus être exprimé sont d'abord caractérisées relativement à l'ADN par analyse avec la méthode de transfert d'ADN (Southern blot), à l'aide d'une sonde consistant en un fragment contenant tout ou partie de la région du récepteur aux opiacés, cette sonde étant définie dans les exemples.

L'hybridation de cette sonde montre clairement que la bande correspondant à l'un des récepteurs aux opiacés de type sauvage (c'est-à-dire normalement présent chez les animaux) n'est plus présente dans les animaux homozygotes vis-à-vis de la mutation, mais remplacée par une bande correspondant au génome modifié.

2) L'analyse par transfert d'ARN (Northern blot) des ARN extraits des tissus exprimant l'un des récepteurs aux opiacés, notamment cerveau, montre qu'il n'y a plus d'expression d'ARN correspondant au gène sauvage. La sonde utilisée dans ce cas est définie par la portion d'ADN complémentaire codant pour le récepteur opiacé p de souris en aval du site BamH I unique de la région codante jusqu'au codon STOP.

3) Enfin on peut démontrer aussi que la liaison de ligands spécifiques à l'un des récepteurs aux opiacés, notamment à l'aide des ligands DAGO (sélectif vis-à-vis de cul), naltrindole (sélectif vis-à-vis de 8) ou CI977 (sélectif vis-à-vis de K), est complètement absente dans ces souris.

Les tissus dans lesquels l'expression d'un gène codant pour un récepteur opiacé est modifiée sont essentiellement les tissus nerveux et en particulier les cellules neuronales.

Dans le cadre de l'invention, on n'exclut pas la modification de l'expression du susdit gène dans d'autres types de cellules, telles que les cellules immunitaires.

Concernant les pathologies douloureuses traitées par les opiacés concernés par l'invention on peut citer
1. douleurs aiguës ou chroniques : douleurs par excès de nociception avec lésions tissulaires, incluant les douleurs cancéreuses, les douleurs postopératoires, les douleurs infectieuses et les douleurs chroniques de type rhumatismes inflammatoires et rhumatismes inflammatoires dégénératifs,
2. douleurs chroniques : douleurs par lésion du système nerveux ou douleurs neuropathiques comprenant (1) les déafférentations (exemple amputation) et les déafférentations avec nociception (exemple : lombosciatalgie résiduelle postopératoire).

Par ailleurs, les antagonistes opiacés peuvent avoir des propriétés immuno-suppressives qui peuvent être mises à profit dans la prévention ou le traitement des greffes, mais le mécanisme de cette action biologique n' est pas connu.

A cet égard, le natrindole a un effet suppressif sur la réaction mixte lymphocytaire (Mixed lymphocyte reaction, MLR en anglais) in vitro et empêche le rejet de greffe in vivo (Arakawa, K., Akami, T., Okamoto, M.,
Nakai, I., Oka, T., Nagase, H. Transplantation proceedings (1993) 25:738740). Les protocoles expérimentaux concernant l'étude du rejet de greffe se trouvent dans cette référence. Les souris transgéniques de l'invention permettent d'évaluer la composante mu (vs delta et kappa) dans la réponse des souris aux drogues en développement, par exemple des composés dérivés du natrindole (antagoniste delta) pour la mise au point d'un agent bloquant le rejet de greffe.

I1 a été montré par ailleurs que les alcaloïdes opiacés ont une activité immunosuppressive sur d'autres fonctions immunitaires: ils bloquent/inhibent la production d'anticorps et l'activité tueuse ("Natural Killer"), deux composantes essentielles des réponses immunitaires contre les infections. Les souris délétées pour l'expression des récepteurs opioïdes seront donc également utilisées en tant que modèle animal pour tester l'action des drogues immunosuppressives de types opiacées mises au point pour l'application cidessus, pour toutes les composantes de la réponse immunitaire.

Dans ce qui précède et ce qui suit, par "gènes ,u du récepteur aux opiacés", on désigne également les isoformes générées par épissage alternatif qui se situent au niveau de la jonction spécifique au gène mu (entre exon 3 et 4): Zimprich, A., Simon, T. and Hollt, V. (1995) Cloning and expression of an isoform of the rat y-opioid receptor (rMORlB) which differs in agonistinduced desensitization from RMOR1. FEBS 359:142-146 and Bare, LA.,
Mansson, E. and Yang, DM. (1994) Expression of two variants of the human y-opioid receptor mRNA in SK-N-SH cells and human brain. FEBS 354:213216.

L'invention concerne également l'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain tel que décrit ci-dessus qui n'exprime plus l'un au moins des récepteurs suivants : le récepteur aux opiacés de type mu, le récepteur aux opiacés de type kappa et le récepteur aux opiacés de type delta.

L'invention concerne également un animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères contenant le gène du récepteur aux opiacés de type mu, dans lequel un fragment du gène du récepteur contenant un exon, notamment l'exon 2 est
- soit remplacé par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié,
- soit interrompu par l'insertion entre deux nucléotides contigus par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment le gène de résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur phosphoglycérate kinase-1 (PGK-1), l'expression du gène de type mu étant supprimée.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, 1' animal mammifère transgénique ou les cellules de mammifère dans lequel le gène t n est plus exprimé sont tels qu'il y a interruption du gène ju, notamment d'un exon et en particulier de 1' exon 2, par insertion entre deux nucléotides contigus par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment le gène de résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur phosphoglycérate kinase-l (PGK-1), l'expression du gène de type mu étant supprimée.

L'invention concerne également un animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères contenant le gène du récepteur aux opiacés de type delta, dans lequel un fragment du gène du récepteur contenant un exon, notamment l'exon 1 est
- soit remplacé par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié,
- soit interrompu par l'insertion entre deux nucléotides contigus par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment le gène de résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur phosphoglycérate kinase -1 (PGK-1), l'expression du gène de type delta étant supprimée.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'animal mammifère transgénique ou les cellules de mammifère dans lequel le gène delta n'est plus exprimé sont tels qu'il y a remplacement d'un fragment du gène 6 contenant un exon, notamment l'exon 1 par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié.

L'invention a également pour objet un animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères contenant le gène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans lequel un fragment du gène du récepteur contenant un exon, notamment l'exon 1 est
- soit remplacé par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié,
- soit interrompu par l'insertion entre deux nucléotides contigus par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment le gène de résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur phosphoglycérate kinase -1 (PGK-1), l'expression du gène kappa étant supprimée.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'animal mammifère transgénique ou les cellules de mammifère dans lequel le gène kappa n'est plus exprimé sont tels qu'il y a remplacement d'un fragment du gène K contenant un exon, notamment l'exon 1 par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié.

L'invention concerne également des cellules cultivées à partir des animaux mammifères transgéniques non humains décrits ci-dessus.

Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne des cultures cellulaires contenant l'une des susdites constructions transgéniques.

Ces cultures cellulaires peuvent être obtenues soit à partir de cellules prélevées sur des animaux transgéniques tels que définis ci-dessus ou soit à partir de lignées cellulaires en utilisant les susdites constructions transgéniques, cette deuxième possibilité pouvant être effectuée à l'aide de techniques standard de transfection cellulaire.

L'invention concerne également un mammifère transgénique non humain tel qu'obtenu par introduction dans un blastocyte de cellules souches embryonnaires (cellules ES) comportant dans leur génome l'une des susdites constructions transgéniques, obtenue par recombinaison homologue, sélection d'animaux chimères mâles selon un critère correspondant à la lignée ES, croisement des animaux sélectionnés avec des souris, notamment des souris
C57 Black 6, pour obtenir des animaux hétérozygotes par rapport à l'une des susdites constructions et éventuellement croisement de deux hétérozygotes pour obtenir un animal homozygote par rapport à l'une des susdites constructions.

L'homozygote présente un fond génétique 129/C57 Black 6 50/50. On peut revenir sur un fond génétique C57 Black 6 par croisement homozygote avec des souris C57 Black 6 sur 12 générations au moins.

On choisit de façon avantageuse les souris C57 Black 6, car ce fond génétique est plus favorable pour certaines expériences de comportement.

L'invention concerne également un mammifère transgénique tel que produit par croisement d'animaux transgéniques exprimant l'une des constructions transgéniques définies ci-dessus.

L'invention concerne également un procédé d'obtention d'un modèle transgénique pour l'étude des pathologies impliquant les récepteurs aux opiacés de type mu, ou les récepteurs aux opiacés de type delta ou les récepteurs aux opiacés de type kappa, et de leur traitement, comprenant
- le remplacement du gène endogène du récepteur aux opiacés de type ,u, ou du gène endogène du récepteur aux opiacés de type delta ou du gène endogène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans des cellules, notamment embryonnaires souches de souris (ES), cellules par une construction comprenant le gène du récepteur aux opiacés de type mu, ou le gène du récepteur aux opiacés de type delta ou le gène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans lequel respectivement
* l'exon 2 du gène du récepteur aux opiacés de type mu est
interrompu entre deux nucléotides contigus par une portion d'un
gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié,
notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du
promoteur PGKI, ou
* un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés
de type delta est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle
d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le
gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou
* un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés
de type kappa est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle
d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le
gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI,
et en particulier dans lequel le gène du récepteur aux opiacés de
type mu est interrompu au site BamHI de 1' exon 2 par l'insertion
de la cassette PGK-neo,
ou le fragment génomique Sma I-Sma I de 600 pb, contenant
l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est
remplacé par la cassette PGK-neo,
ou le fragment génomique de 235 pb de l'exon 1 du gène du
récepteur aux opiacés de type kappa contenant 1' ATG initiateur de
l'exon 1 et 232 paires de bases en aval du susdit ATG est remplacé
par la cassette PGK-neo, et
- l'introduction des susdites cellules dans des embryons, notamment des blastocytes de mammifères non humains,
- la sélection d'animaux chimères mâles selon un critère correspondant à la lignée ES,
- le croisement des animaux sélectionnés avec des souris, notamment des souris C57BL/6, pour obtenir des animaux hétérozygotes par rapport à l'une des constructions selon l'invention et
- éventuellement le croisement de deux hétérozygotes pour obtenir un animal homozygote par rapport à l'une des constructions selon l'invention.

Le critère utilisé est par exemple la couleur des poils (Agouti).

L'invention concerne un procédé de criblage de médicaments actifs sur des pathologies impliquant les récepteurs aux opiacés, notamment les pathologies suivantes : douleurs sévères aiguës ou chroniques, toxicomanie, prévention ou traitement de rejet de greffes, comprenant
- l'administration à un mammifère non humain transgénique ou à des cellules de mammifères non humains transgéniques contenant à la place du gène endogène du récepteur aux opiacés de type mu, ou du gène endogène du récepteur aux opiacés de type delta, ou du gène endogène du récepteur aux opiacés de type kappa, une construction contenant le gène du récepteur aux opiacés de type mu, ou le gène du récepteur aux opiacés de type delta ou le gène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans lequel respectivement
* l'exon 2 du gène du récepteur aux opiacés de type mu est
interrompu entre deux nucléotides contigus par une portion d'un
gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié,
notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du
promoteur PGKI, ou
* un fragment contenant 1' exon 1 du gène du récepteur aux opiacés
de type delta est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle
d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le
gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou
* un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés
de type kappa est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle
d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le
gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI,
et en particulier dans lequel le gène du récepteur aux opiacés de
type mu est interrompu au site BamHI de l'exon 2 par l'insertion
de la cassette neo,
ou le fragment génomique Sma I-Sma I de 600 pb, contenant
l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est
remplacé par la cassette PGK-neo,
ou le fragment génomique de 235 pb de l'exon 1 du gène du
récepteur aux opiacés de type kappa contenant l'ATG initiateur de
l'exon 1 et 232 paires de bases en aval du susdit ATG est remplacé
par la cassette PGK-neo
- la détermination des seuils nociceptifs par le test de l'immersion de la queue et de la plaque chaude après injection des drogues à tester,
- la détermination de la réponse aux drogues à tester pour les animaux dans lesquels on a produit une douleur chronique induite par l'injection de produits irritants, carrhagénane et adjuvant de Freund et produisant des mono arthrites ou polyarthrites ou le test de section du nerf sciatique ou le test de ligature du nerf sciatique dans le cas de douleurs neuropathiques,
- ou la détermination des propriétés psychotropes des drogues à tester par les tests de préférence de place ou d'auto-administration, ou la détermination du niveau de dépendance physique par l'induction d'une dépendance sévère et la provocation d'un sevrage dans le cas de la toxicomanie,
- ou la détermination de la réaction mixte lymphocytaire et de la durée de vie des greffons (Arakawa, K., Akami, T., Okamoto, M., Nakai, I., Oka,
T., Nagase, H. Transplantation proceedings (1993) 25:738-740) dans le cas de la prévention ou du traitement du rejet de greffes.

L'invention concerne également une construction transgénique contenant le gène du récepteur aux opiacés de type mu, ou le gène du récepteur aux opiacés de type delta ou le gène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans lequel respectivement
- l'exon 2 du gène du récepteur aux opiacés de type mu est interrompu entre deux nucléotides contigus par une portion d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou
- un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou
- un fragment contenant 1' exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type kappa est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier dans lequel le gène du récepteur aux opiacés de type mu est interrompu au site BamHI de 1' exon 2 par l'insertion de la cassette neo, ou le fragment génomique Sma I-Sma I de 600 pb, contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est remplacé par la cassette PGK-neo, ou le fragment génomique de 235 pb de l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type kappa contenant l'ATG initiateur de l'exon 1 et 232 paires de bases en aval du susdit ATG est remplacé par la cassette PGK-neo.

Description des figures
- Figure 1:
Interruption du gène du récepteur opioide y
a) Stratégie de préparation des souris n'exprimant plus le gène p.

L'organisation génomique et les cartes de restriction sont représentées de la façon suivante : pour la construction (sommet), gène sauvage (milieu) et gène recombinant (bas). Les boîtes noires représentent les régions codantes et la boite blanche représente le gène Néo. La ligne renforcée indique la sonde en 5' utilisée pour identifier les événements de recombinaison homologue.

E,exon; Néo, gène de résistance à la néomycine ; sites de restriction : B,
BamH I; S, SalI; Sp, Spe t.
b) Analyse génomique par transfert d'ADN (Southern blot) réalisé avec de l'ADN digéré par BamH I à partir de cellules ES électroporées, en utilisant la sonde 5'. Les fragments du gène sauvage et du gène recombinant sont respectivement de 6,3 kb et 7,6 kb.
c) Analyse génomique par transfert d 'ADN (Southern blot) réalisé avec de l'ADN de queues de souris. Les souris hétérozygotes sont croisées, l'ADN génomique de leur progéniture est soumis à une digestion par BamH I et analysé en utilisant la sonde 5'. Les génotypes sont décrits au-dessus de chaque bande : +/+, sauvage; +/-, hétérozygote; -/- homozygote.

- Figure 2
Analyse des sites de liaison des récepteurs , 6 et K dans les cerveaux de souris sauvages +/+, hétérozygotes +/- et homozygotes -/- déficients en gène du récepteur IL
a) Une analyse de Scatchard vis-à-vis de la liaison avec [3H] DAGO (y), [3H] NTI (6) et [3H] CI977 (K) est représentée pour chaque génotype de souris. Un essai représentatif est montré. Les valeurs de Bmax et de Kd (# SEM = écart type moyen) à partir d'au moins trois expériences distinctes sont indiquées.

Kd Bmax Kd Bmax Kd Bmax
O +/+ 1.343 0.099 0.068 0.095 0.214 0.019
(0.104) (0.005) (0.005) (0.010) (0.019) (0.001) A utilisant des domaines de concentration de 0.05-6,4 nM, 0.005-0.64 nM et 0.01-1.28 nM respectivement. De la naloxone (Sigma) est utilisée à une concentration de 2 ILM pour déterminer la liaison non spécifique. Les expériences sont réalisées en triple en utilisant au moins deux préparations de membranes distinctes, chacune faite à partir de trois cerveaux. Les données de liaison sont analysées en utilisant le programme EBDA-LIGAND (Biosoft).

Pour la cartographie par autoradiographie, les souris sont tuées par décapitation et les cerveaux intacts enlevés et immédiatement congelés dans l'isopentane à -20 C. Des sections coronaires gelées de 20 ,um sont coupées dans un cryostat (Zeiss Microm 505E) et sont montées en étant dégelées sur des lamelles pour microscope pré-traitées avec de la gélatine et séchées en utilisant CaSO4 anhydre pendant 1 semaine à -20 C. Un ensemble additionnel de sections est coupé de façon adjacente à celles-ci pour la détermination de liaisons non spécifiques qui est déterminée pour tous les ligands avec la naloxone (1 ILM pour DAGO, CI-977 et 10 ILM pour DELT I). Des lamelles sont préincubées dans Tris-HCl 50 mM, pH 7.4, plus 0.9% NaCl pendant 30 minutes pour éliminer les opioïdes endogènes. Une concentration d'environ 3 à 4 fois les Kd est utilisée pour le marquage des récepteurs ([3H] DAGO, 4 nM; [3H] DELT I, 7 nM; [3H] C1977, 2.5 nM). La liaison est effectuée dans Tris-HCl 50 mM, pH 7.4 (1 ml pour chaque lamelle) à température ambiante pendant 60 minutes pour tous les ligands, lavée trois fois avec du tampon Tris-HCl refroidi à 4"C (5 minutes), rapidement séché à l'air frais et dessiqué pendant 3 jours avant de l'apposer à des films autoradiographiques [3H]-Hyperfilm (Amersham) pour une période de trois semaines (IL et b) et quatre semaines. Toutes les lamelles des cerveaux + / +, + 1-et -/- sont déposées sur le même film, développées (en utilisant 50% Kodak D19 developer, 3 minutes) et analysées en utilisant un analyseur d'image MCID (Imaging Research, Canada). Ligands : CI977 (enadoline ou (-)-(5b,7b,8a) 3,4-dichloro-N-méthyl-N[7-(1-pyrrolidinyl)- 1-oxaspiro [4, 5]-dec-8- yl]benzo [b] furan-4-acétamide), DAGO, [3H] -D-Ala2MePhe4Gly-o15 enképhaline; DELT I, D-Ala2deltorphine I; NTI, naltrindole.

- Figure 3
Analyse de l'hybridation in situ de gènes de peptides opioïdes endogènes dans les cerveaux mutants et sauvages.
a) Les sections coronaires au niveau du striatum (PENK et PDYN, grossissement xt5) et au niveau de l'hypothalamus (POMC, grossissement x40) des cerveaux +/+, +/- et -/- sont représentées sous l'illumination en champ sombre avec le grain du signal apparaissant en blanc. Le marquage en utilisant les sondes d'ARN antisens de la proenképhaline (PENK) et de la prodynorphine (PDYN) est détecté dans le noyau accumbens (ACB), caudate putamen (CPU), le tubercule olfactif (OTU) et le cortex piriforme (PIR) et le marquage en utilisant la ribosonde antisense POMC est détecté dans le noyau arqué (AN).
b) Le fort grossissement (x100) des sections à travers l'hypothalamus et à travers la glande pituitaire de cerveaux de souris +/+ et -/- hybridés à la ribosonde antisens proopioimelanocortine (POMC) est photographié sous illumination en champ clair (les grains du signal apparaissent comme taches noires). Les cellules contenant le transcript POMC sont représentées dans le noyau arqué et le marquage du lobe intermédiaire (IL) de la glande pituitaire est aussi représenté.

METHODES.

Des sections (10 ILM) sont préparées au cryostat à partir de cerveaux congelés et hybridées avec des ribosondes antisens spécifiques marquées au 35S comme décrit (Decimo et al., (1995) In situ hybridization of nucleic acid probes to cellular RNA. In Gene Probes 2, A practical approach, Ed. Hames
B.D. et Hiddins S., 183-210 Oxford University Press, Oxford). La sonde
PENK est synthétisée à partir d'un fragment d'ADNc de 800 pb Pvu II-Xba I clonée dans pBluescript, la sonde PDYN à partir d'un fragment de restriction de 1700 pb Pst I-EcoR I sous-cloné dans pSP64 et la sonde POMC à partir d'un fragment de 400 pb Not I-Nco I cloné dans pBluescript. Les ADNcs sont un don de E. Borrelli. Les ribosondes sont synthétisées en parallèle, les cerveaux des trois génotypes sont traités et hybridés dans la même série d'expériences, et exposés sous émulsion Kodak NTB-2 pendant la même période de temps.

- Figure 4:
Activité locomotrice spontanée de souris mutantes dépourvues de récepteurs opioïdes CL (-/-), et de leurs congénères de type sauvage (+/+). Les boites consistent en des surfaces rectangulaires plastique (25.5 cm x 20.5 cm) avec deux photocellules croisées, isolées dans un cadre insonorisé avec une illumination légère (lux). L'activité locomotrice est mesurée à 14 h pendant trois jours consécutifs. La mesure dure 15 minutes. Aux jours 5 et 6, l'activité locomotrice est enregistrée à 14 h et 2 h respectivement. Toutes les expériences sont faites par un observateur aveugle. Les valeurs sont analysées par le système statistique ANOVA. Les comparaisons individuelles sont faites par le test de Dunnett. Le nombre d'animaux: 24 sauvages et 23 mutants. Les carrés noirs correspondent aux souris homozygotes et les carrés blancs correspondent aux souris sauvages. Les étoiles noires indiquent la comparaison à différents temps de mesure pour le même groupe d'animaux
a. schéma de gauche : entre le premier et le troisième jour,
b. schéma de droit : entre 14 h et 2 h.

Les étoiles blanches montrent la comparaison entre les groupes sauvages et mutants au même moment de mesure (test de Dunnett bilatéral).

Une étoile correspond à p < 0.05 et deux étoiles correspondent à p 0.01.

Figure 5
Réponses antinociceptives à l'administration de morphine dans les souris mutantes dépourvues de récepteur opioïde IL ) et leurs congénères de type sauvage (+/+). Pour évaluer la réponse à la douleur, on a effectué
a) test de l'immersion de la queue
b) test de la plaque chaude.

Le test de l'immersion de la queue (54"C) et le test de la plaque chaude sont effectués 10 minutes et 20 minutes respectivement après injection de solution saline ou de morphine. Le temps maximal observé est de 15 secondes pour le test de l'immersion de la queue, et de 30 et 180 secondes respectivement pour la réponse au léchage et au saut dans le test de la plaque chaude. Les tests pharmacologiques et le soin aux animaux est fait selon les normes éthiques standard (Nili, 1985). Les valeurs sont analysées par
ANOVA (mutation et traitement) entre les sujets. Les comparaisons individuelles sont faites par le test de Dunnett. Le nombre d'animaux par groupe est de 7 à 11.

Les carrés noirs correspondent aux souris homozygotes et les carrés blancs correspondent aux souris sauvages.

Les étoiles noires indiquent les comparaisons entre les animaux traités avec une solution saline (animaux témoins) du même génotype et les étoiles blanches montrent la comparaison entre les groupes sauvages et mutants qui reçoivent le même traitement (test de Dunnett bilatéral).

Une étoile correspond à p < 0.05 et deux étoiles correspondent à p < 0.0t.

- Figure 6
Pour évaluer le caractère euphorisant des drogues, on effectue le test de la place de préférence à la place conditionnée, induite par la morphine dans les souris dépourvues de récepteur opioide Il (-/-), et leurs congénères de type sauvage (+/+). Le paradigme de la préférence de place est effectué en utilisant les mêmes conditions expérimentales que celles données dans (Valverde et al., 1996), à l'exception du temps de conditionnement (18 minutes) et de la taille des compartiments (15 cm x 15 cm x 15 cm). En bref, le schéma de conditionnement consiste en 3 phases. Pendant la phase de préconditionnement, les animaux sont placés sur une surface neutre et le temps passé dans chaque compartiment est enregistré. La phase de conditionnement consiste en 6 jours consécutifs de morphine (3 mg/kg, sous-cutanée) ou de solution saline. Les portes situées sur les murs des compartiments permettent de confiner les souris immédiatement après l'injection. Les souris reçoivent la morphine aux jours 1, 3 et 5, et la solution saline aux jours 2, 4 et 6. Les animaux témoins reçoivent la solution saline chaque jour. La phase de test est réalisée exactement comme la phase de préconditionnement (libre accès de chaque compartiment), 24 h après l'étape de conditionnement finale. Les données sont exprimées en résultats calculés comme différence entre le temps de postconditionnement et de préconditionnement passé dans le compartiment associé avec le médicament. Les valeurs sont analysées par ANOVA (mutation et traitement) entre les sujets. Le nombre d'animaux par groupe est de 9 à 14.

Les étoiles noires indiquent les comparaisons entre les animaux traités avec une solution saline (animaux témoins) du même génotype et les étoiles blanches montrent la comparaison entre les groupes sauvages et mutants qui reçoivent le même traitement (test de Student "t bilatéral).

Deux étoiles correspondent à p < 0.01.

- Figure 7
Incidence de l'abstinence mesurée pendant le syndrome de manque de morphine provoqué par la naloxone dans des souris mutantes dépourvues de récepteurs opioïdes IL (-/-), et leurs congénères de type sauvage (+/+).
a) Signes somatiques. Les carrés noirs correspondent aux souris homozygotes et les carrés blancs correspondent aux souris sauvages.
b) Signes végétatifs.

Les résultats sont exprimés comme moyennes + SEM. La dépendance aux opiacés est induite dans les souris par des injections intrapéritonéales répétées de morphine, à intervalle de 12 heures pendant 6 jours. La dose de morphine est progressivement augmentée comme suit: premier jour, 20 mg/kg; deuxième jour: 40 mg/kg; troisième jour: 60 mg/kg; quatrième jour: 80 mg/kg; cinquième jour: 100 mg/kg; sixième jour (seulement une injection le matin) 100 mg/kg. Les souris témoins sont traitées avec de la solution saline dans les mêmes conditions. Le manque est provoqué dans chaque animal en injectant de la naloxone (1 mg/kg, sous-cutanée) seulement une fois 2 heures après la dernière administration de morphine. Trente minutes avant l'injection de naloxone, les animaux sont placés individuellement dans des chambres de test consistant en des boîtes rondes transparentes (30 cm de diamètre x 50 cm de hauteur) avec un sol blanc. Pendant les 15 minutes précédant l'injection de naloxone, les souris sont observées afin de vérifier la présence d'un comportement normal. Les signes somatiques de manque sont évalués immédiatement après l'injection de l'antagoniste opiacé pendant une période de 30 minutes. Le nombre d'ébrouements, de sauts, de tremblements de la patte et de reniflage sont comptés. Le claquement de dents, les diarrhées, tremblements et ptôses sont évalués pendant des périodes de 5 minutes, un point pour la présence de chaque signe étant donné pendant chaque période. Le nombre de périodes montrant le signe est ensuite compté (score maximum : 6).

Le poids corporel et la température rectale sont déterminés 2 minutes avant et 30 minutes après l'injection de naloxone. La température rectale est également mesurée 60 minutes après la naloxone. Voir légende de la figure 5 pour l'analyse statistique. Le nombre d'animaux par groupe va de 9 à 14.

Les carrés noirs correspondent aux témoins homozygotes ayant reçu une injection de solution saline. Les carrés blancs correspondent aux témoins sauvages ayant reçu une injection de solution saline.

Les carrés comportant des diagonales serrées correspondent aux témoins homozygotes ayant reçu une injection de morphine. Les carrés comportant des diagonales espacées correspondent aux témoins sauvages ayant reçu une injection de morphine.

Une étoile correspond à p < 0.05 et deux étoiles correspondent à p < 0.01.

- Figure 8 : Criblage ES : Interruption du gène mu par recombinaison homologue:
A. Représentation d'un fragment BamH I-BamH I (environ 14 kb) du gène mu de souris pour lequel la recombinaison homologue a eu lieu. Le gène néo avec son promoteur et son signal de polyadénylation sont insérés dans 1' exon 2 (nucléotides 6375 à 7989). La position des sondes externes 5' et 3', ainsi que la sonde néo est indiquée en gras sous le fragment de gène schématisé.

B. Taille des fragments attendus lors du criblage par Southern de l'ADN génomique de cellules ES. Digestion de l'ADN par BamH I et hybridation du
Southern avec la sonde I (= sonde 5'). WT = fragment sauvage; Rec= fragment muté.

C. Taille des fragments attendus lors du criblage par Southern de 1'ADN génomique de cellules ES. Digestion de l'ADN par BamH I et hybridation du
Southern avec la sonde II (= sonde néo. WT = fragment sauvage; Rec= fragment muté.

D. Taille des fragments attendus lors du criblage par Southern de l'ADN génomique de cellules ES. Digestion de l'ADN par EcoR I + Nco I et hybridation du Southern avec la sonde III (= sonde 3'). WT = fragment sauvage; Rec= fragment muté.

Légende:
- le trait correspond au génome,
- le rectangle blanc correspond à l'intron mMOR,
- le rectangle noir correspond à l'exon mMOR,
- le rectangle comportant les diagonales espacées correspond au promoteur PGK,
- le rectangle comportant les diagonales serrées correspond au gène neo.

- Figure 9 : Construction 6
Interruption du gène delta par recombinaison homologue.

A. Carte de restriction d'un fragment Sac I-EcoR I d'environ 14.5 kb du gène delta de souris contenant 1' exon 1 codant pour les acides aminés 1 à 77 du récepteur delta.

B. Portion du gène delta Sac I-EcoR I utilisé pour réaliser le vecteur de recombinaison homologue. Le fragment de 1.9 kb contenant le gène néo a été inséré dans les sites Sma I présents de part et d'autre de 1' exon 1.

C. Résultat de la recombinaison homologue: la totalité de ltexon I est remplacée par le gène néo. La position des sondes 5' et 3' externes utilisées pour le criblage est indiquée sous forme de traits gras sous le fragment de gène schématisé. La sonde 5' (= sonde 1) correspond à un fragment Sac I-Sac I de 700 pb. La sonde 3' (= sonde 2) a été obtenue par PCR avec les oligos indiqués sur le schéma et a une taille de 300 pb.

Légende:
- les carrés comportant des diagonales correspondent au gène néo,
- les carrés comportant des losanges correspondent à l'exon 1.

A= ApaI S=SacI B=BamHI Sal = SalI
E=EcoRI Sc = Sca I
K=KpnI Sm=SmaI
N = NotI Sp = SpeI
- Figure 10 : Construction K
Interruption du gène kappa par recombinaison homologue.

A. Carte de restriction d'un fragment EcoR I-EcoR I d'environ 16 kb du gène kappa de souris contenant les exons 1 et 2 codant respectivement pour les acides aminés 1 à 86 et 87 à 102 du récepteur kappa. Le sites EcoR I, Sac I et
BamH I sont présents naturellement dans le gène; les deux sites Sma I ont été créés par mutagénèse dirigée. Les tailles des fragments BamH I-BamH I et
EcoR I-EcoR I sont indiquées.

B. Portion du gène kappa BamH I-BamH I utilisé pour réaliser le vecteur de recombinaison homologue.

C. Résultat de la recombinaison homologue: la plus grande partie de l'exon I est remplacée par le gène néo. La position des sondes 5' et 3' externes utilisées pour le criblage est indiquée sous forme de traits gras sous le fragment de gène schématisé.

EXEMPLE 1:
Création d'une lignée de souris mutantes pour laquelle le gène codant pour le récepteur opioide mu n'est plus exprimé.

Méthodes. Une banque génomique de souris dérivée de la souche 129/sv est criblée en utilisant une sonde d'ADNc du récepteur oploide 6 de souris (Kieffer B. et al. (1992) PNAS 89:12048) dans des conditions faiblement stringentes. Un fragment génomique codant le récepteur IL contenant les exons 2 et 3 est obtenu et un fragment Sal I/Spe I de 6,8 kb est excisé et souseloné dans pBlueScript (Stratagene). Une cassette Bgl ll de 1,6 kb contenant le gène de résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur PGK (Lufkin, T,
Dierich, A., LeMeur, M., Mark, M. and Chambon, P. (1991) Cell, vol. 66, p. 1105) est insérée dans un site unique BamH I présent dans l'exon 2, éliminant ainsi les sites endogènes BamH I et interrompant la séquence codanre au niveau de la seconde boucle intracellulaire (acide aminé 193). Le vecteur cible est linéarisé et électroporé dans des cellules (P 1)-ES (Lufkin, T.,
Dierich, A., LeMeur, M., Mark, M. and Chambon, P. (1991) Cell, vol. 66, p. 1105). Les clones résistants à la néomycine sont criblés par transfert d'ADN en utilisant une sonde en 5' marquée au 32P générée par PCR sur les fragments génomiques provenant de la digestion par BamH I. Les mêmes transferts sont ensuite hybridés avec une sonde en 3' générée par PCR, ainsi que la sonde Néo constituée par le fragment de 536 pb BamH I-Pvu II de l'ADNc codant pour la néomycine (Lufkin, T., Dierich, A., LeMeur, M.,
Mark, M. and Chambon, P. (1991) Cell, vol. 66, p. 1105) pour confirmation de recombinaison homologue.

S'agissant des sondes, elles ont été générées par PCR à partir de 1'ADN génomique dans la région située entre les sites BamH I et Sal I pour la sonde 5' et proche du site Nco I pour la sonde en 3'. Les oligonucléotides qui ont permis de les obtenir sont les suivants sonde 5': oligo sens: 5' CTGGATAATAATGGAGAAATACAGAC3'
oligo antis ens: 5'AGAGGGAGCCTGTAAGCATGAAG3'
Taille: 463 pb sonde 3': oligo sens: 5'TGTGGCTCCGCAGGTTCTAGCA3'
oligo antisens: 5 'TGCACTTGACAACACAGAGTTTA3 '
Taille: 1010 pb.

Un clone positif est micro-injecté dans des blastocytes C57BL/6 (Lufkin,
T., Dierich, A., LeMeur, M., Mark, M. and Chambon, P. (1991) Cell 66:1105) et donne naissance à des descendants chimériques qui à leur tour sont croisés avec des souris C57BL/6. Des souriceaux de couleur Agouti sont caryotypés par analyse par transfert d'ADN de biopsie de queues et les mâles transmettant la lignée sont utilisés pour fonder une colonie.

Résultat : Génération de souris déficientes en MOR.

Le gène du récepteur opioïde Cr. (MOR) est inactivé dans des cellules souche embryonnaire 129/Sv par insertion d'une cassette Néo dans la région codante du gène (figure 1 a). Les événements de ciblage du gène sont identifiés par transfert d'ADN (figure 1 b) et 7 clones parmi 90 résistants à la néomycine se sont révélés positifs, représentant une fréquence de ciblage de
1/13ème. L'analyse par transfert d'ADN en utilisant une sonde en 3' générée par PCR et la sonde Néo confirme l'intégration précise d'une copie unique du fragment de gène MOR interrompu (non représenté). Un clone positif ES est utilisé pour établir une souris mutante (figure 1 c). L'analyse par saturation de liaison (3H) DAGO ([3H]-D-Ala2-MePhe4Gly-o15) sur des homogénats de cerveaux entiers confirme une réduction de 50% des sites de liaison du récepteur IL dans les animaux hétérozygotes et une perte totale de liaison du
ligand IL dans les mutants homozygotes (figure 2a). Les études autoradiographiques de liaison (3H) DAGO montrent l'absence de site de liaison du récepteur IL dans toutes les coupes de cerveau examinées chez les souris homozygotes et une diminution de moitié chez les souris hétérozygotes.

Ces résultats démontrent l'inactivation complète du gène MOR.

EXEMPLE 2:
- Création d'une lignée de souris mutantes pour laquelle le gène codant pour le récepteur opioïde kappa a été interrompu par recombinaison homologue.

Le gène codant pour le récepteur opioïde kappa de souris a été obtenu, par criblage d'une banque d'ADN génomique de souris SVJ129 (commercialisée par Stratagene, USA) à l'aide d'une sonde de 231 paires de bases (pb) codant pour les acides aminés 6 à 82 du récepteur kappa. Huit clones positifs ont été obtenus et la position du premier exon codant a été cartographiée en utilisant des techniques standards. Un fragment de restriction
BamH I de 6,8 kilopaires de bases (kb, voir figure 10), contenant le premier exon codant, a été sous cloné dans le vecteur pBluescript (Stratagene) dans lequel le site Sma I a été détruit préalablement. Deux sites Sma I ont ensuite été créés par mutagenèse dirigée, l'un sur le site d'initiation de la traduction (CCATGG en CCCGGG), l'autre à l'extrémité 5' de l'exon 1. Ces deux sites ont ainsi permis de détruire le site d'initiation de la traduction (ATG) et d'éliminer un fragment de 234 pb contenant la majorité de la séquence codante contenue dans l'exon 1 (voir figure 10). Ce fragment à été remplacé par une cassette néo (Lufkin, T., Dierich, A., LeMeur, M., Mark, M. and Chambon,
P. (1991) Cell, vol. 66, p. 1105) contenant le gène de résistance à la néomycine flanqué d'un promoteur en 5' et d'un signal de polyadenylation en 3' issus du gène PGK (phosphoglycérate kinase). Le vecteur final (voir figure 10) contient 1,3 kb en 5' et 5,2 kb en 3' de séquences du gène kappa. Cette construction a été électroporée dans des cellules embryonnaires souches (ES) provenant de souris de la lignée SV129. Les cellules ont ensuite été sélectionnées au G418 et les clones résistants ont été sous clonés. L'ADN génomique de ces clones a été isolé et analysé par Southern en utilisant des sondes externes 5' et 3'. Les cellules d'un des clones positifs ont été injectées dans des blastocytes de souris de la lignée C57/BL6 et des souris chimériques ont été obtenues. Ces chimères, par croisement avec des souris C57/BL6, permettront d'obtenir des souris hétérozygotes puis le croisement de ces souris entre elles permettront d'obtenir les animaux homozygotes.

Détails techniques:
sonde externe 3': correspond à un fragment de restriction
BamH I/Sac I d'environ 700 pb situé à 5,2 kb en 3' de l'exon 1 (voir figure 10).
sonde externe 5': correspond à un fragment de restriction
Sac I/BamH I d'environ 600 pb situé à 1,3 kb de l'exon 1. Le site BamHI de ce fragment est présent naturellement dans le gène du récepteur kappa (voir figure 10). Le site Sac I correspond à un site de clonage présent dans le phage l Fix II qui a été utilisé pour construire la banque d'ADN génomique de souris.

EXEMPLE 3:
- Création d'une lignée de souris mutantes pour laquelle le gène codant pour le récepteur opiolde delta a été interrompu par recombinaison homologue.

Une banque génomique de souris (cellules ES SV 129/D3), clonée dans le vecteur EMBL3, a été criblée avec une sonde d'ADNc de souris. Plusieurs clones ont été obtenus. Le clone de phage 17.2, qui a une taille de 14.5 kb et qui contient le premier exon du gène codant pour le récepteur opioïde delta, a été utilisé pour la construction du vecteur pour la recombinaison homologue dans des cellules embryonnaires de souris. D'abord une carte de restriction a été réalisé autour du premier exon. La construction du vecteur a été fait en quatre étapes: (1) Un fragment EcoR I/Not I de 7.2 kb contenant le premier exon du gène du récepteur opioïde delta a été cloné dans le vecteur pBluescript. (2) Le premier exon a été enlevé en coupant ce plasmide par l'enzyme Sma I. (3) Un fragment de 1.9 kb du vecteur pKJ-1 (Lufkin, T.,
Dierich, A., LeMeur, M., Mark, M. and Chambon, P. (1991) Cell, 66:1105) contenant le gène de résistance de la Néomycine sous contrôle du promoteur
PGK est inséré à cet endroit. (4) Un fragment de 1.3 kb Not I-Sac I du clone de phage 17.2 est ajouté en amont de cette construction. La construction finale est représentée dans la figure 9 et a été vérifié par séquençage.

S'agissant de la sonde 5', elle est représentée par sonde 1 sur la figure 9 et correspond au fragment Sac I-Sac I (représenté par sonde 1 sur la figure 9) indiqué sur la carte de restriction du gène.

S'agissant de la sonde 3', elle est représentée par le fragment obtenu par
PCR situé entre les sites EcoR I (voir figure 9, sonde 2). Les oligonucléotides qui ont permis de l'obtenir sont respectivement:
oligonucléotide sens: 5' AGGAAGCCTGGGTCTCCTTC3' oligonucléotide antisens: 5'GTGCACCATGGGTGTGC AGC 5'GTGCACCATGGGTGTGCAGC3'.

Tableau 1:
Activité de l'adénylate cyclase stimulée par la forskoline et basale (FK, 100 mM) dans les homogénats du striatum et cervelet à partir de souris sauvages (+ / +) et déficientes homozygotes (-/-) après manque à la morphine induit par la naloxone. Les résultats sont exprimés en pmoles d'AMP cyclique formé/minute/mg de protéine et représente la moyenne t SEM de quatre expériences individuelles en triple. L'étoile indique p < 0,05 comparé au témoin (solution saline).

<SEP> +/+ <SEP> <SEP> -/
Saline <SEP> Morphine <SEP> Saline <SEP> Morphine
<tb> Basal <SEP> 278#23 <SEP> 401#22* <SEP> 304#16 <SEP> 304#28
<tb> STRIATUM
<tb> FK <SEP> 1130#71 <SEP> 1473#43* <SEP> 1196#40 <SEP> 1158#108
<tb> Basal <SEP> 235#35 <SEP> 209#30 <SEP> 236#17 <SEP> 213#42
<tb> CEREBELLUM
<tb> FK <SEP> 1075#115 <SEP> 966#55 <SEP> 1068#56 <SEP> 979#73
<tb>
METHODES.

Les souris traitées de façon chronique (voir figure 7) soit avec la solution saline soit avec la morphine reçoivent une injection unique de naloxone et sont tuées 1 h après. Les tissus sont homogénéisés dans 10 volumes d'un tampon refroidi à la glace contenant : Tris-HCl 20 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM, DTT (dithiothreïtol) 0.5 mM, PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle) 0.5 mM.

Les homogénats (40-100 g de protéine) sont incubés à 37"C pendant 10 minutes dans 60 ,ul d'un milieu test de composition suivante : Tris 50 mM, pH 7.6, MgCl2 5 mM, AMPc 1 mM, ATP 100 ILM contenant 106 cpm (oe-32P)-ATP, avec un système de régénération consistant en 5 mM de créatine phosphate et 250 mg/ml de créatine kinase. La quantité du oc-32P-AMPc formé est mesurée après séparation d'AMPc à partir d'ATP sur des colonnes d' aluminium comme précédemment décrit (Hanoune, J., Stengel, D.,
Lacombe, M.L., Feldmann, G. et Coudrier, E. (1977) J. Biol. Chem.

252:2039-2045). La protéine est déterminée en utilisant l'essai Bio-Rad (Bio
Rad, FRG). L'analyse statistique est effectuée en utilisant l'ensemble général linéa
S.J. et al. (1990) Molecular Neuropharmacology 1:23-29 Fang R.J. et al.

(1994) Journal of Pharmacol. Exp. Therapeutics 268:836-846 et Robson L.E. et al. (1985) European Journal of Pharmacol. 112:65-71). Ces résultats montrent que le nombre total de récepteurs 6 et K n'est pas modifié dans les animaux déficients en récepteur IL Etant donné que la distribution des récepteurs peut néanmoins être modifiée, on a effectué une cartographie par autoradiographie complète à partir du bulbe olfactif dans les régions du cerveau frontales et médianes. Dans les souris de type sauvage, la distribution anatomiques des sites IL 6 et K est similaire à celui reporté dans les autres souris (Moskowitz and Goodman, 1985 ; Dupin et al., 1991 ; Sharif and
Hughes, 1989) et le rat (Mansour et al., 1987 ; Boyle et al., 1990). La liaison aux récepteurs 8 et K est présente dans toutes les régions dans lesquelles la liaison est détectée dans les souris de type sauvage. Il y a cependant quelques différences quantitatives de région et un nombre plus faible de récepteurs a été détecté par la deltorphine 1 chez la souris -/-. On n'a pas encore déterminé si cette différence est d'ordre méthodologique ou réelle.

Trois précurseurs des peptides opioides ont été décrits dans le système nerveux central, le proencéphaline (PENK), la prodynorphine (PDYN) et la proopiolmelanocortine (POMC). La synthèse de POMC est réduite au noyau arqué de l'hypothalamus dans le cerveau, tandis que les transcripts PENK et
PDYN ont des distributions qui se recouvrent substantiellement dans les ganglions de base (Kachaturian et al. (1993) Handbook of Exp. Pharmacol. vol. 104/I, Opioids I. Ed. A. Herz). On a investigué l'effet de l'absence du récepteur IL sur l'expression de ces gènes en utilisant l'analyse par hybridation in situ. I1 n'y a pas de modification dans le réseau d'expression de PENK dans le tubercule olfactif, le cortex piriforme, le noyau accumbens et le striaturn parmi les génotypes de souris (figure 3 a). Dans les ganglions de base, l'ARNm de PDYN est trouvé élevé dans accumbens et moins abondant dans caudate-putamen pour les trois cerveaux de souris +l+, + /- et -/- (figure 3 a). De plus, le radiomarquage des noyaux supraoptique et hypothalamiques paraventriculaires par la sonde PDYN est inchangé (pas représenté), l'expression de POMC est limitée aux neurones arqués dans les trois souches de souris (figure 3 a), avec un nombre similaire et une distribution de cellules contenant le transcript (figure 3 b). Enfin, l'expression de POMC est aussi recherchée dans la glande pituitaire et un fort marquage du lobe intermédiaire est observé avec aucune différence significative dans les animaux déficients en récepteur IL (figure 3 b). Par conséquent, les schémas de marquage paraissent non distingables parmi les génotypes, suggérant que les niveaux de distribution et d'expression des peptides opioïdes sont inchangés en l'absence de récepteurs IL
POMC et PENK codent pour les ss-endorphine et les enképhalines, peptides qui, de préférence, ciblent le récepteur Cc. L'absence de diminution évidente de ces peptides en l'absence de leur récepteur suggère que l'expression du récepteur n'exerce pas de contrôle négatif sur la synthèse des ligands endogènes.

Comportement spontané:
L'activité locomotrice spontanée des souris mutantes est évaluée dans les boîtes d'activité locomotrice pendant trois sessions faites à 14 h dans des jours consécutifs. Lorsque les animaux sont exposés aux boîtes pour la première fois, aucune différence significative dans l'activité locomotrice n' est observée entre les souris mutantes et leurs congénères de type sauvage. Cependant, une tendance à l'hypolocomotion est observée dans les deux premières sessions.

L'activité locomotrice des souris est ensuite mesurée dans les mêmes boîtes durant le jour (14 h) et la nuit (2 h). A la fois les souris mutantes et les souris de type sauvage montrent une augmentation significative de l'activité locomotrice pendant la nuit, suggérant que le rythme circadien n' est pas modifié dans les souris qui manquent de récepteur CL. Pendant les périodes du jour et de la nuit, l'activité des animaux mutants est également plus faible dans cet environnement familier, selon l'observation préliminaire faite pendant les deux premières sessions. Ainsi, l'activité locomotrice des animaux déficients en récepteur IL et homozygotes est légèrement décrue (22% du degré des souris sauvages).

Réponse au traitement aigu et chronique à la morphine:
Les réponses pharmacologiques obtenues après une administration aiguë et chronique de morphine sont étudiées chez les souris déficientes en récepteur opioïde IL Dans une première expérience, les effets antinociceptifs induits par une injection aiguë de morphine (2 et 6 mg/kg, sous-cutanée) sont évalués dans l'immersion de la queue (latence de retrait de la queue) et plaque chaude (latence de léchage et de saut). Le seuil nociceptif des souris mutantes et de type sauvage est le même dans les différents paramètres évalués dans les deux tests, suggérant l'absence d'implication du récepteur IL dans la perception nociceptive de base. Dans les souris de type sauvage, 1' administration de morphine induit des réponses antinociceptives significatives dans le test d'immersion de la queue, et dans le léchage, et dans le saut du test de la plaque chaude. Dans les mutants, aucune réponse antinociceptive n'est induite par la morphine dans aucun de ces seuils nociceptifs (figure 5).

Dans une seconde expérience, les propriétés de renforcement de la morphine sont recherchées dans le même groupe d'animaux en utilisant le paradigme de conditionnement à la plaque (Valverde et al. (1996)
Psychopharmacology 123:119-126). L'administration de morphine induit une préférence de place conditionnée chez les souris de type sauvage, comme le montre une augmentation significative du temps passé dans le compartiment associé à la morphine pendant la phase de test. Ce comportement conditionné n'est pas observé chez les souris mutantes, qui passent le même temps dans le compartiment destiné à la morphine dans les phases de conditionnement (figure 6). La réponse observée dans ce test est probablement due à une perte de propriétés d' auto-récompense de la morphine chez les souris dépourvues de récepteur opioide y.

Dans une troisième expérience, un degré de dépendance important est induit en donnant des doses augmentées de morphine, et la manifestation de symptômes (somatiques) de manque est évaluée après l'administration de naloxone. Après traitement chronique à la morphine, les souris de type sauvage mais pas les mutantes montrent les signes classiques de rongeurs traités aux opiacés, tels que le réflexe de Straub et l'activité locomotrice augmentée. L'administration de naloxone ne change pas le comportement dans les témoins auxquels on administre une solution saline et induit les différents symptômes comportementaux du manque dans les animaux sauvages traités par la morphine (figure 7). Dans les animaux mutants traités chroniquement à la morphine, l'injection de naloxone n'induit aucune modification comportementale, montrant l'absence de dépendance à la morphine dans les souris déficientes en récepteur opioïde tc.

Le traitement aux opiacés chronique augmente la réponse de la voie de transduction du signal d'AMP cyclique spécifiquement dans les zones du cerveau impliquées dans la tolérance aux opiacés et la dépendance (locus coeruleus, amygdales, striatum) (Terwilliger, R.Z., Beitner-Johnson, D.,
Sevarino, K.A., Crain, S.M. and Nestler, E.J. Brain Res., 548:100-110 (1991); Duman, R.S., Tallman, J.F. and Nestler, E.J. J. Pharmacol. Exp.

Ther. 246:1033-1039 (1988)), un phénomène que l'on pense être impliqué dans le syndrome du manque (Nestler, E.J., Hope, B.T. and Widnell, K.L.

Neuron, 11:995-1006 (1993)). Pour fournir une base biochimique pour la dernière observation comportementale, on a quantifié l'activité de l'adénylate cyclase de base et stimulée par la forskoline dans le striatum de souris sauvages et de souris déficientes après manque de morphine induite par la naloxone. L'analyse statistique montre une interaction significative (corrélation) entre le traitement à la morphine et le génotype +/+ pour à la fois l'activité d'adénylate cyclase de base (F(1,12)=7.15, p=0.0203) et stimulée par la forskoline (F(1,12)=7.36, p=0.0189). Ainsi, l'administration de naloxone après traitement chronique à la morphine résulte dans une activité d'adénylate cyclase du striatum augmentée de 30% chez les souris sauvages selon les observations précédentes (Terwilliger, R.Z., Beitner-Johnson, D.,
Sevarino, K.A., Crain, S.M. and Nestler, E.J. Brain Res., 548:100-110 (1991)). Au contraire, l'accroissement de l'activité de cyclase est absente chez les animaux déficients en récepteur IL Comme témoin négatif, on a utilisé l'activité d'adénylate cyclase dans le cerebellum, une région naturellement dépourvue de récepteurs ,u, et on a trouvé aucun changement significatif entre les différents groupes. Ce résultat suggère que l'absence de récepteur IL chez les animaux mutants homozygotes empêche le développement de l'activité de l'adénylate cyclase et supporte l'hypothèse selon laquelle l'augmentation de la voie de 1'AMP cyclique est impliquée dans l'abstinence aux opiacés.

CONCLUSIONS.

Aucune anomalie morphologique évidente n' est détectée chez ces souris, qui grandissent et se reproduisent normalement et présentent une activité circadienne préservée.

On a étudié les sites de liaison des récepteurs opioïdes (y, 6 et K) par analyse par saturation et cartographie par autoradiographie sur des sections du cerveau et on a analysé les figures d'expression des gènes des peptides endogènes opioïdes (proenképhaline, prodynorphyne et proopiomélanocortine) par hybridation in situ. On montre une absence totale de sites de liaison des récepteurs opioïdes IL dans les souris -/-, sans changement marqué dans le nombre de sites 6 et K dans ces animaux. On a analysé la distribution de l'expression des peptides opioïdes et observé que l'on ne peut pas faire de distinction entre les souris de type sauvage et mutantes. Ces observations indiquent que des changements compensatoires sont intervenus dans le système opioïde endogène en l'absence du récepteur CL.

On dispose par conséquent d'un modèle animal pour étudier l'analgésie induite par les opiacés, 1' auto-récompense et la dépendance physique. Des expériences pharmacologiques in vitro et in vivo réalisées antérieurement avaient montré que les trois sous-types de récepteurs opioides seraient impliqués dans la régulation du stimulus nociceptif. De plus, à la fois les récepteurs IL et 6 sont impliqués dans les propriétés d' auto-récompense des opiacés et sont des candidats pour participer à l'expression de la dépendance physique aux opiacés. Le but de la présente étude est donc de déterminer la contribution des récepteurs IL en réponse aux opiacés in vivo et pour mesurer la réponse comportementale des animaux, nous avons utilisé la morphine comme médicament prototype opiacé.

On a étudié l'analgésie induite par la morphine en utilisant les tests d'immersion de la queue et de la plaque chaude, où la réponse nociceptive implique de façon prédominante des mécanismes respectivement spinaux et supraspinaux. En l'absence de médicament, les seuils de douleurs sont identiques entre les souris + / + et -/-, suggérant que le récepteur opioïde IL n'est pas impliqué dans le maintien d'une perception normale de la douleur ou que son rôle physiologique peut être compensé par d'autres mécanismes différents du système opioïde endogène. La morphine induit une analgésie dépendant de la dose dans les animaux de type sauvage, mais, la morphine est complètement sans effet chez les souris déficientes en récepteur IL L'absence de réponse à la morphine dans le test de l'immersion de la queue est particulièrement intéressante et conduit à reconsidérer le rôle des autres récepteurs opioides dans l'analgésie spinale.

Les propriétés d'auto-récompense de la morphine dans le paradigme de la préférence de place sont également étudiées. Le phénotype des souris mutantes est clair: aucune préférence de place conditionnée n'est observée chez les souris mutantes, tandis que la morphine induit des effets ré-enforceants marqués chez les souris de type sauvage.

Une forte dépendance physique est également induite par l'injection de doses croissantes de morphine (jusqu'à 100 mg/kg) et le syndrome manque induit en injectant l'antagoniste naloxone opioide non spécifique. Dans les souris de type sauvage, la naloxone provoque les signes somatiques classiques de manque, de même que la perte de poids et l'hypothermie. Au contraire, les souris homozygotes déficientes en récepteur IL ne présentent aucun des signes comportemental ou végétatif d'abstinence observés chez les animaux de type sauvage. Afin de donner un support biochimique à ce dernier résultat, on a mesuré l'activité de l'adénylate cyclase dans le striatum des souris abstinentes.

On a trouvé une augmentation de 30% de l'activité de l'adénylate cyclase de base et de celle induite par la forskoline chez les souris de type sauvage en manque de morphine, ainsi que précédemment décrit dans la littérature. Au contraire, aucune modification des niveaux de formation d'AMP cyclique n'est observée dans les souris mutantes.

Cet ensemble de résultats est d'un intérêt primordial pour la compréhension de l'action biologique des médicaments opiacés. Par la présente invention, on rapporte l'identification de la cible moléculaire de la morphine.

On démontre également que l'activité du gène MOR est absolument essentielle pour l'analgésie induite par la morphine, les effets d'auto-récompense et de dépendance physique. De plus, on montre également par la présente invention que les récepteurs 6 et K n'interviennent pas dans les actions biologiques de la morphine - même partiellement - en l'absence du récepteur ,a, bien que ces récepteurs soient exprimés et se lient aux ligands opioïdes chez les souris mutantes. Par conséquent, le produit du gène du récepteur opioïde IL n'est pas seulement la cible préférée de la morphine, comme décrit, mais également un composant nécessaire à l'action des opiacés. La présente approche génétique montre pour la première fois le rôle indispensable du récepteur opioïde IL dans de multiples actions des opiacés.

Claims

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain dont l'expression du gène codant pour un récepteur aux opiacés est modifiée, notamment dans les tissus nerveux par rapport à une expression normale, notamment dans les tissus nerveux, pour la détermination d'un médicament actif sur les pathologies impliquant les récepteurs aux opiacés, notamment les douleurs sévères aigües ou chroniques, la toxicomanie, ou la prévention ou le traitement des rejets de greffe.

2. Utilisation selon la revendication 1, d'un animal mammifère transgénique non humain qui n'exprime plus l'un au moins des récepteurs suivants : le récepteur aux opiacés de type mu, le récepteur aux opiacés de type kappa et le récepteur aux opiacés de type delta.

3. Animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères contenant le gène du récepteur aux opiacés de type mu, dans lequel un fragment du gène du récepteur contenant un exon, notamment l'exon 2 est

- soit remplacé par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié,

- soit interrompu par l'insertion entre deux nucléotides contigus par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment le gène de résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur phosphoglycérate kinase-1 (PGK-1), l'expression du gène de type mu étant supprimée.

4. Animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères contenant le gène du récepteur aux opiacés de type delta, dans lequel un fragment du gène du récepteur contenant un exon, notamment l'exon 1 est

- soit interrompu par l'insertion entre deux nucléotides contigus par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment le gène de résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur phosphoglycérate kinase -1 (PGK-1), l'expression du gène de type delta étant supprimée.

5. Animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères contenant le gène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans lequel un fragment du gène du récepteur contenant un exon, notamment l'exon 1 est

- soit interrompu par l'insertion entre deux nucléotides contigus par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment le gène de résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur phosphoglycérate kinase -1 (PGK-1), l'expression du gène kappa étant supprimée.

6. Cellules cultivées à partir des animaux mammifères transgéniques non humains selon l'une des revendications 3 à 5.

7. Mammifère transgénique non humain obtenu par introduction dans un blastocyte de cellules souches embryonnaires (cellules ES) comportant dans leur génome l'une des constructions selon l'une des revendications 3 à 5, obtenu par recombinaison homologue, sélection d'animaux chimères mâles selon un critère correspondant à la lignée ES, croisement des animaux sélectionnés avec des souris, notamment des souris C57BL/6, pour obtenir des animaux hétérozygotes par rapport à l'une des constructions selon l'une des revendications 3 à 5 et éventuellement croisement de deux hétérozygotes pour obtenir un animal homozygote par rapport à l'une des constructions selon l'une des revendications 3 à 5.

8. Procédé d'obtention d'un modèle transgénique pour l'étude des pathologies impliquant les récepteurs aux opiacés de type mu, ou les récepteurs aux opiacés de type delta ou les récepteurs aux opiacés de type kappa, et de leur traitement, comprenant

- le remplacement du gène endogène du récepteur aux opiacés de type IL ou du gène endogène du récepteur aux opiacés de type delta ou du gène endogène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans des cellules notamment embryonnaires souches de souris (ES), par une construction comprenant le gène du récepteur aux opiacés de type mu, ou le gène du récepteur aux opiacés de type delta ou le gène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans lequel respectivement

* l'exon 2 du gène du récepteur aux opiacés de type mu est

interrompu entre deux nucléotides contigus par une portion d'un

gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié,

notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du

promoteur PGKI, ou

* un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés

de type delta est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle

d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le

gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou

* un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés

de type kappa est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle

d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le

gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI,

et en particulier dans lequel le gène du récepteur aux opiacés de

type mu est interrompu au site BamHI de l'exon 2 par l'insertion

de la cassette PGK-neo,

ou le fragment génomique Sma I-Sma I de 600 pb, contenant

l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est

remplacé par la cassette PGK-neo,

ou le fragment génomique de 235 pb de l'exon 1 du gène du

récepteur aux opiacés de type kappa contenant 1'ATG initiateur de

l'exon 1 et 232 paires de bases en aval du susdit ATG est remplacé

par la cassette PGK-neo, et

- l'introduction des susdites cellules dans des embryons, notamment des blastocytes de mammifères non humains,

- la sélection d'animaux chimères mâles selon un critère correspondant à la lignée ES,

- le croisement des animaux sélectionnés avec des souris, notamment des souris C57BL/6, pour obtenir des animaux hétérozygotes par rapport à l'une des constructions selon l'une des revendications 3 à 5 et

- éventuellement le croisement de deux hétérozygotes pour obtenir un animal homozygote par rapport à l'une des constructions selon l'une des revendications 3 à 5.

9. Procédé de criblage de médicaments actifs sur des pathologies impliquant les récepteurs aux opiacés, notamment les pathologies suivantes douleurs sévères aigües ou chroniques, toxicomanie, prévention ou traitement de rejet de greffes, comprenant

- l'administration à un mammifère non humain transgénique ou à des cellules de mammifères non humains transgéniques contenant à la place du gène endogène du récepteur aux opiacés de type mu, ou du gène endogène du récepteur aux opiacés de type delta, ou du gène endogène du récepteur aux opiacés de type kappa, une construction contenant le gène du récepteur aux opiacés de type mu, ou le gène du récepteur aux opiacés de type delta ou le gène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans lequel respectivement

* l'exon 2 du gène du récepteur aux opiacés de type mu est

interrompu entre deux nucléotides contigus par une portion d'un

gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié,

notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du

promoteur PGKI, ou

* un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés

de type delta est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle

d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le

gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou

* un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés

de type kappa est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle

d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le

gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI,

et en particulier dans lequel le gène du récepteur aux opiacés de

type mu est interrompu au site BamHI de l'exon 2 par l'insertion

de la cassette neo,

ou le fragment génomique Sma I-Sma I de 600 pb, contenant

l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est

remplacé par la cassette PGK-neo,

ou le fragment génomique de 235 pb de l'exon 1 du gène du

récepteur aux opiacés de type kappa contenant 1 'ATG initiateur de

l'exon 1 et 232 paires de bases en aval du susdit ATG est remplacé

par la cassette PGK-neo

- la détermination des seuils nociceptifs par le test de l'immersion de la queue et de la plaque chaude après injection des drogues à tester,

- et la détermination de la réponse aux drogues à tester pour les animaux dans lesquels on a produit une douleur chronique induite par l'injection de produits irritants carrhagénane et adjuvant de Freund et produisant des monoarthrites ou polyarthrites, ou le test de section du nerf sciatique, ou le test de ligature du nerf sciatique dans le cas de douleurs neuropathiques,

- ou la détermination des propriétés psychotropes des drogues à tester par les tests de préférence de place ou d'auto-administration ou la détermination du niveau de dépendance physique par l'induction d'une dépendance sévère et la provocation d'un sevrage dans le cas de la toxicomanie,

- ou la détermination de la réaction mixte lymphocytaire et de la durée de vie des souffrances dans le cas de la prévention ou du traitement du rejet de greffes.

10. Construction transgénique contenant le gène du récepteur aux opiacés de type mu, ou le gène du récepteur aux opiacés de type delta ou le gène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans lequel respectivement

- l'exon 2 du gène du récepteur aux opiacés de type mu est interrompu entre deux nucléotides contigus par une portion d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou

- un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou

- un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type kappa est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier dans lequel le gène du récepteur aux opiacés de type mu est interrompu au site BamHI de l'exon 2 par l'insertion de la cassette neo, ou le fragment génomique Sma I-Sma I de 600 pb, contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est remplacé par la cassette PGK-neo, ou le fragment génomique de 235 pb de l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type kappa contenant 1'ATG initiateur de l'exon 1 et 232 paires de bases en aval du susdit ATG est remplacé par la cassette PGK-neo.