FR2744133A1 - METHOD FOR CULTURING CELLS WITH ANGIOGENIC POTENTIAL TO INDUCE VASCULAR MORPHOGENESIS OF SAID CELLS, IN VITRO MODELS OF VASCULAR MORPHOGENESE THUS OBTAINED, AND THEIR APPLICATIONS, IN PARTICULAR TO DRUG SCREENING - Google Patents
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Abstract
Description
PROCÉDÉ DE CULTURE DE CELLULES À POTENTIEL
ANGIOGÉNIQUE POUR INDUIRE LA MORPHOGÉNÈSE VASCULAIRE
DESDITES CELLULES, MODÈLES IN VITRO DE MORPHOGÉNÈSE
VASCULAIRE AINSI OBTENUS, ET LEURS APPLICATIONS NOTAMMENT
AU CRIBLAGE DE DROGUES.METHOD FOR CULTURING POTENTIAL CELLS
ANGIOGENIC TO INDUCE VASCULAR MORPHOGENESIS
SUCH CELLS, IN VITRO MODELS OF MORPHOGENESIS
VASCULAR SO OBTAINED, AND THEIR APPLICATIONS IN PARTICULAR
SCREENING FOR DRUGS.
La présente invention concerne le domaine de la culture cellulaire et plus particulièrement un procédé de culture de cellules à potentiel angiogénique pour induire la morphogénèse vasculaire de ces cellules. La morphogénèse vasculaire est définie comme l'ensemble des événements cellulaires et tissulaires permettant la formation des vaisseaux sanguins (Risau, W. The present invention relates to the field of cell culture and more particularly to a method of culturing cells with angiogenic potential to induce the vascular morphogenesis of these cells. Vascular morphogenesis is defined as the set of cellular and tissue events allowing the formation of blood vessels (Risau, W.
"Differentiation of the endothelium". Faseb. J., 1995, 6933)
- soit à partir de cellules indifférenciées (angioblastes), il s'agit alors de la vasculogénèse,
- soit à partir de vaisseaux préformés, et il s'agit alors de l'angiogénèse."Differentiation of the endothelium". Faseb. J., 1995, 6933)
- either from undifferentiated cells (angioblasts), this is then vasculogenesis,
- either from preformed vessels, and this is then angiogenesis.
La vasculogénèse est essentiellement un phénomène embryonnaire alors que l'angiogénèse apparaît non seulement durant l'embryogénèse, mais également durant la vie adulte. Cette angiogénèse tardive répond à des processus physiologiques, tels que la cicatrisation tissulaire ou la régénération endométriale, ainsi qu'à des phénomènes pathologiques, lors par exemple de complications dégénératives du diabète insulino-dépendant, de rhumatismes inflammatoires chroniques, d'une progression tumorale ou d'une endométriose. L'inhibition de l'angiogénèse est donc un objectif thérapeutique dans ces pathologies, alors qu'au contraire, l'induction de l'angiogénèse est recherchée dans la cicatrisation tissulaire, la greffe de peau ou la re-vascularisation post-ischémique (Battegay, E. J. Angiogenesis
Mechanistic insights, neovascular diseases, and therapeutic prospects". J. Mol. Med., 1995, 333-346).Vasculogenesis is essentially an embryonic phenomenon whereas angiogenesis appears not only during embryogenesis, but also during adulthood. This late angiogenesis responds to physiological processes, such as tissue healing or endometrial regeneration, as well as to pathological phenomena, for example during degenerative complications of insulin-dependent diabetes, chronic inflammatory rheumatism, tumor progression or endometriosis. The inhibition of angiogenesis is therefore a therapeutic objective in these pathologies, whereas on the contrary, the induction of angiogenesis is sought in tissue healing, skin grafting or post-ischemic re-vascularization (Battegay , EJ Angiogenesis
Mechanistic insights, neovascular diseases, and therapeutic prospects ". J. Mol. Med., 1995, 333-346).
Ces perspectives thérapeutiques nécessitent de disposer de modèles in vivo ou in vitro permettant le criblage de substances capables d'inhiber ou, au contraire, d'induire l'angiogénèse. On connait dans l'art antérieur de tels modèles, parmi lesquels on peut distinguer les modèles animaux et les modèles in vitro. These therapeutic perspectives require the availability of in vivo or in vitro models allowing the screening of substances capable of inhibiting or, on the contrary, inducing angiogenesis. In the prior art, such models are known, among which animal models and in vitro models can be distinguished.
Les modèles animaux permettent l'exploration à la fois des mécanismes directs et indirects de l'angiogénèse. De tels modèles sont par exemple les suivants
- La néovascularisation de la cornée d'oeil de lapin (Hendkin, P. "Ocular neovascularization. The Kril memorial lecture". Am. J. Ophtalmol., 1978, 85, 287-301).Animal models allow the exploration of both direct and indirect mechanisms of angiogenesis. Such models are for example the following
- The neovascularization of the rabbit eye cornea (Hendkin, P. "Ocular neovascularization. The Kril memorial lecture". Am. J. Ophtalmol., 1978, 85, 287-301).
Dans ce modèle, la cornée est normalement vascularisée et un traumatisme chimique ou physique induit la formation de néo-vaisseaux capillaires. Ce modèle animal est limité par les complexités de manipulation, notamment la standardisation du traumatisme, le coût et les difficultés de l'expérience puisque un lapin est nécessaire pour chaque test. En outre, son emploi est soumis aux réglementations sur l'expérimentation animale.In this model, the cornea is normally vascularized and a chemical or physical trauma induces the formation of capillary neo-vessels. This animal model is limited by the complexities of handling, in particular the standardization of the trauma, the cost and the difficulties of the experiment since a rabbit is necessary for each test. In addition, its use is subject to regulations on animal testing.
- La membrane d'oeuf de poule embryonné (Sorgente, N., K. E. Kuetter, L. W. Soble, "The resistance of certain tissues to invasion". Lab. Invest., 1975, 32, 217-222). Il s'agit d'un modèle traditionnel de l'embryologie selon lequel la formation rapide d'un réseau vasculaire durant la phase initiale de l'embryogénèse permet l'analyse des effets inhibiteurs de l'angiogénèse. - The embryonated chicken egg membrane (Sorgente, N., K. E. Kuetter, L. W. Soble, "The resistance of certain tissues to invasion". Lab. Invest., 1975, 32, 217-222). It is a traditional model of embryology according to which the rapid formation of a vascular network during the initial phase of embryogenesis allows the analysis of the inhibitory effects of angiogenesis.
Bien que le matériel mis en oeuvre dans ce modèle soit peu coûteux et non soumis à une réglementation contraignante, il est de manipulation délicate et non automatisable. Although the equipment used in this model is inexpensive and not subject to restrictive regulations, it is delicate to handle and cannot be automated.
En outre, les informations recueillies grâce à ce modèle aviaire ne sont pas directement transposables à 1'homme. In addition, the information collected using this avian model cannot be directly transposed to humans.
L'utilisation de modèles animaux est rendue difficile par la variabilité inter-individus limitant les possibilités de standardisation, et par la mise en oeuvre de manipulations lourdes peu automatisables. En outre, la question de la spécificité d'espèce des effets observés est toujours soulevée, dès que le modèle s'éloigne du modèle mammifère. Enfin, la mise en place de réglementations visant à limiter l'usage d'animaux dans l'expérimentation cosmétique et pharmaceutique, n'est pas favorable aux développements de ce type de modèle. The use of animal models is made difficult by the inter-individual variability limiting the possibilities of standardization, and by the implementation of heavy manipulations which are not very automated. In addition, the question of the species specificity of the effects observed is always raised, as soon as the model moves away from the mammalian model. Finally, the implementation of regulations aimed at limiting the use of animals in cosmetic and pharmaceutical experimentation is not favorable to the development of this type of model.
Les modèles in vitro utilisent la capacité de cellules en culture de former des structures tubulaires centrées sur un espace luminal représentatif de la lumière physiologique des vaisseaux de l'appareil circulatoire. De tels modèles sont par exemple
- Les gels tridimensionnels de collagène I (Montesano, R., L. Orci, "Phorbol ester induces angiogenesis in vitro from large vessel endothelial cell".In vitro models use the ability of cultured cells to form tubular structures centered on a luminal space representative of physiological light from the vessels of the circulatory system. Such models are for example
- Three-dimensional collagen I gels (Montesano, R., L. Orci, "Phorbol ester induces angiogenesis in vitro from large vessel endothelial cell".
J. Cell. Physiol., 1987, 139, 284-291) (Montesano, R., L.J. Cell. Physiol., 1987, 139, 284-291) (Montesano, R., L.
Orci, "Tumor-promoting phorbol ester induces angiogenesis in vitro", Cell, 1985, 42, 469-477). Ce modèle permet de cultiver des cellules d'une lignée aortique de boeuf à la surface d'un gel formé de collagène purifié de type I en présence d'effecteurs de différenciation cellulaire tel que le phorbol myristyl acétate (PMA). Ces cellules induisent la formation de cordes cellulaires qui parfois envahissent le gel sous-jacent pour former de véritables tubules dans l'épaisseur du gel. Ce modèle est limité à l'utilisation de quelques lignées cellulaires très particulières ayant le potentiel de former des structures tubulaires différenciées. L'inducteur de différenciation le plus démonstratif dans ce modèle est un ester de phorbol, le PMA, qui est un promoteur tumoral non physiologique, alors que les inducteurs physiologiques, comme le FGF (fibroblast growth factor), ont des effets dont la reproductibilité interlaboratoire n'est pas satisfaisante. La notion de structures tubulaires tridimensionnelles, qui est un élément crucial des phénomènes de morphogénèse vasculaire, est toujours discutable dans ce modèle où l'envahissement du gel par les tubules néoformés reste très peu profond, et où seul un expérimentateur averti peut clairement différencier les cordes cellulaires formées à la surface du gel, des tubules très légèrement sous-jacents. En conséquence, une simple photographie de la culture en microscopie inversée ne permet pas d'affirmer acec certitude l'envahissement du gel, et seule la technique lourde d'analyse histologique du gel en coupes sériées peut apporter la preuve de l'envahissement du gel par les formations tubulaires.Orci, "Tumor-promoting phorbol ester induces angiogenesis in vitro", Cell, 1985, 42, 469-477). This model makes it possible to cultivate cells of a beef aortic line on the surface of a gel formed from purified collagen type I in the presence of cell differentiation effectors such as phorbol myristyl acetate (PMA). These cells induce the formation of cellular cords which sometimes invade the underlying gel to form real tubules in the thickness of the gel. This model is limited to the use of a few very specific cell lines with the potential to form differentiated tubular structures. The most demonstrative differentiation inducer in this model is a phorbol ester, PMA, which is a non-physiological tumor promoter, while physiological inducers, such as FGF (fibroblast growth factor), have effects including inter-laboratory reproducibility is not satisfactory. The notion of three-dimensional tubular structures, which is a crucial element of the phenomena of vascular morphogenesis, is always debatable in this model where the invasion of the gel by the newly formed tubules remains very shallow, and where only an experienced experimenter can clearly differentiate the strings cells formed on the surface of the gel, very slightly underlying tubules. Consequently, a simple photograph of the culture in inverted microscopy does not make it possible to confirm with certainty the invasion of the gel, and only the heavy technique of histological analysis of the gel in serial sections can provide evidence of the invasion of the gel. by tubular formations.
- Le gel de matrice EHS. Il s'agit de matrice extracellulaire qui est sécrétée par une tumeur
EHS de souris et dont la composition a été initialement décrite par H. K. Kleinman (Kleinman, H. K., M. L.- EHS matrix gel. It is an extracellular matrix that is secreted by a tumor
EHS of mice and the composition of which was initially described by HK Kleinman (Kleinman, HK, ML
McGarvey, L. A. Liotta, P. G. Robey, K. Tryggvason, G. R.McGarvey, L. A. Liotta, P. G. Robey, K. Tryggvason, G. R.
Martin, "Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin and heparin sulfate proteoglycan from
EHS sarcoma". Biochemistry, 1982, 21, 6188-6193). Cette matrice est purifiée par un procédé non dénaturant pour servir de support tri-dimensionnel de culture cellulaire.Martin, "Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin and heparin sulfate proteoglycan from
EHS sarcoma ". Biochemistry, 1982, 21, 6188-6193). This matrix is purified by a non-denaturing process to serve as a three-dimensional cell culture support.
Les cellules à potentiel vasculaire forment en quelques heures à la surface de ce gel des structures en réseau assimilées à des structures vasculaires. La rapidité des phénomènes fait admettre aux spécialistes du domaine qu'il s'agit plus d'un phénomène de migration et d'organisation cellulaire, que d'une véritable différenciation fonctionnelle. De plus, des cellules non programmées pour former in vivo des néo-capillaires, donnent dans ce modèle, des structures en réseau comparables à celles obtenues avec des cellules vasculaires. La spécificité vasculaire des phénomènes observés dans ce modèle n'est donc pas admise de façon générale. Ce produit est d'ailleurs commercialisé dans diverses applications de recherche, autres que l'étude des phénomènes angiogéniques.Cells with vascular potential form in a few hours on the surface of this gel network structures assimilated to vascular structures. The rapidity of the phenomena makes specialists in the field admit that it is more a phenomenon of migration and cellular organization, than a real functional differentiation. In addition, cells not programmed to form neo-capillaries in vivo, give in this model, network structures comparable to those obtained with vascular cells. The vascular specificity of the phenomena observed in this model is therefore not generally accepted. This product is also marketed in various research applications, other than the study of angiogenic phenomena.
- Les lignées de cellules embryonnaires de souris. Les cellules du stroma précoce de l'embryon de souris, désignées dans la littérature par cellules ES, forment des corps embryonnaires après culture in vitro dans des conditions appropriées. Ces corps embryonnaires sont capables de former des kystes pleins dont les cellules de la coque externe expriment certains caractères de différenciation angiogénique de type vasculaire, désignés corps embryonnaires vasculaires (Wang, R., R. - Mouse embryonic cell lines. The cells of the early stroma of the mouse embryo, designated in the literature by ES cells, form embryonic bodies after cultivation in vitro under appropriate conditions. These embryonic bodies are capable of forming full cysts, the cells of the outer shell of which express certain angiogenic differentiation characteristics of the vascular type, designated vascular embryonic bodies (Wang, R., R.
Clark., V. L. Bautch, "Embryonnic stem cell-derived cystic embryoïd bodies form vascular channels : an in vitro model of blood vessel development", Development 1992, 114, 303316). Ce modèle explore les phases très initiales de la vasculogénèse embryonnaire. En effet, bien que l'amorce de canaux vasculaires existe dans ce modèle, ces structures restent à l'intérieur du corps embryonnaire et ne poursuivent pas leur développement. Il s'agit donc exclusivement d'un phénomène de vasculogénèse.Clark., V. L. Bautch, "Embryonnic stem cell-derived cystic embryoid bodies form vascular channels: an in vitro model of blood vessel development", Development 1992, 114, 303316). This model explores the very initial phases of embryonic vasculogenesis. Indeed, although the priming of vascular channels exists in this model, these structures remain inside the embryonic body and do not continue their development. It is therefore exclusively a phenomenon of vasculogenesis.
La multiplication des modèles in vitro témoigne de la difficulté de définir un modèle général, simple d'emploi et reproductible. En effet, comme indiqué pour chacun des exemples de l'art antérieur rappelés cidessus, ltorganisation tri-dimensionnelle des structures vasculaires néo-formées est difficile à démontrer. En outre, les phénomènes observés avec les modèles existants ne sont représentatifs que de certaines étapes du processus complexe qui s'enchaînent selon une chronologie précise pour permettre la formation d'un néo-capillaire. The proliferation of in vitro models demonstrates the difficulty of defining a general model, easy to use and reproducible. In fact, as indicated for each of the examples of the prior art mentioned above, the three-dimensional organization of the neo-formed vascular structures is difficult to demonstrate. In addition, the phenomena observed with existing models are only representative of certain stages of the complex process which are linked according to a precise chronology to allow the formation of a neo-capillary.
Ainsi, l'intérêt de la diversité des modèles existants repose sur leur complémentarité, chaque modèle étant adapté à l'étude de certains aspects seulement de l'angiogénèse; or cette diversité n'est pas compatible avec une utilisation industrielle facile.Thus, the interest of the diversity of the existing models rests on their complementarity, each model being adapted to the study of only certain aspects of angiogenesis; this diversity is not compatible with easy industrial use.
Le but de la présente invention est précisément d'offir un modèle couvrant les deux grandes phases de la morphogénèse vasculaire, la vasculogénèse, c'est à dire la formation de néo-vaisseaux à partir de cellules indifférenciées, et l'angiogénèse, c'est à dire l'extension vasculaire à partir de néo-vaisseaux préformés. Un but supplémentaire de la présente invention, qui n'est réalisé par aucun des modèles de l'art antérieur, est de pouvoir distinguer aisément, la multiplication cellulaire, la migration avec envahissement du tissu avoisinant, la tubulisation avec formation d'une lumière interne, le bourgeonnement avec formation de structures secondaires. The aim of the present invention is precisely to provide a model covering the two main phases of vascular morphogenesis, vasculogenesis, that is to say the formation of neo-vessels from undifferentiated cells, and angiogenesis, it i.e. vascular extension from preformed neo-vessels. An additional object of the present invention, which is not achieved by any of the models of the prior art, is to be able to easily distinguish, cell multiplication, migration with invasion of the surrounding tissue, tubing with formation of an internal lumen , budding with the formation of secondary structures.
Ces buts sont atteints grâce à un procédé de culture de cellules à potentiel angiogénique, général, simple d'emploi et reproductible, permettant d'induire la morphogénèse vasculaire desdites cellules, comprenant les étapes consistant à
- (a) obtenir une préparation cellulaire contenant des cellules à potentiel angiogénique;
- (b) mettre en contact ces cellules avec un gel de collagène comprenant du collagène de type III ou constitué exclusivement de collagène de type III, en présence d'un milieu de culture adapté auxdites cellules;
- (c) laisser les cellules se développer dans le gel de collagène pendant une durée suffisante pour permettre la morphogénèse vasculaire.These aims are achieved by a method of culturing cells with angiogenic potential, general, simple to use and reproducible, making it possible to induce the vascular morphogenesis of said cells, comprising the steps consisting in
- (a) obtain a cell preparation containing cells with angiogenic potential;
- (b) bringing these cells into contact with a collagen gel comprising type III collagen or consisting exclusively of type III collagen, in the presence of a culture medium suitable for said cells;
- (c) allow the cells to develop in the collagen gel for a sufficient time to allow the vascular morphogenesis.
Le gel de collagène mis en oeuvre à l'étape (b) est constitué de collagène des types I et III; selon une forme de réalisation préférée, il comprend entre environ 15 et 100 %, et avantageusement entre 30 et 100 %, de collagène de type III. The collagen gel used in step (b) consists of types I and III collagen; according to a preferred embodiment, it comprises between approximately 15 and 100%, and advantageously between 30 and 100%, of type III collagen.
La préparation de gels de collagène de ces types sont notamment décrit dans les demandes de brevet européen publiées sous les numéros 214 035, 242 270, 667 332. D'autres collagènes de ces types sont disponibles commercialement. The preparation of collagen gels of these types is described in particular in the European patent applications published under the numbers 214 035, 242 270, 667 332. Other collagens of these types are commercially available.
Il peut s'agir de collagènes humains ou origine animale, obtenus de placenta. It can be human or animal collagens, obtained from placenta.
Les cellules à potentiel angiogénique envisagées dans le cadre de l'invention sont plus particulièrement choisies parmi des cellules d'une lignée de cellules souches embryonnaires de mammifère, des cellules de tératocarcinome, des cellules tumorales, ou tout autre type de cellules présentant un potentiel angiogénique comme des cellules ayant acquis par modification génétique ce potentiel angiogénique. The cells with angiogenic potential envisaged in the context of the invention are more particularly chosen from cells of a line of embryonic mammalian stem cells, teratocarcinoma cells, tumor cells, or any other type of cells having angiogenic potential. as cells that have acquired this angiogenic potential by genetic modification.
A titre d'exemple spécifique de cellules d'une lignée de cellules souches embryonnaires de mammifère, on peut citer des cellules ES de souris, telle que la lignée D3 dérivée de blastocystes de souris (ATCC
CRL 1934).By way of specific example of cells of a mammalian embryonic stem cell line, mention may be made of mouse ES cells, such as the D3 line derived from mouse blastocysts (ATCC
CRL 1934).
Indépendamment du milieu de culture adapté aux cellules cultivée de l'étape (b) et qui est un milieu classique que l'homme du métier est à même de déterminer selon la nature des cellules mises en oeuvre, la
Demanderesse a observé que l'adjonction à ladite étape (b) d'un ou plusieurs facteurs de croissance, par exemple incorporés au gel de collagène, et plus particulièrement de FGF (fibroblast growth factor) et surtout de VEGF (vascular endothlial growth factor) ou d'un mélange de FGF et de VEGF, permet de doubler environ le nombre de corps embryonnaires, de favoriser et d'accélérer la formation des structures tubulaires.Independently of the culture medium adapted to the cells cultivated in step (b) and which is a conventional medium that the skilled person is able to determine according to the nature of the cells used, the
The Applicant has observed that the addition to said step (b) of one or more growth factors, for example incorporated into the collagen gel, and more particularly of FGF (fibroblast growth factor) and especially of VEGF (vascular endothlial growth factor) or a mixture of FGF and VEGF, makes it possible to approximately double the number of embryonic bodies, to promote and accelerate the formation of tubular structures.
Le procédé de l'invention défini ci-dessus permet d'induire chez des cellules à potentiel angiogénique un effet cellulaire surprenant, en effet, si le potentiel vasculaire des corps embryonnaires était connu, la révélation de l'expression in vitro de ce potentiel de différenciation est remarquable. Ce procédé permet de disposer d'un nouveau modèle de morphogénèse vasculaire assurant l'exploration distincte au cours de l'étape (c) lors d'une même expérimentation des deux phases représentatives de la morphogénèse vasculaire
- la formation de troncs initiaux à partir de corps embryonnaires, laquelle est le reflet de la vasculogénèse,
- la formation de tubules secondaires au niveau des fourches de division des tubules primaires, laquelle est le reflet d'un bourgeonnement caractéristique de l'angiogénèse.The process of the invention defined above makes it possible to induce in cells with angiogenic potential a surprising cellular effect, in fact, if the vascular potential of the embryonic bodies was known, the revelation of the expression in vitro of this potential of differentiation is remarkable. This process makes it possible to have a new model of vascular morphogenesis ensuring distinct exploration during step (c) during the same experiment of the two representative phases of vascular morphogenesis.
- the formation of initial trunks from embryonic bodies, which is a reflection of vasculogenesis,
- the formation of secondary tubules at the level of the division forks of the primary tubules, which is the reflection of a budding characteristic of angiogenesis.
L'invention concerne donc aussi un modèle in vitro de morphogénèse vasculaire, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules à potentiel angiogénique incluses dans un gel de collagène comprenant du collagène de type
III ou constitué exclusivement de collagène de type III, dans un milieu de culture adapté auxdites cellules. Ce gel de collagène est avantageusement constitué de collagène des types I et III d'origine placentaire, et selon une forme de réalisation préférée, il comprend entre environ 5 et 100 % de collagène de type III.The invention therefore also relates to an in vitro model of vascular morphogenesis, characterized in that it comprises cells with angiogenic potential included in a collagen gel comprising collagen of the type
III or consisting exclusively of type III collagen, in a culture medium adapted to said cells. This collagen gel is advantageously made up of collagen types I and III of placental origin, and according to a preferred embodiment, it comprises between approximately 5 and 100% of collagen type III.
Selon une forme de réalisation particulière, et indépendamment du milieu de culture adapté aux cellules, le modèle de l'invention comprend également un ou plusieurs facteurs de croissance. Des facteurs de croissances préférés sont le FGF mais surtout le VEGF, ou un mélange de FGF et de VEGF. According to a particular embodiment, and independently of the culture medium adapted to the cells, the model of the invention also comprises one or more growth factors. Preferred growth factors are FGF but especially VEGF, or a mixture of FGF and VEGF.
Conformément au procédé défini précédemment, on préfère, dans le modèle de l'invention, que
- le gel de collagène soit constitué de collagène des types I et III, et dans ce cas comprenne entre environ 15 et 100 %, et avantageusement entre 30 et 100%, de collagène de type III.According to the method defined above, it is preferred, in the model of the invention, that
- The collagen gel consists of collagen types I and III, and in this case comprises between approximately 15 and 100%, and advantageously between 30 and 100%, of collagen type III.
- les cellules à potentiel angiogénique soient choisies parmi des cellules d'une lignée de cellules souches embryonaires de mammifère, des cellules de tératocarcinome, des cellules tumorales, ou tout autre type de cellules présentant un potentiel angiogénique comme des cellules ayant acquis par modification génétique ce potentiel angiogénique. A titre d'exemple spécifique de cellules d'une lignée de cellules souches embryonaires de mammifère, on peut citer des cellules ES de souris, telle que la lignée D3 dérivée de blastocystes de souris (ATCC
CRL 1934).the cells with angiogenic potential are chosen from cells of a line of embryonic mammalian stem cells, teratocarcinoma cells, tumor cells, or any other type of cell having angiogenic potential such as cells which have been acquired by genetic modification, angiogenic potential. As a specific example of cells of a mammalian embryonic stem cell line, mention may be made of mouse ES cells, such as the D3 line derived from mouse blastocysts (ATCC
CRL 1934).
En raison de leur simplicité, le procédé de l'invention et le modèle qui y est associé, précédemment décrits, sont particulièrement adaptés au criblage industriel de médicament sur la base de leurs propriétés pro ou anti vasculaires. En outre1 ils donnent la possibilité d'étudier le développement vasculaire, mais également les dysfonctionnements vasculaires, en utilisant par exemple des anticorps neutralisants ou des sondes oligonucléotidiques anti-sens. Because of their simplicity, the method of the invention and the model associated with it, described above, are particularly suitable for industrial screening of medicaments on the basis of their pro or anti vascular properties. In addition1 they give the possibility of studying vascular development, but also vascular dysfunctions, using for example neutralizing antibodies or antisense oligonucleotide probes.
En effet, la mise en oeuvre du procédé de l'invention avec des molécules, notamment dont l'activité est inconnue, permet de sélectionner celles qui présenteraient une propriété de modulation des phénomènes de vasculogénèse ou d'angiogénèse. De telles molécules auraient un intérêt pharmacologique majeur dans de multiples pathologies tant humaines que animales impliquant un dysfonctionnement vasculaire, comme des complications dégénératives du diabète, des rhumatismes inflammatoires articulaires, la progression tumorale et métastatique. Indeed, the implementation of the process of the invention with molecules, in particular whose activity is unknown, makes it possible to select those which would have a property of modulation of the phenomena of vasculogenesis or angiogenesis. Such molecules would be of major pharmacological interest in multiple pathologies, both human and animal, involving vascular dysfunction, such as degenerative complications of diabetes, inflammatory joint rheumatism, tumor and metastatic progression.
En conséquence, l'invention concerne aussi un procédé de criblage de substances susceptibles de favoriser ou inhiber la morphogénèse vasculaire mettant en oeuvre un procédé de culture de cellules à potentiel angiogénique décrit précédemment, caractérisé en ce que l'on introduit la substance à tester à l'une au moins des étapes (a) à (c) de ce procédé, et en ce que l'on mesure par tout moyen approprié la présence ou l'absence de morphogénèse vasculaire. Consequently, the invention also relates to a method for screening for substances capable of promoting or inhibiting vascular morphogenesis using a method for culturing cells with angiogenic potential described above, characterized in that the test substance to be tested is introduced. at least one of steps (a) to (c) of this process, and in that the presence or absence of vascular morphogenesis is measured by any suitable means.
La mise en oeuvre de ce procédé de criblage peut être avantageusement réalisée grâce à une trousse comprenant au moins un compartiment protégé renfermant un modèle de l'invention décrit précédemment, ou une ou plusieurs séries de compartiments protégés, chaque série comprenant un compartiment renfermant un gel de collagène et au moins un des compartiments suivants
- un compartiment renfermant des cellules à potentiel angiogénique,
- un compartiment renfermant un milieu de culture adaptée auxdites cellules;
- un compartiment renfermant un ou plusieurs facteurs de croissance.The implementation of this screening method can be advantageously carried out using a kit comprising at least one protected compartment containing a model of the invention described above, or one or more series of protected compartments, each series comprising a compartment containing a gel collagen and at least one of the following compartments
- a compartment containing cells with angiogenic potential,
- A compartment containing a culture medium adapted to said cells;
- a compartment containing one or more growth factors.
Outre, l'application du procédé de l'invention au criblage de drogues, celui trouve des applications dans le domaine du diagnostic, chez l'homme ou l'animal, du potentiel métastatique d'une tumeur et de pathologies à composante vasculaire. In addition, the application of the method of the invention to drug screening, that finds applications in the field of diagnosis, in humans or animals, of the metastatic potential of a tumor and of pathologies with a vascular component.
En effet, la vascularisation d'une tumeur est souvent corrélée à son potentiel métastasique. En conséquence, la mesure du potentiel angiogénique selon le procédé de l'invention permet de pronostiquer la gravité de la tumeur. En cancérologie clinique, l'établissement d'un pronostic de gravité d'une tumeur maligne solide pourrait être alors amélioré par la prise en compte du pouvoir angiogénique de la tumeur. Actuellement des tests cytologiques sont réalisés pour mesurer le développement du réseau vasculaire intra-tumoral mais aucun test fonctionnel n existe. In fact, the vascular supply of a tumor is often correlated with its metastatic potential. Consequently, the measurement of the angiogenic potential according to the method of the invention makes it possible to predict the severity of the tumor. In clinical oncology, establishing a prognosis for the severity of a solid malignant tumor could then be improved by taking into account the angiogenic power of the tumor. Currently cytological tests are performed to measure the development of the intra-tumor vascular network but no functional test exists.
L'invention concerne donc aussi un procédé de diagnostic du potentiel métastatique d'une tumeur chez un patient mettant en oeuvre un procédé de culture de cellules à potentiel angiogénique décrit précédemment, caractérisé en ce que les cellules à potentiel angiogénique incluses dans le gel de collagène sont des cellules tumorales prélevées chez ledit patient. The invention therefore also relates to a method for diagnosing the metastatic potential of a tumor in a patient using a method for culturing cells with angiogenic potential described above, characterized in that the cells with angiogenic potential included in the collagen gel are tumor cells taken from said patient.
La mise en oeuvre de ce procédé diagnostic du potentiel métastasique d'une tumeur peut être avantageusement réalisée grâce à une trousse comprenant une ou plusieurs séries de compartiments protégés, chaque série comprenant un compartiment renfermant un gel de collagène et au moins un des compartiments suivants
- un compartiment renfermant un milieu de culture adaptée auxdites cellules;
- un compartiment renfermant un ou plusieurs facteurs de croissance;
- un compartiment dans lequel seront placées des cellules tumorales prélevées chez ledit patient.The implementation of this method for diagnosing the metastatic potential of a tumor can be advantageously carried out using a kit comprising one or more series of protected compartments, each series comprising a compartment containing a collagen gel and at least one of the following compartments
- A compartment containing a culture medium adapted to said cells;
- a compartment containing one or more growth factors;
- a compartment in which tumor cells taken from said patient will be placed.
Les pathologies à composante vasculaire, telles que des diabètes, des rhumatismes, l'endométriose et des cancers engendrent la présence dans les fluides biologiques de facteurs angiogéniques, comme le FGF ou le
VEGF, susceptibles de constituer des marqueurs du développement de la maladie. L'invention concerne donc encore un procédé de diagnostic d'une pathologie à composante vasculaire chez un patient mettant en oeuvre un procédé de culture de cellules à potentiel angiogénique décrit précédemment, caractérisé en ce qu'à l'une au moins des étapes (a) à (c), on ajoute un échantillon biologique prélevé dudit patient et susceptible de contenir des facteurs angiogéniques capables de favoriser la morphogénèse vasculaire. Les échantillons biologiques sur lesquels peuvent être pratiqués ce diagnostic sont notamment le sérum, l'urine, le liquide céphalo-rachidien, le plasma, etc...Pathologies with a vascular component, such as diabetes, rheumatism, endometriosis and cancers cause the presence in biological fluids of angiogenic factors, such as FGF or
VEGF, which may constitute markers for the development of the disease. The invention therefore also relates to a method for diagnosing a pathology with a vascular component in a patient using a method for culturing cells with angiogenic potential described above, characterized in that in at least one of the steps (a ) to (c), a biological sample taken from said patient and likely to contain angiogenic factors capable of promoting vascular morphogenesis is added. The biological samples on which this diagnosis can be performed are in particular serum, urine, cerebrospinal fluid, plasma, etc.
La mise en oeuvre de ce procédé de diagnostic de pathologies à composante vasculaire chez un patient peut être avantageusement réalisée grâce à une trousse comprenant au moins un compartiment protégé renfermant un modèle de l'invention décrit précédemment, ou une ou plusieurs séries de compartiments protégés, chaque série comprenant un compartiment renfermant un gel de collagène, et au moins un des compartiments suivants
- un compartiment renfermant des cellules à potentiel angiogénique,
- un compartiment renfermant un milieu de culture adaptée auxdites cellules;
- un compartiment dans lequel sera placée un échantillon biologique prélevé dudit patient.The implementation of this method of diagnosing pathologies with a vascular component in a patient can be advantageously carried out using a kit comprising at least one protected compartment containing a model of the invention described above, or one or more series of protected compartments, each series comprising a compartment containing a collagen gel, and at least one of the following compartments
- a compartment containing cells with angiogenic potential,
- A compartment containing a culture medium adapted to said cells;
- a compartment in which a biological sample taken from said patient will be placed.
Outre des applications au criblage de drogue et au diagnostic, le procédé de culture de cellules à potentiel angiogénique de l'invention, permet de préparer un biomatériau à base de collagène dans lequel sont incluses, selon le stade de l'étape (c), des cellules, soit à potentiel angiogénique, soit ayant plus ou moins déjà induit une différenciation vasculaire. L'invention se rapporte donc aussi à un biomatériau cellularisé constitué d'un gel de collagène comprenant du collagène de type III ou constitué exclusivement de collagène de type III, dans lequel sont incluses des cellules à potentiel angiogénique ou des cellules ayant plus ou moins induit une différenciation vasculaire. Le biomatériau précédent peut en outre comprendre ou être imprégné d'un milieu de culture adapté aux cellules incorporées dans le gel de collagène. Avantageusement, le gel de collagène entrant dans la composition de ce biomatériau, est constitué de collagène des types I et III, et selon une forme de réalisation préférée, il comprend entre environ 15 et 100 % et avantageusement entre 30 et 100 %, de collagène de type III. Il peut s'agir de collagènes humains ou d'origine animale, obtenus de placenta. In addition to applications in drug screening and in diagnosis, the method of culturing cells with angiogenic potential of the invention makes it possible to prepare a collagen-based biomaterial in which are included, depending on the stage of step (c), cells, either with angiogenic potential, or having more or less already induced vascular differentiation. The invention therefore also relates to a cellularized biomaterial consisting of a collagen gel comprising type III collagen or consisting exclusively of type III collagen, in which are included cells with angiogenic potential or cells having more or less induced vascular differentiation. The above biomaterial can also comprise or be impregnated with a culture medium suitable for the cells incorporated in the collagen gel. Advantageously, the collagen gel used in the composition of this biomaterial, consists of collagen types I and III, and according to a preferred embodiment, it comprises between approximately 15 and 100% and advantageously between 30 and 100%, collagen type III. It can be human or animal collagens, obtained from placenta.
Les cellules entrant dans la composition de ce biomatériau peuvent, en outre, avoir été, préalablement à leur inclusion dans le gel de collagène, génétiquement modifiées pour produire des principes actifs thérapeutiques, comme des facteurs de croissance. The cells used in the composition of this biomaterial may, moreover, have been, prior to their inclusion in the collagen gel, genetically modified to produce therapeutic active principles, such as growth factors.
Ce biomatériau peut encore conformément au procédé de l'invention être imprégné d'au moins un facteur de croissance, tel que le VEGF et/ou le FGF.. This biomaterial can also, according to the method of the invention, be impregnated with at least one growth factor, such as VEGF and / or FGF.
Un biomatériau conforme à l'invention est utile comme implant cellularisé pour remplacer ou compenser la vascularisation défectieuse d'un organe, ou encore dans une stratégie de thérapie cellulaire, pour permettre la production in vivo d'un principe actif thérapeutique. A biomaterial in accordance with the invention is useful as a cellular implant to replace or compensate for the defective vascularization of an organ, or even in a cell therapy strategy, to allow the in vivo production of a therapeutic active principle.
Une application de l'invention, proche de la précédente, consiste à mettre en oeuvre dans un organisme, à titre d'implant colonisable par des cellules, un biomatériau constitué d'un gel de collagène comprenant du collagène de type III ou constitué exclusivement de collagène de type III, imprégné d'au moins un facteur de croissance, de préférence choisi parmi le FGF et le VEGF. An application of the invention, close to the previous one, consists in using in a body, as an implant colonizable by cells, a biomaterial consisting of a collagen gel comprising type III collagen or consisting exclusively of type III collagen, impregnated with at least one growth factor, preferably chosen from FGF and VEGF.
Comme pour le biomatériau précédemment, il comprend, selon une forme de réalisation préférée, entre environ 15 et 100 % et avantageusement entre 30 et 100 %, de collagène de type III. Il peut s'agir de collagènes humains ou d'origine animale, obtenus de placenta. Ce biomatériau est particulièrement utile comme implant colonisable in vivo, dans l'organisme d'un sujet humain ou animal, par des cellules dudit organisme. Ce biomatériau peut alors comprendre outre le gel de collagène et le(s) facteur(s) de croissance, un milieu adapté, voir sélectif, favorisant sa colonisation par un ou plusieur types cellulaires de l'organisme.As for the biomaterial previously, it comprises, according to a preferred embodiment, between approximately 15 and 100% and advantageously between 30 and 100%, of type III collagen. It can be human or animal collagens, obtained from placenta. This biomaterial is particularly useful as an implant that can be colonized in vivo, in the organism of a human or animal subject, by cells of said organism. This biomaterial can then comprise, in addition to the collagen gel and the growth factor (s), a suitable, or even selective, medium, promoting its colonization by one or more cell types of the organism.
D'autres avantages et caractéristiques de
l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui
suivent donnés à titre non limitatifs et se référant aux
dessins en annexe, dans lesquels les figures 1 et 2
représentent des photos, en microscopie inversée, de
corps embryonnaires vascularisés obtenus avec le procédé
de l'invention.Other advantages and characteristics of
the invention will appear on reading the examples which
follow given without limitation and referring to
annexed drawings, in which Figures 1 and 2
represent photos, in reverse microscopy, of
vascularized embryonic bodies obtained with the process
of the invention.
I - Culture de cellules ES indifférenciées. I - Culture of undifferentiated ES cells.
Les cellules ES de la lignée D3 dérivée de blastocystes de souris (ATCC CRL 1934) sont cultivées dans des boîtes de culture 100 mm (Costar, Cambridge, Ma, USA, réf. 3100) recouvertes de gélatine 0,2 % (Sigma, Saint
Louis, Mi, USA M17353)
Le milieu de culture est constitué de milieu "Dubelco Modified Eagle's Medium (DMEM) High Glucose (Gibco 41965-039) additionné de 15 % de sérum de veau foetal (FCS, Gibco, Grand Island, NY, USA), de pyruvate de sodium 1 mM (Gibco 1136-039), d'acides aminés non essentiels 0,1 mM (Gibco 11140-035), de L-Glutamine 2 mM (Gibco 25030-032), de mono-thio-glycérol 150 mM (Sigma,
Saint Louis, Mi, USA M17353) et d'un mélange de pénicilline-streptomycine 100 Zg/ml (Gibco 15140-030).ES cells of the D3 line derived from mouse blastocysts (ATCC CRL 1934) are cultured in 100 mm culture dishes (Costar, Cambridge, Ma, USA, ref. 3100) coated with 0.2% gelatin (Sigma, Saint
Louis, Mi, USA M17353)
The culture medium consists of “Dubelco Modified Eagle's Medium (DMEM) High Glucose (Gibco 41965-039) medium supplemented with 15% fetal calf serum (FCS, Gibco, Grand Island, NY, USA), sodium pyruvate 1 mM (Gibco 1136-039), non-essential amino acids 0.1 mM (Gibco 11140-035), L-Glutamine 2 mM (Gibco 25030-032), 150 mM mono-thio-glycerol (Sigma,
Saint Louis, Mi, USA M17353) and a mixture of penicillin-streptomycin 100 Zg / ml (Gibco 15140-030).
Les cellules sont maintenues sous forme indifférenciées par ajout de LIF recombinant humain (leukemia inhibiting factor) 1000 u/ml (Schmitt, R., M. The cells are maintained in undifferentiated form by adding human recombinant LIF (leukemia inhibiting factor) 1000 u / ml (Schmitt, R., M.
Bruyns, H. R. Snodgrass, "Hematopoetic development of embryonic stem cells in vitro : cytokin and receptor gene expression". Genes Dev., 1991, 5, 728-740). Le milieu de culture additionné de LIF est renouvelé tous les jours.Bruyns, H. R. Snodgrass, "Hematopoetic development of embryonic stem cells in vitro: cytokin and receptor gene expression". Genes Dev., 1991, 5, 728-740). The culture medium supplemented with LIF is renewed every day.
Sous ces conditions, 95% de la population de cellules ES est dans un état indifférencié clairement visible en microscopie à contraste de phase. Un stock de plusieurs dizaines de cryotubes contenant 5 millions de cellules ES provenant du même passage a été préparé à l'avance. Under these conditions, 95% of the population of ES cells is in an undifferentiated state clearly visible in phase contrast microscopy. A stock of several dozen cryotubes containing 5 million ES cells from the same passage was prepared in advance.
Ce protocole expérimental permet bien entendu un grand nombre de variantes à la portée de l'homme du métier à partir de l'enseignement de cet exemple. Il est possible notamment de remplacer le LIF par tout autre inhibiteur de la différenciation, comme l'Oncostatin M. This experimental protocol naturally allows a large number of variants within the reach of the skilled person from the teaching of this example. It is possible in particular to replace the LIF with any other inhibitor of differentiation, such as Oncostatin M.
II - ExDériences de différenciation. II - Differentiation experiences.
Une ampoule de cellule D3 est décongelée puis mise en culture comme indiquée ci-dessus. Après deux jours de culture, les cellules sont subconfluentes. Elles sont alors décollées par une solution de trypsine 0,25 % (Gibco) dans du tampon salin (PBS) contenant 1 mM d'EDTA, puis ensemencées à raison de 5 mi lions de cellules par boîte durant 24 heures. Trois heures avant l'induction de la différenciation, le milieu contenant du LIF est renouvelé. A D3 cell ampoule is thawed and then cultured as indicated above. After two days of culture, the cells are subconfluent. They are then peeled off with a 0.25% trypsin solution (Gibco) in saline buffer (PBS) containing 1 mM EDTA, then seeded at the rate of 5 ml of cells per dish for 24 hours. Three hours before the induction of differentiation, the medium containing LIF is renewed.
Après trypsination, la différenciation est réalisée dans des boîtes de culture bactériologiques (35/10 mm) (Greiner, 627102). Sont mélangés par boîte
- 500 Rl d'une solution de collagène I+III préparé à partir de placenta humain (50 % de chacun des deux types de collagène),
- 250 Rl de milieu Iscove Medium Dulbecco
Modified (IMDM) deux fois concentré (Gibco 42200-014),
- 750 111 d'une solution de différenciation deux fois concentré (SD) contenant de la transferrine 300 mg (Boehringer Mannheim 652202), de lBinsuline 10 mg/ml (Boehringer 977420), du mono-thio-glycérol 450 mM, 15 % de sérum de veau foetal (FCS, Gibco, Grand
Island, NY, USA) dans de 1'ISCOVE Glutamax (Gibco 31980022)
- 50 Fl de suspension contenant au moins 500 cellules.After trypsination, the differentiation is carried out in bacteriological culture dishes (35/10 mm) (Greiner, 627102). Are mixed by box
- 500 Rl of a collagen I + III solution prepared from human placenta (50% of each of the two types of collagen),
- 250 Rl of Iscove Medium Dulbecco medium
Modified (IMDM) twice concentrated (Gibco 42200-014),
- 750 111 of a twice concentrated differentiation solution (SD) containing transferrin 300 mg (Boehringer Mannheim 652202), lBinsulin 10 mg / ml (Boehringer 977420), mono-thio-glycerol 450 mM, 15% of fetal calf serum (FCS, Gibco, Grand
Island, NY, USA) in ISCOVE Glutamax (Gibco 31980022)
- 50 μl of suspension containing at least 500 cells.
En contrôle, des inductions de différenciation sont réalisées en remplaçant la solution de collagène par de la méthyl-cellulose 1,1 % (Methocel high viscosity, Fluka A. G., Buchs, Suisse) selon la même technique. In control, differentiation inductions are carried out by replacing the collagen solution with 1.1% methyl cellulose (Methocel high viscosity, Fluka A. G., Buchs, Switzerland) according to the same technique.
Enfin, des essais sont également réalisés en utilisant comme support de culture, une solution de matrice Matrigel (EHS) (Collaborative Biomedical Product,
Becton Dickinson) utilisée diluée au 1/2, additionnée du milieu SD et d'une solution d'IMDM tous deux concentrés deux fois.Finally, tests are also carried out using, as culture support, a Matrigel matrix solution (EHS) (Collaborative Biomedical Product,
Becton Dickinson) used diluted 1/2, added with SD medium and an IMDM solution, both concentrated twice.
Pour certains essais, les cytokines seules ou en mélange suivantes ont été incorporées au milieu de culture
- VEGF recombinant humain à raison de 50 ng/ml (Pre protech 100-20),
- bFGF recombinant humain à raison de 100 ng/ml (R & D 233-FB-025).For certain tests, the following cytokines alone or as a mixture were incorporated into the culture medium
- human recombinant VEGF at a rate of 50 ng / ml (Pre protech 100-20),
- human recombinant bFGF at a rate of 100 ng / ml (R & D 233-FB-025).
Toutes les expériences rapportées ci-dessus ont été réalisées selon le même schéma, lequel constitue un exemple acceptant de nombreuses variantes à la portée de l'homme du métier à partir de l'enseignement de ce schéma. Notamment, des essais favorables ont été réalisés avec un gel de collagène constitué de collagène I+III comprenant 10 % de collagène III pour 90 % de collagène I. All the experiments reported above were carried out according to the same scheme, which constitutes an example accepting many variants within the reach of the skilled person from the teaching of this scheme. In particular, favorable tests have been carried out with a collagen gel consisting of collagen I + III comprising 10% of collagen III for 90% of collagen I.
Le collagène préféré est un collagène placentaire humain non dénaturé de type I+III préparé en solution à 3 mg/ml et dilué à 1 mg/ml en présence du milieu de culture qui élève son pH et le gélifie. Le gel ainsi obtenu en quelques heures est un gel semi-solide qui est facilement démoulable et séchable sur lame. La concentration en collagène doit bien entendu être adaptée pour disposer d'un gel ni trop liquide, ni trop solide ; à titre indicatif, la quantité de collagène peut être comprise entre 0,5 mg/ml et 20 mg/ml. The preferred collagen is an undenatured human placental collagen of type I + III prepared in solution at 3 mg / ml and diluted to 1 mg / ml in the presence of the culture medium which raises its pH and gels it. The gel thus obtained in a few hours is a semi-solid gel which is easily demouldable and dryable on a slide. The collagen concentration must of course be adapted in order to have a gel which is neither too liquid nor too solid; As an indication, the amount of collagen can be between 0.5 mg / ml and 20 mg / ml.
Les proportions de cellules par rapport à la quantité de collagène sont susceptibles d'admettre des variations par rapport au schéma rapporté ci-dessus. Des résultats concluant ont été obtenus avec des mélanges comprenant entre 500 à 1500 cellules pour environ 1,5 mg de collagène. The proportions of cells relative to the amount of collagen are likely to admit variations compared to the diagram reported above. Conclusive results have been obtained with mixtures comprising between 500 to 1500 cells for approximately 1.5 mg of collagen.
III - Quantification du phénomène observe. III - Quantification of the observed phenomenon.
Les boîtes sont observées quotidiennement au microscope inversé et photographiées. Des comptages peuvent être réalisés afin d'évaluer le nombre de corps embryonnaires
- ne présentant pas de structure vasculaire (CO),
- présentant une ou plusieurs structures tubulaires inférieures à son diamètre (C+),
- présentant un ensemble de tubules de longueur supérieure ou égale à son diamètre (C++).The boxes are observed daily under an inverted microscope and photographed. Counts can be made to assess the number of embryonic bodies
- not having a vascular structure (CO),
- having one or more tubular structures smaller than its diameter (C +),
- presenting a set of tubules of length greater than or equal to its diameter (C ++).
Un pourcentage de vascularisation est ensuite obtenu en calculant le rapport : (C+)+(C++) / nombre total de corps embryonnaires par boîte. A percentage of vascularization is then obtained by calculating the ratio: (C +) + (C ++) / total number of embryonic bodies per dish.
IV - Coloration et immunofluorescence indirecte. IV - Staining and indirect immunofluorescence.
Occasionnellement, les gels sont séchés sur lame selon la méthode initialement décrite (Lanotte, M., "Terminal differentiation of hematopoietic cell clones cultured in tridimesional collagen matrix : in situ cell morphology and enzyme histochemistry analysis". Biol. Occasionally, the gels are dried on a slide according to the method initially described (Lanotte, M., "Terminal differentiation of hematopoietic cell clones cultured in tridimesional collagen matrix: in situ cell morphology and enzyme histochemistry analysis". Biol.
Cil., 1984, 50, 107-120), puis colorés au May Grünewald
Giemsa (Biolyon, Unipath, Dardilly, France 09262 et 09766) selon les recommandations du fournisseur.Cil., 1984, 50, 107-120), then colored with May Grünewald
Giemsa (Biolyon, Unipath, Dardilly, France 09262 and 09766) according to the supplier's recommendations.
Les gels séchés peuvent également être fixés par une solution de paraformaldéhyde 3 % préparée dans du tampon phosphate salin (PBS) afin de permettre la réalisation d'un test d'immunofluorescence indirecte. Les lames sont ensuite mises en contact à 37 OC durant une heure avec un anticorps monoclonal de rat dirigé contre une molécule marqueur des cellules vasculaires (PECAM pour
Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule, ou Facteur von Willebrand) (Risau, W., "Differentiation of the endothelium". Faseb J., 1995, 6-933). Après plusieurs lavages effectués en PBS, les lames sont incubées 30 minutes avec une solution contenant des fragments F(ab')2 de sérum de chèvre dirigé contre les immunoglobulines G de rat diluée au 1/100 (Jackson ImmunoResearch, Immunotech,
France) dans du PBS. Deux derniers lavages en PBS permettent l'observation des lames au microscope à fluorescence.The dried gels can also be fixed with a 3% paraformaldehyde solution prepared in phosphate buffered saline (PBS) in order to allow the performance of an indirect immunofluorescence test. The slides are then brought into contact at 37 ° C. for one hour with a rat monoclonal antibody directed against a marker molecule of the vascular cells (PECAM for
Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule, or Factor von Willebrand) (Risau, W., "Differentiation of the endothelium". Faseb J., 1995, 6-933). After several washes carried out in PBS, the slides are incubated for 30 minutes with a solution containing fragments F (ab ') 2 of goat serum directed against rat immunoglobulins G diluted to 1/100 (Jackson ImmunoResearch, Immunotech,
France) in PBS. Two last washes in PBS allow observation of the slides under a fluorescence microscope.
V - Résultats. V - Results.
La matrice Matrigel (EHS) additionnée ou non de facteurs de croissance ne permet pas l'obtention de corps embryonnaires (CE). En effet, les cellules ES ne s'associent pas en amas constitués de quelques cellules et ne forment pas de structures plus importantes. Elles ne peuvent pas être observées au microscope et doivent certainement mourir très rapidement. The Matrigel matrix (EHS) with or without the addition of growth factors does not allow the production of embryonic bodies (EC). In fact, ES cells do not associate in clusters made up of a few cells and do not form larger structures. They cannot be observed under a microscope and must certainly die very quickly.
La méthyl-cellulose additionnée ou non de facteurs de croissance permet la formation de CE en quelques jours. AU bout de trois jours, des amas cellulaires sont observés. Ces amas grossissent jusqu'à être visibles à l'oeil nu au bout de cinq jours. Les CE ainsi obtenus peuvent présenter des morphologies différentes selon qu'ils sont ou non entourés d'une coque cellulaire. Mais aucune structure vasculaire extérieure n'est observée avec ce support de culture. Ces résultats sont à rapprocher de plusieurs travaux antérieurs décrivant des canaux vasculaires confinés à l'intérieur des CE (Wang, R., R. Clark., V. L. Bautch, "Embryonnic stem cell-derived cystic embryoïd bodies from vascular channels : an in vitro model of blood vessel development", Development 1992, 114, 303-316 ; Doetschman, T., A. Kier,
J. D. Coffin, "Embryonic stem cells model systems for vasculogenesis and cardiac disorders". Hypertension, 1993, 22, 618-629). L'adjonction de facteurs de croissance permet de doubler le nombre de CE obtenus à partir de 1500 cellules ES indifférenciées (obtention de 50 CE au minimum par boïte en présence de facteurs de croissance). Methyl cellulose, with or without added growth factors, allows the formation of CE in a few days. After three days, cell clusters are observed. These clumps grow until they are visible to the naked eye after five days. The CE thus obtained can have different morphologies depending on whether or not they are surrounded by a cell shell. However, no external vascular structure is observed with this culture support. These results are to be compared to several previous works describing vascular channels confined inside the EC (Wang, R., R. Clark., VL Bautch, "Embryonnic stem cell-derived cystic embryoid bodies from vascular channels: an in vitro model of blood vessel development ", Development 1992, 114, 303-316; Doetschman, T., A. Kier,
JD Coffin, "Embryonic stem cells model systems for vasculogenesis and cardiac disorders". Hypertension, 1993, 22, 618-629). The addition of growth factors makes it possible to double the number of CEs obtained from 1500 undifferentiated ES cells (obtaining at least 50 CEs per box in the presence of growth factors).
De manière remarquable, le procédé de l'invention mettant en oeuvre un support de gel de collagène I+III permet la formation de CE présentant des structures tubulaires rayonnantes. Remarkably, the process of the invention using a collagen I + III gel support allows the formation of CEs having radiant tubular structures.
Les cellules ES indifférenciées incorporées à l'intérieur du gel de collagène I+III contenant la solution SD présentent le même aspect qu'en présence de méthyl cellulose durant les premiers jours de la culture. The undifferentiated ES cells incorporated into the collagen I + III gel containing the SD solution have the same appearance as in the presence of methyl cellulose during the first days of culture.
Mais, entre J5 et J8, les CE formés (une trentaine par boîte au minimum) voient leur taille augmenter. Au cours des jours suivants, certains d'entre eux présentent des structures tubulaires rayonnantes dont la longueur est la plupart du temps inférieure au diamètre du CE considéré.But, between D5 and D8, the CEs trained (at least thirty per box) see their size increase. During the following days, some of them present radiant tubular structures whose length is mostly less than the diameter of the CE in question.
Le pourcentage de vascularisation peut néanmoins atteindre 50 %. Ces structures tubulaires ne sont pas révélées en immunofluorescence par des anticorps monoclonaux dirigés contre des molécules marqueurs des cellules d'origine vasculaire.The percentage of vascularization can nevertheless reach 50%. These tubular structures are not revealed in immunofluorescence by monoclonal antibodies directed against marker molecules of cells of vascular origin.
L'addition de VEGF et de FGF favorise et accélère la différenciation des cellules ES en cellules endothéliales. Ainsi, lorsque du FGF, du VEGF ou un mélange de ceux-ci est incorporé au gel de collagène, des structures tubulaires commencent à se former dès j6. Le calcul du pourcentage de vascularisation a permis de montrer
- qu'il existe bien un décalage d'apparition des structures tubulaires sans facteur de croissance par rapport aux conditions avec des facteurs de croissance,
- que le FGF et surtout le VEGF introduits individuellement sont suffisants à induire une tubulisation,
- que le FGF et le VEGF agissent en synergie puisque la condition réunissant ces deux facteurs donne les meilleurs résultats (75 % de vascularisation à J10). The addition of VEGF and FGF promotes and accelerates the differentiation of ES cells into endothelial cells. Thus, when FGF, VEGF or a mixture of these is incorporated into the collagen gel, tubular structures begin to form from day 6. The calculation of the percentage of vascularization allowed to show
- that there is a lag in the appearance of tubular structures without growth factor compared to the conditions with growth factors,
- that the FGF and especially the VEGF introduced individually are sufficient to induce tubulation,
- that FGF and VEGF act in synergy since the condition combining these two factors gives the best results (75% of vascularization on D10).
Les expériences d'immunofluorescence ont clairement démontré le caractère vasculaire des structures tubulaires obtenues en présence de VEGF. Ce facteur semble particulièrement efficace pour induire la différenciation des cellules ES en cellules endothéliales exprimant les molécules PECAM mais également le facteur von Willebrand qui est un marqueur tardif de la différenciation endothéliale. Immunofluorescence experiments clearly demonstrated the vascular character of the tubular structures obtained in the presence of VEGF. This factor seems particularly effective for inducing the differentiation of ES cells into endothelial cells expressing PECAM molecules but also the von Willebrand factor which is a late marker of endothelial differentiation.
La photo de la figure 1 représente, en microscopie inversée, différents types de corps embryonnaires obtenus à J10 dans un gel de collagène supplémenté par du VEGF et du FGF. On observe sur cette photo, de la gauche vers le droite : un CE non vascularisé, un CE entouré de cellules ayant migré dans le gel, enfin un CE fortement vascularisé, c'est à dire, dont la longueur des tubules est supérieure au diamètre du corps et présentant des branchements secondaires, témoignant du processus d'angiogénèse. The photo of FIG. 1 represents, in reverse microscopy, different types of embryonic bodies obtained on D10 in a collagen gel supplemented with VEGF and FGF. We can see in this photo, from left to right: a non-vascularized CE, a CE surrounded by cells that have migrated into the gel, finally a highly vascularized CE, that is to say, whose tubule length is greater than the diameter of the body and with secondary branches, testifying to the process of angiogenesis.
La photo de la figure 2 représente, en microscopie inversée, un CE fortement vascularisé (branchements tertaires) avec présence de nombreuses cellules intra-tubulaires probablement d'origine hématopoïétique. The photo in FIG. 2 represents, in inverted microscopy, a highly vascularized CE (tertiary connections) with the presence of numerous intra-tubular cells probably of hematopoietic origin.
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