FR2731230A1 - MONO AND POLYCLONAL ANTIBODIES DIRECTED AGAINST E2 PROTEIN REGION 63-75 - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention concerne des anticorps monoclonaux et plus particulièrement des anticorps monoclonaux dirigés contre la région s'étendant du résidu 63 au résidu 75 de la protéine E2 ; leur procédé de fabrication et leur utilisation sous forme de médicament ou sous forme de kit en vue de la détection diagnostique ou thérapeutique de cellules présentant E2. The present invention relates to monoclonal antibodies and more particularly to monoclonal antibodies directed against the region extending from residue 63 to residue 75 of the E2 protein; their manufacturing process and their use in the form of a medicament or in the form of a kit for the diagnostic or therapeutic detection of cells having E2.
Le premier gène pseudoautosomal connu chez l'homme est le gène MIC 2. Ce gène est localisé sur la partie terminale du bras court du chromosome X (Xp22.32-p ter) et sur la région distale du bras court du chromosome Y(Ypll.2p ter). The first known pseudoautosomal gene in humans is the MIC 2 gene. This gene is located on the terminal part of the short arm of the X chromosome (Xp22.32-p ter) and on the distal region of the short arm of the Y chromosome (Ypll .2p ter).
Le gène MIC 2 et son produit, la protéine E2, sont à la base du groupe sanguin Xga chez l'homme dont l'expression est liée au sexe ; les femmes Xga négatives n'expriment pas la protéine E2 à la surface des érythrocytes mais présentent, à l'intérieur des globules rouges, la forme précurseur intracytoplasmique. En confirmation de cette localisation pseudoautosomale, il a été demontré que l'expression de MIC 2 échappe au phénomène d'inactivation du chromosome X chez les femmes. La molécule
E2 a été classée au Ve Atelier International sur les
Antigènes de Différenciation Leucocytaire à Boston (1993)
CD99.The MIC 2 gene and its product, the E2 protein, are the basis of the Xga blood group in humans whose expression is linked to sex; Xga negative women do not express the E2 protein on the surface of erythrocytes but present, inside the red blood cells, the intracytoplasmic precursor form. In confirmation of this pseudoautosomal localization, it has been shown that the expression of MIC 2 escapes the phenomenon of inactivation of the X chromosome in women. The molecule
E2 was classified at the 5th International Workshop on
Leukocyte Differentiation Antigens in Boston (1993)
CD99.
Après clonage et séquençage, la séquence primaire de la molécule E2 a été déterminée (Gelin et al. The EMBC
Journal vol. 8 n" 11 pp 3253-3259, 1989). La molécule E2 est une protéine transmembranaire intégrale, n'appartenant à aucune famille de protéines connues, mais présentant dans la partie proximale de son segment extracellulaire une région ressemblant au collagène et dans sa partie distale, une région riche en proline, donc vraisemblablement très pelotonnée. Son segment intracytoplasmique, fait de 32 résidus, est suffisamment long pour permettre la transduction d'un signal à l'intérieur de la cellule.Cette protéine a été mise en évidence à la surface des lymphocytes T et est impliquée dans le phénomène des rosettes : les anticorps monoclonaux anti E2, qui ont permis de découvrir cette molécule, bloquent les rosettes en se fixant à la surface du lymphocyte T. Sa masse moléculaire est de 32 kD et elle possède des propriétés biochimiques particulières : E2 est sialylée et surtout porte exclusivement des radicaux sucrés liés en O.After cloning and sequencing, the primary sequence of the E2 molecule has been determined (Gelin et al. The EMBC
Journal vol. 8 n "11 pp 3253-3259, 1989). The molecule E2 is an integral transmembrane protein, not belonging to any family of known proteins, but having in the proximal part of its extracellular segment a region resembling collagen and in its part distal, a region rich in proline, therefore probably very curled up. Its intracytoplasmic segment, made of 32 residues, is long enough to allow the transduction of a signal inside the cell. surface of T lymphocytes and is involved in the phenomenon of rosettes: anti-E2 monoclonal antibodies, which have made it possible to discover this molecule, block rosettes by attaching to the surface of T lymphocyte. Its molecular mass is 32 kD and it has special biochemical properties: E2 is sialylated and especially carries exclusively sugar radicals linked in O.
Cette protéine E2 est présente à l'intérieur de la cellule sous la forme d'un précurseur de 28 kD. This E2 protein is present inside the cell in the form of a 28 kD precursor.
Par ailleurs, la protéine E2 provoque un ensemble de phénomènes fonctionnels liés de façon frappante à certaines régions structurelles de la molécule : les anticorps monoclonaux s'adressant à un épitope non restreint de la molécule, déclenchent sur la souspopulation de corticothymocytes "doubles positifs", et d'une sous-population de lymphocytes T périphériques
- le phénomène de "flip-flop" de la phosphatidylsérine
à la membrane cytosplasmique,
- l'agrégation homotypique de ces cellules T.In addition, the protein E2 causes a set of functional phenomena strikingly linked to certain structural regions of the molecule: monoclonal antibodies targeting an unrestricted epitope of the molecule, trigger on the underpopulation of "double positive" corticothymocytes, and a subpopulation of peripheral T cells
- the "flip-flop" phenomenon of phosphatidylserine
to the cytosplasmic membrane,
- the homotypic aggregation of these T cells.
Compte tenu de ces observations, la protéine E2 paraît devoir jouer un rôle fonctionnel très particulier et vraisemblablement très important dans la fonction et les mécanismes de différenciation des lymphocytes T, ainsi que sur toute autre cellule porteuse de ladite molécule E2. Given these observations, the E2 protein seems to play a very specific and probably very important functional role in the function and differentiation mechanisms of T lymphocytes, as well as on any other cell carrying said E2 molecule.
Par les méthodes classiques, 4 épitopes ont été définis sur la protéine E2. Deux d'entre eux sont présents sur toutes les cellules T quel que soit leur degré de maturité ou leur spécialisation fonctionnelle (épitopes 0662 et L129) et les deux autres ont une expression restreinte (épitopes 12E7 et D44). By conventional methods, 4 epitopes were defined on the E2 protein. Two of them are present on all T cells regardless of their degree of maturity or their functional specialization (epitopes 0662 and L129) and the other two have a restricted expression (epitopes 12E7 and D44).
La position exacte de l'épitope 12E7 sur la protéine E2 est connue. The exact position of the 12E7 epitope on the E2 protein is known.
L'épitope D44 est très caractéristique des corticothymocytes, tandis qu'il n'est pas exprimé sur les thymocytes médullaires. En périphérie, l'expression de 12E7 et de D44 est restreinte sur les lymphocytes CD4 et CD8 au sein de la population CD8, l'expression des deux épitopes est mutuellement exclusive, les lymphocytes CD8+
D44+ étant très spécifiquement les lymphocytes T tueurs.The D44 epitope is very characteristic of corticothymocytes, while it is not expressed on medullary thymocytes. At the periphery, the expression of 12E7 and D44 is restricted on CD4 and CD8 lymphocytes within the CD8 population, the expression of the two epitopes is mutually exclusive, CD8 + lymphocytes
D44 + being very specifically the killer T lymphocytes.
Cette particularité de D44 a permis de démontrer l'existence de lymphocyte T cytotoxiques spécifiques du VIH chez les patients infectés.This peculiarity of D44 has made it possible to demonstrate the existence of cytotoxic T lymphocytes specific for HIV in infected patients.
La position exacte des épitopes 0662 et L129 sur la protéine E2 a maintenant été déterminée par la présente invention. The exact position of the 0662 and L129 epitopes on the E2 protein has now been determined by the present invention.
Les épitopes L129 et 0662 sont situés précisément entre une région riche en proline (acides aminés 45 à 62) et une région riche en glycine (acides aminés 76 à 90) de la protéine E2. Cette région s'étendant du résidu 63 au résidu 75 de la protéine E2 sera appelée par commodité dans le reste de la descritpion, région 63-75. The L129 and 0662 epitopes are located precisely between a proline-rich region (amino acids 45 to 62) and a glycine-rich region (amino acids 76 to 90) of the E2 protein. This region extending from residue 63 to residue 75 of the E2 protein will be called for convenience in the rest of the description, region 63-75.
En outre, il a précisément été démontré que les phénomènes précédemment décrits, à savoir notamment d'adhésion des cellules T, l'agrégation des corticothymocytes et le phénomène de flip-flop membranaire, sont étroitement liés aux épitopes L129 et 0662. In addition, it has precisely been demonstrated that the previously described phenomena, namely in particular T cell adhesion, the aggregation of corticothymocytes and the phenomenon of membrane flip-flop, are closely linked to the epitopes L129 and 0662.
Malgré l'importance du rôle de la protéine E2 et en particulier celui des épitopes L129 et 0662 dans de nombreux phénomènes impliquant les lymphocytes T, on ne dispose pas dans l'état de la technique d'anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes L129 et 0662, et qui permettraient de continuer les recherches concernant la protéine E2 et de préciser son rôle au sein de l'organisme. Despite the importance of the role of the protein E2 and in particular that of the L129 and 0662 epitopes in many phenomena involving T lymphocytes, there are no monoclonal antibodies directed against the L129 and 0662 epitopes in the prior art. , and which would allow research to continue on the E2 protein and clarify its role within the body.
Des anticorps monoclonaux 0662 et L129 ont bien été cités par les inventeurs dans la littérature, mais ni leurs structures ni leurs moyens d'obtention n'ont été divulgués. Monoclonal antibodies 0662 and L129 have indeed been cited by the inventors in the literature, but neither their structures nor their means of obtaining have been disclosed.
Un des buts de la présente invention est donc de fournir des anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes L129 et 0662. One of the aims of the present invention is therefore to provide monoclonal antibodies directed against the L129 and 0662 epitopes.
D'une façon générale, la présente invention concerne les anticorps monoclonaux capables de reconnaître tout ou au moins une partie de la région 63-75 de la protéine E2. In general, the present invention relates to monoclonal antibodies capable of recognizing all or at least part of the 63-75 region of the E2 protein.
Dans un de ses modes de réalisation, la présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre toute ou au moins une partie de la région 66-75 de la protéine E2. In one of its embodiments, the present invention relates to a monoclonal antibody directed against all or at least part of the region 66-75 of the E2 protein.
En particulier, la présente invention concerne les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes L129 et 0662, plus particulièrement. In particular, the present invention relates to the monoclonal antibodies directed against the L129 and 0662 epitopes, more particularly.
Il est à noter que l'anticorps dirigé contre l'épitope 0662, et appelé ci-après Ac 0662, a été déposé le 02 mars 1995 sous forme d'hybridome auprès de la collection
CNCM sous la référence 0662-CD99 et le numéro d'enregistrement I-1551. It should be noted that the antibody directed against the epitope 0662, and hereinafter called Ac 0662, was deposited on March 02, 1995 in the form of a hybridoma with the collection
CNCM under the reference 0662-CD99 and the registration number I-1551.
De la même manière, l'anticorps dirigé contre l'épitope L129, et appelé ci-après Ac L129, a été déposé le 02 mars 1995 sous forme d'hybridome auprès de la collection
CNCM sous la référence L129-CD99 et le numéro d'enregistrement I-1552. Similarly, the antibody directed against the L129 epitope, and hereinafter called Ac L129, was deposited on March 02, 1995 in the form of a hybridoma with the collection.
CNCM under the reference L129-CD99 and the registration number I-1552.
Un procédé d'obtention des anticorps monoclonaux selon l'invention peut être le suivant
On prépare tout d'abord une banque d'hybridomes secrétant des anticorps monoclonaux contre la protéine E2 par des méthodes tout à fait classiques d'obtention d'anticorps monoclonaux. Une telle méthode peut, par exemple, consister en une immunisation de souches de souris de type "Biozzi" avec une population entière de thymocytes (la sélection des lignées étant basée sur la capacité de leur milieu de culture à inhiber les rosettes), suivie de l'étape classique de fusion. Puis, après 3 étapes de clonage successives, les anticorps monoclonaux produits en grande quantité dans les souris sont récoltés puis purifiés par HPLC. Les anticorps monoclonaux ainsi purifiés sont alors séparés par immunodiffusion et ensuite sont quantifiés par la technique de Mancini (Mancini et al.A process for obtaining monoclonal antibodies according to the invention can be as follows
First of all, a bank of hybridomas secreting monoclonal antibodies against the protein E2 is prepared by completely conventional methods for obtaining monoclonal antibodies. Such a method can, for example, consist of immunization of mouse strains of the "Biozzi" type with an entire population of thymocytes (the selection of the lines being based on the capacity of their culture medium to inhibit rosettes), followed by the classic stage of fusion. Then, after 3 successive cloning steps, the monoclonal antibodies produced in large quantities in the mice are harvested and then purified by HPLC. The monoclonal antibodies thus purified are then separated by immunodiffusion and then are quantified by the technique of Mancini (Mancini et al.
1965. Immunochemistry 2:235). Selon une technique habituelle, les anticorps monoclonaux sont enfin biotinylés (Bernard et al., J. Exp. Med. 155:1317).1965. Immunochemistry 2: 235). According to a usual technique, the monoclonal antibodies are finally biotinylated (Bernard et al., J. Exp. Med. 155: 1317).
Ensuite, on réalise une bibliothèque de peptides de
E2, dont certains au moins, contiennent la région 63-75 ou 66-75 et on procède à un criblage de la banque de monoclonaux, par exemple en mettant les peptides en compétition avec des cellules exprimant E2 à leur surface, ou avec des cellules transfectantes exprimant une bibliothèque de fragments d'ADNc E2.Next, a library of peptides of
E2, at least some of which contain the region 63-75 or 66-75 and the monoclonal library is screened, for example by putting the peptides in competition with cells expressing E2 on their surface, or with cells transfectants expressing a library of E2 cDNA fragments.
On peut alors identifier, par comparaison, les clones reconnaissant spécifiquemennt les épitopes pertinents. It is then possible to identify, by comparison, the clones which specifically recognize the relevant epitopes.
A titre d'exemple, on peut utiliser la banque d'épitopes peptidiques correspondant aux séquences suivantes figurant dans le listage de séquences : SEQ ID n1 à 6. As an example, one can use the peptide epitope bank corresponding to the following sequences appearing in the sequence listing: SEQ ID n1 to 6.
En outre, il peut être intéressant dans certains cas, de disposer d'anticorps polyclonaux dirigés contre toute ou partie de la protéine E2. In addition, it may be advantageous in certain cases to have polyclonal antibodies directed against all or part of the E2 protein.
En ce sens, la présente invention concerne également un procédé de production d'anticorps polyclonaux dirigés contre toute ou partie de la région extracellulaire de la protéine E2, notamment contre sa région 63-75, comprenant une injection d'un peptide correspondant à toute ou partie de ladite région extracellulaire de E2, notamment ladite région 63-75, à un mammifère, par exemple un lapin, et le recueil du sérum après immunisation. Ledit peptide peut être couplé à une molécule porteuse ou un support classique. In this sense, the present invention also relates to a process for the production of polyclonal antibodies directed against all or part of the extracellular region of the E2 protein, in particular against its region 63-75, comprising an injection of a peptide corresponding to all or part of said extracellular region of E2, in particular said region 63-75, to a mammal, for example a rabbit, and the collection of serum after immunization. Said peptide can be coupled to a carrier molecule or a conventional support.
De la même façon, la présente invention concerne également un procédé de production d'anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine E2, comprenant une injection de cellules transfectées, notamment CHO ou COS, par ladite protéine E2 à un mammifère, par exemple un lapin, un recueil du sérum après immunisation, une élimination des anticorps non spécifiques de la protéine E2 par épuisement dudit sérum sur cellules non transfectées, notamment sur cellules CHO ou COS. In the same way, the present invention also relates to a process for the production of polyclonal antibodies directed against the E2 protein, comprising an injection of transfected cells, in particular CHO or COS, by said E2 protein into a mammal, for example a rabbit, a collection of serum after immunization, elimination of non-specific antibodies of the E2 protein by exhaustion of said serum on non-transfected cells, in particular on CHO or COS cells.
Un autre aspect de la présente invention concerne l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre le ou les épitopes L129 et/ou 0662 de la protéine E2 pour la préparation d'un médicament destiné à supprimer ou à réduire la prolifération de cellules tumorales présentant à leur surface la protéine E2 ou à modifier le fonctionnement des lymphocytes T ou de toute cellule normale ou anormale porteuse de la molécule E2. Another aspect of the present invention relates to the use of monoclonal antibodies directed against the L129 and / or 0662 epitope (s) of the E2 protein for the preparation of a medicament intended to suppress or reduce the proliferation of tumor cells exhibiting E2 protein on their surface or to modify the functioning of T lymphocytes or any normal or abnormal cell carrying the E2 molecule.
En effet, les inventeurs de la présente invention ont constaté que les anticorps selon l'invention, dirigés contre les épitopes de 0662 et L129 de la protéine E2, provoquent l'apoptose, ou mort cellulaire programmée, des cellule présentant la protéine E2 à leur surface, et en particulier, celle des cellules tumorales. In fact, the inventors of the present invention have found that the antibodies according to the invention, directed against the epitopes of 0662 and L129 of the protein E2, cause apoptosis, or programmed cell death, of the cells presenting the protein E2 at their surface, and in particular, that of tumor cells.
La réalisation d'un médicament comprenant comme principe actif au moins un des anticorps selon l'invention, peut donc contribuer à lutter efficacement contre les proliférations tumorales ou des phénomènes pathologiques de natures diverses dans la mesure où ces cellules présentent la protéine E2 à leur surface. The production of a medicament comprising as active principle at least one of the antibodies according to the invention, can therefore contribute to effectively combating tumor proliferation or pathological phenomena of various natures insofar as these cells present the E2 protein on their surface .
L'invention concerne également un tel médicament ayant une action dirigée contre toute ou au moins une partie de la région 63-75 de la protéine E2 comprenant une dose efficace d'au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal selon la présente invention. The invention also relates to such a medicament having an action directed against all or at least part of the region 63-75 of the E2 protein comprising an effective dose of at least one monoclonal or polyclonal antibody according to the present invention.
Une dose efficace in vivo d'un tel médicament selon la présente invention sera de préférence comprise entre 0,02 mg/jour/kg et 200 mg/jour/kg d'anticorps par jour. An effective in vivo dose of such a drug according to the present invention will preferably be between 0.02 mg / day / kg and 200 mg / day / kg of antibody per day.
Un tel médicament pourra être utilisé notamment dans la lutte contre le sarcome d'Ewing ou contre toute autre tumeur ou désordre pathologique notamment ceux impliquant des cellules exprimant le gène MIC2. Such a drug could be used in particular in the fight against Ewing's sarcoma or against any other tumor or pathological disorder in particular those involving cells expressing the MIC2 gene.
Selon un autre aspect de la présente invention, il est également possible de réaliser un kit en vue de la détection diagnostique ou thérapeutique de desordres pathologiques ou de tumeurs comprenant au moins un anticorps selon l'invention dirigé contre tout ou au moins une partie de la région 63-75 de la protéine E2. According to another aspect of the present invention, it is also possible to produce a kit for the diagnostic or therapeutic detection of pathological disorders or of tumors comprising at least one antibody according to the invention directed against all or at least part of the region 63-75 of the E2 protein.
Afin de procéder à la vérification de la reconnaissance commune de la région 63-75 de E2 par Ac L129 et AC 0662, le protocole expérimental classique suivant est réalisé
a) Criblage d'une bibliothèque d'épitopes de E2 contenant des inserts de 50 à 100 pb dans un test "blot" sur colonies en utilisant Ac L129 et Ac 0662 en tant que sonde
b) Après 3 criblages successifs, 10 clones reconnus par Ac 0662 sont sélectionnés
c) Ces 10 clones sont également reconnus par Ac
L129 après criblage
d) De manière analogue, 8 autres clones reconnus par Ac L129 et soumis à un criblage avec Ac 0662 sont également reconnus par ce dernier
e) Les inserts inclus dans ces 18 clones reconnus à la fois par Ac 0662 et Ac L129 sont séquencés et leur séquence nucléotidique est comparée à celle du cDNA de E2.In order to verify the common recognition of the region 63-75 of E2 by Ac L129 and AC 0662, the following classic experimental protocol is carried out
a) Screening of a library of E2 epitopes containing inserts of 50 to 100 bp in a "blot" test on colonies using Ac L129 and Ac 0662 as probe
b) After 3 successive screenings, 10 clones recognized by Ac 0662 are selected
c) These 10 clones are also recognized by Ac
L129 after screening
d) Similarly, 8 other clones recognized by Ac L129 and subjected to screening with Ac 0662 are also recognized by the latter.
e) The inserts included in these 18 clones recognized by both Ac 0662 and Ac L129 are sequenced and their nucleotide sequence is compared with that of the cDNA of E2.
Après comparaison, on s'aperçoit que ces différens clones présentent bien une région commune de 12 acides aminés.After comparison, we see that these different clones have a common region of 12 amino acids.
Ac L129 et Ac 0662 reconnaissent donc bien la région de 12 acides aminés de la protéine E2 (région 6375). Cette région est totalement distincte de la région 12E7 de la protéine E2 (39-42). Ac L129 and Ac 0662 therefore recognize the 12 amino acid region of the E2 protein well (region 6375). This region is completely distinct from the 12E7 region of the E2 protein (39-42).
Afin de mettre en évidence les épitopes distincts reconnus par Ac 0662 et Ac 129 au sein de la region 63-75 de la protéine E2, 6 peptides différents B à G (SEQ ID ne 1 à 6 respectivement) sont synthétisés (voir figure II). Un septième peptide A contenant l'épitope 12E7 sert de témoin. In order to highlight the distinct epitopes recognized by Ac 0662 and Ac 129 within the region 63-75 of the protein E2, 6 different peptides B to G (SEQ ID no 1 to 6 respectively) are synthesized (see Figure II) . A seventh peptide A containing the 12E7 epitope serves as a control.
Des quantités croissantes des différents peptides sont ajoutées à 10 pg/ml de Ac 0662 ou de Ac L129, puis incubées avec des cellues CHO présentant la protéine E2 après transfection par cDNA.Increasing amounts of the different peptides are added to 10 μg / ml of Ac 0662 or of Ac L129, then incubated with CHO cells presenting the protein E2 after transfection with cDNA.
La liaison des anticorps monoclonaux est analysée par cytofluorométrie. The binding of monoclonal antibodies is analyzed by cytofluorometry.
Comme attendu, le peptide A n'affecte en rien la reconnaissance par Ac L129 et Ac 0662 de la protéine E2. Au contraire, le peptide D contenant la région 63-75 complète, inhibe totalement la fixation de Ac 0662 et Ac L129 sur la protéine E2, ce qui confirme les résultats déjà obtenus précédemment. As expected, peptide A does not affect the recognition by Ac L129 and Ac 0662 of the protein E2. On the contrary, peptide D containing the complete 63-75 region totally inhibits the binding of Ac 0662 and Ac L129 to the protein E2, which confirms the results already obtained previously.
Par ailleurs, aucune inhibition de fixation de Ac 0662 et Ac L129 sur la protéine E2 n'est constatée après incubation avec les peptides B et C, ceci étant dû au fait que les régions de part et d'autre du résidu 70 nécessaires pour la fixation des deux anticorps sont absentes sur les peptides B et C. Furthermore, no inhibition of binding of Ac 0662 and Ac L129 to the protein E2 is observed after incubation with peptides B and C, this being due to the fact that the regions on either side of the residue 70 necessary for the fixation of the two antibodies is absent on peptides B and C.
Ac 0662 se lie au peptide F, ce que ne fait Ac L129 qu'à très forte concentration. Ac 0662 et Ac L129 ne reconnaissent pas le peptide E. Ceci montre bien que l'épitope reconnu par Ac L129 est plus grand que celui reconnu par Ac 0662. Ceci est confirmé par un peptide G présentant les acides aminés 68 à 77 de la protéine. E2 empêche la liaison de Ac 0662 à E2 mais pas celle de Ac
L129.Ac 0662 binds to the F peptide, which Ac L129 does only at very high concentration. Ac 0662 and Ac L129 do not recognize the E peptide. This clearly shows that the epitope recognized by Ac L129 is larger than that recognized by Ac 0662. This is confirmed by a G peptide having amino acids 68 to 77 of the protein. . E2 prevents the binding of Ac 0662 to E2 but not that of Ac
L129.
L'anticorps monoclonal Ac 0662 reconnaît donc la région s'étendant du résidu 66 au résidu 75 de E2, alors que Ac L129 reconnaît une région de taille supérieure comprenant le résidu 70. The monoclonal antibody Ac 0662 therefore recognizes the region extending from residue 66 to residue 75 of E2, while Ac L129 recognizes a region of larger size comprising residue 70.
Les deux anticorps, Ac 0662 et Ac L129, reconnaissent donc bien des régions distinctes comprises entre les résidus 63 et 75 de la protéine E2. The two antibodies, Ac 0662 and Ac L129, therefore recognize many distinct regions between residues 63 and 75 of the protein E2.
Protocole exPérimental :
Le vecteur d'expression utilisé est le vecteur pMAMneo (Clontech, Palo Alto, USA) qui confère une résistance à l'antibiotique G418. Le cDNA codant pour E2, a été inséré en site de clonage Nhe 1 ayant des extrémités "blunt" obtenues par traitement par Klenow.Experimental protocol :
The expression vector used is the vector pMAMneo (Clontech, Palo Alto, USA) which confers resistance to the antibiotic G418. The cDNA coding for E2 was inserted at the Nhe 1 cloning site having “blunt” ends obtained by treatment with Klenow.
Le vecteur recombinant a été transfecté dans des cellules CHO en utilisant une précipitation au phosphate de calcium. Les cellules CHO sont maintenues en phase unique de culture dans un milieu HAM/F12 additionné de 10% de PCS activé à la chaleur, glutamine, pyruvate, pénicilline et streptomycine. On ajoute, 36 heures après la transfection, du G418 à une concentration de 1 mg/ml afin de sélectionner les cellules résistantes. The recombinant vector was transfected into CHO cells using calcium phosphate precipitation. CHO cells are maintained in a single culture phase in HAM / F12 medium supplemented with 10% heat activated PCS, glutamine, pyruvate, penicillin and streptomycin. G418 is added 36 hours after transfection at a concentration of 1 mg / ml in order to select the resistant cells.
Des cellules CHO résistantes au G418 sont, par ailleurs, sélectionnées par estimation de l'expression du produit du gêne par cytofluorimétrie. Le marquage cellulaire est réalisé comme décrit dans l'art antérieur (Gélin, 1991). On effectue 3 cycles de sélection de l'expression positive par tri des cellules activées par fluorescence, au moyen d'un cytomètre de flux Facstar Plus (Becton Dickinson). CHO cells resistant to G418 are, moreover, selected by estimation of the expression of the gene product by cytofluorimetry. Cell labeling is carried out as described in the prior art (Gélin, 1991). 3 cycles of selection of the positive expression are carried out by sorting the cells activated by fluorescence, using a Facstar Plus flow cytometer (Becton Dickinson).
Les figures annexées au présent brevet sont données à titre illustratif et non limitatif de l'invention. The figures appended to this patent are given by way of illustration and without limitation of the invention.
La figure I représente la structure de la protéine
E2 (CD99) et la localisation des épitopes 0662, L129 et 12E7.Figure I shows the structure of the protein
E2 (CD99) and the location of epitopes 0662, L129 and 12E7.
La figure II est une représentation schématique des régions de la protéine E2 correspondant aux différents peptides utilisés lors de la vérification de la reconnaissance par Ac 0662 et Ac L129 de deux épitopes distincts au sein de la protéine E2. FIG. II is a schematic representation of the regions of the E2 protein corresponding to the different peptides used when verifying the recognition by Ac 0662 and Ac L129 of two distinct epitopes within the E2 protein.
Sur la figure I, on peut voir que la protéine est divisée en trois régions principales précédées d'un peptide signale < PS). La région extracellulaire (EC) compte 100 acides aminés, elle est suivie d'une région transmembranaire (TM) de 25 acides aminés et d'une région intracellulaire (IC) de 38 acides aminés. In Figure I, we can see that the protein is divided into three main regions preceded by a peptide signaled (PS). The extracellular region (EC) has 100 amino acids, it is followed by a transmembrane region (TM) of 25 amino acids and an intracellular region (IC) of 38 amino acids.
La région (EC) comporte une région (P) riche en proline (acides aminés 45 à 62) et une région (G) riche en glycine (acides aminés 76 à 90). The region (EC) comprises a region (P) rich in proline (amino acids 45 to 62) and a region (G) rich in glycine (amino acids 76 to 90).
Les anticorps selon la présente invention reconnaissent la région 63-75 comprise entre la région (G) et la région (P). Cette région 63-75 est également visible sur la figure II (partie foncée). The antibodies according to the present invention recognize the region 63-75 between the region (G) and the region (P). This region 63-75 is also visible in Figure II (dark part).
Informations concernant SEQ ID NO 1 i) Caractéristiques de la séquence
A. LONGUEUR 12
B. TYPE acides aminés ii) Type de molécule
- Peptide iii) Type de fragment
- fragment interne iv) Origine
- Protéine E2 humaine (CD99) v) Séquence
Pro-Ser-Ser-Gly-Ser -Phe- Ser- Asp-Ala-Asp-Len-Ala
Informations concernant SEQ ID NO 2 i) Caractéristiques de la séquence
A. LONGUEUR 10
B. TYPE acides aminés ii) Type de molécule
- Peptide iii) Type de fragment
- fragment interne iv) Origine
- Protéine E2 humaine (CD99) v) Séquence
Asp - Ala - Asp - Leu- Ala-Asp-Gly-Val-Ser-Gly
Informations concernant SEQ ID NO 3 i) Caractéristiques de la séquence
A. LONGUEUR 14
B.TYPE acides aminés ii) Type de molécule
- Peptide iii) Type de fragment
- fragment interne iv) Origine
- Protéine E2 humaine (CD99) v) Séquence
pro-Ser-Ser-Ser-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Ala-Asp-Leu-Ala-Asp. Information concerning SEQ ID NO 1 i) Characteristics of the sequence
A. LENGTH 12
B. TYPE amino acids ii) Type of molecule
- Peptide iii) Type of fragment
- internal fragment iv) Origin
- Human E2 protein (CD99) v) Sequence
Pro-Ser-Ser-Gly-Ser -Phe- Ser- Asp-Ala-Asp-Len-Ala
Information concerning SEQ ID NO 2 i) Characteristics of the sequence
A. LENGTH 10
B. TYPE amino acids ii) Type of molecule
- Peptide iii) Type of fragment
- internal fragment iv) Origin
- Human E2 protein (CD99) v) Sequence
Asp - Ala - Asp - Leu- Ala-Asp-Gly-Val-Ser-Gly
Information concerning SEQ ID NO 3 i) Characteristics of the sequence
A. LENGTH 14
B.TYPE amino acids ii) Type of molecule
- Peptide iii) Type of fragment
- internal fragment iv) Origin
- Human E2 protein (CD99) v) Sequence
pro-Ser-Ser-Ser-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Ala-Asp-Leu-Ala-Asp.
Informations concernant SEQ ID NO 4 i) Caractéristiques de la séquence
A. LONGUEUR 10
B. TYPE acides aminés ii) Type de molécule
- Peptide iii) Type de fragment
- fragment interne iv) Origine
- Protéine E2 humaine (CD99) v) Séquence
Pro - Ser - Ser - Gly - Ser - Phe - Ser - Asp - Ala - Asp
Informations concernant SEQ ID NO 5 i) Caractéristiques de la séquence
A. LONGUEUR 10
B. TYPE acides aminés ii) Type de molécule
- Peptide iii) Type de fragment
- fragment interne iv) Origine
- Protéine E2 humaine (CD99) v) Séquence
Gly - Ser - Phe - Ser - Asp - ala - Asp - Leu - Ala - Asp
Informations concernant SEQ ID NO 6 i) Caractéristiques de la séquence
A. LONGUEUR 10
B. TYPE acides aminés ii) Type de molécule
- Peptide iii) Type de fragment
- fragment interne iv) Origine
- Protéine E2 humaine (CD99) v) Séquence
Phe - Ser - Asp - Ala - Asp - Leu - Ala - Asp - Gly - Val Information concerning SEQ ID NO 4 i) Characteristics of the sequence
A. LENGTH 10
B. TYPE amino acids ii) Type of molecule
- Peptide iii) Type of fragment
- internal fragment iv) Origin
- Human E2 protein (CD99) v) Sequence
Pro - Ser - Ser - Gly - Ser - Phe - Ser - Asp - Ala - Asp
Information concerning SEQ ID NO 5 i) Characteristics of the sequence
A. LENGTH 10
B. TYPE amino acids ii) Type of molecule
- Peptide iii) Type of fragment
- internal fragment iv) Origin
- Human E2 protein (CD99) v) Sequence
Gly - Ser - Phe - Ser - Asp - ala - Asp - Leu - Ala - Asp
Information concerning SEQ ID NO 6 i) Characteristics of the sequence
A. LENGTH 10
B. TYPE amino acids ii) Type of molecule
- Peptide iii) Type of fragment
- internal fragment iv) Origin
- Human E2 protein (CD99) v) Sequence
Phe - Ser - Asp - Ala - Asp - Leu - Ala - Asp - Gly - Val
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| AUSSEL C. ET AL.: "Monoclonal Antibodies Directed Against the E2 Protein (MIC2 gene Product) Induce Exposure of Phosphatidylserine at the Thymocyte Cell Surface", BIOCHEMISTRY, vol. 32, no. 38, 28 September 1993 (1993-09-28), pages 10096 - 10101 * |
| BERNARD G ET AL: "MAbs against E2 molecule ( CD99 ) induce homotypic aggregation of cortico-thymocytes and tyrosine protein phosphorylation.", EXPERIMENTAL BIOLOGY 94, PARTS I AND II, ANAHEIM, CALIFORNIA, USA, APRIL 24-28, 1994. FASEB JOURNAL 8 (4-5). 1994. A780. * |
| BERNARD, GHISLAINE ET AL: "The E2 molecule ( CD99 ) specifically triggers homotypic aggregation of CD4+ CD8+ thymocytes", J. IMMUNOL. (1995), 154(1), 26-32 * |
| ELLIS, NATHAN A. ET AL: "PBDX is the XG blood group gene", NAT. GENET. (1994), 8(3), 285-9 * |
| GELIN C. ET AL.: "The E2 antigen, a 32kd glycoprotein involved in T-cell adhesion processes, is the Mic2 gene product", EMBO JOURNAL, vol. 8, no. 11, EYNSHAM, OXFORD GB, pages 3253 - 3259 * |
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