FR2748477A1

FR2748477A1 - New Helicobacter pylori membrane proteins

Info

Publication number: FR2748477A1
Application number: FR9708389A
Authority: FR
Inventors: Ling Kang Lissolo
Original assignee: Pasteur Merieux Serum et Vaccines SA
Current assignee: Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1997-07-01
Filing date: 1997-07-01
Publication date: 1997-11-14
Anticipated expiration: 2017-07-01
Also published as: FR2748477B1

Abstract

New purified Helicobacter pylori proteins (I) are obtained from a membrane fraction and have apparent mol. wt. (by electrophoresis on 10% polyacrylamide gel in presence of SDS) of 54, 50, 32-35 and 30 kD, of which the 54 kD protein does not react with anti-catalase antiserum.

Description

La présente invention a pour objet des protéines d'Hélicohacter pylori nouvellement obtenues sous forme substantiellement purifiées. ainsi que les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. The present invention relates to newly obtained helicohacter pylori proteins in substantially purified form. as well as the pharmaceutical compositions which contain them.

H. pylori est une bactérie à gram négatif retrouvée exclusivement à ce jour à la surface de la muqueuse de l'estomac chez l'homme et plus particulièrement autour des lésions de cratère des ulcères gastriques et duodénaux. Cette bactérie est à l'heure actuelle reconnue comme l'agent étiologique des gastrites antrales et apparaît comme un des cofacteurs requis pour le développement des ulcères, Par ailleurs, il semble que le développement des carcinomes gastriques puisse être associé à la présence d'H. pylori. H. pylori is a gram-negative bacterium found exclusively to date on the surface of the stomach lining of humans and more particularly around crater lesions of gastric and duodenal ulcers. This bacterium is currently recognized as the etiological agent of antral gastritis and appears as one of the cofactors required for the development of ulcers. Moreover, it seems that the development of gastric carcinomas may be associated with the presence of H . pylori.

Il apparaît donc hautement souhaitable de mettre au point un vaccin en vue de prévenir ou de traiter les infections à H. pylori. Un tel vaccin serait très probablement de nature sous-unitaire. It therefore appears highly desirable to develop a vaccine for the prevention or treatment of H. pylori infections. Such a vaccine would most likely be subunit in nature.

Différentes protéines d'H pylori ont été caractérisées ou isolées à ce jour. Il s'agit notamment de l'uréase, composée de deux sous-unités A et B de 30 et 67 kD respectivement ; de la cytotoxine vacuolaire de 87 kD (VacA) ; d'un antigène immunodominant de 128 kD associé à la cytotoxine, des heat shock protéines HspA et
HspB de 13 et 58 kD respectivement d'une catalase de 54 kD , d'une hémaglutinine fibrillaire (HpaA) de 2OkD d'une protéine de 15 kD riche en histidine (han); ; d'une protéine de la membrane exteme de 30 kD ; ainsi que d'une famille de porines HopA,
HopB, HopC et HopD, de poids moléculaires compris entre 48 et 67 kD.Various H pylori proteins have been characterized or isolated to date. These include urease, composed of two subunits A and B of 30 and 67 kD respectively; the 87 kD vacuolar cytotoxin (VacA); a cytokine-associated immunodominant antigen of 128 kD, HspA heat shock proteins and
HspB 13 and 58 kD respectively of a 54 kD catalase, a fibrous haemaglutinin (HpaA) of 20kD of a 15 kD protein rich in histidine (han); ; a 30 kD outer membrane protein; as well as a family of HopA porins,
HopB, HopC and HopD, of molecular weight between 48 and 67 kD.

Certaines de ces protéines ont déjà été proposées comme antigènes vaccinaux potentiels. Il reste que la recherche de nouveaux antigènes doit être poursuivie, notamment dans la mesure où l'on prévoit que, pour obtenir un effet vaccinal optimisé, plusieurs antigènes devront être vraisemblablement incorporés dans un vaccin. Some of these proteins have already been proposed as potential vaccine antigens. However, the search for new antigens must be pursued, particularly since it is expected that, to obtain an optimized vaccine effect, several antigens will probably have to be incorporated in a vaccine.

C'est pourquoi l'invention a pour objet une protéine d'H. pylori sous forme substantiellement purifiée, susceptible d'être obtenue à partir d'une fraction membranaire d'H. pylori, et dont le poids moléculaire après électrophorèse sur gel de polyacrlamide 10% en présence de SDS, apparaît de l'ordre de 76, 54. 50 ou 30 kD. Lorsque la protéine a un poids moléculaire d'environ 54 kD on précise en outre qu'elle ne réagit pas avec un ante sérum anti-catalase. This is why the subject of the invention is an H protein. pylori in substantially purified form, obtainable from a membrane fraction of H. pylori, and whose molecular weight after electrophoresis on polyacrlamide gel 10% in the presence of SDS, appears on the order of 76, 54. 50 or 30 kD. When the protein has a molecular weight of approximately 54 kD, it is furthermore specified that it does not react with an ante anti-catalase serum.

Un antisérum anti-catalase d'H. pu,lori peut être notamment préparé selon le procédé d'immunisation décrit dans l'Exemple 5 ci-après, en utilisant une préparation de catalase obtenue par chromatographie, tel que décrit dans l'Exemple 6. Anti-catalase antiserum of H. In particular, it may be prepared according to the immunization method described in Example 5 below, using a catalase preparation obtained by chromatography, as described in Example 6.

Par "forme substantiellement purifiée", on entend une préparation notamment dépourvue des protéines cytoplasmiques et périplasmiques d'H pylori. By "substantially purified form" is meant a preparation in particular free of cytoplasmic and periplasmic H pylori proteins.

La protéine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 76 kD est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel
(i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl ss-D
glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation
(ii) on récupère un surnageant que l'on soumet à dialyse contre du PBS 75 mM pH
7,2, suivie d'une centrifugation;
(iii) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que
l'on resuspend milieu aqueux, avantageusement en tampon carbonate pH 9,5
contenant 5 % de zwittergent 3-14
(iv) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions
sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI 0,1 - 0,5 M, avantageusement en
tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14
(v) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,25 - 0,35 M que l'on soumet à une
chromatographie échangeuse de cations sur colonne de S-Sépharose en gradient
de NaCI O - 0,5 M, avantageusement en tampon acétate pH 5 à 0,1 % de
zwittergent 3-14 (de manière avantageuse, la fraction en NaCI 0,25 - 0,35 M est
d'abord dialysée contre du tampon acétate pH 5 à 0,1 % de zwittergent 3-14); et
(vi) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,15 - 0,2 M.Membrane protein whose apparent molecular weight is of the order of 76 kD is obtainable by a process in which
(i) H. pylori bacteria are extracted with n-octyl ss-D
glucopyranoside 1%, followed by centrifugation
(ii) recovering a supernatant which is dialyzed against 75 mM PBS pH
7.2, followed by centrifugation;
(iii) the membrane fraction constituted by the pellet of centrifugation is recovered
the aqueous medium is resuspended, advantageously in carbonate buffer pH 9.5
containing 5% zwittergents 3-14
(iv) the membrane fraction is subjected to anion exchange chromatography
on a Q-Sepharose column in 0.1 - 0.5 M NaCl gradient, advantageously in
carbonate buffer pH 9.5 at 0.1% zwittergent 3-14
(v) recovering the fraction eluted with 0.25 - 0.35 M NaCl, which is subjected to
cation exchange chromatography on a gradient S-Sepharose column
0.5M NaCl, advantageously in pH 5 acetate buffer at 0.1% of
zwittergent 3-14 (advantageously, the 0.25 - 0.35 M NaCl fraction is
first dialyzed against acetate buffer pH 5 0.1% zwittergent 3-14); and
(vi) the fraction eluted with 0.15 - 0.2 M. NaCl is recovered.

La protéine membranaire de 76 kD a pour fonction biologique présumée d'être une porine, vraisemblablement située au niveau de la membrane externe. Exner et al, Infect. The 76 kD membrane protein has the presumed biological function of being a porin, presumably located at the level of the outer membrane. Exner et al, Infect.

Immun. (Apr.1995) 63 . 1567 caractérise une famille de porines qui chacunes présentent en electrophorése de SDS-Page, un profil de migration différent selon qu'elles ont été chauffées 9 950C (procédé conventionnel) ou non. Tel n'est pas le cas pour ce qui concerne la protéine de 76 kD selon l'invention ; en effet sa migration sur gel n'est pas modifiée avec un échantillon chauffé à 60 C et non à 950C.Immun. (Apr.1995) 63. 1567 characterizes a family of porins which each have in SDS-Page electrophoresis, a different migration profile depending on whether they were heated 9 950C (conventional method) or not. This is not the case as regards the 76 kD protein according to the invention; indeed its gel migration is not modified with a sample heated to 60 C and not to 950C.

La séquence N-terminale de la protéine de 76 kD est comme suit (code une lettre)
EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV.The N-terminal sequence of the 76 kD protein is as follows (code one letter)
EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV.

La protéine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 54 kD est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel
(i) on procède à une extraction des bactéries H. pylon par du n-octyl J3-D
glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation
(ii) on récupère un culot bactérien que l'on traite par du lysosyme et que l'on
soumet à sonication, suivie d'une centrifugation
(iii) on récupère un culot de centrifugation que l'on soumet à un lavage en tampon
Tris HCl 20mM pH 7,5, suivi d'une centrifugation
(iv) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que
l'on resuspend en milieu aqueux avantageusement en tampon carbonate pH 9,5
contenant 5 % de zwittergent 3-14
(v) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions
sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement dans
un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14, suivi d'un lavage en
NaCI 1M, avantageusement dans un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de
zwittergent 3-14
(vi) on récupère la fraction éluée en début de lavage en NaCI I M que l'on soumet à
une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de DEAE Sépharose en
gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement en tampon Tris-HCI pH 7,5 à 0,1
% de zwittergent 3-14 (de manière avantageuse. la fraction en NaCI 1 M est
d'abord dialysée contre du tampon Tris-HCI pi-i 75 à 0,1 % de zwittergent 3-
14); et
(vii) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,1 - 0,25 M.The membrane protein whose apparent molecular weight is of the order of 54 kD can be obtained by a process in which
(i) H. pylon bacteria are extracted with n-octyl J3-D
glucopyranoside 1%, followed by centrifugation
(ii) recovering a bacterial pellet which is treated with lysosyme and which is
subject to sonication followed by centrifugation
(iii) recovering a centrifugation pellet which is subjected to a buffer wash
Tris HCl 20mM pH 7.5, followed by centrifugation
(iv) recovering the membrane fraction consisting of the pellet of centrifugation that
it is resuspended in aqueous medium advantageously carbonate buffer pH 9.5
containing 5% zwittergents 3-14
(v) the membrane fraction is subjected to anion exchange chromatography
on Q-Sepharose column in O-0.5M NaCl gradient, advantageously in
carbonate buffer pH 9.5 at 0.1% zwittergent 3-14, followed by washing with
1M NaCl, advantageously in a carbonate buffer pH 9.5 at 0.1% of
zwittergent 3-14
(vi) recovering the fraction eluted at the start of washing in IM NaCl which is subjected to
column anion exchange chromatography of DEAE Sepharose in
0 - 0.5M NaCl gradient, advantageously in Tris-HCl buffer, pH 7.5 to 0.1
% zwittergent 3-14 (advantageously the 1M NaCl fraction is
first dialyzed against Tris-HCl buffer p-75 to 0.1% zwittergent 3-
14); and
(vii) the fraction eluted with 0.1 - 0.25 M NaCl is recovered.

La proteine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 50 kD est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel
(i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl f3-D
glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation;
(ii) on récupère un culot bactérien que l'on traite par du lysosyme et que l'on
soumet à sonication, suivie d'une centrifugation
(iii) on récupère un culot de centrifugation que l'on soumet à un lavage en tampon
Tris HCI 20mM pH 7,5, suivi d'une centrifugation;
(iv) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que
l'on resuspend en milieu aqueux, avantageusement en tampon carbonate pH 9,5
contenant 5 % de zwittergent 3-14
(v) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions
sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement dans
un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14, suivi d'un lavage en
NaCI 1 M, avantageusement dans un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de
zwittergent 3-14
(vi) on récupère la fraction éluée en début de lavage en NaCI I M que l'on soumet à
une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de DEAE Sépharose en
gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement en tampon Tris-HC1 pH 7,5 à
0,1 % de zwittergent 3-14 (de manière avantageuse, la fraction en NaCI 1 M est
d'abord dialysée contre du tampon Tris-HC1 pH 7,5 à 0,1 % de zwittergent 3
14) ; et
(vii) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,3 - 0,4 M. The membrane protein whose apparent molecular weight is of the order of 50 kD is obtainable by a process in which
(i) H. pylori bacteria are extracted with n-octylf3-D
glucopyranoside 1%, followed by centrifugation;
(ii) recovering a bacterial pellet which is treated with lysosyme and which is
subject to sonication followed by centrifugation
(iii) recovering a centrifugation pellet which is subjected to a buffer wash
Tris HCI 20mM pH 7.5, followed by centrifugation;
(iv) recovering the membrane fraction consisting of the pellet of centrifugation that
it is resuspended in an aqueous medium, advantageously in carbonate buffer pH 9.5
containing 5% zwittergents 3-14
(v) the membrane fraction is subjected to anion exchange chromatography
on Q-Sepharose column in O-0.5M NaCl gradient, advantageously in
carbonate buffer pH 9.5 at 0.1% zwittergent 3-14, followed by washing with
1M NaCl, advantageously in a carbonate buffer pH 9.5 at 0.1% of
zwittergent 3-14
(vi) recovering the fraction eluted at the start of washing in IM NaCl which is subjected to
column anion exchange chromatography of DEAE Sepharose in
NaCl gradient O - 0.5M, advantageously in Tris-HCl buffer pH 7.5 to
0.1% zwittergent 3-14 (advantageously the 1M NaCl fraction is
first dialyzed against Tris-HCl buffer pH 7.5 at 0.1% zwittergent 3
14); and
(vii) the fraction eluted with 0.3 - 0.4 M NaCl is recovered.

La protéine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 30 kD est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel:
(i) on procède à une extraction des bactéries H pylori par du n-octyl -D
glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation;
(ii) on récupère un culot bactérien que l'on traite par du lysos > 'me et que l'on
soumet à sonication, suivie d'une centrifugation
(iii) on récupère un culot de centrifugation que l'on soumet à un lavage en tampon
Tris HCl 20mM pH 7,5, suivi d'une centrifugation
(iv) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que
l'on resuspend en milieu aqueux, avantageusement en tampon carbonate pH 9,5
contenant 5 % de zwittergent 3-14
(v) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions
sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement dans
un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14
(vi) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,28 - 0,35M, que l'on soumet à une
chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de DEAE Sépharose en
gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement en tampon Tris-HC1 pH 7,5 à 0,1
% de zwittergent 3-14 (de manière avantageuse, la fraction en NaCI 1 M est
d'abord dialysée contre du tampon Tris-HC1 pH 7,5 à 0,1 % de zwittergent 3
14); et
(vii) on récupère la fraction correspondant à l'élut direct (absence de NaCI). The membrane protein whose apparent molecular weight is of the order of 30 kD is obtainable by a process in which:
(i) extraction of H pylori bacteria by n-octyl-D is carried out
glucopyranoside 1%, followed by centrifugation;
(ii) a bacterial pellet is recovered which is treated with lysos>'me and that one
subject to sonication followed by centrifugation
(iii) recovering a centrifugation pellet which is subjected to a buffer wash
Tris HCl 20mM pH 7.5, followed by centrifugation
(iv) recovering the membrane fraction consisting of the pellet of centrifugation that
it is resuspended in an aqueous medium, advantageously in carbonate buffer pH 9.5
containing 5% zwittergents 3-14
(v) the membrane fraction is subjected to anion exchange chromatography
on Q-Sepharose column in O-0.5M NaCl gradient, advantageously in
carbonate buffer pH 9.5 at 0.1% zwittergent 3-14
(vi) the fraction eluted with 0.28 - 0.35M NaCl is recovered, which is subjected to
column anion exchange chromatography of DEAE Sepharose in
0 - 0.5M NaCl gradient, advantageously in Tris-HCl buffer, pH 7.5 to 0.1
% zwittergent 3-14 (advantageously the 1 M NaCl fraction is
first dialyzed against Tris-HCl buffer pH 7.5 at 0.1% zwittergent 3
14); and
(vii) the fraction corresponding to the direct elution (absence of NaCl) is recovered.

Les protéines de 54, 50 et 30 kD selon l'invention sont vraisemblablement des protéines membranaires intrinsèques. La protéine de 54 kD ne réagit pas avec des anticorps anti-catalase, ni en western blot, ni en dot blot. La protéine de 30 kD ne réagit pas avec des anticorps anti-sous unité A de l'uréase, ni en western blot, ni en dot blot. The 54, 50 and 30 kD proteins according to the invention are probably intrinsic membrane proteins. The 54 kD protein does not react with anti-catalase antibodies, neither in western blot, nor in dot blot. The 30 kD protein does not react with anti-subunit A urease antibodies, nor in western blots, nor in dot blots.

Selon un mode particulier, les protéines selon l'invention peuvent être notamment obtenues par purification à partir d'H pylori ou exprimées par voie recombinante dans un système hétérologue. Dans ce dernier cas, les protéines peuvent présenter des modifications post traductionnelles qui ne soient pas identiques à celles des protéines correspondantes issues de la souche d'origine. According to one particular embodiment, the proteins according to the invention may in particular be obtained by purification from H pylori or expressed recombinantly in a heterologous system. In the latter case, the proteins may have post translational modifications that are not identical to those of the corresponding proteins from the original strain.

L'invention a aussi pour objet une protéine i.a. d'H. pilori ou un polypeptide sous forme substantiellement purifiée, qui est capable d'être reconnu par un antisérum ou d'un anticorps monoclonal établi à l'encontre d'une des protéines précédemment décrites. Pour ce qui concerne les polypeptides, il s'agit notamment de polypeptides dérivés d'une protéine selon l'invention par mutation d'un ou plusieurs acides aminés, e.g. par délétion. The invention also relates to an i.a. H. pillori or a polypeptide in substantially purified form, which is capable of being recognized by an antiserum or a monoclonal antibody established against one of the previously described proteins. As regards the polypeptides, these include polypeptides derived from a protein according to the invention by mutation of one or more amino acids, e.g., by deletion.

Enfin l'invention concerne également une composition pharmaceutique notamment destinée à la prévention ou au traitement d'une infection à H pylori, qui comprend à titre de principe actif une protéine ou un polypeptide selon l'invention ; I'usage d'une protéine ou un polypeptide selon l'invention à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique ; I'usage d'une protéine ou un polypeptide selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une infection à H. pylori ; ainsi q'une méthode de prévention ou de traitement d'une infection à H. pylori, selon laquelle on administre à un individu une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace d'une protéine ou d'un polypeptide selon l'invention
Une composition selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle.Finally, the invention also relates to a pharmaceutical composition, in particular intended for the prevention or treatment of H. pylori infection, which comprises as active principle a protein or a polypeptide according to the invention; The use of a protein or a polypeptide according to the invention as a therapeutic or prophylactic agent; The use of a protein or a polypeptide according to the invention for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of H. pylori infection; and a method for preventing or treating an H. pylori infection, according to which an individual is administered a prophylactically or therapeutically effective amount of a protein or polypeptide according to the invention.
A composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner.

En particulier on associe une protéine selon l'invention avec un adjuvant, un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie orale ou parentérale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration.In particular, a protein according to the invention is combined with an adjuvant, a diluent or a support that is acceptable from a pharmaceutical point of view. A composition according to the invention may be administered by any conventional route in use in the field of vaccines, in particular orally or parenterally. The administration may take place in single or repeated doses one or more times after a certain interval interval. The appropriate dosage varies depending on various parameters, for example, the individual being treated or the mode of administration.

De manière plus détaillée, on propose à titre d'exemple, d'administrer une protéine ou un polypeptide selon l'invention par voie orale. A cet effet, une protéine ou un polypeptide selon l'invention peut être encapsulée seule ou en présence d'autres protéines de H. pylori dans des capsules de gélatine afin de protéger l'antigène contre la dégradation par le suc gastrique ou bien administrée en présence de bicarbonate de sodium. De telles formulations ont déjà été utilisées pour des compositions pharmaceutiques (Black et al, De. Biol. In more detail, it is proposed by way of example, to administer a protein or a polypeptide according to the invention orally. For this purpose, a protein or a polypeptide according to the invention may be encapsulated alone or in the presence of other H. pylori proteins in gelatin capsules in order to protect the antigen against degradation by gastric juice or administered in vivo. presence of sodium bicarbonate. Such formulations have already been used for pharmaceutical compositions (Black et al., De. Biol.

Stand. (1983) 53). La protéine peut également etre encapsulée dans des microsphères de
PLGA (copolymères d'acide glycolique et acide lactique) selon le protocole décrit aillcurs (Eldridge et al, Curr. Top. Microbiol. Immuno. (1989) 146 59-66) la protéine peut également être incluse dans des liposomes préparés selon les méthodes conventionnelles largement décrites ("Liposomes : a practical approach, Ed. RRC New, D. Rickwood &
B.D. Hames, 1990, Oxford University Press, ISBN 0-19-963077-1).Stand. (1983) 53). The protein can also be encapsulated in microspheres of
PLGA (copolymers of glycolic acid and lactic acid) according to the protocol described above (Eldridge et al., Curr Top Microbiol Immuno (1989) 146 59-66) the protein can also be included in liposomes prepared by the methods Conventional widely described ("Liposomes: a practical approach, Ed RRC New, D. Rickwood &
BD Hames, 1990, Oxford University Press, ISBN 0-19-963077-1).

Indépendamment de la formulation, la quantité de protéine administrée à l'homme par voie orale est de l'ordre de 1 à 10 mg par prise, et l'on préconise au moins 3 prises à intervalle de 4 semaines. Regardless of the formulation, the amount of protein administered to the human orally is of the order of 1 to 10 mg per dose, and it is recommended at least 3 taken at intervals of 4 weeks.

Alternativement, une protéine ou un polypeptide selon l'invention peut être administré par voie parentérale. Pour ce faire, une protéine ou un polypeptide selon l'invention est adsorbée sur gel d'alumine de façon tout à fait conventionnelle. La protéine en solution à 1 mg/ml dans un tampon dont le pH est voisin de 6,5 est mise en contact pendant I heure avec de l'hydroxyde d'aluminium à 10 mg/ml mesuré à Au"'. La composition finale de la préparation est la suivante : protéine à activité catalasique 50 ug/ml, Au+*+250 pg/ml, merthiolate 1/10 000, le tout en PBS. Alternatively, a protein or a polypeptide according to the invention can be administered parenterally. To do this, a protein or a polypeptide according to the invention is adsorbed on alumina gel in a completely conventional manner. The protein in solution at 1 mg / ml in a buffer whose pH is close to 6.5 is brought into contact for 1 hour with aluminum hydroxide at 10 mg / ml measured at Au ". The final composition of the preparation is as follows: protein with catalase activity 50 μg / ml, Au + * + 250 μg / ml, merthiolate 1/10 000, all in PBS.

Comme dans le cas de l'administration orale, 3 injections sont préconisées chacune espacée de 4 semaines de la précédente. As in the case of oral administration, 3 injections are recommended each spaced 4 weeks from the previous one.

L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes
La Figure 1 est un schéma récapitulatif du protocole de préparation des fractions membranaires I, II et III dtfI. pylori.The invention is illustrated below with reference to the following figures
Figure 1 is a summary diagram of the protocol for the preparation of membrane fractions I, II and III dtfI. pylori.

La Figure 2 présente l'analyse des fractions membranaires I, II et III par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie. Les échantillons déposées sont : la fraction membranaire I (colonne 2), la fraction membranaire II (colonne 3), la fraction membranaire III (colonne 4) et les marqueurs de poids moléculaire (colonne 1). Figure 2 shows the analysis of membrane fractions I, II and III by 10% polyacrylamide gel electrophoresis and Coomassie blue staining. The deposited samples are: the membrane fraction I (column 2), the membrane fraction II (column 3), the membrane fraction III (column 4) and the molecular weight markers (column 1).

La Figure 3 présente l'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie, des protéines purifiées à partir d'un gel préparatif (colonnes 3 à 7). Les échantillons déposés sont : la fraction HpPI (colonne 3), la fraction llpP2 (colonne 4), la fraction HpP4 (colonne 5). la fraction HpP5 (colonne 6), la fraction
HpP6 (colonne 7), les marqueurs de poids moléculaire (colonnes I et 8) et la fraction membranaire I (colonne 2). Figure 3 shows 10% polyacrylamide gel electrophoresis analysis and Coomassie blue staining, proteins purified from a preparative gel (columns 3-7). The deposited samples are: the HpPI fraction (column 3), the IIpP2 fraction (column 4), the HpP4 fraction (column 5). the fraction HpP5 (column 6), the fraction
HpP6 (column 7), molecular weight markers (columns I and 8) and membrane fraction I (column 2).

La Figure 4 présente l'analyse des fractions issues du passage sur DEAE Sépharose, des fractions 7 et 9 (obtenues après elution sur Q Sépharose). Les fractions ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrwlamide 10% ou 12,5% et colorées au bleu de
Coomassie. Les échantillons déposés sont : la fraction 7 (colonne 2A). la fraction 7.1 (colonne 3A), la fraction 7.2 (colonne 4A), la fraction 9 (colonne 2B), la fraction 9. 1 (colonne 3B), la fraction 9.2 (colonne 4B), la fraction 9.3 (colonne 5B) et les marqueurs de poids moléculaire (kDa) (colonne 1A et 1B). Figure 4 shows the analysis of fractions from the passage on DEAE Sepharose, fractions 7 and 9 (obtained after elution on Q Sepharose). The fractions were separated by 10% or 12.5% polyacrylamide gel electrophoresis and stained with
Coomassie. The deposited samples are: fraction 7 (column 2A). fraction 7.1 (column 3A), fraction 7.2 (column 4A), fraction 9 (column 2B), fraction 9. 1 (column 3B), fraction 9.2 (column 4B), fraction 9.3 (column 5B) and molecular weight markers (kDa) (columns 1A and 1B).

La Figure 5 présente, après électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie, le profil électrophorétique de la fraction D issue de la chromatographie sur colonne de Q-Sépharose de la fraction membranaire III (colonne 3) et de la fraction D'issue de la chromatographie sur colonne de S-Sépharose de la fraction D (colonne 4). La colonne 1 correspond aux marqueurs de poids moléculaire et la colonne 2, à la fraction membranaire III. FIG. 5 shows, after 10% polyacrylamide gel electrophoresis and staining with Coomassie blue, the electrophoretic profile of the fraction D resulting from the Q-Sepharose column chromatography of the membrane fraction III (column 3) and the fraction Resulting from S-Sepharose column chromatography of fraction D (column 4). Column 1 corresponds to molecular weight markers and column 2 corresponds to membrane fraction III.

EXEMPLE 1 : Préparation des fractions membranaires
1A- Culture
La souche H pylori ATCC 43579 est cultivée en milieu liquide dans un
fermenteur de 10 1.EXAMPLE 1 Preparation of Membrane Fractions
1A- Culture
Strain H pylori ATCC 43579 is cultured in a liquid medium in a
fermenter of 10 1.

Un congelat de germes en glycérol est utilisé pour ensemenser un flacon de 75
cm2 contenant du milieu dit "biphasique" (une phase solide en gélose Colombia
contenant 6 % de sang de mouton frais et une phase liquide en trypticase de soja
contenant 20 % de sérum de veau foetal). Après 24 heures de culture dans des
conditions microaérophiles, la phase liquide de cette culture est utilisée pour
ensemenser plusieurs flacons de 75 cm2 en milieu biphasique en l'absence de sang de
mouton. Après 24 heures de culture, la phase liqude permet d'ensemenser un
biofermenteur de 2 1 en milieu liquide trypticase soja contenant de la bêta
cyclodextrine à 10 g/l. Cette culture à DO 1,5-1,8 est inoculée dans un fermenteur de
10 I en milieu liquide. Après 94 heures de culture. les bactéries sont récoltées par
centrifugation à 4000 x g pendant 30 minutes à 4 C. Une culture de 10 litres de H
pylori ATCC 43579 en fermenteur sous atmosphère microaérophile permet d'obtenir
environ 20 à 30 g (poids humide) de bactéries. A freeze of germs in glycerol is used for seeding a bottle of 75
cm2 containing so-called "biphasic" medium (a solid phase in Colombia agar
containing 6% fresh sheep blood and a liquid phase in soy trypticase
containing 20% fetal calf serum). After 24 hours of cultivation in
microaerophilic conditions, the liquid phase of this culture is used to
sese several bottles of 75 cm2 in biphasic medium in the absence of blood of
sheep. After 24 hours of culture, the liquor phase makes it possible to seed a
biofermentor of 2 1 in tryptic soybean liquid medium containing beta
cyclodextrin at 10 g / l. This culture with OD 1.5-1.8 is inoculated in a fermenter of
10 I in a liquid medium. After 94 hours of culture. the bacteria are harvested by
centrifugation at 4000 xg for 30 minutes at 4 C. A culture of 10 liters of H
pylori ATCC 43579 fermenter under microaerophilic atmosphere provides
about 20 to 30 g (wet weight) of bacteria.

1B - Extraction par le n octal p-D glucopyranoside (OG)
Le culot de germes obtenu précédemment est lavé avec 500 ml de PBS (Phosphate buffer saline ; NaCI 7,650 g, phosphate disodique 0,724 g phosphate monopotassique 0,210 g pour un litre ; pH 7,2) par litre de culture. Puis les germes sont à nouveau centrifugés dans les mêmes conditions.1B - Extraction by n octal pD glucopyranoside (OG)
The seed pellet obtained above is washed with 500 ml of PBS (phosphate buffer saline, NaCl 7.650 g, disodium phosphate 0.724 g di potassium phosphate 0.210 g per liter, pH 7.2) per liter of culture. Then the germs are again centrifuged under the same conditions.

Le culot bactérien obtenu (C1) est remis en suspension dans une solution d'OG (Sigma) à 1 % (30 ml/litre de culture). La suspension bactérienne est incubée pendant
I heure à température ambiante sous agitation magnétique, puis centrifugée à 17 600 x g pendant 30 minutes à 4OC. The bacterial pellet obtained (C1) is resuspended in a 1% solution of OG (Sigma) (30 ml / liter of culture). The bacterial suspension is incubated during
I hour at room temperature with magnetic stirring, then centrifuged at 17,600 xg for 30 minutes at 4OC.

Le culot (C2) est conservé pour être traité par la suite. The pellet (C2) is kept for later processing.

Le surnageant (S2) obtenu est dialysé (MWCO= 10 000 Da, Spectra/por) pendant une nuit à 40C sous agitation magnétique contre 2 fois I litre de PBS dilué au 1/2. Le précipité formé au cours de la dialyse est récupéré par centrifugation à 2 600 x g pendant 30 minutes à 40C. Le surnageant (S2d) est éliminé et le culot (Cs2d) qui contient des protéines de membrane externe, est conservé à -20 C. The supernatant (S2) obtained is dialysed (MWCO = 10,000 Da, Spectra / por) overnight at 40C with magnetic stirring against 2 times 1 liter of PBS diluted 1/2. The precipitate formed during the dialysis is recovered by centrifugation at 2600 x g for 30 minutes at 40C. The supernatant (S2d) is removed and the pellet (Cs2d), which contains external membrane proteins, is stored at -20 ° C.

1C - Cassage des germes
Le culot (C2) obtenu après centrifugation des germes traités par l'OG est remis en suspension dans du tampon Tris-HCl 20 mM pH 7,5 et Pefabloc 100 I1M (tampon
A) puis homogénéisé à l'aide de l'ultra-turrax (3821, Janke & Kungel). L'homogénat obtenu est mis en présence de lysosyme (0,1 mg/ml final) et d'EDTA (lmM final).1C - Broken germs
The pellet (C2) obtained after centrifugation of the OL-treated seeds is resuspended in 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 and Pefabloc 100 μM (buffer).
A) then homogenized using ultra-turrax (3821, Janke & Kungel). The homogenate obtained is brought into contact with lysosyme (0.1 mg / ml final) and EDTA (1mM final).

L'homogénat est soniqué 3 fois 2 minutes à 40C (+ sonde=0,5 cm, puissance=20%, Sonifier 450 Branson), puis ultracentrifugé à 210 000 x g pendant 30 minutes à 40C. Le surnageant (S3) qui contient des protéines cytoplasmiques et périplasmiques, est éliminé, alors que le culot (C3) est récupéré. lavé en tampon A puis ultracentrifugé à 210 000 x g pendant 30 minutes à 4"C. Après élimination du surnageant (S4), le culot (C.4) est conservé à -200C. Ce culot contient des protéines intrinsèques et périphériques. The homogenate is sonicated 3 times 2 minutes at 40C (+ probe = 0.5 cm, power = 20%, Sonifier 450 Branson), then ultracentrifuged at 210,000 x g for 30 minutes at 40C. The supernatant (S3) which contains cytoplasmic and periplasmic proteins is removed, while the pellet (C3) is recovered. washed in buffer A and then ultracentrifuged at 210,000 × g for 30 minutes at 4 ° C. After removal of the supernatant (S4), the pellet (C.4) is stored at -200 ° C. This pellet contains intrinsic and peripheral proteins.

La procédure peut être poursuivie par un double lavage du culot C4 pour
éliminer les protéines membranaires périphériques. Le culot C4 est remis en
suspension dans du tampon NaC03 50 mM pH 9,5, Pefabloc et 100 pM (tampon B).The procedure can be continued by double washing the C4 pellet for
eliminate peripheral membrane proteins. The C4 pellet is handed over
suspension in 50 mM NaC03 buffer pH 9.5, Pefabloc and 100 μM (buffer B).

La suspension est ultracentrifugée à 210 000 x g pendant 30 minutes à 40C. Le
surnageant (Sy) est éliminé puis le culot (Cg) est lavé et ultracentrifugé dans les
memes conditions que précédemment. Après élimination du surnageant (S6), le culot
(C6) qui contient essentiellement des protéines membranaires intrinsèques, est
conservé à -20 C. The suspension is ultracentrifuged at 210,000 xg for 30 minutes at 40C. The
supernatant (Sy) is removed and the pellet (Cg) is washed and ultracentrifuged in the
same conditions as before. After removal of the supernatant (S6), the pellet
(C6) which essentially contains intrinsic membrane proteins, is
kept at -20 C.

Les fractions C4, C6 et CS2d sont appelées par la suite respectivement
fractions membranaires I, II et III.Fractions C4, C6 and CS2d are subsequently called respectively
membrane fractions I, II and III.

1D - Analyse des fractions membranaires
Les différentes fractions membranaires sont analysées par électrophorèse sur
gel de polyacrylamide en présence de SDS selon la méthode de Laemmli (1970). Les
protéines sont visualisées après coloration au bleu de Coomassie.1D - Analysis of membrane fractions
The different membrane fractions are analyzed by electrophoresis on
polyacrylamide gel in the presence of SDS according to the method of Laemmli (1970). The
Proteins are visualized after staining with Coomassie blue.

Si on considère les protéines majeures de chaque fraction, les profils SDS
PAGE (Figure 2) montrent que la fraction membranaire I est très proche de la
fraction membranaire II. Par contre ces deux dernières différent sensiblement de la
fraction membranaire III.If we consider the major proteins of each fraction, the SDS profiles
PAGE (Figure 2) show that the membrane fraction I is very close to the
membrane fraction II. On the other hand, these last two differ significantly from
membrane fraction III.

Le profil de la fraction membranaire I présente 7 bandes protéiques majeures de
poids moléculaires respectifs 87, 76, 67, 54, 50, 47 et 35 kDa (colonne 2). Par
western blot en présence d'anticorps anti-ureB ou d'anticorps anti-catalase, on a
montré que la bande à 67 kDa correspondait à la sous-unité B de l'uréase et la bande
à 54 kD correspondait à la catalase. Ces deux protéines ne se retrouvent pas dans le
profil de la fraction II (colonne 3) puisque le lavage en tampon carbonate élimine les
protéines faiblement associées à la membrane. Quant au profil protéique de la
fraction membranaire III, il montre la présence de 4 bandes majeures à 76, 67, 50 et
30 kDa (colonne 4).The profile of the membrane fraction I has 7 major protein bands of
respective molecular weights 87, 76, 67, 54, 50, 47 and 35 kDa (column 2). By
western blot in the presence of anti-ureB antibodies or anti-catalase antibodies,
showed that the 67 kDa band corresponded to the urease subunit B and the band
at 54 kD corresponded to catalase. These two proteins are not found in the
profile of fraction II (column 3) since carbonate buffer washing eliminates the
proteins weakly associated with the membrane. As for the protein profile of the
membrane fraction III, it shows the presence of 4 major bands at 76, 67, 50 and
30 kDa (column 4).

EXEMPLE 2 : Purification des protéines de la fraction membranaire I par SDS-PAGE
préparative
Une électrophorèse est réalisée sur gel de polyacrylamide selon la méthode de
Laemmli (1970) avec un gel de concentration de 5% et un gel de séparation de 10%. La fraction membranaire est remise en suspension dans du tampon A, puis diluée au demi dans le tampon échantillon 2X. Le mélange est chauffé 5 minutes à 95"C. Environ 19 mg de protéines sont déposés sur un gel de dimension 16 x 12 cm et d'épaisseur 5 mm. Une prémigration est effectuée à 50 V pendant 2 heures, suivie d'une migration à 65 V pendant la nuit. La coloration du gel au bleu de Coomassie R250 (0.05 X0 dans de l'eau ultrafiltrée) permet une bonne visualisation des bandes.EXAMPLE 2 Purification of Proteins of Membrane Fraction I by SDS-PAGE
preparative
Electrophoresis is carried out on polyacrylamide gel according to the method of
Laemmli (1970) with a concentration gel of 5% and a separation gel of 10%. The membrane fraction is resuspended in buffer A, and then diluted half in the 2X sample buffer. The mixture is heated for 5 minutes at 95 ° C. About 19 mg of proteins are deposited on a gel of size 16 × 12 cm and 5 mm thick Premigration is carried out at 50 V for 2 hours, followed by migration. at night at 65 V. The staining of R250 Coomassie blue gel (0.05 X0 in ultrafiltered water) allows good visualization of the bands.

Les bandes majeures HpPl, HpP2, HpP4, HpP5 et HpP6 sont découpées au scalpel et broyées à l'ultra-turrax en présence de 10 ou 20 ml de tampon d'extraction Tris-HC1 25 mM pH 8,8, urée 8 M, SDS 10%, phényl méthyl sulfonyl fluorique (PMSF) 100 pLM et Pefabloc 100 I1M (tampon C). Chaque broyat est filtré sur un préfiltre Millipore AP20 (filtre = 4,7 cm, 4)pore = 20 ,um) à l'aide d'un extrudeur à une pression de 7 bars, à température ambiante. Chaque broyat est lavé avec 5 à 10 ml de tampon C et filtré comme précédemment. Les deux filtrats obtenus à partir de chaque broyat correspondant sont rassemblés. The major bands HpP1, HpP2, HpP4, HpP5 and HpP6 are cut with a scalpel and ground with ultra-turrax in the presence of 10 or 20 ml of 25 mM Tris-HCl extraction buffer pH 8.8, 8 M urea, 10% SDS, phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF) 100 pMa and Pefabloc 100 μM (buffer C). Each crushed material is filtered on a Millipore AP20 prefilter (filter = 4.7 cm, 4) pore = 20 μm) using an extruder at a pressure of 7 bar at room temperature. Each crushed material is washed with 5 to 10 ml of buffer C and filtered as above. The two filtrates obtained from each corresponding ground material are combined.

Chaque filtrat est précipité avec 3 volumes d'un mélange 50 : 50 méthanol 75% et isopropanol 75%, puis ultracentrifugé à 240 000 x g pendant 16 heures à 10"C sur rotor 70
TFT (J8-55, Beckman).Each filtrate is precipitated with 3 volumes of a 50:50 mixture of 75% methanol and 75% isopropanol and then ultracentrifuged at 240,000 xg for 16 hours at 10 ° C. on a rotor 70.
TFT (J8-55, Beckman).

Chaque culot est repris par 2 ml de tampon de solubilisation NaP04 10 mM pH 7,0,
NaCI I M, Sarkosyl 0,1%, PMSF 100 pM, Pefabloc 100 M et urée 6 M (tampon D).Each pellet is taken up in 2 ml of 10 mM NaPO 4 pH 7 solubilization buffer,
1M NaCl, 0.1% Sarkosyl, 100μM PMSF, 100M Pefabloc and 6M urea (D buffer).

L'échantillon solubilisé est dialysé successivement contre 100 ml de tampon D à 4 M d'urée et 0,1% de Sarkosyl, contre 100 ml de tampon D à 2 M d'urée et 0,5% de Sarkosyl et contre 2 fois 100 ml de tampon D sans urée et à 0,5% de Sarkosyl. La dialyse est effectuée pendant I heure sous agitation magnétique à température ambiante. Le dialysat final est incubé pendant 30 minutes dans un bain de glace, puis centrifugé à faible vitesse pendant 10 minutes à 40C (Biofuge A, Heraeus Sepatech). Le surnageant est récupéré, filtré sur filtre Millipore à 0,45 llm et conservé à -20 C. The solubilized sample is dialyzed successively against 100 ml of buffer D at 4 M urea and 0.1% Sarkosyl, against 100 ml of buffer D at 2 M urea and 0.5% Sarkosyl and cons twice 100 ml of buffer D without urea and 0.5% of Sarkosyl. Dialysis is carried out for 1 hour with magnetic stirring at room temperature. The final dialysate is incubated for 30 minutes in an ice bath and then centrifuged at low speed for 10 minutes at 40C (Biofuge A, Heraeus Sepatech). The supernatant is recovered, filtered on Millipore filter at 0.45 μm and stored at -20.degree.

Une analyse SDS-PAGE a été réalisée pour chaque fraction (Figure 3). SDS-PAGE analysis was performed for each fraction (Figure 3).

L'analyse du profil électrophorétique de chaque fraction montre que les fractions HpPl, HpP2 et HpP4 sont pures avec une seule bande sur gel pour chacune de ces fractions (respectivement à 87, 76 et 54 i < Da), Par contre les fractions HpP5 et HpP6 sont partiellement purifiées dans la mesure où leurs profils montrent deux bandes respectivement à 47 et 50 kDa pour HpP5 et 32 et 35 kDa pour HpP6. The analysis of the electrophoretic profile of each fraction shows that the fractions HpP1, HpP2 and HpP4 are pure with a single band on gel for each of these fractions (respectively at 87, 76 and 54 i <Da), against the fractions HpP5 and HpP6 are partially purified as their profiles show two bands at 47 and 50 kDa respectively for HpP5 and 32 and 35 kDa for HpP6.

EXEMPLE 3 Purification des protéines membranaires de 30, 50 et 54 kD à partir de la
fraction membranaire I
3A - Chromatographie échangeuse d'anions sur Q-Sépharose
Une colonne de Q Sépharose de 40 ml (+=2,5 cm, h=8 cm) est préparée selon
les indications du fabricant (Pharmacia). La colonne est lavée, puis équilibrée avec le
tampon NaC03 50 mM pH 9,5, Pefabloc 100 CIM et Zwittergent 3-14 à 0,1%. La
chromatographie a été suivie par une détection UV à 280nm à la sortie de la colonne.EXAMPLE 3 Purification of 30, 50 and 54 kD Membrane Proteins from the
membrane fraction I
3A - Anion exchange chromatography on Q-Sepharose
A column of Q Sepharose 40 ml (+ = 2.5 cm, h = 8 cm) is prepared according to
the indications of the manufacturer (Pharmacia). The column is washed, then balanced with
50 mM NaC03 pH 9.5 buffer, Pefabloc 100 CIM and Zwittergent 3-14 0.1%. The
Chromatography was followed by UV detection at 280 nm at the outlet of the column.

Cent quarante mg de protéines de la fraction membranaire I préalablement
solubilisée sont déposées sur la colonne qui est ensuite lavée avec le tampon
d'équilibre (NaC03 50 mM pH 9,5, Pefabloc 100C1M et Zwittergent 3-14 0,1%)
jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm soit stabilisée. Les protéines sont éluées par un
gradient de 0,1 à 0,5 M de NaCI dans le tampon d'équilibre (10 fois VT) suivi d'un
lavage en tampon d'équilibre contenant 0,5 et 1 M de NaCI (2 fois VT). Les fractions
collectées sont analysées par SDS-PAGE et rassemblées en différents pools selon
leur profil électrophorétique, puis conservées à -20 C. Les fractions sont comme suit

One hundred and forty mg of protein of the membrane fraction I
solubilized are deposited on the column which is then washed with the buffer
equilibrium (50 mM NaC03 pH 9.5, Pefabloc 100C1M and Zwittergent 3-14 0.1%)
until the absorbance at 280 nm is stabilized. Proteins are eluted by a
gradient from 0.1 to 0.5 M NaCl in the equilibration buffer (10 times VT) followed by a
equilibrium buffer wash containing 0.5 and 1 M NaCl (twice VT). Fractions
collected are analyzed by SDS-PAGE and collected in different pools according to
their electrophoretic profile, then stored at -20 C. Fractions are as follows

<tb> fractions <SEP> élution <SEP> fractions <SEP> élution <SEP>
<tb> <SEP> 1 <SEP> éluat <SEP> direct <SEP> 6 <SEP> NaCI <SEP> 0,25-0,28M
<tb> <SEP> 2 <SEP> lavage <SEP> 7 <SEP> 0,28-0,35M <SEP>
<tb> <SEP> tamp.équilibre <SEP>
<tb> <SEP> 3 <SEP> NaCI <SEP> O <SEP> -O, <SEP> 1M <SEP> 8 <SEP> NaCI <SEP> 0,35-0,5M
<tb> <SEP> 4 <SEP> NaCI <SEP> O,i-O,2M <SEP> 9 <SEP> début <SEP> lavage <SEP> NaCI <SEP> I <SEP> M <SEP>
<tb> <SEP> 5 <SEP> NaCI <SEP> 0,2-0, 25M <SEP> 10 <SEP> fin <SEP> lavage <SEP> NaCI <SEP> 1M <SEP>
<tb>
Le bilan protéique montre que 53% des protéines sont éluées au cours du gradient de NaCI O-O,SM, 14% des protéines ne se sont pas fixées sur la colonne et 33% des protéines sont éluées au cours du lavage en NaCI 1M positivement à pH 7,5, alors que les protéines éluées en 1M NaCI correspondent à des protéines acides fortement chargées à ce pH.<tb> fractions <SEP> elution <SEP> fractions <SEP> elution <SEP>
<tb><SEP> 1 <SEP> eluate <SEP> direct <SEP> 6 <SEP> NaCl <SEP> 0.25-0.28M
<tb><SEP> 2 <SEP> wash <SEP> 7 <SEP> 0.28-0.35M <SEP>
<tb><SEP> equilibrium buffer <SEP>
<tb><SEP> 3 <SEP> NaCl <SEP> O <SEP> -O, <SEP> 1M <SEP> 8 <SEP> NaCl <SEP> 0.35-0.5M
<tb><SEP> 4 <SEP> NaCl <SEP> O, iO, 2M <SEP> 9 <SEP> start <SEP> wash <SEP> NaCI <SEP> I <SEP> M <SEP>
<tb><SEP> 5 <SEP> NaCl <SEP> 0.2-0, 25M <SEP> 10 <SEP> end <SEP> wash <SEP> NaCI <SEP> 1M <SEP>
<Tb>
The protein balance shows that 53% of the proteins are eluted during the gradient of NaCl OO, SM, 14% of the proteins are not fixed on the column and 33% of the proteins are eluted during washing in pH-positive 1M NaCl. 7.5, whereas the proteins eluted in 1M NaCl correspond to acid proteins highly charged at this pH.

La purification des fractions 7 et 9 est poursuivie comme suit. The purification of fractions 7 and 9 is continued as follows.

3B- Séparation des protéines des fractions 7 et 9 par chromatographie
échangeuse d'anions sur DEAE Sépharose
Une colonne de DEAE Sépharose est préparée selon les indications du fabricant (Pharmacia) pour un volume de gel d'environ 10 ml (+=1,5 cm, h=5 cm) (maximal 10 mg protéine/mi de gel). La colonne est lavée, puis équilibrée avec le tampon Tris-HC1 50 mM pH 7,5, Pefabloc 100 pLM et Zwittergent 3-14 à 0,1%. La chromatographie est suivie comme précédemment par une détection UV à 280nm à la sortie de la colonne.3B-Separation of Protein from Fractions 7 and 9 by Chromatography
anion exchange on DEAE Sepharose
A column of DEAE Sepharose is prepared according to the manufacturer's indications (Pharmacia) for a gel volume of about 10 ml (+ = 1.5 cm, h = 5 cm) (maximum 10 mg protein / ml of gel). The column is washed, then equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, Pefabloc 100 pLM and Zwittergent 3-14 0.1%. The chromatography is followed as previously by UV detection at 280 nm at the column outlet.

La fraction 7 dialysée au préalable contre le tampon d'équilibre (Tris-HC1 50 mM pH 7,5, Pefabloc 100 HM et Zwittergent 3-14 0,1%) contenant 10 mg de protéines, est déposée sur la colonne de DEAE Sépharose. La colonne est lavée en tampon d'équilibre jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm soit stabilisée. Les protéines sont éluées par un gradient de O à 0,5 M de NaCI dans le tampon d'équilibre (10 fois
VT), suivi d'un lavage en tampon d'équilibre contenant 1 M de NaCI (2 fois x VT).The fraction 7 dialysed beforehand against the equilibrium buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, Pefabloc 100 HM and Zwittergent 3-14 0.1%) containing 10 mg of proteins, is deposited on the DEAE Sepharose column. . The column is washed in equilibrium buffer until the absorbance at 280 nm is stabilized. The proteins are eluted with a gradient of 0 to 0.5 M NaCl in the equilibrium buffer (10 times
VT), followed by an equilibrium buffer wash containing 1 M NaCl (twice x VT).

Les fractions collectées sont analysées par SDS-PAGE, puis rassemblées en différents pools selon leur profil protéique et conservées à -20 C. Par SDS-PAGE, on montre que la fraction 7.1 (éluat direct) est d'intérêt.The collected fractions are analyzed by SDS-PAGE, then pooled in different pools according to their protein profile and stored at -20 C. By SDS-PAGE, it is shown that the fraction 7.1 (direct eluate) is of interest.

Une purification identique est reconduite avec la fraction 9 contenant 3 1 mg de protéines. Par SDS-PAGE on montre que les fractions 9.1, 9.2 et 9.3 respectivement éluées à 0,1 -0,25 M NaCI, 0,3 -0,4 M NaCI et 1 M NaCI sont d'intérêt. Identical purification is repeated with fraction 9 containing 31 mg of proteins. By SDS-PAGE it is shown that the fractions 9.1, 9.2 and 9.3 respectively eluted at 0.1 -0.25 M NaCl, 0.3 -0.4 M NaCl and 1 M NaCl are of interest.

Pour la fraction 7 (Figure 4A), les résultats obtenus montrent que seulement une protéine de 30 kDa (colonne 3 ; fraction 7.1) a été enrichie et partiellement séparée après passage sur la colonne de DEAE Sépharose, les autres protéines n'ont pas été séparées. Pour la fraction 9 (Figure 4B). les profils electrophorétiques montrent que deux protéines de 54 et 15 kDa (colonnes 3 et 5 fractions 9.1 et 9.3) ont été séparées et une protéine de 50 kD a été enrichie (colonne 4 , fraction 9.2). La protéine de 54 kD de la fraction 9.1 ne réagit pas avec des anticorps anti-catalase. For fraction 7 (FIG. 4A), the results obtained show that only a 30 kDa protein (column 3, fraction 7.1) has been enriched and partially separated after passage over the DEAE Sepharose column, the other proteins have not been separated. For fraction 9 (Figure 4B). the electrophoretic profiles show that two 54 and 15 kDa proteins (columns 3 and 5 fractions 9.1 and 9.3) were separated and a 50 kD protein was enriched (column 4, fraction 9.2). The 54 kD protein of fraction 9.1 does not react with anti-catalase antibodies.

EXEMPLE 4 : Purification de la protéine membranaire de 76 kD à partir de la fraction
membranaire III
4A - Séparation des protéines de la fraction membranaire III sur la colonne Q
Sépharose
Cent quarante mg de protéines de la fraction membranaire III préalablement
solubilisée ont été déposées sur une colonne Q Sépharose préparée comme
précédemment en 3A. Après que la colonne ait été lavée avec le tampon d'équilibre
(NaC03 50 mM pH 9,5, Pefabloc 100 IlM et Zwittergent 3-14 0,1%) jusqu'au retour
à la ligne de base, un lavage avec NaCI 0,1M en tampon d'équilibre a été réalisé
jusqu'au retour à la ligne de base (fraction A), suivi d'un gradient de NaCI de 0,1 à
0,5 M en tampon d'équilibre (fractions B, C, D et E), puis d'un lavage avec NaCI 1M
en tampon d'équilibre (fraction F). Les résultats sont représentés dans le tableau ci
dessous.

EXAMPLE 4 Purification of the 76 kD Membrane Protein from the Fraction
membrane III
4A - Separation of Proteins from Membrane Fraction III on Column Q
Sepharose
One hundred and forty mg of protein from the III membrane fraction
solubilized were deposited on a column Q Sepharose prepared as
previously in 3A. After the column has been washed with equilibrium buffer
(50 mM NaC03 pH 9.5, Pefabloc 100 IlM and Zwittergent 3-14 0.1%) until return
at baseline, a 0.1M NaCl wash in equilibration buffer was performed
until return to the baseline (fraction A), followed by a NaCl gradient of 0.1 to
0.5 M in equilibrium buffer (fractions B, C, D and E), followed by washing with 1M NaCl
in equilibrium buffer (fraction F). The results are shown in the table
below.

fractions <SEP> élution <SEP> protéines <SEP> totales
<tb> <SEP> (mg) <SEP>
<tb> <SEP> A <SEP> lavage <SEP> eNaClO,lM <SEP> 18
<tb> <SEP> B <SEP> NaCI <SEP> 0,1-0,2M <SEP> 14
<tb> <SEP> C <SEP> NaCI <SEP> 0,25M <SEP> 10
<tb> <SEP> D <SEP> NaCI <SEP> 0,25-0,35M <SEP> 27
<tb> <SEP> E <SEP> NaCI <SEP> 0,35-0,45M <SEP> 26
<tb> <SEP> F <SEP> lavage <SEP> NaCI <SEP> 1M <SEP> 20
<tb>
Le bilan protéique nous montre que 55% des protéines sont éluées au cours du gradient de NaCI 0,1-0,5M, 15% sont éluées au cours du lavage avec NaCI 0,1M et 15% sont éluées au cours du lavage avec NaCI 1 M. fractions <SEP> elution <SEP> total proteins <SEP>
<tb><SEP> (mg) <SEP>
<tb><SEP> A <SEP> wash <SEP> eNaClO, lM <SEP> 18
<tb><SEP> B <SEP> NaCl <SEP> 0.1-0.2M <SEP> 14
<tb><SEP> C <SEP> NaCl <SEP> 0.25M <SEP> 10
<tb><SEP> D <SEP> NaCl <SEP> 0.25-0.35M <SEP> 27
<tb><SEP> E <SEP> NaCl <SEP> 0.35-0.45M <SEP> 26
<tb><SEP> F <SEP> wash <SEP> NaCI <SEP> 1M <SEP> 20
<Tb>
The protein balance shows us that 55% of the proteins are eluted during the gradient of 0.1-0.5M NaCl, 15% are eluted during washing with 0.1M NaCl and 15% are eluted during washing with NaCl 1 Mr.

Les profils SDS-PAGE de chacune des fractions obtenues après passage de la fraction membranaire III sur la colonne Q Sépharose, sont différents. De plus, certaines protéines sont enrichies par rapport à la fraction membranaire III de départ. The SDS-PAGE profiles of each of the fractions obtained after passage of the membrane fraction III on the Q Sepharose column are different. In addition, some proteins are enriched with respect to the starting membrane fraction III.

On observe notamment un enrichissement de la protéine de 76 kDa sur le profil correspondant à la fraction D dont la purification est poursuivie comme suit. In particular, the protein of 76 kDa is enriched on the profile corresponding to fraction D, the purification of which is continued as follows.

4B - Purification sur colonne S Sépharose, de la protéine de 76 kDa à partir de
la fraction D obtenue sur colonne Q Sépharose
Une colonne de S Sépharose est préparée selon les indications du fabricant
(Pharmacia) pour un volume de gel d'environ 10 ml (4)1,5 cm, h=5 cm) (maximal 10
mg protéine/ml de gel). La colonne est lavée, puis équilibrée avec le tampon acétate
50 mM pH 5,0, Pefabloc 100 I1M et Zwittergent 3-14 à 0,1%.4B - Purification on S-Sepharose column, of the 76 kDa protein from
fraction D obtained on column Q Sepharose
A column of S Sepharose is prepared according to the manufacturer's instructions
(Pharmacia) for a gel volume of about 10 ml (4) 1.5 cm, h = 5 cm) (maximum
mg protein / ml gel). The column is washed and then equilibrated with the acetate buffer
50 mM pH 5.0, Pefabloc 100 I1M and Zwittergent 3-14 at 0.1%.

La fraction D dialysée préalablement contre le tampon d'équilibre (acétate 50
mM pH 5,0, Pefabloc 100 I1M et Zwittergent 3-14 0,1%) est déposée sur la colonne
de S Sépharose. La colonne est ensuite lavée avec le même tampon jusqu'à ce que
l'absorbance à 280 nm soit stabilisée. Environ 3 volumes de colonne sont nécessaires
pour le retour à la ligne de base. Les protéines sont éluées par un gradient de O à 0,5
M de NaCI en tampon d'équilibre (10 fois VT), suivi d'un lavage avec le tampon
d'équilibre contenant 0,5 et 1M de NaCI (4 fois VT). Les fractions collectées sont
analysées, rassemblées et conservées comme précédemment.The fraction D dialysed beforehand against the equilibrium buffer (acetate 50
mM pH 5.0, Pefabloc 100 I1M and Zwittergent 3-14 0.1%) is deposited on the column
of Sepharose. The column is then washed with the same buffer until
the absorbance at 280 nm is stabilized. About 3 column volumes are needed
for the return to the baseline. The proteins are eluted by a gradient of 0 to 0.5
M NaCl in equilibrium buffer (10 times VT), followed by washing with buffer
equilibrium containing 0.5 and 1M NaCl (4 times VT). The fractions collected are
analyzed, collected and preserved as before.

La fraction D' sortant au cours du gradient NaCI 0-0,5M, entre 0.15 et 0,20 M
NaCI a été récupérée. Sur cette fraction, une analyse par SDS-PAGE et par western
blot est effectuée. Les résultats sont représentés à la Figure 5.The fraction D 'leaving during the NaCl gradient 0-0.5M, between 0.15 and 0.20 M
NaCl has been recovered. On this fraction, an analysis by SDS-PAGE and by western
blot is performed. The results are shown in Figure 5.

Ces résultats montrent qu'après deux colonnes échangeuses d'ions, la protéine
de 76 kDa est enrichie ; mais elle demeure contaminée avec une protéine de 54 kDa
et une protéine de 67 kDa (colonne 4). La protéine de 54 kDa ne réagit pas avec les
anticorps anti-catalase, par conséquent elle ne correspond donc pas à la catalase, de
même la protéine de 67 kDa ne réagissant pas avec l'anticorps anti-ureB en western
blot, par conséquent elle ne correspond pas à la sous-unité B de l'uréase. L'analyse
par western blot en présence d'un antisérum anti-76 kDa montre que les faibles
bandes observées en dessous de la bande à 76 kDa correspondent à une dégradation
de la protéine de 76 kDa, puisqu'elles réagissent faiblement avec cet ante sérum
(colonne 7).These results show that after two ion exchange columns, the protein
76 kDa is enriched; but it remains contaminated with a protein of 54 kDa
and a 67 kDa protein (column 4). The 54 kDa protein does not react with
anti-catalase antibody, therefore it does not correspond to catalase,
even the 67 kDa protein does not react with the anti-ureB antibody in western
blot, therefore it does not correspond to the subunit B of urease. analysis
Western blot in the presence of an anti-76 kDa antiserum shows that the weak
bands observed below the band at 76 kDa correspond to a degradation
of the 76 kDa protein, since they react weakly with this ante serum
(column 7).

EXEMPLE 5 : Préparation de sérums hnperimmuns à ltencontre des protéines
membranaires de 76, 50 et 35 kD. EXAMPLE 5 Preparation of Superimmune Serums Against Proteins
Membranes of 76, 50 and 35 kD.

Des sérums polyclonaux spécifiques des protéines membranaires majeures H. pilori sont obtenus par hyperimmunisation des lapins respectivement avec les antigènes purifiés par SDS-PAGE préparative HpP2, HpP5 et HpP6. La première injection JO (sous-cutanée multisites et intramusculaire) est effectuée avec une préparation contenant 50 g de protéine membranaire émulsionnée en adjuvant complet de Freund, puis les rappels J21 et
J42 se font par injection de 25 pg de protéine membranaire en adjuvant incomplet de
Freund. Les animaux sont sacrifiés à J60. Les sérums obtenus sont décomplémentés pendant 30 minutes à 56"C et stérilisés par filtration sur membrane de porosité 0,22 pm (Millipore).Polyclonal sera specific for H. pilori major membrane proteins are obtained by hyperimmunisation of rabbits respectively with antigens purified by preparative SDS-PAGE HpP2, HpP5 and HpP6. The first OJ injection (multisite and intramuscular subcutaneous) is carried out with a preparation containing 50 g of Freund's complete adjuvant-emulsified membrane protein, followed by recalls J21 and
J42 are by injection of 25 μg of membrane protein into incomplete adjuvant of
Freund. The animals are sacrificed at J60. The sera obtained are decomplemented for 30 minutes at 56 ° C. and sterilized by membrane filtration with a porosity of 0.22 μm (Millipore).

L'antisérum anti-HpP2 réagit avec la protéine de 76ltD telle qu'isolée selon l'Exemple 4, tandis que I'antisérum anti- HpP5 réagit avec la protéine de 5OkD isolée dans la fraction 9.2 obtenue dans l'Exemple 3. The anti-HpP2 antiserum reacts with the 76ItD protein as isolated according to Example 4, whereas the anti-HpP5 antiserum reacts with the isolated 50k protein in the fraction 9.2 obtained in Example 3.

Bien evidemment, le protocole d'immunisation décrit ci-avant peut être utilisé de manière similaire pour produire des antisérums à l'encontre de chacune des protéines purifiées aux Exemples 3 et 4. Les préparations obtenues dans ces exemples pourront être avantageusement soumises à une electrophorêse préparative sur gel de SDS-PAGE. Les bandes protéiques seront traitées comme précédemment afin d'obtenir une préparation destinée à l'immunisation. Of course, the immunization protocol described above can be used in a similar manner to produce antisera against each of the proteins purified in Examples 3 and 4. The preparations obtained in these examples can be advantageously subjected to electrophoresis. preparative gel on SDS-PAGE. The protein bands will be treated as before to obtain a preparation for immunization.

EXEMPLE 6 : Purification d'une catalase à partir d'lI. pylori
Une culture est réalisée comme décrit dans l'Exemple 1A. Le culot bactérien lavé est remis en suspension dans du tampon phosphate de sodium 50 mM pH 7,5 contenant du
PMSF (phenylmethylsulionyl fluoride Sigma) 100 I1M (tampon A) à concentration finale de 0,1 g (poids humide) par millilitre. La suspension est homogénéisée à l'aide d'un mixeur de type Ultraturrax. Les cellules bactériennes sont ensuite cassées par sonication avec un appareil de type Sonifier (Branson) équipé d'une sonde de diamètre 1,8 cm. La sonication s'effectue par intermittence, 1 min de sonication et 1 min de repos sur glace. Une sonication de 10 min est suffisante pour casser complètement 5 g de germes en suspension. Le lysat ainsi obtenu est centrifugé pendant 15 min à 40C à 4 000 g. Le surnageant est récupéré puis, centrifugé à nouveau à 100 000 g pendant 30 min à 4"C. Le surnageant de cette deuxième centrifugation (S2) est récupéré pour une purification chromatographie. La fraction S2 préparée de cette façon conserve environ 90% de l'activité enzymatique "catalase" totale, telle que mesurée selon la technique de Hazell et al (supra) ou Beers &
Sizer, J. Biol. Chem. (1952)195 :133. EXAMPLE 6 Purification of Catalase from II. pylori
A culture is carried out as described in Example 1A. The washed bacterial pellet is resuspended in 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.5 containing
PMSF (phenylmethylsulionyl fluoride Sigma) 100 μM (buffer A) at a final concentration of 0.1 g (wet weight) per milliliter. The suspension is homogenized using a mixer of the Ultraturrax type. The bacterial cells are then broken by sonication with a Sonifier type device (Branson) equipped with a 1.8 cm diameter probe. The sonication is carried out intermittently, 1 min of sonication and 1 min of rest on ice. A sonication of 10 min is sufficient to completely break 5 g of germs in suspension. The lysate thus obtained is centrifuged for 15 min at 40 ° C. at 4000 g. The supernatant is recovered and then centrifuged again at 100,000 g for 30 min at 4 ° C. The supernatant of this second centrifugation (S2) is recovered for purification chromatography.The fraction S2 prepared in this way retains about 90% of the Catalase enzymatic activity, as measured by the technique of Hazell et al (supra) or Beers &
Sizer, J. Biol. Chem. (1952) 195: 133.

La fraction S2 est chargée sur une colonne S-Sépharose (Pharmacia) préalablement équilibrée avec du tampon A. La colonne est lavée avec le même tampon. La chromatographie est suivie avec un détecteur UV à 280 nm pour les protéines et par l'activité enzymatique pour la catalase. Après élimination des protéines non-fixées (I'absorption à 280 nrn revient à la ligne de base), la colonne est ensuite lavée avec un gradient de NaCI, O à 1M dans du tampon A. Les fractions correspondant au pic de l'activité catalase sont recueillies, concentrées dans une cellule de concentration de type
Amicon équipée de membrane dont le seuil de coupure est de 100 000 Daltons. La fraction concentrée ainsi obtenue est chargé sur une colonne Séphacryl S-300 HR préalablement équilibrée avec du tampon PBS. Les fractions contenant de l'activité catalase sont recueillies, concentrées à 1 mg/ml et dialysées contre le tampon PBS. La solution finale est filtrée sur une membrane de porosité 0,22 urn et conservée à -700C.Fraction S2 is loaded on an S-Sepharose (Pharmacia) column previously equilibrated with buffer A. The column is washed with the same buffer. Chromatography is followed with a UV detector at 280 nm for proteins and enzymatic activity for catalase. After removal of unfixed proteins (absorbance at 280 nrn returns to the baseline), the column is then washed with a gradient of NaCl, 0 to 1M in buffer A. Fractions corresponding to the peak of the activity. catalase are collected, concentrated in a concentration cell of type
Amicon equipped with a membrane with a cutoff of 100,000 Daltons. The concentrated fraction thus obtained is loaded onto a Sephacryl S-300 HR column previously equilibrated with PBS buffer. Fractions containing catalase activity are collected, concentrated to 1 mg / ml and dialysed against PBS buffer. The final solution is filtered on a 0.22 μm porosity membrane and stored at -700C.

La protéine ainsi purifiée présente les caractéristiques suivantes:
(i) Une activité enzymatique de catalase typique, en l'absence d'activité
peroxydase.The protein thus purified has the following characteristics:
(i) Typical catalase enzymatic activity, in the absence of activity
peroxidase.

(ii) Un spectre visible typique d'une hémoprotéine, un pic de Soret à 406 nm et les
pics d'alpha et de bêta entre 520 nm et 550 nm.(ii) A typical visible spectrum of a hemoprotein, a Soret peak at 406 nm and the
peaks of alpha and beta between 520 nm and 550 nm.

(iii) Une forme monomerique à 54 kD en SDS-PAGE avec la séquence N-terminale
suivante: MVNKDVKQTTAFGAPVWDDNNVITAGPRG (iii) A 54 kD monomeric form in SDS-PAGE with the N-terminal sequence
next: MVNKDVKQTTAFGAPVWDDNNVITAGPRG

Claims

(vii) the fraction eluted with 0.1 - 0.25 M NaCl is recovered.

NaCl gradient O - 0.5 M, and

column anion exchange chromatography of DEAE Sepharose in

(vi) recovering the fraction eluted at the start of washing in 1 M NaCl which is subjected to

NaCl 1M,

on Q-Sepharose column in 0.5 M NaCl gradient, followed by washing with

(v) the membrane fraction is subjected to anion exchange chromatography

it is resuspended in an aqueous medium,

(iv) recovering the membrane fraction consisting of the pellet of centrifugation that

Tris HCI 20 mM pH 7.5, followed by centrifugation

(iii) recovering a centrifugation pellet which is subjected to a buffer wash

subject to sonication followed by centrifugation

(ii) recovering a bacterial pellet which is treated with lysosyme and which is

glucopyranoside 1%, followed by centrifugation

(i) H. pylori bacteria are extracted with n-octyl-D

obtained by a process in which

not react with anti-catalase antiserum, said protein being likely to be

1. A protein whose apparent molecular weight is of the order of 54 kD and which does not

2. A protein or polypeptide in substantially purified form, which is

capable of being recognized by an antiserum established against a protein according to the

claim 1.

3. A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a

H. pylori infection, which comprises as an active ingredient a protein or

polypeptide according to claim 1 or 2.