FR2734841A1 - New sequences encoding hydroxy-phenyl pyruvate di:oxygenase - Google Patents
New sequences encoding hydroxy-phenyl pyruvate di:oxygenase Download PDFInfo
- Publication number
- FR2734841A1 FR2734841A1 FR9513570A FR9513570A FR2734841A1 FR 2734841 A1 FR2734841 A1 FR 2734841A1 FR 9513570 A FR9513570 A FR 9513570A FR 9513570 A FR9513570 A FR 9513570A FR 2734841 A1 FR2734841 A1 FR 2734841A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- sep
- gene
- hppd
- sequence
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
Abstract
Description
Gène de l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase et obtention de plantes contenant ce
gène résistantes aux herbicides.Gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and obtaining plants containing this
gene resistant to herbicides.
La présente invention concerne le gène de l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD), un gène chimère contenant ce gène comme séquence codante et son utilisation pour 1' obtention de plantes résistantes à certains herbicides. The present invention relates to the gene for hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase (HPPD), a chimeric gene containing this gene as a coding sequence and its use for obtaining plants resistant to certain herbicides.
On connait certains herbicides tel que l'isoxaflutol, herbicide sélectif du mais, de la famille des isoxazoles ou encore la sulcotrione de la famille des tricétones. Cependant aucun gène de résistance à de tels herbicides n' a été décrit. Certain herbicides are known, such as isoxaflutol, a selective herbicide for maize, the isoxazole family or sulcotrione of the tricetone family. However, no gene for resistance to such herbicides has been described.
L'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase est une enzyme qui catalyse la réaction de transformation du para-hydroxy phénylpyruvate en homogentisate. Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase is an enzyme that catalyzes the conversion reaction of para-hydroxy phenylpyruvate to homogentisate.
Par ailleurs la séquence en acides aminés de l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase issue de Pseudomonas sp. P.J. 874 a été décrite, sans qu'il y ait une description de son rôle dans la résistance des plantes aux herbicides (RüETSCHI et col:
Eur. J. Biochem. 205,459466, 1992). Ce document ne donne pas de description du gène de la protéine.Furthermore, the amino acid sequence of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase from Pseudomonas sp. PJ 874 has been described, without a description of its role in plant resistance to herbicides (RüETSCHI et al:
Eur. J. Biochem. 205, 45466, 1992). This document does not give a description of the gene of the protein.
I1 a maintenant été découvert la séquence d'un gène de ce type et qu'un tel gène
pouvait, une fois incorporé dans des cellules végétales, fournir des plantes présentant une
résistance intéressante à certains herbicides récents, tels que ceux de la famille des
isoxazoles ou de celle des tricétones.It has now been discovered the sequence of a gene of this type and that such a gene
could, once incorporated into plant cells, provide plants with a
interesting resistance to some recent herbicides, such as those from the family of
isoxazoles or that of tricetones.
La présente invention a donc pour objet un gène de résistance à un herbicide,
caractérisé en ce qu'il exprime l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD). Celui-ci
peut être d'origine quelconque mais est de préférence d'origine bactérienne, telle que
notamment le genre Pseudomonas ou encore d'origine végétale.The subject of the present invention is therefore a gene for resistance to a herbicide,
characterized in that it expresses hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase (HPPD). This one
may be of any origin but is preferably of bacterial origin, such as
especially the genus Pseudomonas or of plant origin.
L'invention comprend également un procédé d'isolement du gène ci-dessus, caractérisé
en ce que:
-on choisit, comme amorces, quelques oligonucléotides issus de la séquence en
acides aminés d'une HPPD,
- à partir de ces amorces, on synthétise des fragments d'amplification par PCR
- on isole le gène par création et criblage d'une banque génomique et
- on clone le gène.The invention also comprises a method for isolating the above gene, characterized
in that:
as primers, some oligonucleotides derived from the sequence
amino acids of a HPPD,
from these primers, PCR amplification fragments are synthesized
the gene is isolated by creation and screening of a genomic library and
the gene is cloned.
De préférence on utilise des amorces issues de la séquence de 1'HPPD d'une bactérie
du genre Pseudomonas. De manière particulièrement préférée, elles sont issues de
Pseudomonas fluorescens.Preferably, primers derived from the HPPD sequence of a bacterium are used.
of the genus Pseudomonas. In a particularly preferred manner, they come from
Pseudomonas fluorescens.
Ce gène peut être utilisé dans un procédé pour la transformation des plantes comme
gène marqueur ou comme séquence codante permettant de conférer à la plante une résistance à certains herbicides. Il peut également être utilisé en association avec d'autres gènes marqueurs et/ou séquence codante pour une propriété agronomique.This gene can be used in a process for the transformation of plants as
marker gene or as a coding sequence making it possible to confer resistance to certain herbicides on the plant. It can also be used in combination with other marker genes and / or coding sequence for agronomic property.
La transformation des cellules végétales peut être obtenu par tout moyen connu approprié. Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplates avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. The transformation of the plant cells can be achieved by any suitable known means. A series of methods involves bombarding cells or protoplates with particles to which the DNA sequences are attached.
Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante d'un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes. Another series of methods consists of using as a means of transfer into the plant of a chimeric gene inserted into a plasmid Ti of Agrobacterium tumefaciens or Ri of Agrobacterium rhizogenes.
La présente invention a encore pour objet un gène chimère comprenant, dans le sens de la transcription, au moins une séquence de régulation promotrice, une séquence codante hétérologue qui exprime l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase et au moins une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation. The subject of the present invention is also a chimeric gene comprising, in the direction of transcription, at least one promoter regulatory sequence, a heterologous coding sequence which expresses the hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and at least one terminating regulatory sequence or of polyadenylation.
Comme séquence de régulation promotrice on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase (RuBisCO) ou de celui d'un gène de l'a tubuline (Demande européennne EP n" 0 652 286), ou encore d'un gène de virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaique du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), mais tout promoteur convenable connu peut être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante, tel que par exemple, celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP 0507698. As a promoter regulatory sequence, it is possible to use any promoter sequence of a gene expressing itself naturally in plants, in particular a promoter of bacterial, viral or plant origin, such as, for example, that of a gene of the small subunit. ribulose-biscarboxylase unit (RuBisCO) or that of a tubulin gene (European Application EP No. 0 652 286), or a plant virus gene such as, for example, that of mosaic of cauliflower (CAMV 19S or 35S), but any known suitable promoter can be used, preferably using a promoter regulatory sequence which promotes overexpression of the coding sequence, such as for example that comprising at least one histone promoter as described in the European application EP 0507698.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de trancription "enhancer", comme par exemple l'activateur de translation du virus etch du tabac (TEV) décrit dans la demande
W087/07644, ou des peptides de transit, soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale.constituée d'une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande européenne n" 0 508 909.According to the invention, it is also possible to use, in association with the promoter regulatory sequence, other regulatory sequences, which are situated between the promoter and the coding sequence, such as enhancer-enhancing activators, such as, for example the tobacco etch virus (TEV) translation activator described in the application
WO87 / 07644, or transit peptides, either simple or double, and in this case optionally separated by an intermediate sequence, that is to say comprising, in the direction of transcription, a sequence coding for a transit peptide d a plant gene encoding a plastid-centric enzyme, a portion of the N-terminal mature sequence of a plant gene coding for a plastid-localized enzyme, and a sequence encoding a second transit peptide of a plant gene coding for a plastid-localization enzyme, consisting of a portion of the sequence of the N-terminal mature portion of a plant gene encoding a plastid-localized enzyme, as described in European Application No. 0 508 909.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP n" 0 633 317. As a terminating or polyadenylation regulatory sequence, it is possible to use any corresponding sequence of bacterial origin, such as, for example, the Nos terminator of Agrobacterium tumefaciens, or else of plant origin, such as for example a histone terminator as described in US Pat. European Application EP 0 633 317.
La présente invention a encore pour objet les cellules végétales, de plantes monocotylédones ou dicotylédones, notamment des cultures, transformées selon l'un des procédés décrits ci-dessus et contenant dans leur génome une quantité efficace d'un gène exprimant l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD). On a observé que des plantes transformées de cette façon présentent une résistance importante à certains herbicides récents tels que ceux de la famille des isoxazoles et notamment du 4-[4-CF3-2 (méthylsulfoyl) benzoyl]-5-cyclopropyl isoxazole, ou encore de celle des tricétones, comme par exemple la sulcotrione. The subject of the present invention is also plant cells, monocotyledonous or dicotyledonous plants, in particular cultures, transformed according to one of the methods described above and containing in their genome an effective amount of a gene expressing hydroxy-phenyl. pyruvate dioxygenase (HPPD). It has been observed that plants transformed in this way have a significant resistance to certain recent herbicides such as those of the isoxazole family and in particular 4- [4-CF3-2 (methylsulfoyl) benzoyl] -5-cyclopropyl isoxazole, or of that of the tricetones, such as sulcotrione.
L'invention a enfin pour objet un procédé de désherbage de plantes, notamment de cultures, à l'aide d'un herbicide de ce type, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes transformées selon l'invention. Finally, the subject of the invention is a process for the weeding of plants, in particular crops, with the aid of a herbicide of this type, characterized in that this herbicide is applied to plants transformed according to the invention.
Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des exemples expérimentaux ci-dessous. The various aspects of the invention will be better understood using the experimental examples below.
Exemple 1: Isolement du gène de l'HPPD de P. fluorescens A32 . Example 1: Isolation of the HPPD gene of P. fluorescens A32.
A partir de la séquence en acides aminés de l'HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874 ( publié par Rüetschi U. et al. 1992. Eur. J. Biochem. 205: 459-466), on déduit la séquence de différents oligonucléotides pour amplifier par PCR une partie de la séquence codante de l'HPPD de P. fluorescens A32 (isolée par McKellar, R.C. 1982. J. Appl Bacteriol. 53:305316). Un fragment d'amplification du gène de cette HPPD a été utilisé pour cribler une banque génomique partielle de P. fluorescens A32 et ainsi isoler le gène codant pour cette enzyme. From the amino acid sequence of HPPD of Pseudomonas sp. PJ 874 (published by Retschi U. et al., 1992. Eur J. Biochem 205: 459-466), the sequence of different oligonucleotides was deduced to PCR amplify a part of the coding sequence of the P-HPPD. A32 fluorescens (isolated by McKellar, RC 1982. J. Appl Bacteriol 53: 305316). An amplification fragment of the gene of this HPPD was used to screen a partial genomic library of P. fluorescens A32 and thus isolate the gene coding for this enzyme.
A) Préparation de l'ADN génomique de P. fluorescens A32. A) Preparation of the genomic DNA of P. fluorescens A32.
La bactérie a été cultivée dans 40 ml de milieu minnimum M63 (KH2PO4 13,6gui, (NH4)2SO4 2go1, MgS04 0,2go, FeSO4 0,005 g/I pH7 plus L-tyrosine lOmM comme seule source de carbone) à 28"C pendant 48 heures. The bacterium was cultured in 40 ml of M63 medium (13.6 μg KH 2 PO 4, (NH 4) 2 SO 4 2 μg, 0.2 g MgSO 4, 0.005 g / l FeSO 4 pH7 plus 10 mM L-tyrosine as sole carbon source) at 28 ° C. for 48 hours.
Après lavage, les cellules sont repnses dans 1 ml de tampon de lyse (tris HCl 100 mM pH 8,3, NaCI 1,4 IM et EDTA 10 mM) et incubées 10 minutes à 65"C. Après un traitement au phénol/chloroforme (24/1) et un traitement au chloroforme, les acides nucléiques sont précipités par addition d'un volume d'isopropanol puis repris dans 300 ul d'eau stérile et traités à la RNAse 10 llg/ml final. 1'ADN est de nouveau traité au phénol/chloroforme, chloroforme et reprécipité par addition de 1/10 de volume d'acétate de sodium 3M pH5 et 2 volumes d'éthanol. l'ADN est ensuite repris dans de l'eau stérile et dosé. After washing, the cells are spotted in 1 ml of lysis buffer (100 mM Tris HCl pH 8.3, 1 M NaCl and 10 mM EDTA) and incubated for 10 minutes at 65 ° C. After phenol / chloroform treatment (24/1) and a chloroform treatment, the nucleic acids are precipitated by addition of a volume of isopropanol and then taken up in 300 μl of sterile water and treated with RNAse 10 μg / ml final. phenol / chloroform, chloroform and reprecipitated by the addition of 1/10 volume of 3M sodium acetate pH5 and 2 volumes of ethanol, the DNA is then taken up in sterile water and assayed.
B) Choix des oligonucléotides et synthèses. B) Choice of oligonucleotides and syntheses.
A partir de la séquence en acides aminés de l'HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874 on choisit cinq oligonucléotides, deux dirigés dans le sens NH2 terminal de la protéine vers le
COOH terminal de la protéine et trois dirigés dans le sens inverse (voir SEQ. ID N0 1 . Le choix a été dicté par les deux règles suivantes:
-une extrémité 3' de l'oligonucléotide stable, c'est à dire au moins deux bases sans ambiguité.From the amino acid sequence of HPPD of Pseudomonas sp. PJ 874 five oligonucleotides are selected, two directed in the NH2 terminal direction of the protein to the
Terminal COOH of the protein and three directed in the opposite direction (see SEQ ID NO: 1) The choice was dictated by the following two rules:
a 3 'end of the stable oligonucleotide, that is to say at least two bases without ambiguity.
-une dégénérescence la plus faible possible. -degeneration as low as possible.
Les oligonucléotides choisis ont les séquences suivantes: P1: 5'TA(C/T)GA(G/A)AA(C/T)CCIATGGG3'
P2: 5'GA(G/A)ACIGGICCIATGGA3'
P3: 5'AA(C/T)TGCATIA(G/A)(G/A)AA(C/T)TC(C/T)TC3'
P4: 5'AAIGCIAC(G/A)TG(C/T)TG(T/G/A)ATICC3'
P5: 5'GC(C/T)TT(A/G)AA(A/G)TTICC(C/T)TCICC3'
Ils ont été synthétisés sur le synthétiseur "Cyclone plus DNA Synthesizer" de marque
MILLPORE.The oligonucleotides chosen have the following sequences: P1: 5'TA (C / T) GA (G / A) AA (C / T) CCIATGGG3
P2: 5'GA (G / A) ACIGGICCIATGGA3 '
P3: 5'AA (C / T) TGCATIA (G / A) (G / A) AA (C / T) TC (C / T) TC3 '
P4: 5'AAIGCIAC (G / A) TG (C / T) TG (T / G / A) ATICC3 '
P5: 5'GC (C / T) TT (A / G) AA (A / G) TTICC (C / T) TCICC3 '
They were synthesized on the brand "Cyclone plus DNA Synthesizer" synthesizer
MILLPORE.
Avec ces cinq oligonucléotides par PCR les fragments d'amplification que l'on doit obtenir théoriquement d'après la sséquence SEQ ID N 1 ont les tailles suivantes:
avec les amorces P1 et P3 -------- > environ 690 bp
avec les amorces P1 et P4 -------- > environ 720 bp
avec les amorces Pi et P5 -------- > environ 1000 bp
avec les amorces P2 et P3 -------- > environ 390 bp
avec les amorces P2 et P4 -------- > environ 420 bp
avec les amorces P2 et P5 -------- > environ 700 bp
C) Amplification d'une partie codante de l'HPPD de P. fluorescens A32.With these five oligonucleotides by PCR, the amplification fragments that must theoretically be obtained according to the SEQ ID No. 1 sequence have the following sizes:
with primers P1 and P3 --------> about 690 bp
with primers P1 and P4 --------> about 720 bp
with primers Pi and P5 --------> about 1000 bp
with primers P2 and P3 --------> about 390 bp
with primers P2 and P4 --------> about 420 bp
with primers P2 and P5 --------> about 700 bp
C) Amplification of a coding part of the HPPD of P. fluorescens A32.
Les amplifications ont été faites sur un appareil PCR PERKIN ELMER 9600 et avec la Taq polymérase PERKIN ELMER avec son tampon dans les conditions standards, c'est à dire pour 501l1 de réaction il y a les dNTP à 200 M, les primers à 20 M, la Taq polymérase 2,5 unités et 1' ADN de P. fluorescens A32 2,5 tig. The amplifications were made on a PERKIN ELMER 9600 PCR apparatus and with the PERKIN ELMER Taq polymerase with its buffer under standard conditions, ie for 501l1 reaction there are the 200 M dNTPs, the 20 M primers. Taq polymerase 2.5 units and DNA of P. fluorescens A32 2.5 μg.
Le programme d'amplification utilisé est, 5 min à 95 C puis 35 cycles < 45 sec 95 C, 45 sec 49 C, 1 min 72"C > suivis de 5 min à 72"C. The amplification program used is 5 min at 95 C then 35 cycles <45 sec 95 C, 45 sec 49 C, 1 min 72 "C> followed by 5 min at 72" C.
Dans ces conditions, tous les fragments d'amplification obtenus ont une taille compatible avec les tailles théoriques données au-dessus, ce qui est une bonne indication de la spécificité des amplifications. Under these conditions, all the amplification fragments obtained have a size compatible with the theoretical sizes given above, which is a good indication of the specificity of the amplifications.
Les fragments d'amplifications obtenus avec les jeux d'amorces P1/P4, P1/P5 et P2/P4 sont ligués dans pBSII SK(-) après digestion de ce plasmide par Eco RV et traitement à la terminal transférase en présence de ddTTP comme décrit dans HOLTON T.A. and
GRAHAM M.W. 1991. N.A.R. vol 19, n 5 pi 156. The amplification fragments obtained with the sets of primers P1 / P4, P1 / P5 and P2 / P4 are ligated in pBSII SK (-) after digestion of this plasmid by Eco RV and treatment with the transferase terminal in the presence of ddTTP as described in HOLTON TA and
GRAHAM MW 1991. NAR Vol 19, n 5 ft 156.
Un clone de chacun des trois types est séquencé partiellement; ceci permet de confirmer qu'on a bien amplifié dans les trois cas une partie de la région codante de l'HPPD de P. fluorescens A32. Le fragment P l/P4 est retenu comme sonde pour cribler une banque génomique partielle de P. fluorescens A32 et isoler le gène complet de l'HPPD. One clone of each of the three types is partially sequenced; this makes it possible to confirm that in all three cases a portion of the P. fluorescens A32 HPPD coding region was amplified. The P1 / P4 fragment is retained as a probe to screen a partial genomic library of P. fluorescens A32 and isolate the complete HPPD gene.
D) Isolement du gène. D) Isolation of the gene.
Par Southern on montre qu'un fragment de 7 Kbp après digestion de l'ADN de P. By Southern it is shown that a fragment of 7 Kbp after digestion of the DNA of P.
fluorescens A32 par l'enzyme de restriction BamHI s'hybride avec la sonde HPPD P1/P4.A32 fluorescens by the BamHI restriction enzyme hybridizes with the HPPD P1 / P4 probe.
On a donc fait digérer 400cl d'ADN de P. fluorescens A32 par l'enzyme de restriction
BamHI et purifier surgel d'agarose les fragments d'ADN faisant environ 7Kbp.Thus, 400 μl of P. fluorescens A32 DNA was digested with the restriction enzyme
BamHI and purify agarose agarose DNA fragments making about 7Kbp.
Ces fragments sont ligués dans pBSII SK(-), lui-même digéré par Barn HI et déphosphorylé par traitement à la phosphatase alcaline. Après transformation dans E. coli
DHlOb, la banque génomique partielle est criblée avec la sonde HPPD P1/P4.These fragments are ligated into pBSII SK (-), itself digested with Barn HI and dephosphorylated by alkaline phosphatase treatment. After transformation in E. coli
DH10b, the partial genomic library is screened with the HPPD P1 / P4 probe.
Un clone positif a été isolé et appelé pRP A. Sa carte simplifiée est donnée figure 1
Sur cette carte est indiqué la position de la partie codante du gène HPPD. Elle est composée de 1077 nucléotides qui codent pour 358 acides aminés (voir SEQ ID N" 2 ).A positive clone was isolated and named pRP A. Its simplified map is given in Figure 1
On this map is indicated the position of the coding part of the HPPD gene. It is composed of 1077 nucleotides which encode 358 amino acids (see SEQ ID No. 2).
L'HPPD de P. fluorescens A32 présente une bonne homologie en acides aminés avec celle de Pseudomonas sp. strain P.J. 874, il y a en effet 92% d'identité entre ces deux protéines ( voir SEQ ID N" 3 ).The HPPD of P. fluorescens A32 has good amino acid homology with that of Pseudomonas sp. strain P.J. 874, there is indeed 92% identity between these two proteins (see SEQ ID No. 3).
Exemple 2: Construction de deux gènes chimères. Example 2 Construction of two chimeric genes
Pour conférer la résistance de plantes aux herbicides inhibant l'HPPD, on construit deux gènes chimères:
Le premier consiste à mettre la partie codante du gène de l'HPPD de P. fluorescens
A32 sous le controle du promoteur double histone (Brevet européennne N" 0 507 698)
suivi du Tobacco etch virus translational enhancer (TEV) (pRTL-GUS (Carrington and
Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597)) avec le terminateur du gène de la nopaline synthase.To confer plant resistance to HPPD inhibiting herbicides, two chimeric genes are constructed:
The first is to put the coding part of the P. fluorescens HPPD gene
A32 under the control of the double histone promoter (European Patent No. 0 507 698)
Tobacco etch virus translational enhancer (TEV) monitoring (pRTL-GUS (Carrington and
Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597)) with the terminator of the nopaline synthase gene.
L'HPPD sera alors localisée dans le cytoplasme. HPPD will then be localized in the cytoplasm.
Le deuxiéme sera identique au premier, à ceci près qu'entre activateur de trancription
TEV et la partie codante de l'HPPD, on intercale le peptide de transit optimisé (OTP)
(Demande européennne EP n" 0 508 909). L'HPPD sera alors localisée dans le chloroplaste.The second will be identical to the first one, except that between activator of trancription
TEV and the coding part of the HPPD, the optimized transit peptide (OTP) is intercalated
(European Application EP 0 508 909) The HPPD will then be localized in the chloroplast.
A) Construction du vecteur pRPA-RD-153:
- pRPA-RD-ll: Un dérivé de pBS-II SK(-) (Stratagene catalog #212206) contenant le
site de polyadenylation de la nopaline synthase (NOS polyA) ( Demande européennne EP
n" 0 652 286) est cloné entre les sites Kpnl et Sall. Le site KpnI est transformé en un site
NotI par traitement avec la T4 ADN polymerase I en presence de 150 pM
dedeoxynucleotide triphoshates puis ligation avec un linker NotI (Stratagene catalog
#1029). Ainsi on obtient une cassettte de clonage NOS polyA. A) Construction of the vector pRPA-RD-153:
pRPA-RD-11: A derivative of pBS-II SK (-) (Stratagene catalog # 212206) containing the
polyadenylation site of nopaline synthase (NOS polyA) (European Application EP
No. 0 652 286) is cloned between the KpnI and SalI sites The KpnI site is transformed into a site
NotI by treatment with T4 DNA polymerase I in the presence of 150 μM
dedeoxynucleotide triphoshates then ligation with a NotI linker (Stratagene catalog
&Num; 1029). Thus we obtain a NOS polyA cloning cassette.
- pRPA-RD-127: Un dérivé de pRPA-BL-466 (Demande européennne EP n 0 337 899) cloné dans pRPA-RD- 11 créant une cassette d'expression du gène oxy et contenant le promoteur de la petite sous unité de la ribulose-biscarboxylase:
"promoteur (SSU) - oxy gene - NOS polyA"
Pour créer ce plasmide, pRPA-BL-466 a été digéré avec XbaI et HindIII pour isoler un fragment de 1.9 kbp contenant le promoteur SSU et le gène oxy qui a été ligué dans le plasmide pRPA-RD- 11 digéré avec des enzymes compatibles.pRPA-RD-127: A derivative of pRPA-BL-466 (European Application EP 0 337 899) cloned into pRPA-RD-11 creating an expression cassette of the oxy gene and containing the promoter of the small subunit of ribulose-biscarboxylase:
"promoter (SSU) - oxy gene - NOS polyA"
To create this plasmid, pRPA-BL-466 was digested with XbaI and HindIII to isolate a 1.9 kbp fragment containing the SSU promoter and the oxy gene that was ligated into plasmid pRPA-RD-11 digested with compatible enzymes.
- pRPA-RD- 132: C'est un dérivé de pRPA-BL-488 (Demande européennne EP n 0 507 698) cloné dans pRPA-RD-127 avec création d'une cassette d'expression du gène oxy avec le promoteur double histone:
"promoteur double histone - oxy gene - NOS polyA
Pour fabriquer ce plasmide, pRPA-BL-466 est digéré par HindIII, traité par la Klenow puis redigéré avec NcoI. Le fragment de 1.35 kbp purifié contenant le promoteur double histone H3A748 est ligué avec le plasmide pRPA-RD-127 qui avait été digéré par XbaI, traité Klenow et redigéré par NcoI.pRPA-RD-132: It is a derivative of pRPA-BL-488 (European Application EP 0 507 698) cloned into pRPA-RD-127 with creation of an expression cassette of the oxy gene with the double promoter histone:
"double histone promoter - oxy gene - NOS polyA
To make this plasmid, pRPA-BL-466 is digested with HindIII, treated with Klenow and then redigested with NcoI. The purified 1.35 kbp fragment containing the double histone promoter H3A748 is ligated with the plasmid pRPA-RD-127 which had been digested with XbaI, Klenow treated and redigested with NcoI.
- pRPA-RD-153: C'est un derivé de pRPA-RD-132 contenant l'activateur de translation du virus etch du tabac (TEV). pRTL-GUS (Carrington and Freed, 1990; J. pRPA-RD-153: This is a derivative of pRPA-RD-132 containing the translation activator of etch tobacco virus (TEV). pRTL-GUS (Carrington and Freed, 1990;
Virol. 64: 1590-1597) est digéré avec Ncol and EcoRI et le fragment de 150 bp est ligué dans pRPA-RD-132 digéré avec les mêmes enzymes. Donc on a créé une cassette d'expression contenant le promoteur:
"double histone promoter - TEV -oxy gene - NOS polyA"
B) Construction du vecteur pRPA-RD-185:
pUC19/GECA:Un dérivé de pUC-19 (Gibco catalog #15364-011) contenant de nombreux sites de clonage. pUC-19 est digéré avec EcoRI et ligué avec I'oligonucleotide linker 1:
Linker 1: AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG
CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGAT CCCCCGGGC TTAA
Le clone sélectionné contient un site EcoRI suivi du polylinker qui contient les sites suivants: EcoRI, Apal, Avrll, Pmel, Sfil, SacI, Kpnl, Semai, BamHI, Xbal, Sali, PstI, Sphl et
HindIII.Virol. 64: 1590-1597) is digested with Ncol and EcoRI and the 150 bp fragment is ligated into pRPA-RD-132 digested with the same enzymes. So we created an expression cassette containing the promoter:
"double histone promoter - TEV -oxy gene - NOS polyA"
B) Construction of the vector pRPA-RD-185:
pUC19 / GECA: A derivative of pUC-19 (Gibco catalog # 15364-011) containing numerous cloning sites. pUC-19 is digested with EcoRI and ligated with oligonucleotide linker 1:
Linker 1: AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG
CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGAT CCCCCGGGC TTAA
The selected clone contains an EcoRI site followed by the polylinker which contains the following sites: EcoRI, ApaI, AvrII, Pmel, SfiI, SacI, KpnI, Semai, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI and
HindIII.
pRPA-RD-185: c'est un dérivé de pUCl9/GECA contenant un polylinker modifié. pRPA-RD-185: it is a derivative of pUCl9 / GECA containing a modified polylinker.
pUC19/GECA est digéré par HindlII et ligué avec l'oligonucleotide linker 2:
Linker 2: AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCT GGTTCAGGG
AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA
Le clone sélectionné contient un site Hindi!! site au milieu du polylinker qui contient maintenant les sites suivants: EcoRI, Apal, AvrII, Pmel, Sfil, Sacl, Kpnl, Smal,
BamHI, Xbal, Sali, Pstl, Sphl, Hindi!!, PacI, Ascl Xhol et EcoNI.pUC19 / GECA is digested with HindIII and ligated with oligonucleotide linker 2:
Linker 2: AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCT GGTTCAGGG
AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA
The selected clone contains a Hindi site !! site in the middle of the polylinker which now contains the following sites: EcoRI, Apal, AvrII, Pmel, SfiI, SacI, KpnI, SmaI,
BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI, HindIII, PacI, Ascl XhoI and EcoNI.
C) Construction du vecteur pRP T:
- pRP O: un dérivé de pRPA-RD-153 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD - terminateur Nos. Pour fabriquer pRP O, pRPA-RD153 est digéré par Hind m, traité par la Klenow puis redigéré par NcoI pour enlever le gène oxy et le remplacer par le gène HPPD sorti du plasmide pRP A par digestion BstEII, traitement par la Klenow et redigestion par NcoI.C) Construction of the pRP T vector:
pRP O: a derivative of pRPA-RD-153 containing an expression cassette of HPPD, double histone promoter - TEV - HPPD gene - Nos terminator. To make pRP O, pRPA-RD153 is digested with Hind III, treated with Klenow and then redigrated with NcoI to remove the oxy gene and replace it with the HPPD gene extracted from plasmid pRP A by BstEII digestion, Klenow treatment and redigestion by NcoI.
- pRP R: pour l'obtenir le plasmide pRP O a été digéré par PvuII et SacI, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pRPA-RD-185 lui-même digéré par PvuII et SacI. pRP R: to obtain the plasmid pRP O was digested with PvuII and SacI, the chimeric gene was purified and then ligated into pRPA-RD-185 itself digested with PvuII and SacI.
- pRP T: il a été obtenu par ligation du gène chimère sorti de pRP R après digestion par SacI et Hindllî dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 digéré par les mêmes enzymes(Demande européennne EP n 0 508 909). pRP T: it was obtained by ligation of the chimeric gene extracted from pRP R after digestion with SacI and HindIII in the plasmid pRPA-BL 150 alpha2 digested with the same enzymes (European Application EP 0 508 909).
Le gène chimère du vecteur binaire pRP T a donc la structure suivante:
<tb> Promoteur <SEP> double <SEP> histone <SEP> TEV <SEP> Région <SEP> codante <SEP> de <SEP> 1'HPPD <SEP> | <SEP> Terminateur <SEP> nos <SEP>
<tb>
D) Construction du vecteur pRP V:
- pRP P: c'est un dérivé de pRPA-RD-7 (Demande européennne EP n 0 652 286) contenant le peptide de transit optimisé suivi du gène de l'HPPD. Il a été obtenu par ligation de la partie codante de 1'HPPD sorti de pRP A par digestion BstEII et NcoI, traitement à la Klenow et du plasmide pRPA-RD-7 lui-même digéré SphI et AccI et traité à la DNAse polymérase T4.<tb> Promoter <SEP> double <SEP> histone <SEP> TEV <SEP> Region <SEP> coding <SEP> of <SEP>1'HPPD<SEP> | <SEP> Terminator <SEP> our <SEP>
<Tb>
D) Construction of the pRP V vector:
pRP P: it is a derivative of pRPA-RD-7 (European Application EP 0 652 286) containing the optimized transit peptide followed by the HPPD gene. It was obtained by ligation of the coding part of the hPPD taken out of pRP A by BstEII and NcoI digestion, Klenow treatment and plasmid pRPA-RD-7 itself digested SphI and AccI and treated with T4 DNAse polymerase. .
- pRP Q: un dérivé de pRPA-RD-153 contenant une cassette d'expression de 1'HPPD, promoteur double histone - TEV - OTP - gène HPPD - terminateur Nos. Pour le construire le plasmide pRPA-RD-153 est digéré par Sal I, traité par la Klenow puis redigéré par NcoI pour enlever le gène oxy et le remplacer par le gène HPPD sorti du plasmide pRP P par digestion BstEII, traitement par la Klenow et redigestion par Ncot. pRP Q: a derivative of pRPA-RD-153 containing an expression cassette for HPPD, double histone promoter - TEV - OTP - HPPD gene - terminator Nos. To construct it, the plasmid pRPA-RD-153 is digested with Sal I, treated with Klenow and then redigested with NcoI to remove the oxy gene and replace it with the HPPD gene extracted from the plasmid pRP P by BstEII digestion, Klenow treatment and redigestion by Ncot.
- pRP S: pour l'obtenir, le plasmide pRP Q a été digéré par PvuII et SacI pour sortir le gène chimère qui a été ligué dans pRPA-RD-185 lui-même digéré par PvutI et SacI. pRP S: to obtain it, the plasmid pRP Q was digested with PvuII and SacI to release the chimeric gene which was ligated into pRPA-RD-185 itself digested with PvutI and SacI.
- pRP V: il a été obtenu par ligation du gène chimère sorti de pRP S après digestion par SacI et HindIII dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 (Demande européennne EP n" 0 508 909). pRP V: it was obtained by ligation of the chimeric gene extracted from pRP S after digestion with SacI and HindIII in the plasmid pRPA-BL 150 alpha2 (European Application EP 0 508 909).
Le gène chimère du vecteur binaire pRP a donc la structure suivante:
<tb> Promoteur <SEP> double <SEP> TEV <SEP> OTP <SEP> Région <SEP> codante <SEP> de <SEP> l'HPPD <SEP> Terminateur <SEP> nos
<tb> <SEP> histone
<tb>
Exemple 3: Transformation du tabac industriel PBD6.<tb> Promoter <SEP> double <SEP> TEV <SEP> OTP <SEP> Region <SEP> coding <SEP> of <SEP> HPPD <SEP> Terminator <SEP> nos
<tb><SEP> histone
<Tb>
Example 3 Transformation of industrial tobacco PBD6.
Afin de déterminer l'efficacité de ces deux gènes chimériques, ceux-ci ont été transférés dans du tabac industriel PBD6 selon les procédures de transformation et de régénération déjà décrites dans la demande européenne EP n" 0 508 909. In order to determine the efficiency of these two chimeric genes, they were transferred into industrial tobacco PBD6 according to the transformation and regeneration procedures already described in the European application EP 0 508 909.
1)Transformation:
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium EHA
101(Hood et al,1987)porteuse du cosmide pTVK 291(Komari et al,1986).La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh et al(1985).1) Transformation:
The vector is introduced into the non-oncogenic strain of Agrobacterium EHA
101 (Hood et al, 1987) carrying the cosmid pTVK 291 (Komari et al, 1986). The transformation technique is based on the procedure of Horsh et al (1985).
2) Régénération:
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/1 de saccharose ainsi que 200ug/ml de kanamycine.Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires(Science
1985,Vol 227,p.1229-1231) en trois étapes successives::la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/l de saccharose contenant 0.05mu/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours.Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/I de saccharose mais ne contenant pas d'hormone, pendant l0jours.Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucres et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours,les pousses enracinées sont passées en terre.2) Regeneration:
The regeneration of the tobacco PBD6 (origin SEITA France) from leaf explants is carried out on a base medium Murashige and Skoog (MS) comprising 30g / l of sucrose and 200ug / ml of kanamycin.The leaf explants are taken from plants in glasshouse or in vitro and processed using the leaf disc technique (Science
1985, Vol 227, p.1229-1231) in three successive steps :: the first comprises the induction of shoots on an MS medium supplemented with 30 g / l of sucrose containing 0.05 mu / l of naphthylacetic acid (ANA) and 2 mg / l of benzylaminopurine (BAP) for 15 days.The shoots formed during this step are then grown by culture on MS medium supplemented with 30 g / l of sucrose but not containing hormone, for 10 days. takes developed shoots and cultivates them on a rooting medium MS containing half salts, vitamins and sugars and not containing any hormone. After about 15 days, the rooted shoots are in the soil.
Exemple 4: Mesure de la résistance du tabac au 4-F4-CF3-2-(méthylsulfovl) benzoyli- 5-cvclopropvl isoxazole. Example 4: Measurement of the resistance of tobacco to 4-F4-CF3-2- (methylsulfovl) benzoyl-5-cyclopropylisoxazole.
Au sortir de l'in-vitro, les plantules de tabac transformées ont été acclimatées à la serre (60% d'humidité relative; température: 20"C la nuit et 23"C la jour) pendant cinq semaines puis traitées au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfoyl)benzoyl]-5-cyclopropyl isoxazole. In vitro, the transformed tobacco seedlings were acclimated to the greenhouse (60% relative humidity, temperature: 20 ° C at night and 23 ° C during the day) for five weeks and then treated in the 4- [4-CF3-2- (methylsulfoyl) benzoyl] -5-cyclopropyl isoxazole.
Le tabac témoin, non transformé et traité au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfoyl)benzoyl]-5- cyclopropyl isoxazole à des doses allant de 50 à 400 g/ha, développe en environ 72 heures des chloroses, qui s'intensifient pour évoluer vers des nécroses très prononcées en une semaine( couvrant environ 80% des feuilles terminales). Control tobacco, unprocessed and treated with 4- [4-CF3-2- (methylsulfoyl) benzoyl] -5-cyclopropylisoxazole at doses ranging from 50 to 400 g / ha, develops in about 72 hours chlorosis, which 'intensify to progress to very pronounced necrosis within one week (covering approximately 80% of the terminal leaves).
Après transformation ce même tabac, qui surexprime l'HPPD de P. fluorescens, est très bien protégé contre un traitement au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfoyl)benzoyl]-5- cyclopropyl isoxazole à la dose de 400 g/ha. After transformation, this same tobacco, which overexpresses P. fluorescens HPPD, is very well protected against treatment with 4- [4-CF3-2- (methylsulfoyl) benzoyl] -5-cyclopropyl isoxazole at a dose of 400 g / ml. Ha.
Si l'enzyme surexprimée est dans le cytoplasme, ctest à dire si la transformation a été faite avec le gène porté par le verteur pRP T, alors la plante présente de très légères chloroses toutes localisées sur les feuilles intermédiaires. If the overexpressed enzyme is in the cytoplasm, that is, if the transformation was made with the gene carried by the pRP T promoter, then the plant has very slight chloroses all localized on the intermediate leaves.
Si l'enzyme surexprimée est dans le chloroplaste, c'est à dire si la transformation a été faite avec le gène porté par le verteur pRP V, alors la plante est parfaitement protégée, ne présente aucun symptôme. If the overexpressed enzyme is in the chloroplast, ie if the transformation was made with the gene carried by the pRP V, then the plant is perfectly protected, has no symptoms.
Les séquences illustrées sont les suivantes:
SEQ. ID N" 1
Séquence protéique de l?HPPD de Pseudomonas sp. strain P.J. 874 et la séquence nucléotidique théorique de la partie codante correspondante; les cinq oligonucléotides choisis pour faire l'amplification d'une partie de cette région codante sont symbolisés par les cinq fléches.The illustrated sequences are as follows:
SEQ. ID No. 1
Protein sequence of HPPD of Pseudomonas sp. strain PJ 874 and the theoretical nucleotide sequence of the corresponding coding portion; the five oligonucleotides chosen to amplify a part of this coding region are symbolized by the five arrows.
SEQ. ID N" 2 Séquence du gène de l'HPPD de Pseudomonas fluorescens A32 et séquence déduite de la protéine corresponte.SEQ. ID No. 2 Sequence of the HPPD gene of Pseudomonas fluorescens A32 and sequence deduced from the corresponding protein.
SEQ. ID N" 3:
Comparaison des séquences en acides aminés de 1' HPPD de P. fluorescens A32 et de l'HPPD de Pseudomonas sp strain P.J. 874 (seuls les acides aminés divergents entre les deux séquences sont indiqués) ainsi que la séquence consensus.SEQ. ID No. 3:
Comparison of the amino acid sequences of P. fluorescens A32 HPPD and Pseudomonas sp strain PJ 874 HPPD (only the amino acids diverging between the two sequences are shown) as well as the consensus sequence.
La Figure lreprésente la cartographie du plasmide avec le fragment d'ADN génomique de 7 kb contenant le gène de l'HPPD de
P. fluorescens A32. Figure 1 shows the mapping of the plasmid with the 7 kb genomic DNA fragment containing the HPPD gene of
P. fluorescens A32.
Liste de séquences
SEQ. ID N 1
SEQ. ID N 1
<tb> GCNGAYYTNTAYGARAAtCCNATGG <SEP> GNYTNATGGGNTTYGARTTtATHGA <SEP> RYTNGCNWSNCCNACNCCMAAYACN <SEP> 75
<tb> A <SEP> D <SEP> L <SEP> Y <SEP> E <SEP> N <SEP> P <SEP> M <SEP> G <SEP> > <SEP> M <SEP> G <SEP> F <SEP> E <SEP> F <SEP> I <SEP> E <SEP> L <SEP> A <SEP> S <SEP> P <SEP> T <SEP> P <SEP> N <SEP> T
<tb> YTNGARCCNATH <SEP> m <SEP> GARATHATGG <SEP> GNTTYACNAARGTNGCNACNCAYMG <SEP> NWSNAARGAYGTNCAYYTMTAYMGN <SEP> 158
<tb> L <SEP> E <SEP> P <SEP> I <SEP> F <SEP> E <SEP> I <SEP> M <SEP> G <SEP> F <SEP> T <SEP> K <SEP> V <SEP> A <SEP> T <SEP> H <SEP> R <SEP> S <SEP> K <SEP> D <SEP> V <SEP> H <SEP> L <SEP> Y <SEP> R
<tb> CARGGNGCNATHAAWTNATHYTNA <SEP> AYAAYGARCCNCAYWSNGTNGCNWS <SEP> NTAYlTYG(NGCNGARCAYGGN(CN <SEP> 225
<tb> Q <SEP> G <SEP> A <SEP> I <SEP> N <SEP> L <SEP> I <SEP> L <SEP> N <SEP> N <SEP> E <SEP> P <SEP> H <SEP> S <SEP> V <SEP> A <SEP> S <SEP> Y <SEP> F <SEP> A <SEP> A <SEP> E <SEP> H <SEP> G <SEP> P
<tb> WSNGTNT6YGGNATGGCNT <SEP> YM6NG <SEP> TNAARGAYWSNCARAARGCMTAYAA <SEP> RMGNGCMYTNGARYTNGGNGCNCAR <SEP> 388
<tb> S <SEP> V <SEP> C <SEP> G <SEP> M <SEP> A <SEP> F <SEP> R <SEP> V <SEP> K <SEP> D <SEP> S <SEP> Q <SEP> K <SEP> A <SEP> Y <SEP> K <SEP> R <SEP> A <SEP> L <SEP> E <SEP> L <SEP> 6 <SEP> A <SEP> Q
<tb> CCNATHCAYATHGARACNGGNCCNA <SEP> TGGARYTNAAYtTNCCNGCNATHAA <SEP> RGGMATHGGNGGNGCNCCMYTNTAY <SEP> 375
<tb> P <SEP> I <SEP> H <SEP> I <SEP> E <SEP> T <SEP> G <SEP> P <SEP> M <SEP> E <SEP> > <SEP> N <SEP> L <SEP> P <SEP> A <SEP> I <SEP> K <SEP> G <SEP> I <SEP> G <SEP> G <SEP> A <SEP> P <SEP> L <SEP> Y
<tb> YTMATHGAYMGNtUYGGNGARGGNW <SEP> SNWSNATHTAYGAYATNGAYHYGT <SEP> NTTYYTNGARGGN6TNGAYMGNCAY <SEP> 456
<tb> K <SEP> I <SEP> D <SEP> R <SEP> F <SEP> G <SEP> E <SEP> G <SEP> S <SEP> S <SEP> I <SEP> Y <SEP> D <SEP> I <SEP> D <SEP> F <SEP> V <SEP> F <SEP> L <SEP> E <SEP> C <SEP> V <SEP> D <SEP> R <SEP> H
<tb> CCNGTNGGNGCNGGMYTMAARATHA <SEP> THGAtCAYYTNACNCAtAAYGTNTA <SEP> YMGN66NMGNAT6GCNTAYTGGGCN <SEP> 5t5
<tb> P <SEP> V <SEP> G <SEP> A <SEP> G <SEP> L <SEP> K <SEP> I <SEP> I <SEP> D <SEP> H <SEP> L <SEP> T <SEP> H <SEP> N <SEP> V <SEP> Y <SEP> R <SEP> G <SEP> R <SEP> M <SEP> A <SEP> Y <SEP> W <SEP> A
<tb> AAYTTYTAYGARAARYTNTTYAAYT <SEP> TY9GNGARATHUGNTAYTTYGAYAT <SEP> HAARGGNGARTAYACNGGNYTMACN
<tb> N <SEP> F <SEP> Y <SEP> E <SEP> K <SEP> L <SEP> F <SEP> N <SEP> F <SEP> R <SEP> E <SEP> I <SEP> R <SEP> Y <SEP> F <SEP> D <SEP> I <SEP> K <SEP> G <SEP> E <SEP> Y <SEP> T <SEP> G <SEP> L <SEP> T
<tb> WSNAARGCNATGACNGCNCCNGAYG <SEP> GNATGATHMGNATHCCNYTNAAYGA <SEP> RGARWSNwSMAARGGNGCNGGNCAR <SEP> 675
<tb> S <SEP> K <SEP> A <SEP> M <SEP> T <SEP> A <SEP> P <SEP> D <SEP> G <SEP> u <SEP> I <SEP> R <SEP> I <SEP> P <SEP> L <SEP> N <SEP> E <SEP> E <SEP> S <SEP> S <SEP> K <SEP> G <SEP> A <SEP> 6 <SEP> Q
<tb> ATHGARGARTTYYTNAT6CARTTYA <SEP> AYGGNGARGGNATHCARCAYGTNGC <SEP> NmYTwWSNGAYGAYYTNATHAAR <SEP> 75e
<tb> IEEFLMQFN <SEP> G <SEP> E <SEP> 6 <SEP> I <SEP> Q <SEP> H <SEP> V <SEP> A <SEP> F <SEP> L <SEP> S <SEP> D <SEP> D <SEP> L <SEP> I <SEP> K
<tb> ACNTGGGAYCAYYTNAARWSNATHG <SEP> GNATGMGNTTYATGACNGCNCCNCC <SEP> NGAYACNTAYTAYGARATGYTNGAR <SEP> 8t5
<tb> T <SEP> W <SEP> D <SEP> H <SEP> L <SEP> K <SEP> S <SEP> I <SEP> G <SEP> M <SEP> R <SEP> F <SEP> U <SEP> T <SEP> A <SEP> P <SEP> P <SEP> D <SEP> T <SEP> Y <SEP> Y <SEP> E <SEP> M <SEP> L <SEP> E
<tb> GGNMGNYTNCCNAAYCAYGGNGARC <SEP> CNGTNGGNGARYTNCARGCNMGNGG <SEP> NATHYTNYTNGAYGGNWSNWSNGAR <SEP> 988
<tb> GR <SEP> L <SEP> PNH <SEP> G <SEP> E <SEP> P <SEP> V <SEP> G <SEP> ELQA <SEP> RG <SEP> IL <SEP> L <SEP> DG <SEP> S <SEP> SE
<tb> WSNGGNGAYAARMGNYTNYTNYTNC <SEP> ARATHTTYWSNGARACNYTNAT6GG <SEP> NCCNGTN <SEP> m <SEP> TTYGARTTYATHCAR <SEP> 975
<tb> S <SEP> G <SEP> D <SEP> K <SEP> R <SEP> L <SEP> L <SEP> L <SEP> Q <SEP> I <SEP> F <SEP> S <SEP> E <SEP> T <SEP> L <SEP> M <SEP> G <SEP> P <SEP> V <SEP> F <SEP> F <SEP> E <SEP> F <SEP> I <SEP> Q
<tb> MGNAARGGNGAYGAYGGNTtYGGNG <SEP> ARG6NAAYTTYAARGCNYTNTTYGA <SEP> RwSNATHGARMGNGAYCARGGN <SEP> les
<tb> R <SEP> K <SEP> 6 <SEP> D <SEP> D <SEP> G <SEP> F <SEP> G <SEP> E <SEP> 6 <SEP> N <SEP> F <SEP> K <SEP> A <SEP> L <SEP> F <SEP> E <SEP> S <SEP> I <SEP> E <SEP> R <SEP> D <SEP> Q <SEP> V <SEP> R
<tb> MGNGGNGTNYTNWSNACNGAY <SEP> 171
<tb> RGV <SEP> LSTD
<tb>
SEQ.ID N 2
ATGGCAGATCTATACGAAAACCCAA TGGGCCTGATGGGCTTTGAATTCAT CGAATTCGCGTCGCCGACGCCGGGT 75
M A D L Y E N P M G L M G F E F I E F A S P T P G
ACCCTGGAGCCGATCTTCGAGATCA TGGGCTTCACCAAAGTCGCGACCCA CCGTTCCAAGAACGTGCACCTGTAC 150
T L E P I F E I M G F T K V A T H R S K N V H L Y
CGCCAGGGCGAGATCAACCTGATCC TCAACAACGAGCCCAACAGCATCGC CTCCTACTTTGCGGCCGAACACGGC 225
R Q G E I N L I L N N E P N S I A S Y F A A E H G
CCGTCGGTGTGCGGCATGGCGTTCC GCGTGAAGGACTCGCAAAAGGCCTA CAACCGCGCCCTGGAACTCGGCGCC 3ee
P S V C G M A F R V K D S Q K A Y N R A L E L G A
CAGCCGATCCATATTGACACCGGGC CGATGGAATTGAACCTGCCGGCGAT CAAGGGCATCGGCGGCGCGCCGTTG 375 Q P I H I D T G P M E L N L P A I K G I G G A P L
TACCTGATCGACCGTTTCGGCGAAG GCAGCTCGATCTACGACATCGACTT CGTGTACCTCGAAGGTGTGGAGCGC 450
Y L I D R F G E G S S I Y D I D F V Y L E G V E R
AATCCGGTCGGTGCAGGTCTCAAAG TCATCGACCACCTGACCCACAACGT CTATCGCGGCCGCATGGTCTACTGG 525
N P V G A G L K V I D H L T H N V Y R G R M V Y W
GCCAACTTCTACGAGAAATTGTTCA ACTTCCGTGAAGCGCGTTACTTCGA TATCAAGGGCGAGTACACCGGCCTG 600
A N F Y E K L F N F R E A R Y F D I K G E Y T G L
ACTTCCAAGGCCATGAGTGCGCCGG ACGGCATGATCCGCATCCCGCTGAA CGAAGAGTCGTCCAAGGGCGCGGGG 675
T S K A M S A P D G M I R I P L N E E S S K G A G
CAGATCGAAGAGTTCCTGATGCAGT TCAACGGCGAAGGCATCCAGCACGT GGCGTTCCTCACCGACGACCTGGTC 75e
Q I E E F L M Q F N G E G I Q H V A F L T D D L V
AAGACCTGGGACGCGTTGAAGAAAA TCGGCATGCGCTTCATGACCGCGCC GCCAGACACTTATTACGAAATGCTC 825
K T W D A L K K I G M R F M T A P P D T Y Y E M L
GAAGGCCGCCTGCCTGACCACGGCG AGCCGGTGGATCAACTGCAGGCACG CGGTATCCTGCTGGACGGATCTTCC 900
E G R L P D H G E P V D Q L Q A R G I L L D G S S
GTGGAAGGCGACAAACGCCTGCTGC TGCAGATCTTCTCGGAAACCCTGAT GGGCCCGGTGTTCTTCGAATTCATC 975
V E G D K R L L L Q I F S E T L M G P V F F E F I
CAGCGCAAGGGCGACGATGGGTTTG GCGAGGGCAACTTCAAGGCGCTGTT CGAGTCCATCGAACGTGACCAGGTG 1050
Q R K G D D G F G E G N F K A L F E S I E R D Q V
CGTCGTGGTGTATTGACCGCCGATT AA 177 RRGV LTAD
SEQ. ID N 3
Consensus .ADLYENPMG LMGFEFIE.A SPTP.TLEPI FEIMGFTKVA THRSK.VHLY 50
P. fluorescens M......... ........F. ....G..... .......... .....N.... 50
Pseudomonas sp. -......... ........L. ....N..... .......... .....D.... 49
Consensus RQG.INLILN NEP.S.ASYF AAEHGPSVCG MAFRVKDSQK AY.RALELGA 100
P. fluorescens ...E...... ...N.I.... .......... .......... ..N....... 100
Pseudomonas sp. ...A...... ...H.V.... .......... .......... ..K....... 99
Consensus QPIHI.TGPM ELNLPAIKGI GGAPLYLIDR FGEGSSIYDI DFV.LEGV.R 158
P. fluorescens .....D.... .................... .......... ...Y....E. 150
Pseudomonas sp. .....E.... .......... .......... .......... ...F....D. 149
Consensus .PVGAGLK.I DHLTHNVYRG RM.YWANFYE KLFNFRE.RY FDIKGEYTGL 200
P. fluorescens N.......V. .......... ..V....... .......A.. .......... 200
Pseudomonas sp. H.......I. .......... ..A....... .......I.. .......... 199
Consensus TSKAM.APDG MIRIPLNEES SKGAGQIEEF LMQFNGEGIQ HVAFL.DDL. 250
P. fluorescens .....S.... .......... .......... .......... .....T...V 250
Pseudomonas sp. .....T.... .......... .......... .......... .....S...I 249
Consensus KTWD.LK.IG MRFMTAPPDT YYEMLEGRLP .HGEPV..LQ ARGILLDGSS 300
P. fluorescens ....A..K.. .......... .......... D.....DQ.. .......... 300
Pseudomonas sp. ....H..S.. .......... .......... N.....GE.. .......... 299
Consensus . . GDKRLLLQ IFSETLMGPV FFEFIQRKGD DGFGEGNFKA LFESIERDQV 350
P. fluorescens VE........ .......... .......... .......... .......... 350
Pseudomonas sp. ES........ .......... .......... .......... .......... 349
Consensus RRGVL..D 358
P. fluorescens .....TA. 358
Pseudomonas sp. .....ST. 357
<tb> A <SEP> D <SEP> L <SEP> Y <SEP> E <SEP> N <SEP> P <SEP> M <SEP> G <SEP>><SEP> M <SEP> G <SEP > F <SEP>SEP> SEP
<tb> YTNGARCCNATH <SEP><SEP> GARATHATGG <SEP> GNTTYACNAARGTNGCNACNCAYMG <SEP> NWSNAARGAYGTNCAYYTMTAYMGN <SEP> 158
<tb> L <SEP> E <SEP> I <SEP>SEP> SEP > V <SEP> A <SEP> T <SEP> H <SEP> R <SEP> S <SEP> K <SEP> D <SEP> V <SEP> H <SEP> L <SEP> Y <SEP> R
<tb> CARGGNGCNATHAAWTNATHYTNA <SEP> AYAAYGARCCNCAYWSNGTNGCNWS <SEP> NTAYLTYG (NGCNGARCAYGGN (CN <SEP> 225
<tb> Q <SEP> G <SEP> A <SEP> I <SEP> N <SEP> L <SEP> I <SEP> L <SEP> N <SEP> N <SEP> E <SEP> P <SEP > H <SEP> S <SEP> V <SEP> A <SEP> S <SEP> Y <SEP> F <SEP> A <SEP> A <SEP> E <SEP> H <SEP> G <SEP> P
<tb> WSNGTNT6YGGNATGGCNT <SEP> YM6NG <SEP> TNAARGAYWSNCARAARGCMTAYAA <SEP> RMGNGCMYTNGARYTNGGNGCNCAR <SEP> 388
<tb> S <SEP> V <SEP> C <SEP> G <SEP> M <SEP> A <SEP> F <SEP> R <SEP> V <SEP> K <SEP> D <SEP> S <SEP > Q <SEP> K <SEP> A <SEP> Y <SEP> K <SEP> R <SEP> A <SEP> L <SEP> E <SEP> L <SEP> 6 <SEP> A <SEP> Q
<tb> CCNATHCAYATHGARACNGGNCCNA <SEP> TGGARYTNAAYtTNCCNGCNATHAA <SEP> RGGMATHGGNGGNGCNCCMYTNTAY <SEP> 375
<tb> P <SEP> I <SEP> H <SEP> I <SEP> E <SEP> T <SEP> G <SEP> P <SEP> M <SEP> E <SEP>><SEP> N <SE > L <SEP> P <SEP> A <SEP> I <SEP> K <SEP> G <SEP> I <SEP> G <SEP> G <SEP> A <SEP> P <SEP> L <SEP> Y
<tb> YTMATHGAYMGNtUYGGNGARGGNW <SEP> SNWSNATHTAYGAYATNGAYHYGT <SEP> NTTYYTNGARGGN6TNGAYMGNCAY <SEP> 456
<tb> K <SEP> I <SEP> D <SEP> R <SEP> F <SEP> G <SEP> E <SEP> G <SEP> S <SEP> S <SEP> I <SEP> Y <SEP > D <SEP> I <SEP> D <SEP> F <SEP> V <SEP> F <SEP> L <SEP> E <SEP> C <SEP> V <SEP> D <SEP> R <SEP> H
<tb> CCNGTNGGNGCNGGMYTMAARATHA <SEP> THGAtCAYYTNACNCAtAAYGTNTA <SEP> YMGN66NMGNAT6GCNTAYTGGGCN <SEP> 5t5
<tb> P <SEP> V <SEP> G <SEP> A <SEP> G <SEP> L <SEP> K <SEP> I <SEP> I <SEP> D <SEP> H <SEP> L <SEP > T <SEP> H <SEP> N <SEP> Y <SEP> Y <SEP> Y <SEP> Y <SEP>
<tb> AAYTTYTAYGARAARYTNTTYAAYT <SEP> TY9GNGARATHUGNTAYTTYGAYAT <SEP> HAARGGNGARTAYACNGGNYTMACN
<tb> N <SEP> F <SEP> Y <SEP> E <SEP> K <SEP> L <SEP> F <SEP> N <SEP> F <SEP> R <SEP> E <SEP> I <SEP > R <SEP> Y <SEP> F <SEP> D <SEP> I <SEP> K <SEP> G <SEP> E <SEP> Y <SEP> T <SEP> G <SEP> L <SEP> T
<tb> WSNAARGCNATGACNGCNCCNGAYG <SEP> GNATGATHMGNATHCCNYTNAAYGA <SEP> RGARWSNwSMAARGGNGCNGGNCAR <SEP> 675
<tb> S <SEP> K <SEP> A <SEP> M <SEP> T <SEP> A <SEP> P <SEP> D <SEP> G <SEP> u <SEP> I <SEP> R <SEP > I <SEP> P <SEP> L <SEP> N <SEP> E <SEP> E <SEP> S <SEP> S <SEP> K <SEP> G <SEP> A <SEP> 6 <SEP> Q
<tb> ATHGARGARTTYYTNAT6CARTTYA <SEP> AYGGNGARGGNATHCARCAYGTNGC <SEP> NmYTwWSNGAYGAYYTNATHAAR <SEP> 75th
<tb> IEEFLMQFN <SEP> G <SEP> E <SEP> 6 <SEP> I <SEP> Q <SEP> H <SEP> V <SEP> A <SEP> F <SEP> L <SEP> S <SEP > D <SEP> D <SEP> L <SEP> I <SEP> K
<tb> ACNTGGGAYCAYYTNAARWSNATHG <SEP> GNATGMGNTTYATGACNGCNCCNCC <SEP> NGAYACNTAYTAYGARATGYTNGAR <SEP> 8t5
<tb> T <SEP> W <SEP> D <SEP> H <SEP> L <SEP> K <SEP> S <SEP> I <SEP> G <SEP> M <SEP> R <SEP> F <SEP > U <SEP> T <SEP> A <SEP> P <SEP> P <SEP> D <SEP> T <SEP> Y <SEP> Y <SEP> E <SEP> M <SEP> L <SEP> E
<tb> GGNMGNYTNCCNAAYCAYGGNGARC <SEP> CNGTNGGNGARYTNCARGCNMGNGG <SEP> NATHYTNYTNGAYGGNWSNWSNGAR <SEP> 988
<tb> GR <SEP> L <SEP> PNH <SEP> G <SEP> E <SEP> P <SEP> V <SEP> G <SEP> ELQA <SEP> RG <SEP> IL <SEP> L <SEP > DG <SEP> S <SEP> SE
<tb> WSNGGNGAYAARMGNYTNYTNYTNC <SEP> ARATHTTYWSNGARACNYTNAT6GG <SEP> NCCNGTN <SEP> m <SEP> TTYGARTTYATHCAR <SEP> 975
<tb> S <SEP> G <SEP> D <SEP> K <SEP> R <SEP> L <SEP> L <SEP> L <SEP> Q <SEP> I <SEP> F <SEP> S <SEP > E <SEP> T <SEP> L <SEP> M <SEP> G <SEP> P <SEP> V <SEP> F <SEP> F <SEP> E <SEP> F <SEP> I <SEP> Q
<tb> MGNAARGGNGAYGAYGGNTtYGGNG <SEP> ARG6NAAYTTYAARGCNYTNTTYGA <SEP> RwSNATHGARMGNGAYCARGGN <SEP>
### > K <SEP> A <SEP> L <SEP> F <SEP> E <SEP> S <SEP> I <SEP> E <SEP> R <SEP> D <SEP> Q <SEP> V <SEP> R
<tb> MGNGGNGTNYTNWSNACNGAY <SEP> 171
<tb> RGV <SEP> LSTD
<Tb>
SEQ.ID N 2
ATGGCAGATCTATACGAAAACCCAA TGGGCCTGATGGGCTTTGAATTCAT CGAATTCGCGTCGCCGACGCCGGGT 75
MADLYENPMGLMGFEFIEFAS PTPG
ACCCTGGAGCCGATCTTCGAGATCA TGGGCTTCACCAAAGTCGCGACCCA CCGTTCCAAGAACGTGCACCTGTAC 150
TLEPIFEIMGFTKVATHRSKN VHLY
CGCCAGGGCGAGATCAACCTGATCC TCAACAACGAGCCCAACAGCATCGC CTCCTACTTTGCGGCCGAACACGGC 225
RQGEINLILNNEPNSIASYFA AEHG
CCGTCGGTGTGCGGCATGGCGTTCC GCGTGAAGGACTCGCAAAAGGCCTA CAACCGCGCCCTGGAACTCGGCGCC 3ee
PSVCGMAFRVKDSQKAYNRAL ELGA
CAGCCGATCCATATTGACACCGGGC CGATGGAATTGAACCTGCCGGCGAT CAAGGGCATCGGCGGCGCGCCGTTG 375 QPIHIDTGPMELNLPAIKGIG GAPL
TACCTGATCGACCGTTTCGGCGAAG GCAGCTCGATCTACGACATCGACTT CGTGTACCTCGAAGGTGTGGAGCGC 450
YLIDRFGEGSSIYDIDFVYLE GVER
AATCCGGTCGGTGCAGGTCTCAAAG TCATCGACCACCTGACCCACAACGT CTATCGCGGCCGCATGGTCTACTGG 525
NPVGAGLKVIDHLTHNVYRGR MVYW
GCCAACTTCTACGAGAAATTGTTCA ACTTCCGTGAAGCGCGTTACTTCGA TATCAAGGGCGAGTACACCGGCCTG 600
ANFYEKLFNFREARYFDIKGE YTGL
ACTTCCAAGGCCATGAGTGCGCCGG ACGGCATGATCCGCATCCCGCTGAA CGAAGAGTCGTCCAAGGGCGCGGGG 675
TSKAMSAPDGMIRIPLNEESS KGAG
CAGATCGAAGAGTTCCTGATGCAGT TCAACGGCGAAGGCATCCAGCACGT GGCGTTCCTCACCGACGACCTGGTC 75th
QIEEFLMQFNGEGIQHVAFLT DDLV
AAGACCTGGGACGCGTTGAAGAAAA TCGGCATGCGCTTCATGACCGCGCC GCCAGACACTTATTACGAAATGCTC 825
KTWDALKKIGMRFMTAPPDTY YEML
GAAGGCCGCCTGCCTGACCACGGCG AGCCGGTGGATCAACTGCAGGCACG CGGTATCCTGCTGGACGGATCTTCC 900
EGRLPDHGEPVDQLQARGILL DGSS
GTGGAAGGCGACAAACGCCTGCTGC TGCAGATCTTCTCGGAAACCCTGAT GGGCCCGGTGTTCTTCGAATTCATC 975
VEGDKRLLLQIFSETLMGPVF FEFI
CAGCGCAAGGGCGACGATGGGTTTG GCGAGGGCAACTTCAAGGCGCTGTT CGAGTCCATCGAACGTGACCAGGTG 1050
QRKGDDGFGEGNFKALFESIE RDQV
CGTCGTGGTGTATTGACCGCCGATT AA 177 RRGV LTAD
SEQ. ID N 3
Consensus .ADLYENPMG LMGFEFIE.A SPTP.TLEPI FEIMGFTKVA THRSK.VHLY 50
P. fluorescens M ......... ........ F. .... G ..... .......... ..... N .... 50
Pseudomonas sp. -... ........ L. .... N ..... .......... ..... D .... 49
Consensus RQG.INLILN NEP.S.ASYF AAEHGPSVCG MAFRVKDSQK AY.RALELGA 100
P. fluorescens ... E ...... ... NI ... .......... .......... ..N ....... 100
Pseudomonas sp. ... A ...... ... HV ... .......... .......... ..K ....... 99
Consensus QPIHI.TGPM ELNLPAIKGI GGAPLYLIDR FGEGSSIYDI DFV.LEGV.R 158
P. fluorescens ..... D .... .................... .......... ... Y ... .E. 150
Pseudomonas sp. ..... E .... .......... .......... .......... ... F .... D. 149
Consensus .PVGAGLK.I DHLTHNVYRG RM.YWANFYE KLFNFRE.RY FDIKGEYTGL 200
P. fluorescens N ....... V. .......... ..V ....... ....... A .. .......... 200
Pseudomonas sp. H ....... I. .......... ..A ....... ....... I .. .......... 199
Consensus TSKAM.APDG MIRIPLNEES SKGAGQIEEF LMQFNGEGIQ HVAFL.DDL. 250
P. fluorescens ..... S .... .......... .......... .......... ..... T. ..V 250
Pseudomonas sp. ..... T .... .......... .......... .......... ..... S ... I 249
Consensus KTWD.LK.IG MRFMTAPPDT YYEMLEGRLP .HGEPV..LQ ARGILLDGSS 300
P. fluorescens .... A..K .. .......... .......... D ..... DQ .. ........ .. 300
Pseudomonas sp. .... H..S .. .......... .......... N ..... GE .. .......... 299
Consensus. . GDKRLLLQ IFSETLMGPV FFEFIQRKGD DGFGEGNFKA LFESIERDQV 350
P. fluorescens VE ........ .......... .......... .......... ........ .. 350
Pseudomonas sp. ES ........ .......... .......... .......... .......... 349
Consensus RRGVL..D 358
P. fluorescens ..... TA. 358
Pseudomonas sp. ..... ST. 357
<tb> <SEP> Kpnl/Hlndlll
<tb> <SEP> EcoRi
<tb> <SEP> fi0 <SEP> BamHl
<tb> <SEP> a <SEP> 11fl <SEP> < I <SEP> Nco(
<tb> <SEP> ne'
<tb> <SEP> EcoRV
<tb> bemH1
<tb> <SEP> l <SEP> l <SEP> PRPA
<tb> <SEP> .EcoRV
<tb> <SEP> Nicol,
<tb> <SEP> EcoRi
<tb> <SEP> / <SEP> \ <SEP> sst
<tb> <SEP> Reglon <SEP> codant <SEP> du <SEP> gène <SEP> de
<tb>
Fig. 1 <tb><SEP> Kpnl / Hlndlll
<tb><SEP> EcoRi
<tb><SEP> fi0 <SEP> BamHl
<tb><SEP> a <SEP> 11fl <SEP><I<SEP> Nco (
<tb><SEP> ne '
<tb><SEP> EcoRV
<tb> bemH1
<tb><SEP> l <SEP> l <SEP> PRPA
<tb><SEP> .EcoRV
<tb><SEP> Nicol,
<tb><SEP> EcoRi
<tb><SEP> / <SEP> \ <SEP> sst
<tb><SEP> Reglon <SEP> coding <SEP> of the <SEP> gene <SEP> of
<Tb>
Fig. 1
Claims (21)
Priority Applications (31)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9513570A FR2734841B1 (en) | 1995-06-02 | 1995-11-10 | GENE OF HYDROXY-PHENYL PYRUVATE DIOXYGENASE AND PRODUCTION OF PLANTS CONTAINING THIS GENE RESISTANT TO HERBICIDES |
| FR9605944A FR2734842B1 (en) | 1995-06-02 | 1996-05-07 | DNA SEQUENCE OF A HYDROXY-PHENYL PYRUVATE DIOXYGENASE GENE AND OBTAINING PLANTS CONTAINING A HYDROXY-PHENYL PYRUVATE DIOXYGENASE GENE, TOLERANT TO CERTAIN HERBICIDES |
| MA24253A MA23884A1 (en) | 1995-06-02 | 1996-05-30 | DNA SEQUENCE OF A GENE OF HYDROXY-PHENYL PYRUVATE DIOXYGENASE AND OBTAINING PLANTS, CONTAINING A GENE OF HYDROXY-PHENYL PYRUVATE DIOXYGENASE TOLERANT TO CERTAIN HERBICIDES |
| HR9605944A HRP960245A2 (en) | 1995-06-02 | 1996-05-31 | Dna sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides |
| ARP960102830A AR002169A1 (en) | 1995-06-02 | 1996-05-31 | CHEMICAL GENE THAT EXPRESSES HYDROXY-PHENYL-PYRUVATE-DIOXYGENASE (HPPD), VECTOR, PLANT CELL AND SELECTIVE TREATMENT METHOD WITH HERBICIDES THAT UNDERSTAND IT |
| CNB96195857XA CN1206358C (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | DNA sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides |
| MX9709310A MX9709310A (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | Dna sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides. |
| US08/945,515 US6268549B1 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | DNA sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides |
| BRPI9608375A BRPI9608375C8 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | chimeric gene, vector, plant transformation process and selective herbicidal plant treatment process. |
| TR97/01492T TR199701492T1 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | DNA sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase |
| NZ311055A NZ311055A (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | DNA sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene encoding hydroxy-phenyl pyruvate |
| SK1615-97A SK161597A3 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | Dna sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides |
| BRPI9608375-1A BR9608375B1 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | chimeric gene, vector, plant transformation process and selective herbicidal plant treatment process. |
| EA199700435A EA199700435A1 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | DNA SEQUENCE OF HYDROXYPHENYLPIROVATDIOXYGENASE GENE AND OBTAINING PLANTS CONTAINING HYDROXYPHENYLIPYRUVATDIOXYGENASE GENES, TOLERANT TO SOME HERBICIDES |
| DK96920888T DK0828837T3 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | Chimeric gene comprising a DNA sequence for a gene for hydroxyphenylpyruvate dioxygenase and obtaining plants containing a gene for hydroxyphenylpyruvate dioxygenase and resistant to certain herbicides |
| CA2219979A CA2219979C (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | Dna sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides |
| HU9900450A HUP9900450A3 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | Dna sequence of a gene hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides |
| CO96028597A CO4520296A1 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | DNA SEQUENCE OF A GENE OF HYDROXY-PHENYL-PYRUVATE-DIOXYGENASE AND OBTAINING OF PLANTS CONTAINING A GENE OF HYDROXY-PHENYL-PIRUVATE-DIOXYGENASE, TOLERANT TO CERTAIN HERBICIDES |
| JP8536268A JPH11505729A (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | DNA sequence of the gene for hydroxy-phenylpyruvate dioxygenase, and production of plants containing the gene for hydroxy-phenylpyruvate dioxygenase, which are resistant to certain herbicides |
| ES96920888T ES2297840T3 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | CHEMICAL GENE THAT INCLUDES A DNA SEQUENCE OF A HYDROXY-PHENYL-PIRUVATO-DIOXYGENASE GENE AND OBTAINING PLANTS CONTAINING A HYDROXY-PHENYL-PIRUVATO-DIOXYGENASE GENE, TOLERATING TO SOME HERBICIANS. |
| AU62286/96A AU718982B2 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | DNA sequence of a hydroxyphenylpyruvate dioxygenase gene and obtainment of plants comprising a hydroxyphenylpyruvate dioxygenase gene, which are tolerant to certain herbicides |
| KR1019970708731A KR100431366B1 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | Dna sequence of a gene of hydroxy phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides |
| CZ973809A CZ380997A3 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | Dna sequence of hydroxyphenylpyruvate-dioxygenase gene and process for obtaining plants containing the hydroxyphenylpyruvate-dioxygenase gene and being tolerant to specific herbicides |
| SI9630760T SI0828837T1 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | Chimeric gene comprising a dna sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides |
| PL96323679A PL189955B1 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | Dna sequence of hydroxyphenylpyrogronate dioxygenase gene and production of plants containing that gene and resistant to some herbicides |
| EP96920888A EP0828837B1 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | Chimeric gene comprising a dna sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides |
| PT96920888T PT828837E (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | Chimeric gene comprising a dna sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides |
| DE69637402T DE69637402T2 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | CHIMAIR GENE, CONTAINING A HYDROXY-PHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE GENE ENCODING DNA SEQUENCE, AND PRODUCING THESE HERBICIDE RESISTANCES CONTAINING |
| PCT/FR1996/000831 WO1996038567A2 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | Dna sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides |
| AT96920888T ATE383431T1 (en) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | CHIMERIC GENE CONTAINING A DNA SEQUENCE ENCODING A HYDROXY-PHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE GENE AND PRODUCING PLANTS CONTAINING HERBICIDE RESISTANCE |
| BG102131A BG102131A (en) | 1995-06-02 | 1997-12-18 | Dna sequence of a hydroxyphenyl pyruvatedioxygenase gene and the preparation of plants containing a gene of hydroxyphenyl pyruvateoxygenase, tolerent to some herbicides |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9506800A FR2734840B1 (en) | 1995-06-02 | 1995-06-02 | GENE OF HYDROXY-PHENYL PYRUVATE DIOXYGENASE AND PRODUCTION OF PLANTS CONTAINING THIS GENE RESISTANT TO HERBICIDES |
| FR9513570A FR2734841B1 (en) | 1995-06-02 | 1995-11-10 | GENE OF HYDROXY-PHENYL PYRUVATE DIOXYGENASE AND PRODUCTION OF PLANTS CONTAINING THIS GENE RESISTANT TO HERBICIDES |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2734841A1 true FR2734841A1 (en) | 1996-12-06 |
| FR2734841B1 FR2734841B1 (en) | 1998-03-13 |
Family
ID=26232015
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9513570A Expired - Lifetime FR2734841B1 (en) | 1995-06-02 | 1995-11-10 | GENE OF HYDROXY-PHENYL PYRUVATE DIOXYGENASE AND PRODUCTION OF PLANTS CONTAINING THIS GENE RESISTANT TO HERBICIDES |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2734841B1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0507698A1 (en) * | 1991-03-05 | 1992-10-07 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Histone promotors |
| EP0508909A1 (en) * | 1991-03-05 | 1992-10-14 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Chimeric gene for the transformation of plants |
| EP0614970A2 (en) * | 1993-02-25 | 1994-09-14 | Hoechst Schering AgrEvo GmbH | Hydroxyphenylpyruvate-dioxygenase inhibitors and assay for the identification of the enzyme |
| EP0652286A1 (en) * | 1993-11-10 | 1995-05-10 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Promoter elements of chimaeric alpha tubulingenes |
-
1995
- 1995-11-10 FR FR9513570A patent/FR2734841B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0507698A1 (en) * | 1991-03-05 | 1992-10-07 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Histone promotors |
| EP0508909A1 (en) * | 1991-03-05 | 1992-10-14 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Chimeric gene for the transformation of plants |
| EP0614970A2 (en) * | 1993-02-25 | 1994-09-14 | Hoechst Schering AgrEvo GmbH | Hydroxyphenylpyruvate-dioxygenase inhibitors and assay for the identification of the enzyme |
| EP0652286A1 (en) * | 1993-11-10 | 1995-05-10 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Promoter elements of chimaeric alpha tubulingenes |
Non-Patent Citations (12)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2734841B1 (en) | 1998-03-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0828837B1 (en) | Chimeric gene comprising a dna sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides | |
| EP0507698B1 (en) | Histone promotors | |
| JP4683923B2 (en) | Transformed plant with high prenylquinone biosynthesis ability | |
| EP1217073B1 (en) | Transformed plants with improved tolerance to phosphomethylglycine family herbicides containing a gene encoding a mutated 5-enolpyruvylshikimate-3-phophate synthase | |
| CA2261094C (en) | Chimera gene with several herbicide resistant genes, plant cell and plant resistant to several herbicides | |
| MXPA97009310A (en) | Dna sequence of a hydroxypenyl-piruvate-dioxygenase gene and obtaining plants containing a gene of hydroxypenyl-piruvate-dioxygenase, tolerants at certain herbici | |
| JP2001522608A (en) | Obtaining mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequences and herbicide-tolerant plants containing said genes | |
| EP1042491A1 (en) | Maize h3c4 promoter associated with first rice actin intron, chimeric gene containing it and transformed plant | |
| JP6486505B2 (en) | Herbicide resistant proteins, their coding genes and uses | |
| FR2771104A1 (en) | Chimeric gene for imparting herbicide resistance to plants | |
| JP2001509376A (en) | Methods and compositions for producing plants and microorganisms expressing feedback-insensitive threonine dehydratase / deaminase | |
| CA2167228A1 (en) | Herbicide-tolerant transgenic plant | |
| RU2169196C2 (en) | Deoxyribonucleic acid encoding protein glutathione-s-transferase iiic and protein with corresponding amino acid sequence | |
| FR2734840A1 (en) | New sequences encoding hydroxy-phenyl pyruvate di:oxygenase | |
| FR2734841A1 (en) | New sequences encoding hydroxy-phenyl pyruvate di:oxygenase | |
| AU760662B2 (en) | DNA sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides | |
| AU1707801A (en) | Compositions and methods for halogenation reactions | |
| FR2784393A1 (en) | Producing transgenic plants expressing a hydrogen peroxide-producing protein, useful for imparting pathogen resistance or as marker for transformation with second gene | |
| JPH1118776A (en) | Protoporphyrinogen oxidase gene and its use | |
| ZA200204750B (en) | Compositions and methods for halogenation reactions. |