FR2736832A1

FR2736832A1 - INTERFERON-GAMMA POTENTIALIZING AGENT

Info

Publication number: FR2736832A1
Application number: FR9508723A
Authority: FR
Inventors: Jacob Hugues Lortat
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut Pasteur de Lyon
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut Pasteur de Lyon
Priority date: 1995-07-19
Filing date: 1995-07-19
Publication date: 1997-01-24
Anticipated expiration: 2015-07-19
Also published as: WO1997003700A3; FR2736832B1; WO1997003700A2

Abstract

The use of a modulating agent including a grouping of formula A-X-B for preparing a gamma -interferon activity modulating drug is disclosed. In said formula, each of A and B is independently an oligosaccharide group with a sufficient anionic charge such that said oligosaccharide group has an affinity for a portion of the human gamma -interferon C-terminal containing peptide sequence 125-131, and X is a spacer arm long enough to enable each of groups A and B to bind to one of said gamma -interferon homodimer C-terminal peptide sequences. Said modulating agent is particularly useful for delaying the decomposition of gamma -interferon, promoting the activation thereof and enabling it to have systemic and not just local activity. Said agent is also useful for modifying or inhibiting the local action of endogenous gamma -interferon.

Description

L'invention a pour objet un agent potentialisateur de l'interféron-y
L'interféron-y est une cytokine qui joue un rôle très important dans la réponse immunitaire.The subject of the invention is a potentiator of interferon-y.
Interferon-y is a cytokine that plays a very important role in the immune response.

On sait que l'interféron-y intervient dans la régulation de l'induction des lymphocytes T cytotoxiques, augmente l'activité des cellules tueuses NK, favorise la fonction de présentation des antigènes par les macrophages, et qu'il est utilisé notamment comme médicament anti-tumeur et anti-viral.It is known that interferon-y intervenes in the regulation of the induction of cytotoxic T lymphocytes, increases the activity of killer NK cells, promotes the function of presentation of antigens by macrophages, and that it is used in particular as a medicament anti-tumor and anti-viral.

La mise au point d'une thérapeutique basée sur l'utilisation de l'interféron-y pose toutefois des problèmes techniques difficiles en raison notamment de sa courte durée de demi-vie in vivo et de son action essentiellement locale, ce qui nécessite la mise au point de modes d'administration particuliers ; voir par exemple Yoshihiko Watanabe et al., P.N.A.S. USA, 86, 9456-9460 (1989); J. du Plessis et al., Antiviral Research, 18 259-265 (1992); et C. Boutin et al., Cancer, 74, 2460-2467 (1994). The development of a therapy based on the use of interferon-y, however, poses difficult technical problems due in particular to its short half-life in vivo and its essentially local action, which requires the implementation to the point of particular modes of administration; see for example Yoshihiko Watanabe et al., P.N.A.S. USA, 86, 9456-9460 (1989); J. du Plessis et al., Antiviral Research, 18 259-265 (1992); & C. Boutin et al., Cancer, 74, 2460-2467 (1994).

On sait que I'interfëron-y se fixe sur la matrice extracellulaire du tissu conjonctif et plus particulièrement sur les protéoglycannes à héparane-sulfate. La partie C-terminale de l'interféron-y comprend une séquence peptidique 125-131, riche en motifs dérivés d'acides aminés basiques, qui intervient principalement dans l'affinité de liaison de l'interféron-y avec l'héparane-sulfate ; voir par exemple H. Lortat-Jacob et al., C.R. Acad. Sci., Paris, t.311, série III, 143-147 (1990); FEBS
Lett., 280, 152-154 (1991); et J. Clin. Invest., 87, 878-883 (1991). Il a en outre été suggéré que la fixation sur l'héparane-sulfate stabilise et active l'interféron-, et certaines hypothèses ont été faites pour tenter d'expliquer ces phénomènes , voir H. Lortat-Jacob et J.-A. Grimaud, Cell. Mol.It is known that the interferon-y binds to the extracellular matrix of the connective tissue and more particularly to the heparan-sulfate proteoglycans. The C-terminal part of interferon-y comprises a peptide sequence 125-131, rich in motifs derived from basic amino acids, which intervenes mainly in the binding affinity of interferon-y with heparan sulfate ; see for example H. Lortat-Jacob et al., CR Acad. Sci., Paris, t.311, series III, 143-147 (1990); FEBS
Lett., 280, 152-154 (1991); and J. Clin. Invest., 87, 878-883 (1991). It has also been suggested that binding to heparan sulfate stabilizes and activates interferon, and certain hypotheses have been made to try to explain these phenomena, see H. Lortat-Jacob and J.-A. Grimaud , Cell. Mol.

Biol., 37, 253-260 (1991).Biol., 37, 253-260 (1991).

Des tentatives d'identification des sites de l'héparane-sulfate responsables de l'affinité pour l'interféron-y ont été effectuées lors d'études préliminaires qui ont conduit à l'hypothèse que la liaison avec l'interféron-y se ferait par des groupes carboxylés et non par des groupes N-sulfatés qui sont présents dans un domaine de l'héparane-sulfate appelé "domaine de type héparine"; voir
H. Lortat-Jacob et J.-A. Grimaud, Biochimica et Biophysica Acta, 1117, 126-130 (1992).Attempts to identify the sites of heparan sulfate responsible for the affinity for interferon-y were carried out during preliminary studies which led to the hypothesis that the binding with interferon-y would be made by carboxylated groups and not by N-sulphated groups which are present in a heparan sulphate domain called "heparin-like domain"; see
H. Lortat-Jacob and J.-A. Grimaud, Biochimica and Biophysica Acta, 1117, 126-130 (1992).

On a maintenant découvert qu'en réalité l'affinité élevée de l'héparane-sulfate pour l'interféron-y résulte de la présence, dans l'héparane-sulfate, de deux domaines qui contiennent des groupements sulfatés et qui se fixent chacun sur la partie C-terminale d'une des chaînes de
I'interféron-y présent sous la forme d'un homodimère. Les deux domaines de liaisons sont reliés, dans l'héparane-sulfate, par une chaîne saccharidique faiblement sulfatée de longueur telle que les groupements impliqués dans la liaison avec la partie C-terminale puissent se trouver respectivement en regard de leur site de liaison sur l'homodimère.Ainsi, l'organisation de ces domaines confère à l'héparane-sulfate une forte affinité pour l'interférnn-y
Cette découverte a permis de concevoir un agent potentialisateur de l'interféron-y permettant notamment de faciliter le transport de l'interféron-y dans la circulation générale et dans les tissus, en évitant que l'interféron-y soit capturé par la matrice extracellulaire du tissu conjonctif. Grâce à l'agent potentialisateur de l'invention, on peut envisager pour la première fois une action de l'interféron par voie générale, et non une action simplement locale.En outre, l'agent potentialisateur de l'invention augmente la durée de demi-vie de l'interféron- dans l'organisme tout en évitant ou retardant sa dégradation et en favorisant son activation, comme cela sera montré dans la partie expérimentale ci-après.We have now discovered that in reality the high affinity of heparan sulphate for interferon-y results from the presence, in heparan sulphate, of two domains which contain sulphated groups and which each bind to the C-terminal part of one of the chains of
I'interferon-y present in the form of a homodimer. The two binding domains are linked, in heparan sulfate, by a weakly sulfated saccharide chain of such length that the groups involved in the binding with the C-terminal part can be found respectively opposite their binding site on the homodimer. Thus, the organization of these domains gives heparan sulfate a strong affinity for interfernn-y
This discovery made it possible to design an interferon-y potentiating agent, in particular making it possible to facilitate the transport of interferon-y in the general circulation and in the tissues, by preventing interferon-y from being captured by the extracellular matrix. connective tissue. Thanks to the potentiating agent of the invention, it is possible for the first time to envisage an action of interferon by the general route, and not simply a local action. In addition, the potentiating agent of the invention increases the duration of half-life of interferon- in the body while preventing or delaying its degradation and promoting its activation, as will be shown in the experimental part below.

L'invention a donc pour objet l'utilisation comme agent potentialisateur de l'interféron- d'un composé comprenant un groupement répondant à la formule A-X-B, dans laquelle A et B représentent indépendamment un groupe oligosaccharidique portant une charge anionique suffisante pour conférer audit groupe oligosaccharidique une affinité pour une partie de l'extrémité
C-terminale de l'interféron- humain contenant la séquence peptidique 125-131, et X est un bras espaceur de longueur suffisante pour permettre aux groupes A et B de se lier par affinité chacun à l'une des extrémités C-terminales d'un homodimére d'interféron-y.The subject of the invention is therefore the use as a potentiator of interferon- of a compound comprising a group corresponding to the formula AXB, in which A and B independently represent an oligosaccharide group carrying an anionic charge sufficient to confer on said group oligosaccharide an affinity for part of the tip
C-terminal of human interferon containing the peptide sequence 125-131, and X is a spacer arm of sufficient length to allow groups A and B to bind by affinity each to one of the C-terminal ends of an interferon-y homodimer.

Dans la formule A-X-B, A et B sont reliés au bras espaceur par des liaisons covalentes. In the formula A-X-B, A and B are connected to the spacer arm by covalent bonds.

On rappelle que la séquence peptidique 125-131 de l'extrémité C-terminale de l'interféron Sy humain est la suivante (voir par exemple Rinderknecht et al., J. Biol. Chem., 259, 6790-6797 (1984)):
Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg.It will be recalled that the peptide sequence 125-131 of the C-terminal end of human interferon Sy is as follows (see for example Rinderknecht et al., J. Biol. Chem., 259, 6790-6797 (1984)) :
Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg.

L'invention concerne en particulier l'utilisation des composés A-X-B comme agents potentialisateurs dans la préparation d'un médicament à base d'interféron-y. The invention relates in particular to the use of compounds A-X-B as potentiating agents in the preparation of a medicament based on interferon-y.

Afin de mieux faire comprendre les découvertes expérimentales qui sont à la base de l'invention, il convient de rappeler préalablement certaines données physico-chimiques concernant l'interféron-y et les polysaccharides du type héparane-sulfate et héparine. In order to better understand the experimental discoveries which are the basis of the invention, certain physicochemical data concerning interferon-y and the heparan-sulfate and heparin-type polysaccharides should be recalled beforehand.

On sait que l'héparine et l'héparane-sulfate font partie de la famille des glycosaminoglycanes, qui sont des produits ayant des motifs répétitifs disaccharidiques osamine/acide uronique. It is known that heparin and heparan sulfate belong to the family of glycosaminoglycans, which are products having repeating disaccharide units osamine / uronic acid.

La structure de l'héparane-sulfate de fibroblaste humain a été étudiée notamment par J. E. The structure of human fibroblast heparan sulfate has been studied in particular by J. E.

Turnbull et J. T. Gallagher, Biochem. J., 273, 553-559 (1991). Ces auteurs ont montré que la dépolymérisation de l'héparane-sulfate par l'héparinase clive de façon spécifique des disaccharides fortement sulfatés ayant la structure glucosamine (N-sulfatée et éventuellement 6-sulfatée)-cx 1,4acide iduronique (2-sulfaté), et que l'héparane-sulfate contient environ 10 % de liaisons susceptibles d'être clivées par cette enzyme. Les produits de dépolymérisation par l'héparinase sont des oligosaccharides ayant une masse moléculaire moyenne de 10 kDa environ. Ces oligosaccharides résistant à l'héparinase sont très sensibles à la dépolymérisation par l'héparitinase qui clive l'héparane-sulfate dans des zones de faible sulfatation, où les disaccharides prédominants sont du type N-acétyl (ou occasionnellement N-sulfate) glucosamine-a 1,4-acide glucuronique.Turnbull and J. T. Gallagher, Biochem. J., 273, 553-559 (1991). These authors have shown that the depolymerization of heparan sulphate by heparinase specifically cleaves highly sulphated disaccharides having the glucosamine structure (N-sulphate and optionally 6-sulphate) -cx 1,4 iduronic acid (2-sulphate) , and that heparan sulfate contains approximately 10% of bonds capable of being cleaved by this enzyme. The heparinase depolymerization products are oligosaccharides having an average molecular weight of approximately 10 kDa. These heparinase resistant oligosaccharides are very sensitive to depolymerization by heparitinase which cleaves heparan sulfate in areas of low sulfation, where the predominant disaccharides are of the N-acetyl (or occasionally N-sulfate) type glucosamine- has 1,4-glucuronic acid.

Les mêmes auteurs ont également montré que les sites de clivage de l'héparinase sont regroupés dans des domaines ayant des longueurs moyennes de 4 à 7 disaccharides. L'héparane-sulfate a donc une structure polymère composée d'arrangements successifs de domaines hautement sulfatés et faiblement sulfatés.The same authors have also shown that the heparinase cleavage sites are grouped into domains having mean lengths of 4 to 7 disaccharides. Heparan sulfate therefore has a polymer structure composed of successive arrangements of highly sulfated and weakly sulfated domains.

Dans l'héparine (voir par exemple J.T. Gallagher et A. Walker, Biochem. J. 230, 665-674, 1985), l'osamine est aussi la glucosamine N-acétylée ou N-sulfatée et l'acide uronique est principalement l'acide L-iduronique éventuellement 2-sulfaté. Sa structure est donc semblable à celle de l'héparane-sulfate, et ne diffère de celui-ci que par le degré de sulfatation et par le degré d'épiménsation de l'acide glucuronique en acide iduronique. L'héparine est donc peu sensible à l'action de l'héparitinase (qui coupe les glycosaminoglycanes au niveau d'un acide glucuronique) mais est fortement dépolymérisée par l'héparinase (qui coupe au niveau d'un acide iduronique 2sulfaté). In heparin (see for example JT Gallagher and A. Walker, Biochem. J. 230, 665-674, 1985), osamine is also N-acetylated or N-sulfated glucosamine and uronic acid is mainly optionally 2-sulfated L-iduronic acid. Its structure is therefore similar to that of heparan sulphate, and differs from it only by the degree of sulphation and by the degree of epimerization of glucuronic acid to iduronic acid. Heparin is therefore not very sensitive to the action of heparitinase (which cuts glycosaminoglycans at the level of a glucuronic acid) but is strongly depolymerized by heparinase (which cuts at the level of an iduronic acid 2sulfate).

On va maintenant décrire plus en détail certains modes de réalisation de l'invention. We will now describe in more detail certain embodiments of the invention.

L'agent potentialisateur de l'invention contient des groupes terminaux A et B, qui peuvent être semblables ou non, et qui peuvent être constitués de tout oligosaccharide portant une charge anionique suffisante pour permettre la liaison avec la partie C-terminale de I'interféron-y, par affinité de type anion-cation. The potentiating agent of the invention contains terminal groups A and B, which may or may not be similar, and which may consist of any oligosaccharide carrying an anionic charge sufficient to allow binding with the C-terminal part of the interferon -y, by anion-cation type affinity.

Les groupes oligosaccharidiques peuvent contenir notamment des groupements sulfate et/ou phosphate, avec un taux de sulfatation et/ou de phosphatation suffisant pour conférer l'affinité pour la partie C-terminale de l'interféron-y
En particulier, les groupes oligosaccharidiques A et B contiennent des motifs dérivés d'une osamine N-sulfatée, ou des motifs dérivés d'acides uroniques sulfatés, ou encore tous autres motifs portant des groupements anioniques en quantité suffisante pour conférer auxdits groupes A et B une affinité pour I'interféron-y, et en particulier pour une partie de l'extrémité C-terminale de l'interféron-y
Parmi les groupes oligosaccharidiques constituant les extrémités A et B, on citera notamment les groupes oligosaccharidiques qui contiennent en alternance, des motifs disaccharidiques dérivés d'une osamine et d'un acide uronique, comme dans les glycosaminoglycanes. The oligosaccharide groups may contain in particular sulfate and / or phosphate groups, with a rate of sulfation and / or phosphating sufficient to confer affinity for the C-terminal part of interferon-y
In particular, the oligosaccharide groups A and B contain units derived from an N-sulfated osamine, or units derived from sulfated uronic acids, or alternatively all other units carrying anionic groups in an amount sufficient to confer on said groups A and B an affinity for interferon-y, and in particular for part of the C-terminal end of interferon-y
Among the oligosaccharide groups constituting the ends A and B, mention will be made in particular of the oligosaccharide groups which contain alternately, disaccharide units derived from an osamine and from a uronic acid, as in glycosaminoglycans.

Ces groupes oligosaccharidiques A et B peuvent être notamment des fragments de dépolymérisation pouvant être obtenus par l'action de l'héparitinase sur l'héparane-sulfate. Il peut s'agir aussi d'autres produits de dépolymérisation qui peuvent éventuellement être soumis à une réaction de substitution par des substituants portant un groupe anionique (par exemple sulfate ou phosphate), selon les méthodes connues, lorsque le produit de départ n'a pas une charge anionique suffisante. These oligosaccharide groups A and B may in particular be depolymerization fragments which can be obtained by the action of heparitinase on heparan sulfate. It may also be other depolymerization products which may optionally be subjected to a substitution reaction with substituents carrying an anionic group (for example sulfate or phosphate), according to known methods, when the starting product has not not enough anionic charge.

Les groupes oligosaccharidiques A et B peuvent contenir par exemple de 6 à 14, en particulier de 6 à 10 motifs saccharidiques. The oligosaccharide groups A and B can contain, for example, from 6 to 14, in particular from 6 to 10 saccharide units.

Le bras espaceur représenté par X, dans la formule mentionnée ci-dessus de l'agent potentialisateur de l'invention, peut être tout polymère ayant une longueur suffisante pour permettre aux groupes terminaux A et B de se fixer chacun sur l'une des extrémités C-terminales d'un homodimère d'interféron-y. The spacer arm represented by X, in the above-mentioned formula of the potentiating agent of the invention, can be any polymer having a length sufficient to allow the terminal groups A and B to be fixed each on one of the ends C-terminals of an interferon-y homodimer.

On montre ci-après dans la partie expérimentale comment cette longueur suffisante peut être déterminée par de simples expériences de routine. Bien entendu, l'agent potentialisateur peut être présent sous la forme d'un composé Y-A-X-B-Z dans lequel Y et Z, semblables ou différents, sont des groupements polymères ou oligomères analogues notamment aux groupements X, A ou
B (voir l'exemple II de la partie expérimentale ci-après).We show below in the experimental part how this sufficient length can be determined by simple routine experiments. Of course, the potentiating agent can be present in the form of a compound Y-AXBZ in which Y and Z, similar or different, are polymeric or oligomeric groups analogous in particular to the groups X, A or
B (see example II of the experimental part below).

Plus généralement, chacune des expériences décrites dans l'Exemple II peut servir à sélectionner les agents potentialisateurs les plus appropriés. More generally, each of the experiments described in Example II can be used to select the most suitable potentiating agents.

Par exemple, dans le cas où le bras espaceur est un polysaccharide, il peut contenir de 24 à 32 motifs saccharidiques environ. For example, in the case where the spacer arm is a polysaccharide, it can contain from 24 to 32 saccharide units approximately.

Dans des modes de réalisation particuliers, le bras espaceur est un polymère dont au moins certains motifs peuvent contenir des groupements anioniques tels que des groupements sulfate, phosphate ou acide carboxylique. On peut utiliser notamment comme bras espaceurs des fragments de dépolymérisation de polyosides naturels tels que le polydextran, la cellulose,
I'amidon, le carraghénane, le fucoïdan (Sigma), des glycosaminoglycanes et leurs dérivés, notamment leurs dérivés porteurs de groupements anioniques.In particular embodiments, the spacer arm is a polymer of which at least certain units can contain anionic groups such as sulphate, phosphate or carboxylic acid groups. It is possible in particular to use, as spacer arms, depolymerization fragments of natural polysaccharides such as polydextran, cellulose,
Starch, carrageenan, fucoidan (Sigma), glycosaminoglycans and their derivatives, in particular their derivatives carrying anionic groups.

Ces fragments de dépolymérisation peuvent être obtenus selon les méthodes connues, notamment par hydrolyse acide ou basique, par l'action des ultrasons, par digestion enzymatique ou par réaction de dépolymérisation par oxydo-réduction (dite ORD) ("oxidative reductive depolymerization") ; voir par exemple Manssur Yalpani, "Polysaccharides-Syntheses,
Modifications and Structure/Property Relations", Eslevier (1988).These depolymerization fragments can be obtained according to known methods, in particular by acid or basic hydrolysis, by the action of ultrasound, by enzymatic digestion or by depoxidation reaction by oxidation-reduction (called ORD) ("oxidative reductive depolymerization"); see for example Manssur Yalpani, "Polysaccharides-Syntheses,
Modifications and Structure / Property Relations ", Eslevier (1988).

Les fragments de dépolymérisation de longueur convenable susceptibles de constituer le bras espaceur X sont séparés selon les méthodes usuelles. Lorsqu'ils ne contiennent pas de groupes anioniques, ils peuvent éventuellement être modifiés pour introduire de tels groupes anioniques selon les méthodes connues. On peut également utiliser les produits de dépolymérisation de certains polymères contenant déjà des groupes anioniques, par exemple la carboxyméthyl- ou carboxyéthyl-cellulose, le carboxyméthyl- ou carboxyéthyl-amidon, le dextran sulfate, etc. The depolymerization fragments of suitable length capable of constituting the spacer arm X are separated according to the usual methods. When they do not contain anionic groups, they can optionally be modified to introduce such anionic groups according to known methods. It is also possible to use the depolymerization products of certain polymers already containing anionic groups, for example carboxymethyl- or carboxyethyl-cellulose, carboxymethyl- or carboxyethyl-starch, dextran sulfate, etc.

Selon un mode de réalisation particulier, le bras espaceur est un fragment de dépolymérisation pouvant être obtenu par l'action de l'héparinase sur lthéparane-sulfate. On utilise par exemple des fragments de dépolymérisation ayant des masses moléculaires de 6 à 7 kDa. According to a particular embodiment, the spacer arm is a depolymerization fragment which can be obtained by the action of heparinase on heparan sulfate. For example, depolymerization fragments having molecular weights of 6 to 7 kDa are used.

Selon un autre mode de réalisation particulier, le bras espaceur peut être une héparine Nacylée obtenue par N-désulfatation suivie de N-acylation; pour les procédés de N-désulfatation et de N-acylation, voir notamment Methods in Carbohydrate Chemistry. Ac. Press., Vol.VIII, pp.291-294 et le document PCT WO 92/22588. According to another particular embodiment, the spacer arm can be a Nacylated heparin obtained by N-desulfation followed by N-acylation; for the N-desulfation and N-acylation processes, see in particular Methods in Carbohydrate Chemistry. Ac. Press., Vol.VIII, pp.291-294 and PCT document WO 92/22588.

L'agent potentialisateur de l'interféron-y peut être préparé en faisant réagir des dérivés réactifs précurseurs des groupes A et/ou B, simultanément ou séquentiellement, avec un dérivé réactif précurseur du bras espaceur X, selon les méthodes classiques permettant l'établissement de liaisons covalentes entre A et X et entre B et X. Il est à la portée des spécialistes de choisir les dérivés, comprenant les groupes réactifs, de A, B ou X et/ou les groupements protecteurs permettant de diriger la réaction en protégeant temporairement l'un des groupes réactifs. The potentiating agent of interferon-y can be prepared by reacting reactive derivatives precursors of groups A and / or B, simultaneously or sequentially, with a reactive derivative precursor of the spacer arm X, according to conventional methods allowing establishment of covalent bonds between A and X and between B and X. It is within the reach of specialists to choose the derivatives, comprising the reactive groups, of A, B or X and / or the protective groups making it possible to direct the reaction while temporarily protecting one of the reactive groups.

Les groupes réactifs peuvent être déjà naturellement présents dans le produit de départ ou être introduits selon les méthodes connues. The reactive groups can already be naturally present in the starting product or be introduced according to known methods.

Par exemple, lorsque le bras espaceur est un composé polysaccharidique, on peut préparer le composé A-X-B selon les méthodes connues de synthèse utilisées dans la chimie des sucres; voir notamment "Carbohydrate Chemistry, John F. Kennedy Ed., Clarendon Press - Oxford (1988), 500-593 ; et Manssur Yalpani, "Polysaccharides-Syntheses, Modifications and
Structure/Property Relations", Elsevier (1988), pp. 144-181.For example, when the spacer arm is a polysaccharide compound, the AXB compound can be prepared according to known methods of synthesis used in sugar chemistry; see in particular "Carbohydrate Chemistry, John F. Kennedy Ed., Clarendon Press - Oxford (1988), 500-593; and Manssur Yalpani," Polysaccharides-Syntheses, Modifications and
Structure / Property Relations ", Elsevier (1988), pp. 144-181.

On peut, dans certains cas, préparer l'agent potentialisateur de l'invention par dépolymérisation partielle d'un glycosaminoglycane (tel qu'un héparane-sulfate) convenablement protégé : voir par exemple la préparation du fragment IPD dans la partie expérimentale ci-après. It is possible, in certain cases, to prepare the potentiating agent of the invention by partial depolymerization of a glycosaminoglycan (such as a heparan sulfate) suitably protected: see for example the preparation of the IPD fragment in the experimental part below. .

L'agent potentialisateur peut également être constitué par de l'héparine ou des fragments de dépolymérisation d'héparine de taille convenable, et dans ce cas particulier il n'y a pas lieu de distinguer entre les parties A, X et B (ou A, X, B, Y et Z) : on obtient directement, par dépolymérisation et sélection des fragments de taille convenable, I'agent potentialisateur. The potentiating agent can also consist of heparin or heparin depolymerization fragments of suitable size, and in this particular case there is no need to distinguish between parts A, X and B (or A , X, B, Y and Z): the potentiating agent is obtained directly, by depolymerization and selection of fragments of suitable size.

Certaines parties de la molécule d'héparine ou desdits fragments interviennent dans la liaison avec l'interféron-y et jouent donc le rôle des parties A et B, tandis que la zone médiane desdits fragments, qui a sensiblement la même structure que les parties d'extrémité, joue le rôle de bras espaceur. Dans le cas où l'agent potentialisateur de l'invention est à base d'héparine, il est généralement souhaitable de modifier celle-ci chimiquement pour supprimer ou diminuer son activité anti-coagulante.Certain parts of the heparin molecule or of said fragments intervene in the bond with interferon-y and therefore play the role of parts A and B, while the middle zone of said fragments, which has substantially the same structure as the parts d end, acts as a spacer arm. In the case where the potentiating agent of the invention is based on heparin, it is generally desirable to modify it chemically to suppress or reduce its anti-coagulant activity.

La dépolymérisation (facultative) de l'héparine (dans le cas où l'héparine de départ a une masse moléculaire élevée) peut être mise en oeuvre selon les méthodes connues permettant d'obtenir des fragments de taille suffisante. L'isolement des fragments de dépolymérisation de taille appropriée est effectué de façon connue en soi, par exemple par tamisage moléculaire. The optional depolymerization of heparin (in the case where the starting heparin has a high molecular weight) can be carried out according to known methods making it possible to obtain fragments of sufficient size. The isolation of the appropriately sized depolymerization fragments is carried out in a manner known per se, for example by molecular sieving.

L'agent potentialisateur de l'invention peut être en outre tout polymère biocompatible (y compris des copolymères séquencés), contenant des groupements anioniques (sulfate, phosphate) en quantité suffisante au moins sur deux sites correspondant à A et B de la formule donnée cidessus. On peut utiliser en particulier des polysaccharides que l'on peut sulfater selon les méthodes décrites dans la littérature (voir par exemple Methods in Carbohydrate Chemistry Ac. The potentiating agent of the invention can also be any biocompatible polymer (including block copolymers), containing anionic groups (sulfate, phosphate) in sufficient quantity at least on two sites corresponding to A and B of the formula given above . It is possible in particular to use polysaccharides which can be sulfated according to the methods described in the literature (see for example Methods in Carbohydrate Chemistry Ac.

Press, Vol.III, pp.265-267, et Vol.VI, pp.426-429).Press, Vol.III, pp. 265-267, and Vol.VI, pp. 426-429).

On peut également utiliser des polysaccharides sulfatés commerciaux (voir l'exemple II de la partie expérimentale ci-après). Commercial sulfated polysaccharides can also be used (see Example II of the experimental part below).

Les groupes anioniques présents dans l'agent potentialisateur de l'invention, ou une partie desdits groupes, peuvent être salifiés. On peut utiliser notamment les sels alcalins et alcalinoterreux, par exemple les sels de sodium. The anionic groups present in the potentiating agent of the invention, or a part of said groups, can be salified. The alkali and alkaline earth salts, for example the sodium salts, can be used in particular.

Comme on l'a indiqué ci-dessus, l'agent potentialisateur de l'invention permet de réaliser un médicament à base d'interféron-y, capable d'agir par voie générale. Un tel médicament contient donc en combinaison l'agent potentialisateur et l'interféron-y, de préférence à raison d'au moins une mole environ d'agent potentialisateur pour deux moles d'interféron-y. As indicated above, the potentiating agent of the invention makes it possible to produce a drug based on interferon-y, capable of acting generally. Such a medicament therefore contains in combination the potentiating agent and the interferon-y, preferably in an amount of at least about one mole of potentiating agent for two moles of interferon-y.

Dans ce médicament, l'agent potentialisateur empêche la capture de l'interféron- par les molécules d'héparane-sulfate endogène, présentes par exemple dans la matrice extracellulaire, et permet donc son maintien et son transport dans la circulation générale. En outre, l'agent potentialisateur protège l'interféron-y contre les dégradations susceptibles de réduire ou d'annuler son activité, et il permet de maintenir l'interféron-y sous sa forme la plus active jusqu'au moment de son action sur les cellules compétentes. In this drug, the potentiating agent prevents the capture of interferon by endogenous heparan sulfate molecules, present for example in the extracellular matrix, and therefore allows its maintenance and its transport in the general circulation. In addition, the potentiating agent protects interferon-y against degradations liable to reduce or cancel its activity, and it makes it possible to maintain interferon-y in its most active form until the moment of its action on competent cells.

Le médicament de l'invention est préparé selon les méthodes usuelles et contient les véhicules et adjuvants permettant de le présenter sous une forme apte à être administrée notamment par voie intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée, ou encore par voie locale (par exemple cutanée, intra-nasale ou intra-bronchique). The medicament of the invention is prepared according to the usual methods and contains the vehicles and adjuvants making it possible to present it in a form capable of being administered in particular by the intravenous, intramuscular or subcutaneous route, or even by the local route (for example cutaneous, intra-nasal or intra-bronchial).

L'agent potentialisateur et l'interféron-y peuvent être mélangés préalablement dans le médicament, ou être présents dans des conteneurs séparés à mélanger au moment de l'emploi. The potentiator and interferon-y can be mixed beforehand in the drug, or be present in separate containers to be mixed at the time of use.

Le médicament de l'invention est administré de façon à fournir des doses suffisantes d'interféron-y Ces doses dépendent notamment du mode d'administration, du poids corporel et de la nature et de la gravité de la maladie à traiter. Par exemple, par voie sous-cutanée ou intramusculaire, on peut administrer de 105 à 107 unités d'interféron-y par injection, et effectuer de 3 à 7 injections par semaine. The medicament of the invention is administered so as to provide sufficient doses of interferon-y. These doses depend in particular on the method of administration, on the body weight and on the nature and severity of the disease to be treated. For example, subcutaneously or intramuscularly, 105 to 107 units of interferon-y can be administered per injection, and 3 to 7 injections per week given.

Le médicament de l'invention peut être utilisé dans tous les cas où l'une des activités de
I'interféron-y a un intérêt thérapeutique. Parmi ces activités, on pourra citer les effets immunostimulants, par exemple l'effet anti-prolifératif dans les cancers et l'activation des défenses immunitaires dans les maladies infectieuses (virales, bactériennes ou parasitaires), ou encore la capacité de bloquer la synthèse de collagène dans les fibroses d'organes . . etc.The medicament of the invention can be used in all cases where one of the activities of
Interferon-y is of therapeutic interest. Among these activities, mention may be made of the immunostimulatory effects, for example the anti-proliferative effect in cancers and the activation of immune defenses in infectious diseases (viral, bacterial or parasitic), or even the ability to block the synthesis of collagen in organ fibrosis. . etc.

L'invention a donc également pour objet un procédé amélioré de traitement à l'interférony, dans lequel on administre, outre l'interféron-y, un agent potentialisateur tel que défini ci-dessus. The invention therefore also relates to an improved method of treatment with interferony, in which one administers, in addition to interferon-y, a potentiating agent as defined above.

L'agent potentialisateur peut être administré en même temps que l'interféron-y ou (par exemple en administration intraveineuse) peu de temps (notamment moins de 2 minutes) avant ou après l'interféron-y.The potentiating agent can be administered at the same time as interferon-y or (for example by intravenous administration) shortly (in particular less than 2 minutes) before or after interferon-y.

L'interféron-y est présenté généralement sous la forme d'un lyophilisat que l'on dissout dans un véhicule liquide stérile au moment de l'emploi. L'agent potentialisateur de l'invention peut être présenté sous forme de lyophilisat, ou sous forme de solution aqueuse (en particulier de solution dans le sérum physiologique), et dans ce dernier cas, on peut dissoudre l'interféron-y lyophilisé dans la solution d'agent potentialisateur. Interferon-y is generally presented in the form of a lyophilisate which is dissolved in a sterile liquid vehicle at the time of use. The potentiating agent of the invention can be presented in the form of a lyophilisate, or in the form of an aqueous solution (in particular a solution in physiological saline), and in the latter case, the lyophilized interferon-y can be dissolved in the potentiating agent solution.

L'invention concerne en outre un procédé de potentialisation de l'activité de l'interféron-, destiné notamment à permettre une action de l'interféron-y par voie générale et non seulement locale, et/ou destiné à augmenter la durée de demi-vie de l'interféron-y dans l'organisme, à éviter sa dégradation dans l'organisme et à favoriser son activation, ce procédé étant caractérisé par le fait que l'on administre en même temps que l'interféron-y, ou peu de temps avant ou après, un agent potentialisateur tel que défini précédemment. The invention further relates to a method of potentiating the activity of interferon-, intended in particular to allow an action of interferon-y by general and not only local, and / or intended to increase the duration of half -Life of interferon-y in the body, to avoid its degradation in the body and to favor its activation, this process being characterized by the fact that one administers at the same time as interferon-y, or shortly before or after, a potentiating agent as defined above.

Les exemples suivants illustrent l'invention. The following examples illustrate the invention.

EXEMPLE I : Agent potenfialisateur ulé7ivé d'hénarane-sulfate
1: Obtention dthéparane-sulfate marqué au tritiltm
On cultive des fibroblastes de peau humaine jusqu'à confluence, puis les cultures sont mises en incubation pendant 72 heures dans un milieu DMEM/10% FCS contenant 10 ,uCi/mL (soit 0,37 MBq/mL) de glucosamine tritiée (Amersham).Après 72 heures d'incubation, on sépare les cellules du milieu de culture et les soumet à l'action de la trypsine pendant 15 minutes, puis on centrifuge et recueille le surnageant qui, additionné de milieu de culture, est chargé sur une colonne DEAE Sephacel (Pharmacia) équilibrée avec un tampon 20mM phosphate de sodium 0,15 M NaC1, pH 6,8. On applique un gradient linéaire de chlorure de sodium 0,15-0,8 M à raison de 0,2 mL/min. On recueille le pic correspondant aux protéoglycanes héparane-sulfate, qui est élué avec des tampons 0,5-0,6 M NaCI environ.Après dialyse contre de l'eau distillée pour éliminer les sels, on évapore le solvant sous vide et soumet le résidu à une digestion avec la chondroitinase ABC (Sigma) et la papaïne (Sigma) de façon à éliminer les chondroitines sulfates contaminant éventuellement la préparation, et à dégrader la partie protéique des protéoglycannes à héparanes sulfates.EXAMPLE I Potentiated ulnarivated agent of henarane sulphate
1: Obtaining tritiltm-labeled heparan sulfate
Human skin fibroblasts are cultured to confluence, then the cultures are incubated for 72 hours in a DMEM / 10% FCS medium containing 10, uCi / ml (i.e. 0.37 MBq / ml) of tritiated glucosamine (Amersham After 72 hours of incubation, the cells are separated from the culture medium and subjected to the action of trypsin for 15 minutes, then centrifuged and collected the supernatant which, added with culture medium, is loaded onto a DEAE Sephacel column (Pharmacia) balanced with 20 mM 0.15 M sodium phosphate NaC1 buffer, pH 6.8. A linear gradient of 0.15-0.8 M sodium chloride is applied at a rate of 0.2 ml / min. The peak corresponding to the heparan sulfate proteoglycans is collected, which is eluted with buffers approximately 0.5-0.6 M NaCl. After dialysis against distilled water to remove the salts, the solvent is evaporated in vacuo and the residue from digestion with chondroitinase ABC (Sigma) and papain (Sigma) so as to eliminate the chondroitin sulfates possibly contaminating the preparation, and to degrade the protein part of the proteoglycans with heparan sulfates.

On soumet le produit obtenu à une chromatographie sur colonne DEAE Sephacel et on recueille l'héparane-sulfate purifié qui est élué avec un tampon phosphate de sodium 20 mM, NaCI 1M. The product obtained is subjected to chromatography on a DEAE Sephacel column and the purified heparan sulfate is collected which is eluted with a 20 mM sodium phosphate buffer, 1M NaCl.

DMEM signifie : milieu de Eagle modifié par Dulbecco. DMEM means: Eagle medium modified by Dulbecco.

FCS signifie: sérum de veau foetal 2 : Préparation d'une colonne de chromatographie d'affinité (ligwzd: interférnn-y)
On mélange 1 mL de gel de chromatographie Affi-Gel 10 (BioRad) avec 1 mL de tampon 5 mMTris/HCI de pH6,8, contenant 0,5 mg d'interféron-y humain (ROUSSEL-UCLAF) et 1 mg d'héparine (Sigma). On sait que le gel Affi-Gel comporte des groupements réactifs permettant de fixer les groupes amines des protéines. La présence d'un excès d'héparine dans le tampon de couplage a pour but de protéger la région C-terminale de l'interféron- , qui sinon serait susceptible de réagir avec la matrice d'Affi-Gel.Après 16 heures de contact à 4"C avec agitation, on dispose le produit obtenu dans une colonne et on le lave avec un tampon 50 mMTris/HCl de pH 6,8, puis avec le même tampon contenant en outre 2 M NaCI. Avant l'utilisation, la colonne de chromatographie d'affinité obtenue est lavée avec une solution 2 M NaCI puis équilibrée avec un tampon 10 mMTris/HCl de pH 6,8 (tampon d'équilibration). Pour la chromatographie d'affinité, on utilise des échantillons de 200 pL dans le tampon d'équilibration et on élue avec un gradient de chlorure de sodium de 0 à 1 M.FCS stands for: fetal calf serum 2: Preparation of an affinity chromatography column (ligwzd: interfernn-y)
1 ml of Affi-Gel 10 chromatography gel (BioRad) is mixed with 1 ml of 5 mMTris / HCl buffer of pH 6.8, containing 0.5 mg of human interferon-y (ROUSSEL-UCLAF) and 1 mg of heparin (Sigma). It is known that the Affi-Gel contains reactive groups which make it possible to fix the amino groups of proteins. The presence of an excess of heparin in the coupling buffer aims to protect the C-terminal region of interferon-, which otherwise would be liable to react with the Affi-Gel matrix. After 16 hours of contact at 4 "C with stirring, the product obtained is placed in a column and washed with a 50 mMTris / HCl buffer of pH 6.8, then with the same buffer additionally containing 2 M NaCl. Before use, the affinity chromatography column obtained is washed with a 2 M NaCl solution and then equilibrated with a 10 mM Tris / HCl buffer of pH 6.8 (equilibration buffer). 200 pL samples are used for affinity chromatography. in the equilibration buffer and eluted with a sodium chloride gradient of 0 to 1 M.

Sur la colonne de chromatographie d'affinité ainsi obtenue, l'héparine se fixe et est éluée par des solutions de chlorure de sodium de concentration supérieure à 0,5 M environ. Des résultats analogues ont été obtenus de façon constante lors de la répétition de l'expérience 20 fois consécutives. On the affinity chromatography column thus obtained, heparin fixes and is eluted with solutions of sodium chloride with a concentration greater than about 0.5 M. Similar results have been consistently obtained when repeating the experiment 20 times in a row.

3 : Fractionnement de l'héparane-.sitffate et de ses produits de dépolymérisation sur la matrice d'affnité dtinterféron-y
L'héparane-sulfate marqué au tritium obtenu précédemment a été appliqué sur la colonne d'affinité d'interféron-y puis on élue successivement avec des solutions de chlorure de sodium de concentrations croissantes: 0,1-0,2-0,3- -1 M. On constate que l'héparane-sulfate se fixe sur l'interféron de la colonne d'affinité et peut être élué de façon fractionnée avec des solutions dans la gamme 0,3-0,6 M NaCI.3: Fractionation of heparan-.sitffate and its depolymerization products on the affinity matrix dtinterferon-y
The tritium-labeled heparan sulfate obtained previously was applied to the interferon-y affinity column and then eluted successively with sodium chloride solutions of increasing concentrations: 0.1-0.2-0.3 - -1 M. It is found that heparan sulfate binds to the interferon of the affinity column and can be eluted fractionally with solutions in the range 0.3-0.6 M NaCl.

La dépolymérisation de l'héparane-sulfate (HS) avec l'acide nitreux et avec l'héparinase (Sigma) fournit des résidus qui ont pratiquement perdu toute affinité pour l'interféron-y
La dépolymérisation de HS par l'héparitinase (Sigma, 10 U/mL)donne 60 à 70 % de produits qui ne se fixent pas sur l'interféron, le reste des produits obtenus se fixant sur l'interféron et étant élué avec des solutions dans la gamme 0,1-0,3 M NaCI. L'affinité pour l'interféron de ces derniers produits est donc diminuée, par rapport à HS intact.Depolymerization of heparan sulphate (HS) with nitrous acid and with heparinase (Sigma) provides residues which have practically lost all affinity for interferon-y
The depolymerization of HS by heparitinase (Sigma, 10 U / mL) gives 60 to 70% of products which do not bind to interferon, the rest of the products obtained bind to interferon and being eluted with solutions. in the range 0.1-0.3 M NaCI. The affinity for interferon of these latter products is therefore reduced, compared to intact HS.

Les produits de la digestion par l'héparitinase qui se fixent sur l'interféron sont des oligosaccharides N-sulfatés, ayant des degrés de polymérisation de 2 à 12 et pouvant être séparés par tamisage moléculaire sur une colonne de Bio-Gel P-6 (BioRad). Les fractions obtenues sont passées individuellement sur la colonne d'affinité d'interféron-y. L'affinité augmente avec le degré de polymérisation des oligosaccharides, mais elle est relativement faible, puisque les oligosaccharides les plus longs (degré de polymérisation 12) sont déjà élués avec des concentrations en chlorure de sodium allant de 0,2 à 0,3 M. The heparitinase digestion products which bind to interferon are N-sulfated oligosaccharides, having degrees of polymerization from 2 to 12 and which can be separated by molecular sieving on a column of Bio-Gel P-6 ( BioRad). The fractions obtained are passed individually through the interferon-y affinity column. The affinity increases with the degree of polymerization of the oligosaccharides, but it is relatively low, since the longest oligosaccharides (degree of polymerization 12) are already eluted with concentrations of sodium chloride ranging from 0.2 to 0.3 M .

4 : Di estion dthéparane-slxlfate protégé par l'inter éron-
Dans une solution tampon 50mM Tris/HC1 pH 7,6 contenant 10 CIM d'interféron- > y (concentration calculée sur la molécule monomère) et 5 IlM environ d'héparane-sulfate, on ajoute de l'héparitinase jusqu'à une concentration finale de 25 U/mL.4: Di estion of theparane-slxlfate protected by inter eron-
In a 50 mM Tris / HCl pH 7.6 buffer solution containing 10 MIC of interferon-> y (concentration calculated on the monomer molecule) and approximately 5 μM of heparan sulphate, heparitinase is added to a concentration 25 U / mL final.

On effectue en outre une digestion de HS dans les mêmes conditions mais en l'absence d'interféron-y, pour comparaison. HS is also digested under the same conditions but in the absence of interferon-y, for comparison.

Les produits de digestion (4 heures à 30"C) ont été analysés par chromatographie sur Bio
Gel P-10. On élue avec une solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate d'ammonium, à raison de 4 mL par heure. On constate que la digestion de HS par l'héparitinase a fourni des oligosaccharides ayant un degré de polymérisation (dp) de 2 à 14.The digestion products (4 hours at 30 "C) were analyzed by chromatography on Bio
P-10 gel. Eluted with a 0.5 M solution of ammonium hydrogen carbonate, at a rate of 4 ml per hour. It is found that digestion of HS with heparitinase provided oligosaccharides having a degree of polymerization (dp) from 2 to 14.

Lorsque la digestion est effectuée en présence d'interféron-y, on observe à l'élution des pics supplémentaires. Les pics obtenus sont recueillis, lyophilisés et remis en suspension dans le tampon d'équilibration utilisé pour la chromatographie d'affinité. On constate que le premier pic supplémentaire (pic I) a une affinité pratiquement identique à celle de HS intact. Les produits du pic I sont élués, dans la colonne de chromatographie d'affinité, avec des solutions de concentrations 0,4 et 0,5 M NaCI environ (produits majoritaires) et des produits minoritaires sont élués avec des concentrations de 0,3 et 0,6 M NaCI environ. When digestion is carried out in the presence of interferon-y, additional peaks are observed when eluting. The peaks obtained are collected, lyophilized and resuspended in the equilibration buffer used for affinity chromatography. It can be seen that the first additional peak (peak I) has an affinity practically identical to that of intact HS. The products of peak I are eluted in the affinity chromatography column with solutions of concentrations 0.4 approximately and 0.5 M NaCl (majority products) and minority products are eluted with concentrations of 0.3 and About 0.6 M NaCI.

Des expériences semblables, répétées avec des héparanes-sulfates issus de fibroblastes provenant de deux donneurs différents, ont donné des résultats identiques. Similar experiments, repeated with heparan sulfates from fibroblasts from two different donors, gave identical results.

Les produits du pic I correspondent donc à un domaine de HS protégé par l'interféron-y notamment contre la dépolymérisation par l'héparitinase. Ces produits sont appelés ci-après "IPD"
L'IPD est donc un fragment d'héparane-sulfate ayant une forte affinité avec l'interféron- auquel il est capable de se lier. L'IPD est davantage caractérisé ci-après.The products of peak I therefore correspond to a domain of HS protected by interferon-y in particular against depolymerization by heparitinase. These products are hereinafter called "IPD"
IPD is therefore a fragment of heparan sulphate having a strong affinity with interferon- to which it is capable of binding. The IPD is further characterized below.

5: Caractérisation de l'IPD
On a soumis l'IPD à des réactions de dépolymérisation dans les conditions suivantes
a) dépolymérisation par l'acide nitreux, à pH 1,5 pendant 15 minutes à température ambiante;
b) dépolymérisation par l'héparinase (10 U/mL) pendant 15 heures à 30"C. 5: Characterization of the IPD
IPD was subjected to depolymerization reactions under the following conditions
a) depolymerization with nitrous acid, at pH 1.5 for 15 minutes at room temperature;
b) depolymerization with heparinase (10 U / mL) for 15 hours at 30 "C.

Dans chaque cas, on a comparé la dépolymérisation de l'IPD avec la dépolymérisation du HS dont il est issu. In each case, the depolymerization of the IPD was compared with the depolymerization of the HS from which it is derived.

Les produits de dépolymérisation ont été comparés par tamisage moléculaire sur Bio-Gel
P-6.The depolymerization products were compared by molecular sieving on Bio-Gel
P-6.

On constate que l'on obtent, avec l'IPD, 35 % de disaccharides contre 18 % seulement pour HS, indiquant un nombre plus élevé de disaccharides contigus dont la glucosamine est Nsulfatée, dans l'IPD que dans HS. Par ailleurs, la taille des oligosaccharides résistant à HNO2 est plus petite dans l'IPD que dans HS, indiquant l'absence de longues séquences dépourvues de glucosamines N-sulfatées dans l'IPD.L'analyse des profils de digestion de l'IPD et HS permet de calculer (par la formule F = somme des Hins où Hi est le pourcentage de radioactivité dans le pic n" i, et n, est le nombre de disaccharides de ce pic) que 61 % des disaccharides de l'IPD sont Nsulfatés, contre 42 % seulement pour HS. De plus, la répartition de ces disaccharides est différente dans 1'IPD et dans HS, comme mentionné ci-dessus. Enfin, la sensibilité supérieure de l'IPD à l'action de l'héparinase (par rapport à HS) démontre que l'IPD est enrichi en disaccharides contenant un acide iduronique sulfaté en position 2. It is found that 35% of disaccharides are obtained with IPD against 18% only for HS, indicating a higher number of contiguous disaccharides whose glucosamine is Nsulfated, in IPD than in HS. Furthermore, the size of oligosaccharides resistant to HNO2 is smaller in IPD than in HS, indicating the absence of long sequences devoid of N-sulfated glucosamines in IPD. Analysis of digestion profiles of IPD and HS makes it possible to calculate (by the formula F = sum of the Hins where Hi is the percentage of radioactivity in the peak n "i, and n, is the number of disaccharides of this peak) that 61% of the disaccharides of the IPD are Nsulfated, compared to 42% only for HS. In addition, the distribution of these disaccharides is different in IPD and in HS, as mentioned above. Finally, the superior sensitivity of IPD to the action of heparinase (compared to HS) demonstrates that the IPD is enriched in disaccharides containing an iduronic acid sulfated in position 2.

Par ailleurs, l'IPD contient un domaine résistant à l'héparinase. La masse moléculaire de ce domaine a été déterminée et comparée à celle de l'IPD par tamisage moléculaire sur Sepharose
CL-6B (Pharmacia). Les masses moléculaires approximatives des échantillons ont été déterminées selon la méthode de Wasteson, J. Chromatogr. 59, 87-97 (1971). On a trouvé que l'IPD d'une part, et son domaine résistant à l'héparinase d'autre part, ont des masses moléculaires de 10 et 7 kDa, respectivement.In addition, the IPD contains a heparinase resistant domain. The molecular mass of this domain was determined and compared to that of IPD by molecular sieving on Sepharose.
CL-6B (Pharmacia). The approximate molecular weights of the samples were determined according to the method of Wasteson, J. Chromatogr. 59, 87-97 (1971). It has been found that IPD on the one hand, and its heparinase-resistant domain on the other hand, have molecular weights of 10 and 7 kDa, respectively.

L'IPD et son domaine résistant à l'héparinase (HR-IPD) ont été soumis à une dépolymérisation par l'héparitinase dans les conditions suivantes : tampon 50mM TrisHCI pH 7,6 pendant 15 heures à 35"C, en présence de 10 U/mL d'héparitinase. The IPD and its heparinase resistant domain (HR-IPD) were subjected to depolymerization with heparitinase under the following conditions: 50 mM TrisHCI buffer pH 7.6 for 15 hours at 35 "C, in the presence of 10 U / mL heparitinase.

On rappelle qu'une unité (U) d'héparitinase est la quantité d'héparitinase permettant de produire, par action sur l'héparane-sulfate, 0,1 micromole d'acide uronique insaturé par heure. It is recalled that a unit (U) of heparitinase is the amount of heparitinase making it possible to produce, by action on heparan sulfate, 0.1 micromole of unsaturated uronic acid per hour.

Les produits de dépolymérisation ont été analysés sur colonne Bio-Gel P-6. The depolymerization products were analyzed on a Bio-Gel P-6 column.

Le domaine HR-IPD est très sensible à la dépolymérisation par l'héparitinase qui fournit 67 % de disaccharides et 26 % de tétrasaccharides. L'analyse du profil de digestion montre que 82 % des liaisons entre disaccharides ont été clivées. Cela montre que cette région est riche en disaccharides contenant un motif glucuronique, la majorité de ces disaccharides étant N-acétylés. The HR-IPD domain is very sensitive to depolymerization by heparitinase which provides 67% of disaccharides and 26% of tetrasaccharides. Analysis of the digestion profile shows that 82% of the bonds between disaccharides have been cleaved. This shows that this region is rich in disaccharides containing a glucuronic motif, the majority of these disaccharides being N-acetylated.

L'analyse de la composition des disaccharides obtenus par dépolymérisation de l'MR-IPD avec l'héparitinase a été effectuée par HPLC sur colonne échangeuse d'anions. Cette analyse montre une teneur élevée en disaccharides N-acétylés non sulfatés (58 %) et 31 % de disaccharides N-sulfatés sans groupes O-sulfate. En outre, le traitement de l'IPD intact avec l'héparitinase donne deux produits principaux résistant à l'héparitinase, correspondant à des hexasaccharides et à des octasaccharides qui ne sont pas présents dans le domaine HR-IPD. Ces fragments représentent donc les séquences hautement N-sulfatées qui sont clivées et partiellement dégradées par le traitement à l'héparinase.Ces fragments sont complètement dégradés en disaccharides par l'acide nitreux, ce qui montre qu'ils sont composés de séquences contiguës de disaccharides N-sulfatés. Ces fragments sont également clivés par l'héparinase, les octasaccharides donnant principalement des produits tétrasaccharidiques et les hexasaccharides donnant un mélange de tétrasaccharides et de disaccharides, ce qui indique la présence de motifs glucosamine
N-sulfatés (éventuellement 6-sulfatés)-acide iduronique 2-sulfaté.Analysis of the composition of the disaccharides obtained by depolymerization of the MR-IPD with heparitinase was carried out by HPLC on an anion exchange column. This analysis shows a high content of non-sulfated N-acetylated disaccharides (58%) and 31% of N-sulfated disaccharides without O-sulfate groups. In addition, the treatment of intact IPD with heparitinase gives two main products resistant to heparitinase, corresponding to hexasaccharides and octasaccharides which are not present in the HR-IPD domain. These fragments therefore represent the highly N-sulfated sequences which are cleaved and partially degraded by heparinase treatment. These fragments are completely degraded to disaccharides by nitrous acid, which shows that they are composed of contiguous disaccharide sequences N-sulfates. These fragments are also cleaved by heparinase, the octasaccharides giving mainly tetrasaccharide products and the hexasaccharides giving a mixture of tetrasaccharides and disaccharides, which indicates the presence of glucosamine units.
N-sulfates (possibly 6-sulfates) -iduronic acid 2-sulfates.

L'affinité de ces hexasaccharides et octasaccharides pour l'interféron a également été testée à l'aide de la colonne de chromatographie d'affinité. On a observé que ces oligosaccharides n'ont qu'une faible affinité pour l'interféron-"'; similaire à celle observée pour les fragments de même taille obtenus par l'action de l'héparitinase sur le HS intact (voir 3 ci-dessus). The affinity of these hexasaccharides and octasaccharides for interferon was also tested using the affinity chromatography column. It has been observed that these oligosaccharides have only a weak affinity for interferon- "'; similar to that observed for the fragments of the same size obtained by the action of heparitinase on intact HS (see 3 below). above).

De même, le domaine HR-IPD n'a qu'une faible affinité pour l'interféron-y et est élué avec des concentrations en chlorure de sodium comprises entre 0,1 et 0,2 M. Likewise, the HR-IPD domain has only a weak affinity for interferon-y and is eluted with sodium chloride concentrations of between 0.1 and 0.2 M.

Ainsi, l'IPD comprend des régions de structures distinctes qui, quoique n'ayant individuellement qu'une faible affinité pour l'interféron-y, agissent de façon synergique, en ce qui concerne l'affinité pour l'interféron-y lorsqu'elles sont combinées. Thus, the IPD comprises regions of distinct structures which, although individually having only a low affinity for interferon-y, act synergistically, with regard to the affinity for interferon-y when they are combined.

6 : Réticulation de 1 'iii te rftron- par I 'héparane-sulfate
On mélange 250 ng d'interféron-y avec différentes concentrations de HS en solution aqueuse et on laisse incuber pendant 30 minutes à 4"C avec 2mM EDC (1-éthyl-3-(3diméthylaminopropyl) carbodiimine), agent de couplage hétéro-bifonctionnel commercialisé par
Pierce) en présence de N-hydroxysulfosuccinimide (S-NHS), qui active les groupes carboxyliques, à une concentration de 1 mM, pour augmenter le rendement de couplage de l'EDC. Au bout de 15 minutes, on arrête les réactions à l'aide d'un tampon dit d'échantillon d'électrophorèse, et on analyse les produits de réticulation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE).On rappelle qu'un tampon dit d'échantillon d'électrophorèse contient environ 2% de dodécylsulfate de sodium qui dénature les protéines (Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1970).6: Crosslinking of the iii te rftron- by heparan sulfate
250 ng of interferon-y are mixed with different concentrations of HS in aqueous solution and incubated for 30 minutes at 4 "C with 2mM EDC (1-ethyl-3- (3dimethylaminopropyl) carbodiimine), hetero-bifunctional coupling agent marketed by
Pierce) in the presence of N-hydroxysulfosuccinimide (S-NHS), which activates carboxylic groups, at a concentration of 1 mM, to increase the coupling efficiency of EDC. After 15 minutes, the reactions are stopped using a buffer called an electrophoresis sample, and the crosslinking products are analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecylsulfate (SDS-PAGE). It should be remembered that a buffer called an electrophoresis sample contains approximately 2% of sodium dodecyl sulphate which denatures proteins (Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1970).

Par ailleurs, on a fait réagir de l'interféron-y avec un subérate de bis(sulfosuccinimidyle) (en abrégé BS3), un réactif de couplage homo-bifonctionnel commercialisé par Pierce. Furthermore, interferon-y was reacted with a bis (sulfosuccinimidyl) suberate (abbreviated to BS3), a homo-bifunctional coupling reagent sold by Pierce.

On a trouvé que l'interféron- migre comme un monomère de 17 kDa par électrophorèse en milieu dénaturant (gel de 15 % polyacrylamide, 0,1 % SDS, 4M urée). It has been found that interferon migrates as a 17 kDa monomer by electrophoresis in a denaturing medium (15% polyacrylamide gel, 0.1% SDS, 4M urea).

Lorsque l'interféron-y a réagi avec BS3 avant l'électrophorèse, on observe une bande de 34 kDa, ce qui montre que la molécule était sous la forme d'un dimère. When the interferon-y reacted with BS3 before electrophoresis, a band of 34 kDa is observed, which shows that the molecule was in the form of a dimer.

En revanche, le réactif EDC/S-NHS ne réticule pas les deux monomères d'interféron-, probablement pour la raison qu'il n'y a pas de groupe amino en position favorable à proximité d'un groupe carboxylique entre les deux monomères. In contrast, the EDC / S-NHS reagent does not crosslink the two interferon- monomers, probably for the reason that there is no amino group in a favorable position near a carboxylic group between the two monomers .

Lorsque l'interféron-y est mis en réaction avec le système EDC/S-NHS en présence de diverses concentrations de HS provenant de la muqueuse intestinale bovine (Sigma) de façon à réticuler les groupes carboxyliques d'acide uronique de HS avec les groupes aminés de l'interféron- , le matériau obtenu a une masse moléculaire de 50 kDa environ avec deux bandes mineures à 17 et 34 kDa.Ce poids moléculaire de 50 kDa est compatible avec celui attendu pour un dimère d'interféron-y (34 kDa) réticulé avec une molécule de HS (16 kDa). Même lorsqu'on utilise un large excès de HS (10 moles pour 2 moles d'interféron- monomère), on obtient toujours le produit ayant un poids moléculaire de 50 kDa, ce qui montre qu'il s'agit d'une molécule de HS liée à 2 monomères d'interféron-y (34 kDa). When interferon-y is reacted with the EDC / S-NHS system in the presence of various concentrations of HS from the bovine intestinal mucosa (Sigma) so as to crosslink the carboxylic groups of HS uronic acid with the groups amines of interferon-, the material obtained has a molecular mass of approximately 50 kDa with two minor bands at 17 and 34 kDa. This molecular weight of 50 kDa is compatible with that expected for an interferon-y dimer (34 kDa ) crosslinked with an HS molecule (16 kDa). Even when a large excess of HS is used (10 moles per 2 moles of interferon-monomer), the product still having a molecular weight of 50 kDa is obtained, which shows that it is a molecule of HS linked to 2 interferon-y monomers (34 kDa).

Il résulte des expériences précédentes que le domaine IPD de HS est constitué par un domaine interne de 7 kDa dont chaque extrémité est reliée avec un oligosaccharide terminal hexaet/ou octa-saccharidique N-sulfaté, le domaine interne contenant de façon prédominante des disaccharides N-acétylés riches en acide glucuronique. Compte tenu de sa masse moléculaire, le domaine interne contient environ 15-16 motifs disaccharidiques. It follows from previous experiments that the IPD domain of HS is constituted by an internal domain of 7 kDa, each end of which is connected with a terminal oligosaccharide hexaet / or octa-saccharide N-sulfated, the internal domain containing predominantly disaccharides N- acetylated high in glucuronic acid. Given its molecular mass, the internal domain contains approximately 15-16 disaccharide units.

EXEMPLE H : Agent potenlialisateur dérivé d'héparine. de dextran sulfate ou de fucoidan
Toute molécule (dérivée d'héparine ou d'autres polymères anioniques) capable de se lier par affinité avec les deux extrémités C-terminales de l'interféron- dimère de façon à masquer les sites d'interactions avec l'héparane sulfate est susceptible d'utilisation comme agent potentialisateur de l'interféron-y La recherche de telles molécules peut être faite par une étude de compétition. Par exemple, on peut évaluer la capacité d'une molécule à entrer en compétition, pour la fixation à l'interféron-y, avec l'héparane-sulfate intact (ou l'IPD) radiomarqué.Ces molécules peuvent être de l'héparine (éventuellement partiellement désulfatée afin de diminuer son activité anticoagulante), du dextran sulfate (polymère de glucose contenant jusqu'à 3 groupes sulfates par résidu glucose, et ayant une activité anticoagulante réduite -17 unités internationales d'héparine par mg ; Ricketts, W. Biochem. J., 51, 129 (1952)), du fucoïdan (polysaccharide composé de fucoses sulfatés : voir Black, W.A.P. et al., J. Sci. Food Agri., 3, 122 (1952) et
Grauffel, V. et ai., Biomaterials, 10, 363, (1989)), etc.EXAMPLE H Potentiating agent derived from heparin. dextran sulfate or fucoidan
Any molecule (derived from heparin or other anionic polymers) capable of binding by affinity with the two C-terminal ends of the interferon dimer so as to mask the sites of interaction with heparan sulfate is susceptible to use as a potentiating agent of interferon-y The search for such molecules can be made by a competition study. For example, we can assess the ability of a molecule to compete for binding to interferon-y with heparan sulfate intact (or IPD) radiolabelled. These molecules can be heparin (possibly partially desulphated in order to reduce its anticoagulant activity), dextran sulfate (glucose polymer containing up to 3 sulphate groups per glucose residue, and having a reduced anticoagulant activity -17 international units of heparin per mg; Ricketts, W. Biochem. J., 51, 129 (1952)), fucoidan (polysaccharide composed of sulfated fucoses: see Black, WAP et al., J. Sci. Food Agri., 3, 122 (1952) and
Grauffel, V. et ai., Biomaterials, 10, 363, (1989)), etc.

Une telle étude est illustrée ici avec des molécules d'héparine de différents poids moléculaires (1,8 - 4,5 - 9 - 12,5 - 21 kDa). De I'interféron-y (0,3 IlM) est mis en incubation dans 100 L de tampon 10 mM Tris/HC1 pH 6,8, pendant une heure à température ambiante, avec 10000 cpm d'héparane-sulfate et avec des molécules d'héparine dont on peut ajuster les concentrations. Les mélanges réactionnels sont ensuite aspirés à travers un filtre de nitrocellulose (porosité 0,45 llm) à l'aide d'un système de "dot-blot" relié à une trompe à vide.Les filtres de nitrocellulose sont ensuite rincés deux fois avec 200 IlL de tampon 10 mM Tris/HC1 pH 6,8, puis dissous individuellement avec 500 IlL de DMSO et soumis à un comptage en scintillation liquide. Such a study is illustrated here with heparin molecules of different molecular weights (1.8 - 4.5 - 9 - 12.5 - 21 kDa). Interferon-y (0.3 IlM) is incubated in 100 L of 10 mM Tris / HCl pH 6.8 buffer, for one hour at room temperature, with 10,000 cpm of heparan sulfate and with molecules heparin whose concentrations can be adjusted. The reaction mixtures are then aspirated through a nitrocellulose filter (porosity 0.45 llm) using a "dot-blot" system connected to a vacuum pump. The nitrocellulose filters are then rinsed twice with 200 IlL of 10 mM Tris / HCl buffer pH 6.8, then dissolved individually with 500 IlL of DMSO and subjected to liquid scintillation counting.

Dans cette expérience, l'interféron-y s'adsorbe sur la nitrocellulose et retient avec lui les molécules qui lui sont associées. Les molécules (héparane-sulfate ou héparine) restées libres traversent le filtre de nitrocellulose sans être retenues. Ce test est basé sur la forte affinité de la nitrocellulose pour les protéines, et son absence d'interaction avec les polysaccharides. En l'absence de compétiteur, le filtre de nitrocellulose retient environ 3000 cpm d'héparane-sulfate.En présence d'héparine, la quantité d'héparane-sulfate liée à I'interféron-y diminue, démontrant que l'héparine est rentrée en compétition avec l'héparane-sulfate pour se lier à l'interféron-y Cette expérience a montré aussi que les molécules ou fragments d'héparine doivent avoir un poids moléculaire au moins égal à 9 kDa pour interagir efficacement avec l'interféron-Y. In this experiment, interferon-y is adsorbed on nitrocellulose and retains with it the molecules associated with it. The molecules (heparan sulfate or heparin) which remain free pass through the nitrocellulose filter without being retained. This test is based on the strong affinity of nitrocellulose for proteins, and its absence of interaction with polysaccharides. In the absence of a competitor, the nitrocellulose filter retains approximately 3000 cpm of heparan sulfate. In the presence of heparin, the amount of heparan sulfate linked to interferon-y decreases, demonstrating that the heparin has returned in competition with heparan sulphate to bind to interferon-y This experiment also showed that the molecules or fragments of heparin must have a molecular weight at least equal to 9 kDa to interact effectively with interferon-Y .

Dans les expériences suivantes, on étudie l'effet potentialisateur de l'interféron-y a) L'agent potentialisateur augmente le temps de demi-vie de l'interféron- dans la circulation
De I'interféron-y humain, radiomarqué à l'iode 125 a été injecté à des rats, par voie intraveineuse, à raison de 40 ,ug/kg de poids corporel, seul ou en association avec de l'héparine (2000 U/kg de poids corporel) comme agent potentialisateur. Le taux circulant d'interféron-y a été suivi au cours du temps par mesure de la radioactivité précipitable par 10% de TCA, dans les fractions plasmatiques.In the following experiments, the potentiating effect of interferon-y is studied a) The potentiating agent increases the half-life time of interferon- in the circulation
Human interferon-y, radiolabelled with iodine 125, was injected into rats intravenously at a rate of 40 ug / kg body weight, alone or in combination with heparin (2000 U / kg of body weight) as a potentiating agent. The circulating interferon-γ level was monitored over time by measuring the radioactivity precipitable by 10% of TCA, in the plasma fractions.

Injecté seul, I'interféron-y est éliminé du flux sanguin, de façon biexponentielle. Environ 90 % de la cytokine disparaît pendant les 5 à 10 premières minutes avec un temps de demi-vie (tut) de 1,1 minute. Les 10 % restant (2ème partie de la courbe exponentielle) sont éliminés beaucoup plus lentement, avec un tlx2 de 94 minutes. En revanche, lorsque l'interféron-y est coinjecté avec de l'héparine comme agent potentialisateur, sa concentration plasmatique décrit une courbe monoexponentielle caractérisée par un temps de demi-vie de 99 minutes. When injected alone, interferon-y is eliminated from the blood stream, biexponentially. About 90% of the cytokine disappears during the first 5 to 10 minutes with a half-life time (tut) of 1.1 minutes. The remaining 10% (2nd part of the exponential curve) is eliminated much more slowly, with a tlx2 of 94 minutes. On the other hand, when interferon-y is coinjected with heparin as a potentiating agent, its plasma concentration describes a monoexponential curve characterized by a half-life time of 99 minutes.

Il convient de noter que le récepteur de l'interféron- ne participe pas aux effets observés, car I'interféron-y humain utilisé ici n'est pas reconnu par le récepteur de l'interféron- des espèces murines. De plus, une injection d'héparine quelques minutes après l'injection d'interféron- seul remet en circulation la cytokine, par effet de compétition avec des molécules endogènes de type héparine. It should be noted that the interferon-receptor does not participate in the effects observed, since the human interferon-y used here is not recognized by the interferon-receptor of murine species. In addition, an injection of heparin a few minutes after the injection of interferon-only recirculates the cytokine, by competitive effect with endogenous heparin-like molecules.

b) L'agent potentialisateur augmente in vivo l'activité bîologiq'ie de I'interféron-r
De l'interféron-y humain (4. 1OSU) a été injecté par voie intraveineuse à des rats de 500 grammes environ, en association ou non à de l'héparine (2000 U/kg de poids corporel), comme agent potentialisateur. Aux temps 2, 10, 60 et 120 minutes après l'injection, des échantillons de plasma ont été prélevés, pour effectuer une mesure de l'activité d'interféron
L'activité biologique de l'interféron-y est mesurée de la façon suivante. Une couche confluante de cellules Wish (Hayflick, L., Exp.Cell Res. 23, 14-20 (1961)) est mise en présence d'une gamme de concentration d'interféron-y standard (généralement de 100 à 0 U/mL, avec des dilutions de 2 en 2), ou de l'échantillon à doser. Après 24 heures d'incubation dans une étuve à
CO2 à 37"C, les cellules sont infectées avec 100 C11 de VSV (virus de la stomatite vésiculeuse), dont la concentration est ajustée de façon à produire une lyse total des cellules en 24 heures, en l'absence d'interféron-y Dans ce test, la dose d'interféron-y qui protège 50 % des cellules de la lyse par le VSV correspond à 1 U/mL. La mesure de la proportion de cellules protégées peut être faite selon la méthode décrite par Mosmann, T., J. Immunol. Meth. 65, 55-63 (1983).b) The potentiating agent increases in vivo the biological activity of interferon-r
Human interferon-y (4.1OSU) was injected intravenously into rats weighing approximately 500 grams, with or without heparin (2000 U / kg body weight), as a potentiating agent. At times 2, 10, 60 and 120 minutes after the injection, plasma samples were taken to measure the interferon activity
The biological activity of interferon-y is measured as follows. A confluent layer of Wish cells (Hayflick, L., Exp.Cell Res. 23, 14-20 (1961)) is placed in the presence of a range of standard interferon-y concentrations (generally from 100 to 0 U / mL, with 2 in 2 dilutions), or the sample to be assayed. After 24 hours of incubation in a drying oven
CO2 at 37 "C, the cells are infected with 100 C11 of VSV (vesicular stomatitis virus), the concentration of which is adjusted so as to produce total lysis of the cells in 24 hours, in the absence of interferon-y In this test, the dose of interferon-y which protects 50% of cells from lysis by VSV corresponds to 1 U / ml. The proportion of protected cells can be measured according to the method described by Mosmann, T. , J. Immunol, Meth. 65, 55-63 (1983).

Après l'injection d'interféron-y seul, on a trouvé 42 %, 3,7 % et 1,9 % de l'activité injectée aux temps 2, 60 et 120 minutes, respectivement, alors que 7,4 % et 5,7 % de la quantité injectée sont encore présentes dans le plasma, respectivement, aux temps 60 et 120 minutes. En l'absence d'agent potentialisateur, I'interféron-y est donc partiellement inactivé. After the injection of interferon-y alone, 42%, 3.7% and 1.9% of the activity injected were found at times 2, 60 and 120 minutes, respectively, while 7.4% and 5 , 7% of the amount injected are still present in the plasma, respectively, at times 60 and 120 minutes. In the absence of a potentiating agent, interferon-y is therefore partially inactivated.

En présence d'héparine utilisée comme agent potentialisateur, on a mesuré, 2 minutes après l'injection, une activité correspondant à 600 % de celle qui avait été injectée. Il y a donc eu une augmentation très rapide de l'activité spécifique de l'interféron-y en présence de l'agent potentialisateur. Au bout de deux heures après l'injection, l'interféron-y est encore deux fois plus actif qu'avant l'injection. Si l'on combine l'augmentation de l'activité et l'augmentation de la quantité circulant d'interféron-y, il y a environ 50 fois plus d'activité d'interféron dans le sang circulant deux heures après l'injection, grâce à l'agent potentialisateur. L'injection d'héparine seule ne fait apparaître aucune activité de type interféron dans le plasma des animaux. In the presence of heparin used as potentiating agent, an activity corresponding to 600% of that which had been injected was measured 2 minutes after the injection. There was therefore a very rapid increase in the specific activity of interferon-y in the presence of the potentiating agent. After two hours after the injection, interferon-y is still twice as active as before the injection. If you combine the increase in activity with the increase in the circulating amount of interferon-y, there is about 50 times more interferon activity in the blood circulating two hours after the injection, thanks to the potentiating agent. Heparin injection alone does not show any interferon-like activity in the plasma of animals.

Des résultats analogues, en ce qui concerne les temps de demi-vie et l'augmentation de l'activité, peuvent être observés en remplaçant l'héparine soit par des fragments d'héparine ayant une masse moléculaire de 10 kDa, soit par le fragment IPD décrit l'Exemple I ci-dessus, soit encore par le dextran sulfate ou le fùcoïdan. Similar results, with respect to half-lives and increased activity, can be observed by replacing heparin either with heparin fragments having a molecular mass of 10 kDa, or with the fragment IPD describes Example I above, again using either dextran sulfate or fucoidan.

Claims

1. Use as a potentiating agent, in the preparation of a medicament based on interferon-y, of a compound comprising a group of formula AXB, in which A and B independently represent an oligosaccharide group carrying an anionic charge sufficient to confer said oligosaccharide group an affinity for part of the end

C-terminal of human interferon-y containing the peptide sequence 125-131, and X is a spacer arm of sufficient length to allow groups A and B to each bind to one of said peptide sequences of the C-terminal ends of an interferon-y homodimer.

2. Use according to claim 1, characterized in that said oligosaccharide group carries sulfate and / or phosphate groups.

3. Use according to claim I or 2, characterized in that said oligosaccharide group contains units derived from an N-sulfated osamine.

4. Use according to claim 3, characterized in that said oligosaccharide group alternately contains units derived from said osamine and units derived from an optionally sulfated uronic acid.

5. Use according to any one of the preceding claims, characterized in that the said oligosaccharide groups are depolymerization fragments which can be obtained by the action of heparitinase on heparan sulfate.

6. Use according to any one of the preceding claims, characterized in that the said spacer arm is a polymer containing anionic groups.

7. Use according to the preceding claim, characterized in that said anionic groups are chosen from sulphate, phosphate and carboxylic groups.

8. Use according to any one of the preceding claims, characterized in that the said spacer arm is derived from a polysaccharide or from a polyglycol.

9. Use according to any one of the preceding claims, characterized in that the said spacer arm is derived from a polysaccharide chosen from polydextran, cellulose,

Starch, carrageenan, fucoidan and a glycosaminoglycan, and their derivatives.

10. Use according to any one of the preceding claims, characterized in that the said spacer arm is a depolymerization fragment which can be obtained by the action of heparinase on heparan sulfate.

11. Use according to any one of claims 1 and 2, characterized in that the said compound is a biocompatible polymer containing anionic groups in sufficient quantity at least on two sites corresponding to A and B as defined in claim 1.

12. Use according to the preceding claim, characterized in that the said compound is a dextran sulfate or fùcoidan.

13. Medication based on interferon-y, characterized in that it contains a potentiating agent as defined in any one of the preceding claims.

14. Medicament according to the preceding claim, characterized in that it contains approximately one mole of potentiating agent for two moles of interferon-y.