FR2730493A1 - New HIV-1 strain MAD and related nucleic acids and peptide(s) - Google Patents
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Abstract
Description
Polypeptides de glycoprotéine transmembranaire d'enveloppe
du rétrovirus humain du type HIV-1 et polypeptides présentant avec
eux une parenté immunologique
La présente invention est relative aux virus HIV, notamment à un polypeptide et un peptide permettant une détection d'anticorps anti-HIV que les peptides de l'art antérieur ne permettaient pas toujours de détecter. L'invention est basée sur la découverte d'une nouvelle souche HIV-1: HIV-1 MAD . L'antisérum dirigé contre elle ne présente aucune réactivité avec les peptides ou polypeptides du consensus HIV tel qu'il est utilisé de nos jours.Le terme consensus HIV se référe aux régions conservées entre isolats et dont la mise en évidence est essentielle à la conception de vaccins ou de réactifs diagnostiques, et dont les mutations confèrent la résistance aux médicaments antiviraux.Envelope transmembrane glycoprotein polypeptides
human retrovirus type HIV-1 and polypeptides exhibiting with
them an immunological relationship
The present invention relates to HIV viruses, in particular to a polypeptide and a peptide allowing detection of anti-HIV antibodies which the peptides of the prior art did not always make it possible to detect. The invention is based on the discovery of a new HIV-1 strain: HIV-1 MAD. The antiserum directed against it has no reactivity with peptides or polypeptides of the HIV consensus as it is used today. The term HIV consensus refers to the regions conserved between isolates and the demonstration of which is essential for the conception. vaccines or diagnostic reagents, the mutations of which confer resistance to antiviral drugs.
Des analyses phylogéniques de souches HIV-1 permettent de distinguer au moins huit sous-types, le groupe 0 étant le plus divergent du consensus HIV-1 (AIDS Res Hum Retroviruses 1994; 10:877-79). Phylogenic analyzes of HIV-1 strains make it possible to distinguish at least eight subtypes, group 0 being the most divergent from the HIV-1 consensus (AIDS Res Hum Retroviruses 1994; 10: 877-79).
Une contrainte générale dans la mise au point de tests sérologiques HIV, est d'éviter les réactions faussement positives, tout en conservant la sensibilité que permettent les tests antérieurs en détection de séropositivité. A general constraint in the development of HIV serological tests is to avoid false positive reactions, while retaining the sensitivity that previous tests allow for detection of seropositivity.
Les tests basés sur l'emploi de peptide(s) consensus essentiellement dérivés du géne env , ont été considérés comme une solution presque idéale jusqu'à ce que la découverte du variant HIV-1-O fasse entrevoir la possibilité de résultats faussement négatifs (Genomic cloning and complete sequence analysis of a highly divergent african human immuno-deficiency virus isolate. J. Virol. 1994; 68: 1586-96; a new subtype of human immuno-deficiency virus type 1 (MPV-5180) from
Cameroon. J. Virol. 1994; 68:1581-85).Tests based on the use of consensus peptide (s) essentially derived from the env gene, were considered an almost ideal solution until the discovery of the HIV-1-O variant suggested the possibility of false negative results ( Genomic cloning and complete sequence analysis of a highly divergent african human immuno-deficiency virus isolate. J. Virol. 1994; 68: 1586-96; a new subtype of human immuno-deficiency virus type 1 (MPV-5180) from
Cameroon. J. Virol. 1994; 68: 1581-85).
La non-réactivité de certains tests à antigéne peptidique env , chez des patients présentant quand même certains syndromes cliniques caractéristiques du SIDA ou des syndromes lymphadénopathiques qui parfois les précédent, est, à ce jour, parfois imputée à une infection du groupe HIV-1-O (HIV-1/HIV-2 seronegativity in HIV-1 subtype O infected patients, Lancet 1994; 343:1393-94 , New HIV-1 subtype in the Switzerland. Lancet 1994; 344:270-71). The non-reactivity of certain tests with an env peptide antigen, in patients having nevertheless certain clinical syndromes characteristic of AIDS or of the lymphadenopathic syndromes which sometimes precedes them, is, to date, sometimes attributed to an infection of the HIV-1- group. O (HIV-1 / HIV-2 seronegativity in HIV-1 subtype O infected patients, Lancet 1994; 343: 1393-94, New HIV-1 subtype in the Switzerland. Lancet 1994; 344: 270-71).
Contrairement au groupe HIV-1-O qui est considérablement différent des autres types HIV-1, la souche HIV-1 MAD de la présente invention présente une certaine homologie de séquence avec le groupe. Unlike the HIV-1-O group which is considerably different from the other HIV-1 types, the HIV-1 MAD strain of the present invention has a certain sequence homology with the group.
Malgré cela, elle échappe à la détection par peptides consensus des glycoprotéines gp41 et gp120 issus de ce virus.Despite this, it escapes detection by consensus peptides of the gp41 and gp120 glycoproteins derived from this virus.
Ainsi, la présente invention a pour but de mettre à disposition des laboratoires de diagnostic des moyens, notamment des peptides et polypeptides spécifiques permettant une détection d'anticorps anti-HIV, qui étaient jusqu'à ce jour susceptibles d'être indétectables. Elle concerne enfin des mélanges de peptides issus de HIV-1 MAD et de peptides correspondants d'autres HlVs, de façon à éviter les résultats faux négatifs potentiels. Thus, the object of the present invention is to provide diagnostic laboratories with means, in particular specific peptides and polypeptides allowing detection of anti-HIV antibodies, which have hitherto been capable of being undetectable. Finally, it relates to mixtures of peptides from HIV-1 MAD and corresponding peptides from other HlVs, so as to avoid potential false negative results.
L'invention découle des observations faites sur une femme asymptomatique d'origine zaïroise et séropositive, au cours de plusieurs tests de dépistages de l'infection HIV, confirmés par des techniques de Western blot . Cette patiente n'a cependant pas montré de réactivité aux tests basés sur la reconnaissance de peptides env spécifiques du
HIV-1 de groupe O. D'autres analyses à base de peptides spécifiques ont établi que son sérum ne réagissait que modérément avec des peptides spécifiques du groupe HIV-1, ou des peptides du groupe HIV-1-O, mais réagissait avec un seul peptide de la boucle V3 d'un type africain.The invention derives from observations made on an asymptomatic woman of Zairean origin and seropositive, during several tests for screening for HIV infection, confirmed by Western blot techniques. However, this patient did not show reactivity to tests based on the recognition of specific env peptides from
HIV-1 group O. Other analyzes based on specific peptides established that his serum reacted only moderately with peptides specific for group HIV-1, or peptides for group HIV-1-O, but reacted with a only peptide of the V3 loop of an African type.
On a réalisé le séquencage de la glycoproteine gp41 et de la boucle V3 de gp120 V3 à partir d'ADN lymphocytaire et de cultures virales, indiquant que cette souche HIV MAD appartient d'une part au groupe HIV-1-M, et qu'elle diffère de façon importante du groupe O, sans être non plus totalement identique à aucun des autres types HIV-1 déjà caractérisés. De plus, on a constaté que cette souche ne présente pas, dumoins dans les conditions expérimentales mises en oeuvre et qui sont rapportées ci-après, la réactivité vis-à-vis des peptides consensus de la région immuno-dominante de gp41, malgré un nombre réduit de substitutions d'acides aminés dans sa séquence peptidique, en comparaison aux régions immunodominantes d'autres souches HIV-1. The glycoprotein gp41 and the V3 loop of gp120 V3 were sequenced from lymphocytic DNA and viral cultures, indicating that this HIV MAD strain belongs on the one hand to the HIV-1-M group, and that it differs significantly from group O, without being totally identical to any of the other HIV-1 types already characterized. In addition, it was found that this strain does not exhibit, at least under the experimental conditions used and which are reported below, the reactivity towards consensus peptides of the immuno-dominant region of gp41, despite a reduced number of amino acid substitutions in its peptide sequence, compared to the immunodominant regions of other HIV-1 strains.
Cette observation démontre que des variants HIV distincts du groupe O, bien que moins éloignés du consensus HIV-1, peuvent tout de même échapper à une détection sérologique, dans le cas où celle-ci se basait uniquement sur les peptides consensus exprimés par le gène env. This observation demonstrates that distinct HIV variants of the group O, although less distant from the HIV-1 consensus, can still escape serological detection, in the case where this was based solely on the consensus peptides expressed by the gene approx.
Ainsi, la présente invention concerne un polypeptide ou un peptide issus du virus HIV-1 MAD déposé le 9 Février 1995 à la CNCM sous la référence 1-1533, celui-ci comportant dans son génome des séquences nucléotidiques codant les séquences peptidiques ci-après présentées. Thus, the present invention relates to a polypeptide or a peptide derived from the HIV-1 MAD virus deposited on February 9, 1995 at the CNCM under the reference 1-1533, the latter comprising in its genome nucleotide sequences coding for the peptide sequences below presented.
En variante, I'invention concerne un polypeptide ou un peptide dont la séquence se distingue de celle des précédents par substitution, délétion ou addition d'acides aminés, ce polypeptide et ce peptide dérivés conservant néanmoins les caractéristiques antigéniques des précédents. As a variant, the invention relates to a polypeptide or a peptide whose sequence is distinguished from that of the preceding ones by substitution, deletion or addition of amino acids, this polypeptide and this derived peptide nevertheless retaining the antigenic characteristics of the preceding ones.
Une glycoprotéine exprimée par le gène env de la souche HIV-1 MAD est la glycoprotéine gp41 dont une partie de la séquence peptidique et de la séquence nucléotidique correspondante sont représentées à la figure 1 B. A glycoprotein expressed by the env gene of the HIV-1 MAD strain is the gp41 glycoprotein, part of the peptide sequence and of the corresponding nucleotide sequence are shown in FIG. 1 B.
Ainsi, un polypeptide ou un peptide selon l'invention est un polypeptide ou un peptide contenant la séquence peptidique représentée à la figure 1 B ou une partie peptidique contenant
a) soit la séquence d'acides aminés RVLAVERYLQDQQLLGIWGCSGKHI
b) soit une séquence d'acides aminés distincte de la séquence de a) dans laquelle un ou plusieurs acides aminés sont substitués par d'autres acides aminés de sorte que le polypeptide ou le peptide conserve sa réactivité avec un ante sérum contre le polypeptide ou le peptide de a);
c) soit une séquence d'acides aminés selon a) ou b) dans laquelle un ou plusieurs acides aminés ont été supprimés ou ajoutés sous réserve que le polypeptide ou le peptide conserve sa réactivité avec un antisérum contre le polypeptide ou ie peptide de a).Thus, a polypeptide or a peptide according to the invention is a polypeptide or a peptide containing the peptide sequence represented in FIG. 1B or a peptide part containing
a) either the amino acid sequence RVLAVERYLQDQQLLGIWGCSGKHI
b) or an amino acid sequence distinct from the sequence of a) in which one or more amino acids are substituted by other amino acids so that the polypeptide or the peptide retains its reactivity with a serum ante against the polypeptide or the peptide of a);
c) either an amino acid sequence according to a) or b) in which one or more amino acids have been deleted or added provided that the polypeptide or the peptide retains its reactivity with an antiserum against the polypeptide or the peptide of a) .
Préférentiellement, un polypeptide ou peptide selon l'invention est un polypeptide ou un peptide caractérisé en ce qu'il contient
a) soit la séquence RVLAVERYLQDQQLLGIWGCSGKHIC l l I
b) soit une séquence d'acides aminés distincte de la séquence de a) dans laquelle un ou plusieurs acides aminés sont substitués par d'autres acides aminés sous réserve que le polypeptide ou le peptide conserve sa réactivité avec un ante sérum contre le polypeptide ou le peptide de a);
c) soit une séquence d'acides aminés distincte selon a) ou b) dans laquelle un ou plusieurs acides aminés ont été supprimés ou ajoutés sous réserve que le polypeptide ou le peptide conserve sa réactivité avec un antisérum contre le polypeptide ou le peptide a).Preferably, a polypeptide or peptide according to the invention is a polypeptide or a peptide characterized in that it contains
a) either the sequence RVLAVERYLQDQQLLGIWGCSGKHIC ll I
b) or an amino acid sequence distinct from the sequence of a) in which one or more amino acids are substituted by other amino acids provided that the polypeptide or the peptide retains its reactivity with a serum ante against the polypeptide or the peptide of a);
c) either a distinct amino acid sequence according to a) or b) in which one or more amino acids have been deleted or added provided that the polypeptide or peptide retains its reactivity with an antiserum against the polypeptide or peptide a) .
De façon particulièrement avantageuse, le polypeptide ou le peptide est caractérisé en ce qu'il contient:
a) soit la séquence
RLAVERYLQDQQLLGIWGCSGKH ICTTTVPWNS,
b) soit une séquence d'acides aminés distincte de la séquence de a) dans laquelle un ou plusieurs acides aminés sont substitués par d'autres acides aminés sous réserve que le polypeptide ou le peptide conserve sa réactivité avec un ante sérum contre le polypeptide ou le peptide de a);
c) soit une séquence d'acides aminés distincte selon a) ou b) dans laquelle un ou plusieurs acides aminés ont été supprimés ou ajoutés sous réserve que le polypeptide ou le peptide conserve sa réactivité avec un antisérum contre le polypeptide ou le peptide de a).In a particularly advantageous manner, the polypeptide or the peptide is characterized in that it contains:
a) either the sequence
RLAVERYLQDQQLLGIWGCSGKH ICTTTVPWNS,
b) or an amino acid sequence distinct from the sequence of a) in which one or more amino acids are substituted by other amino acids provided that the polypeptide or the peptide retains its reactivity with a serum ante against the polypeptide or the peptide of a);
c) either a distinct amino acid sequence according to a) or b) in which one or more amino acids have been deleted or added provided that the polypeptide or peptide retains its reactivity with an antiserum against the polypeptide or peptide of a ).
Une autre glycoprotéine exprimée par le gène env de la souche HIV-1 MAD est la glycoprotéine gel 20 dont une partie de la séquence peptidique et de la séquence nucléotidique correspondante sont représentées à la figurelA. Another glycoprotein expressed by the env gene of the HIV-1 MAD strain is the glycoprotein gel 20, part of the peptide sequence and of the corresponding nucleotide sequence are shown in FIG.
Ainsi, I'invention vise également un polypeptide ou un peptide contenant la séquence représentée sur la figure 1A ou une partie de ce polypeptide contenant:
a) soit la séquence d'acides aminés QRTGIGPGQALYTTHR,
b) soit une séquence d'acides aminés distincte de la séquence de a) dans laquelle un ou plusieurs acides aminés ont été substitués par d'autres acides aminés sous réserve que le polypeptide ou le peptide conserve sa réactivité avec un ante sérum contre le polypeptide ou le peptide de a);
c) soit une séquence d'acides aminés selon a) ou b) dans laquelle un ou plusieurs acides aminés ont été supprimés ou ajoutés de sorte que le polypeptide ou le peptide conserve sa réactivité avec un antisérum contre le polypeptide ou le peptide de a).Thus, the invention also relates to a polypeptide or a peptide containing the sequence shown in FIG. 1A or a part of this polypeptide containing:
a) either the amino acid sequence QRTGIGPGQALYTTHR,
b) or an amino acid sequence distinct from the sequence of a) in which one or more amino acids have been substituted by other amino acids provided that the polypeptide or the peptide retains its reactivity with a serum ante against the polypeptide or the peptide of a);
c) either an amino acid sequence according to a) or b) in which one or more amino acids have been deleted or added so that the polypeptide or peptide retains its reactivity with an antiserum against the polypeptide or peptide of a) .
De manière préférée, ce polypeptide ou peptide est caractérisé en ce qu'il contient:
a) soit la séquence
CTRPYKNTRQRTGIGPGQALYTTHRIIGDIRQAHC
b) soit une séquence d'acides aminés distincte de la séquence de a) dans laquelle un ou plusieurs acides aminés sont substitués par d'autres acides aminés sous réserve que le polypeptide ou le peptide conserve sa réactivité avec un antisérum contre le polypeptide ou le peptide de a);
c) soit une séquence d'acides aminés distincte des séquences selon a) et b) dans laquelle un ou plusieurs acides aminés ont été supprimés ou ajoutés de sorte que le polypeptide ou le peptide conserve sa réactivité avec un antisérum contre le polypeptide ou le peptide de a).Preferably, this polypeptide or peptide is characterized in that it contains:
a) either the sequence
CTRPYKNTRQRTGIGPGQALYTTHRIIGDIRQAHC
b) or an amino acid sequence distinct from the sequence of a) in which one or more amino acids are substituted by other amino acids provided that the polypeptide or the peptide retains its reactivity with an antiserum against the polypeptide or the peptide from a);
c) or an amino acid sequence distinct from the sequences according to a) and b) in which one or more amino acids have been deleted or added so that the polypeptide or the peptide retains its reactivity with an antiserum against the polypeptide or the peptide from a).
L'invention vise également des acides nucléiques codant des polypeptides ou des peptides tels qu'ils sont définis ci-dessus. The invention also relates to nucleic acids encoding polypeptides or peptides as defined above.
Un acide nucléique entrant dans le cadre de l'invention correspond à la séquence nucléotidique codant une partie de la séquence peptidique de la gp41. Ces deux séquences sont représentées sur la figure 1B. A nucleic acid falling within the scope of the invention corresponds to the nucleotide sequence coding for a part of the peptide sequence of gp41. These two sequences are shown in Figure 1B.
Un autre acide nucléique entrant également dans le cadre de la présente invention correspond à la séquence nucléotidique codant une partie de la séquence peptidique de gp120. Ces deux séquences sont représentées sur la figure 1A. Another nucleic acid also falling within the scope of the present invention corresponds to the nucleotide sequence encoding a part of the peptide sequence of gp120. These two sequences are shown in Figure 1A.
L'invention a également trait aux vecteurs contenant un acide nucléique tel qu'il est défini ci-dessus. The invention also relates to vectors containing a nucleic acid as defined above.
Ainsi, des vecteurs selon l'invention sont les plasmides contenant les acides nucléiques ci-dessus définis, tels que déposés le 9
Février 1995 à la CNCM sous la référence 1-1534 pour gp 120 et pour pour gp 41.Thus, vectors according to the invention are the plasmids containing the nucleic acids defined above, as deposited on 9
February 1995 at the CNCM under the reference 1-1534 for gp 120 and for for gp 41.
L'invention vise également des cellules susceptibles de contenir un acide nucléique, cet acide nucléique répondant à une des séquences nucléotidiques telle qu'elles sont définies ci-dessus. The invention also relates to cells capable of containing a nucleic acid, this nucleic acid responding to one of the nucleotide sequences as defined above.
Alternativement, ces cellules sont transfectées par un vecteur répondant aux caractéristiques d'un vecteur précédemment décrit. Alternatively, these cells are transfected with a vector corresponding to the characteristics of a vector previously described.
La présente invention concerne également un virus tel que celui déposé le 9 Février 1995 à la CNCM sous la référence 1-1533. The present invention also relates to a virus such as that deposited on February 9, 1995 at the CNCM under the reference 1-1533.
Un virus entrant également dans le cadre de l'invention est un virus de même sous-type que le précédent, caractérisé en ce que des peptides consensus de ce virus sont reconnus par des anticorps reconnaissant spécifiquement un polypeptide ou un peptide précédemment défini. A virus also coming within the scope of the invention is a virus of the same subtype as the previous one, characterized in that consensus peptides of this virus are recognized by antibodies specifically recognizing a previously defined polypeptide or peptide.
L'ARN génomique du virus précédemment défini entre également dans le cadre de l'invention. The genomic RNA of the virus previously defined also falls within the scope of the invention.
Entre également dans le cadre de l'invention, un nécessaire ou trousse de détection d'anticorps dans le sérum ou tout autre échantillon biologique de patient susceptible d'être infecté par un rétrovirus humain du type HIV, caractérisé en ce qu'il comprend:
- au moins un polypeptide ou un peptide ayant pour séquence une des séquences décrites ci-dessus;
- des moyens permettant la réaction de formation du complexe immunologique entre le(s) polypeptide(s) ou le(s) peptide(s) et les anticorps éventuellement présents dans l'échantillon biologique à tester, par exemple si besoin un ou plusieurs tampons en incubation,
- un échantillon témoin négatif,
- des moyens de révélation du complexe antigènelanticorps formé.Also within the scope of the invention is a kit or kit for detecting antibodies in serum or any other biological sample from a patient likely to be infected with a human retrovirus of the HIV type, characterized in that it comprises:
- at least one polypeptide or a peptide having for sequence one of the sequences described above;
- means allowing the reaction to form the immunological complex between the polypeptide (s) or the peptide (s) and the antibodies possibly present in the biological sample to be tested, for example if necessary one or more buffers in incubation,
- a negative control sample,
means for revealing the antigen-antibody complex formed.
Egalement selon l'invention, cette trousse contient, en outre, au moins un polypeptide ou un peptide consensus dérivé d'une autre souche HIV ou d'un polypeptide ou d'un peptide comprenant,
soit une séquence d'acides aminés distincte de la séquence de ce polypeptide ou peptide dans laquelle un ou plusieurs acides aminés sont substitués par d'autres acides aminés sous réserve que le polypeptide ou le peptide conserve sa réactivité avec un antisérum contre le polypeptide ou le peptide consensus,
soit une séquence d'acides aminés dans laquelle un ou plusieurs acides aminés ont été supprimés ou ajoutés sous réserve que le polypeptide ou le peptide conserve sa réactivité avec un antisérum contre le polypeptide ou le peptide consensus.Also according to the invention, this kit contains, in addition, at least one consensus polypeptide or peptide derived from another HIV strain or from a polypeptide or peptide comprising,
either an amino acid sequence distinct from the sequence of this polypeptide or peptide in which one or more amino acids are substituted by other amino acids provided that the polypeptide or peptide retains its reactivity with an antiserum against the polypeptide or consensus peptide,
or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted or added provided that the polypeptide or the peptide retains its reactivity with an antiserum against the consensus polypeptide or peptide.
Préférentiellement, une trousse selon l'invention contiendra, en outre, au moins un polypeptide ou un peptide dérivé d'une autre souche
HIV, de préférence la souche HIV-LAI .ou la souche HIV-MN. Preferably, a kit according to the invention will contain, in addition, at least one polypeptide or a peptide derived from another strain.
HIV, preferably the HIV-LAI strain or the HIV-MN strain.
L'invention concerne également une composition polypeptidique pour le diagnostic in vitro d'une infection due au rétrovirus selon l'invention, ou à un de ses variants ce diagnostic s'effectuant dans un échantillon biologique susceptible de contenir les anticorps formés après ladite infection. Cette composition est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polypeptide ou un peptide selon l'invention. The invention also relates to a polypeptide composition for the in vitro diagnosis of an infection due to the retrovirus according to the invention, or to one of its variants, this diagnosis being carried out in a biological sample capable of containing the antibodies formed after said infection. This composition is characterized in that it comprises at least one polypeptide or a peptide according to the invention.
L'échantillon biologique peut être constitué notamment de sang, de plasma, de sérum ou de tout autre extrait biologique. Les compositions ci-dessus sont utilisables pour la détection d'anticorps dans un des échantillons biologiques susdits. The biological sample can consist in particular of blood, plasma, serum or any other biological extract. The above compositions can be used for the detection of antibodies in one of the abovementioned biological samples.
L'invention vise donc également une méthode de diagnostic in vitro d'une infection due spécifiquement à un rétrovirus du type HIV, caractérisée par les étapes de:
- mise en contact d'un échantillon biologique susceptible de contenir des anticorps produits à la suite d'une infection par un rétrovirus du type HIV-1, avec un polypeptide ou un peptide répondant aux définitions ci-dessus, ou avec une composition polypeptidique ou peptidique décrite ci-dessus, dans des conditions appropriées permettant la formation d'un complexe immunologique du type antigênelanticorps,
- détection de l'éventuelle présence du complexe.The invention therefore also relates to a method of in vitro diagnosis of an infection due specifically to a HIV-type retrovirus, characterized by the steps of:
contacting a biological sample capable of containing antibodies produced following an infection by a retrovirus of the HIV-1 type, with a polypeptide or a peptide corresponding to the above definitions, or with a polypeptide composition or peptide described above, under appropriate conditions allowing the formation of an immunological complex of the antigen-antibody type,
- detection of the possible presence of the complex.
L'invention concerne par ailleurs une composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polypeptide et un peptide en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable pour la constitution de vaccins. The invention further relates to an immunogenic composition, characterized in that it comprises at least one polypeptide and one peptide in association with a pharmaceutical vehicle acceptable for the constitution of vaccines.
L'invention se rapporte également à un procédé de préparation des glycoprotéines gp41 et gp120 de la souche rétrovirale selon l'invention, le procédé étant caractérisé par les étapes suivantes:
- lyse des cellules infectées par un rétrovirus HIV-1 selon l'invention et séparation du surnageant et des cellules infectées ou lyse des culots viraux préparés par centrifugation,
- dépôt de l'extrait cellulaire et/ou de l'extrait viral sur immuno-adsorbant contenant des anticorps purifiés, obtenus à partir d'un sérum de sujet infecté par le rétrovirus selon l'invention, et fixés avantageusement sur un support adapté, ledit sérum de sujet infecté ayant la capacité de réagir fortement avec des protéines d'enveloppe du virus selon l'invention,
- incubation en présence d'un tampon et pendant un temps suffisamment long pour obtenir la formation d'un complexe immunologique antigène/anticorps,
- lavage de l'immuno-adsorbant avec un tampon pour éliminer les molécules non retenues sur le support,
- récupération des protéines antigéniques recherchées
Selon un premier mode de réalisation de ce procédé de préparation, la séparation et la récupération des glycoprotéines gp41 et gp120 de HIV-1 MAD sont faites par électrophorèse et par électroréduction des protéines.The invention also relates to a process for the preparation of the gp41 and gp120 glycoproteins of the retroviral strain according to the invention, the process being characterized by the following steps:
lysis of the cells infected with an HIV-1 retrovirus according to the invention and separation of the supernatant from the infected cells or lysis of the viral pellets prepared by centrifugation,
deposition of the cell extract and / or of the viral extract on an immunoadsorbent containing purified antibodies, obtained from a serum of a subject infected with the retrovirus according to the invention, and advantageously fixed on a suitable support, said serum of an infected subject having the capacity to react strongly with envelope proteins of the virus according to the invention,
- incubation in the presence of a buffer and for a time long enough to obtain the formation of an antigen / antibody immunological complex,
- washing the immunosorbent with a buffer to remove the molecules not retained on the support,
- recovery of the antigenic proteins sought
According to a first embodiment of this preparation process, the separation and recovery of the gp41 and gp120 glycoproteins of HIV-1 MAD are carried out by electrophoresis and by electroreduction of the proteins.
Selon un autre mode de réalisation de ce procédé de préparation, la récupération des protéines est obtenue par:
- élution des protéines fixées sur l'immuno-adsorbant cidessus,
- purification des produits ainsi élués sur une colonne de chromatographie contenant, fixés sur le support de séparation, des anticorps reconnaissant la glycoprotéine gp41 ou la gp120 de HIV-1 MAD.According to another embodiment of this preparation process, the recovery of proteins is obtained by:
- elution of the proteins fixed on the above immunosorbent,
- Purification of the products thus eluted on a chromatography column containing, fixed on the separation support, antibodies recognizing the glycoprotein gp41 or the gp120 of HIV-1 MAD.
Entre également dans le cadre de l'invention, un procédé de production d'un polypeptide ou d'un peptide selon l'invention, ce polypeptide ou peptide étant obtenu
- soit par l'expression d'un acide nucléique de l'invention,
- soit par synthèse chimique, par addition d'acides aminés jusqu'à l'obtention de ce polypeptide ou de ce peptide. Also within the scope of the invention is a process for producing a polypeptide or a peptide according to the invention, this polypeptide or peptide being obtained
- either by the expression of a nucleic acid of the invention,
- Either by chemical synthesis, by adding amino acids until this polypeptide or peptide is obtained.
Les principes et les procédés classiques du génie génétique peuvent être ici utilisés ( Molecular cloning , Sambrook, Fritsch,
Maniatis, CSH 1989)
Entre également dans le cadre de l'invention, un procédé de production d'un acide nucléique précédemment défini, pouvant être produit soit par isolement à partir du virus de l'invention, soit par synthèse chimique, soit en utilisant des techniques d'amplification in vitro des acides nucléiques à partir d'amorces spécifiques.The classical principles and processes of genetic engineering can be used here (Molecular cloning, Sambrook, Fritsch,
Maniatis, CSH 1989)
Also within the scope of the invention is a process for producing a previously defined nucleic acid, which can be produced either by isolation from the virus of the invention, or by chemical synthesis, or by using amplification techniques. in vitro nucleic acids from specific primers.
Ainsi, I'invention a également trait à des amorces oligonucléotidiques utilisées lors de l'amplification d'acides nucléiques codant des oligopeptides de glycoprotéine d'enveloppe, par exemple la glycoprotéine gp120 V3 de la souche HIV-1 MAD de la présente invention et de toute séquence gp 120 V3 d'un virus HIV-ldu groupe M. Thus, the invention also relates to oligonucleotide primers used during the amplification of nucleic acids coding for envelope glycoprotein oligopeptides, for example the glycoprotein gp120 V3 of the strain HIV-1 MAD of the present invention and any gp 120 V3 sequence of a group M HIV-1 virus
Ces amorces oligonucléotidiques sont caractérisées en ce qu'elles ont une séquence consistant en au moins huit nucléotides consécutifs des séquences nucléotidiques suivantes:
AATGGCAGTCTAGCAGAAGAA, ou TC CTCAG GAG G G GAC C CAGM . These oligonucleotide primers are characterized in that they have a sequence consisting of at least eight consecutive nucleotides of the following nucleotide sequences:
AATGGCAGTCTAGCAGAAGAA, or TC CTCAG GAG GG GAC C CAGM.
Selon l'invention, ces amorces peuvent être utilisées lors d'un processus d'amplification génique, par exemple par PCR ou une technique équivalente, d'une séquence nucléotidique codant pour un peptide de l'invention. According to the invention, these primers can be used during a gene amplification process, for example by PCR or an equivalent technique, of a nucleotide sequence coding for a peptide of the invention.
Egalement, l'invention concerne une trousse permettant l'amplification par PCR ou une technique équivalente ci-dessus décrite. Also, the invention relates to a kit allowing amplification by PCR or an equivalent technique described above.
Entre également dans le cadre de la présente invention, un procédé de détection de la présence dans un échantillon biologique d'acide(s) nucléique(s) caractéristique(s) d'une rétrovirus de type HIV, y inclus d'un rétrovirus selon l'invention Ce procédé comprend une mise en contact d'un ADNc formé à partir d'ARN(s) contenu(s) dans cet échantillon biologique, dans des conditions permettant l'hybridation de cet ADNc avec le génome rétroviral, et la réalisation d'une amplification génique sur cet échantillon viral. Also within the scope of the present invention, a method for detecting the presence in a biological sample of nucleic acid (s) characteristic (s) of a retrovirus of HIV type, including a retrovirus according to The invention This method comprises bringing a cDNA formed from RNA (s) contained in this biological sample into contact, under conditions allowing the hybridization of this cDNA with the retroviral genome, and carrying out of a gene amplification on this viral sample.
L'invention concerne également un lysat viral tel qu'il est obtenu par lyse des cellules infectées par un virus selon l'invention
Un extrait protéique d'une souche HIV-MAD contenant notamment un polypeptide ou un peptide tel que précédemment défini entre également dans le cadre de l'invention.The invention also relates to a viral lysate as obtained by lysis of cells infected with a virus according to the invention
A protein extract of an HIV-MAD strain containing in particular a polypeptide or a peptide as previously defined also falls within the scope of the invention.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans le (les) exemples et les figures. Other characteristics and advantages of the invention will appear in the example (s) and the figures.
Légende des figures
- Figure 1: superposition de séquences nucléotidiques HIV 1
MAD et des séquences peptidiques codées correspondantes.Legend of figures
- Figure 1: superposition of HIV 1 nucleotide sequences
MAD and corresponding encoded peptide sequences.
- Figure 1A fragment des séquences nucléotidiques et peptidiques de la boucle V3 de la glycoprotéine gp120,
- Figure 1 B fragment des séquences nucléotidiques et peptidiques, comprenant la région immuno-dominante de la glycoprotéine gap41;
- Figure 2 comparaison des séquences d'acides aminés de la boucle V3 de la glycoprotéine gp120 (figure 2A) et de la région immunodominante de la glycoprotéine gp41 (figure 2B), sur différents types de souches HIV-1. FIG. 1A fragment of the nucleotide and peptide sequences of the V3 loop of the gp120 glycoprotein,
- Figure 1 B fragment of the nucleotide and peptide sequences, comprising the immuno-dominant region of the gap41 glycoprotein;
- Figure 2 comparison of the amino acid sequences of the V3 loop of the gp120 glycoprotein (Figure 2A) and the immunodominant region of the gp41 glycoprotein (Figure 2B), on different types of HIV-1 strains.
MAD: souche HIV-1 MAD,
LAI: souche HIV BRUCG
OYl: souche HIV OYI
ELI: souche HIV ELICG
MAL: souche HIV MAL 455: souche HIV 455A
CPZ: souche HIV CG
ANT: souche HIV ANT70C
MVP souche HIV MVP5518
VAU : souche HIV VAU
La séquence CPZ est issue d'une glycoprotéine d'une souche du type SIV , ANT, MVP et VAU sont des séquences issues de glycoprotéines de souches du groupe HIV-l-O.MAD: HIV-1 MAD strain,
LAI: HIV BRUCG strain
OYl: HIV OYI strain
ELI: HIV ELICG strain
MAL: HIV strain MAL 455: HIV 455A strain
CPZ: HIV CG strain
ANT: HIV strain ANT70C
MVP strain HIV MVP5518
VAU: HIV VAU strain
The CPZ sequence is derived from a glycoprotein of a strain of the SIV type, ANT, MVP and VAU are sequences derived from glycoproteins from strains of the HIV-10 group.
Les changements d'acides aminés par rapport au consensus
LAI sont représentés en gras lorsque ceux-ci sont retrouvés dans la séquence de la souche MAD.Amino acid changes from consensus
LAI are represented in bold when these are found in the sequence of the MAD strain.
Localisation de certains peptides : région immunodominante de gp41 (LAI [===]), ANT [2]), O VMP 5180 [ ],
Exemple:
Des séquences d'ADN de lymphocytes du sang périphérique et de cultures virales d'ADN ont été obtenues par amplification génique d'ADN. Dans le procédé d'amplification employé, les inventeurs ont utilisé les amorces nucléotidiques suivantes
CGCGAGCTGCAGTGTTCCTTGGGTTCTTG et CGCGAGCTGCAGGAGTTITCCAGAGGAACCCC, ainsi que
CGCGAGCTGCAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTC et
CGCGAGCTGCAGTTCTTGTTCATTCTTTTCTTGCTG pour la région de la glycoprotéine gp41, ainsi que les amorces
CGCGAGCTGCAGAATGGCAGTCTAGCAGAAGAA et
CGCGAGCTGCAGTTCTGGGTCCCCTCCTGAGGA pour la région V3 de la glycoprotéine gp120. Localization of certain peptides: immunodominant region of gp41 (LAI [===]), ANT [2]), O VMP 5180 [],
Example:
DNA sequences from peripheral blood lymphocytes and viral DNA cultures were obtained by gene amplification of DNA. In the amplification method used, the inventors used the following nucleotide primers
CGCGAGCTGCAGTGTTCCTTGGGTTCTTG and CGCGAGCTGCAGGAGTTITCCAGAGGAACCCC, as well as
CGCGAGCTGCAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTC and
CGCGAGCTGCAGTTCTTGTTCATTCTTTTCTTGCTG for the gp41 glycoprotein region, as well as the primers
CGCGAGCTGCAGAATGGCAGTCTAGCAGAAGAA and
CGCGAGCTGCAGTTCTGGGTCCCCTCCTGAGGA for the V3 region of the gp120 glycoprotein.
Toutes les amoreces utilisées avaient en commun une extrémité 5' contenant un site PST1 permettant le clonage ultérieur dans un plasmide BluescriptB. Les produits d'amplification ont été clonés soit selon les techniques classiques utilisant les amorces universelles T3 et T7 soit directement séquencés par l'utilisation des amorces de la précédente amplification. Les séquences ont ensuite été déterminées par le dispositif automatique de séquençage Applied Biosystems 373A (ESGS Montigny le
Bretonneux, France). All the primers used had in common a 5 ′ end containing a PST1 site allowing subsequent cloning into a BluescriptB plasmid. The amplification products were cloned either according to conventional techniques using the universal primers T3 and T7 or directly sequenced by the use of the primers of the previous amplification. The sequences were then determined by the automatic sequencing device Applied Biosystems 373A (ESGS Montigny on
Bretonneux, France).
Dans une séquence partielle de la glycoprotéine gp41 (souche HIV-1 MAD) codant 124 acides aminés, 1 1 d'entre eux se sont révélés différents de ceux de la séquence consensus LAI. En comparant ces 11 acides aminés dans les séquences peptidiques des diverses autres souches décrites ci-dessus, on retrouve des acides aminés communs:
séquence OYl : 5 acides aminés
séquence ELI : 6 acides aminés
séquence MAL: 7 acides aminés
séquence 455: 7 acides aminés
séquence CPZ: 4 acides aminés
séquence ANT: 3 acides aminés
séquence MPV: 2 acides aminés séquence VAU 2 2 acides aminés. In a partial sequence of the glycoprotein gp41 (strain HIV-1 MAD) encoding 124 amino acids, 1 1 of them appeared to be different from those of the consensus sequence LAI. By comparing these 11 amino acids in the peptide sequences of the various other strains described above, we find common amino acids:
OYl sequence: 5 amino acids
ELI sequence: 6 amino acids
MAL sequence: 7 amino acids
sequence 455: 7 amino acids
CPZ sequence: 4 amino acids
ANT sequence: 3 amino acids
MPV sequence: 2 amino acids VAU 2 sequence 2 amino acids.
Bien que moins divergente de la séquence consensus LAI que des souches de groupe O, la séquence peptidique partielle de gp41
MAD n'est cependant identique à aucune de celles des autres souches HIV-1 connues (Figure 2B).Although less divergent from the LAI consensus sequence than group O strains, the partial peptide sequence of gp41
MAD is however not identical to any of the other known HIV-1 strains (Figure 2B).
La réactivité sérologique semble être abolie par seulement quelques changements d'acides aminés de la région immunodominante de la glycoprotéine gp41. En l'espèce, seules 4 différences ont été observées dans cette région (3 dans chaque peptide testé). Plus particulièrement, le simple échange d'une Leucine (23ème acide aminé de la séquence LAI de la figure 2) par une Histidine, au niveau de la petite boucle SGKLI située entre deux cystéines, apparaît critique.Un épitope spécifique de la région immunodominante de gp 41 de HIV-MAD semble donc être déterminé par un seul acide aminé. Serological reactivity appears to be abolished by only a few amino acid changes in the immunodominant region of the gp41 glycoprotein. In this case, only 4 differences were observed in this region (3 in each peptide tested). More particularly, the simple exchange of a Leucine (23rd amino acid of the LAI sequence of FIG. 2) by a Histidine, at the level of the small SGKLI loop located between two cysteines, appears critical. An epitope specific for the immunodominant region of gp 41 of HIV-MAD therefore seems to be determined by a single amino acid.
Concernant la séquence de la glycoprotéine gel 20 incluant la boucle V3, elle est constituée de 96 acides aminés dont 40 se sont révélés différents de la séquence consensus LAI. As regards the sequence of the glycoprotein gel 20 including the V3 loop, it consists of 96 amino acids, 40 of which were found to be different from the LAI consensus sequence.
Certains acides aminés, sur un total de 40, de la séquence de la gp120 des différentes souches de la figure 1A sont retrouvés chez HIV
MAD:
séquence OYl: 8 acides aminés
séquence ELI: 21 acides aminés
séquence MAL. 18 acides aminés
séquence 455. 10 acides aminés
séquence CPZ: 7 acides aminés
séquence ANT: 4 acides aminés
séquence MPV: 8 acides aminés
séquence VAU : 9 acides aminés
La souche HIV-1 MAD s'est révélée considérablement divergente dans sa séquence par rapport au consensus LAI. Bien que plus proche des souches ELI et MAL, la souche MAD n'a révélé aucune identité avec les souches de type HIV-1 connues (figure 2); la souche HIV-1 MAD présente un motif GPGQALYT commun avec une autre souche africaine (HIV-1 MAL) au niveau de la boucle V3. Ce point commun de séquence est très certainement responsable des réactivités sérologiques croisées observées. Certain amino acids, out of a total of 40, of the gp120 sequence of the different strains in FIG. 1A are found in HIV
MAD:
OYl sequence: 8 amino acids
ELI sequence: 21 amino acids
MAL sequence. 18 amino acids
sequence 455. 10 amino acids
CPZ sequence: 7 amino acids
ANT sequence: 4 amino acids
MPV sequence: 8 amino acids
VAU sequence: 9 amino acids
The HIV-1 MAD strain was found to be considerably divergent in its sequence compared to the LAI consensus. Although closer to the ELI and MAL strains, the MAD strain did not reveal any identity with the known HIV-1 type strains (FIG. 2); the HIV-1 MAD strain has a GPGQALYT motif common with another African strain (HIV-1 MAL) at the V3 loop. This common point in sequence is most certainly responsible for the serological cross-reactivities observed.
Claims (29)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9501513A FR2730493B1 (en) | 1995-02-09 | 1995-02-09 | TRANSMEMBRANE ENVELOPE GLYCOPROTEIN POLYPEPTIDES OF HUMAN RETROVIRUS TYPE HIV-1 AND POLYPEPTIDES HAVING AN IMMUNOLOGICAL PARENT |
| FR9501588A FR2730243B3 (en) | 1995-02-09 | 1995-02-10 | POLYPEPTIDES OF ENVELOPE TRASMEMBRANE GLYCOPROTEIN OF THE HUMAN RETROVIRUS OF THE HIV-1 TYPE AND POLYPEPTIDES PRESENTING AN IMMUNOLOGICAL RELATED TO THEM |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9501513A FR2730493B1 (en) | 1995-02-09 | 1995-02-09 | TRANSMEMBRANE ENVELOPE GLYCOPROTEIN POLYPEPTIDES OF HUMAN RETROVIRUS TYPE HIV-1 AND POLYPEPTIDES HAVING AN IMMUNOLOGICAL PARENT |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2730493A1 true FR2730493A1 (en) | 1996-08-14 |
| FR2730493B1 FR2730493B1 (en) | 1997-04-18 |
Family
ID=9475996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9501513A Expired - Lifetime FR2730493B1 (en) | 1995-02-09 | 1995-02-09 | TRANSMEMBRANE ENVELOPE GLYCOPROTEIN POLYPEPTIDES OF HUMAN RETROVIRUS TYPE HIV-1 AND POLYPEPTIDES HAVING AN IMMUNOLOGICAL PARENT |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2730493B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998052969A1 (en) * | 1997-05-16 | 1998-11-26 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for detecting hiv antibodies and antigens used to this end |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990013630A1 (en) * | 1989-05-03 | 1990-11-15 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Highly cytopathogenic hiv-ndk retrovirus, dna fragments of this retrovirus, method for preparing a protein and/or an enzyme of this virus, and the applications of these |
| EP0402088A2 (en) * | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Merck & Co. Inc. | Conjugate immunogen for aids |
| EP0516135A2 (en) * | 1991-05-31 | 1992-12-02 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Human immunodeficiency virus-related immune preparation |
-
1995
- 1995-02-09 FR FR9501513A patent/FR2730493B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990013630A1 (en) * | 1989-05-03 | 1990-11-15 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Highly cytopathogenic hiv-ndk retrovirus, dna fragments of this retrovirus, method for preparing a protein and/or an enzyme of this virus, and the applications of these |
| EP0402088A2 (en) * | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Merck & Co. Inc. | Conjugate immunogen for aids |
| EP0516135A2 (en) * | 1991-05-31 | 1992-12-02 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Human immunodeficiency virus-related immune preparation |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LOOWAGIE, J. ET AL.: "Genetic diversity of the envelope glyco protein from Human Immunodeficiency Virus Type 1 isolates from african origin", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 69, no. 1, pages 263 - 271 * |
| WAIN-HOBSON, S. ET AL.: "LAV revisited: origins of the early viral HIV-1 isolates from Institut Pasteur", SCIENCE, vol. 252, 17 May 1991 (1991-05-17), LANCASTER, PA US, pages 961 - 965 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998052969A1 (en) * | 1997-05-16 | 1998-11-26 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for detecting hiv antibodies and antigens used to this end |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2730493B1 (en) | 1997-04-18 |
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