FR2729973A1 - Screening for antiviral cpds. that esp. inhibit HIV integrase activity - Google Patents
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Abstract
Description
Procédé de criblage de composés anti-viraux
L'invention a pour objet un procédé de criblage de composés anti-viraux. Elle vise plus spécialement un procédé pour mettre en évidence chez un composé à tester des propriétés inhibitrices d'une activité pathogène d'origine virale.Method for screening anti-viral compounds
The subject of the invention is a method for screening anti-viral compounds. It relates more particularly to a method for demonstrating in a test compound inhibitory properties of a pathogenic activity of viral origin.
Par "activité pathogène d'origine virale", on entend une activité de produit de gène, ARN ou protéine, ou un fragment actif, nécessaire au déroulement du cycle d'un virus, notamment d'un rétrovirus pathogène pour 1'homme ou l'animal. By "pathogenic activity of viral origin" is meant a gene product, RNA or protein product activity, or an active fragment, necessary for the course of the cycle of a virus, in particular a retrovirus that is pathogenic for humans or humans. 'animal.
La recherche de nouveaux moyens de lutte contre les virus mobilise de nombreuses équipes de chercheurs de par le monde, un effort particulièrement important étant développé dans le domaine des rétrovirus depuis la découverte du rôle de HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus
Type 1) en tant qu'agent causal du SIDA.The search for new means of fight against viruses mobilizes many teams of researchers around the world, a particularly important effort being developed in the field of retroviruses since the discovery of the role of HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus
Type 1) as a causative agent of AIDS.
Comme tous les rétrovirus, HIV-1 possède un génome ARN, qui est copié en ADN grâce à une réaction catalysée par la transcriptase inverse, enzyme codée par le génome du rétrovirus. Like all retroviruses, HIV-1 has an RNA genome, which is copied to DNA through a reaction catalyzed by reverse transcriptase, an enzyme encoded by the retrovirus genome.
La copie ADN double brin proviral est plus longue que 1'ARN génomique en raison de la duplication et de l'association de certaines séquences aux extrémités de 1'ARN génomique viral lors de la transcription inverse. Proviral double-stranded DNA copy is longer than genomic RNA because of the duplication and association of certain sequences at the ends of the viral genomic RNA during reverse transcription.
Ces séquences répétées que l'on trouve aux extrémités du provirus s'appellent LTR (long terminal repeat) et sont indispensables lors de l'étape d'intégration. These repeated sequences found at the ends of the provirus are called LTR (long terminal repeat) and are essential during the integration step.
L'ADN rétroviral est ensuite intégré dans le génome de la cellule-hôte grâce à l'intégrase, une autre enzyme codée par le rétrovirus. Cette enzyme provoque des coupures décalées et, tout au moins en première approximation, aléatoires dans le génome de la cellulehôte où se produisent les intégrations. The retroviral DNA is then integrated into the genome of the host cell with integrase, another enzyme encoded by the retrovirus. This enzyme causes staggered and, at least first approximation, random cleavages in the genome of the host cell where the integrations occur.
Cette étape d'intégration, nécessaire à la multiplication du virus, constitue une cible potentielle pour un traitement thérapeutique. This integration step, necessary for the multiplication of the virus, constitutes a potential target for a therapeutic treatment.
Les études menées jusqu'à présent ont plutôt été axées sur la transcriptase inverse. Il est en effet très facile de détecter son activité enzymatique in vitre. Ainsi la majorité des agents thérapeutiques anti
SIDA, et en particulier l'AZT, ont pour rôle d'empêcher son fonctionnement. Mais ces traitements ne donnant pas de résultats définitifs, de nouvelles stratégies ont été développées, concernant essentiellement la protéase rétrovirale.Studies to date have focused instead on reverse transcriptase. It is indeed very easy to detect its enzymatic activity in glass. So the majority of anti therapeutic agents
AIDS, and in particular AZT, have the role of preventing its functioning. But since these treatments do not give definitive results, new strategies have been developed, mainly concerning retroviral protease.
En ce qui concerne l'intégrase, ce n'est que très récemment que des molécules inhibitrices ont été isolées. Ce retard s'explique par le fait que les tests in vitre permettant de détecter l'activité de l'intégrase n'ont été mis au point que depuis peu, et certainement par le fait qu'il n'existe pas de test simple de mise en évidence de l'activité invivo. As far as integrase is concerned, it is only very recently that inhibitory molecules have been isolated. This delay is explained by the fact that the in vitro tests for detecting the activity of integrase have been developed only recently, and certainly because there is no simple test of highlighting the invivo activity.
L'invention a précisément pour but de fournir des moyens permettant de réaliser un test in vive dans un modèle cellulaire et, par là, de détecter des propriétés anti-intégrase chez des produits testés. The purpose of the invention is precisely to provide means for performing an in vivo test in a cellular model and thereby to detect anti-integrase properties in tested products.
De manière plus générale, l'invention vise à fournir des moyens permettant le criblage de composés actifs contre une activité pathogène d'un produit de gène d'un virus, notamment d'un rétrovirus. Ce produit de gène, ARN ou protéine, ou un fragment actif, sera appelé ci-après molécule cible. More generally, the invention aims to provide means for screening active compounds against a pathogenic activity of a gene product of a virus, in particular a retrovirus. This gene product, RNA or protein, or an active fragment will be referred to hereinafter as a target molecule.
L'invention repose ainsi sur l'élaboration d'un système cellulaire dans lequel on introduit une molécule cible capable de provoquer l'apparition d'un caractère phénotypique pouvant être visualisé, étant entendu que l'activité qui produit le caractère phénotypique est étroitement liée à celle produite chez un hôte infecté, nécessaire au déroulement du cycle viral. The invention is thus based on the development of a cellular system in which a target molecule is introduced capable of causing the appearance of a phenotypic character that can be visualized, it being understood that the activity which produces the phenotypic character is closely related. to that produced in an infected host, necessary for the course of the viral cycle.
Le système cellulaire mis en oeuvre selon l'invention comprend des microorganismes en culture, génétiquement modifiés par l'introduction d'une séquence d'ADN capable d'exprimer la molécule cible dans les cellules du microorganisme. The cellular system used according to the invention comprises microorganisms in culture, genetically modified by the introduction of a DNA sequence capable of expressing the target molecule in the cells of the microorganism.
L'invention vise donc l'utilisation d'un tel système cellulaire dans un procédé de criblage de composés inhibiteurs d'un effet pathogène de composés d'origine virale, notamment rétrovirale. The invention therefore relates to the use of such a cell system in a method for screening compounds which inhibit the pathogenic effect of compounds of viral origin, in particular retroviral origin.
Ce procédé est caractérisé en ce qu'il est réalisé in vive et comprend
- l'utilisation d'un microorganisme en culture, génétiquement modifié par l'introduction d'une séquence d'ADN capable de se répliquer dans le microorganisme et d'exprimer une activité pathogène d'une molécule cible d'origine virale, telle que définie ci-dessus,
- l'addition au microorganisme en culture d'un composé à tester, ce composé étant capable de pénétrer à l'intérieur des cellules du microorganisme, et n'interférant pas avec la multiplication naturelle de ce dernier, d'une manière qui rende le test inutilisable.This process is characterized in that it is performed in vivo and comprises
the use of a microorganism in culture, genetically modified by the introduction of a DNA sequence capable of replicating in the microorganism and of expressing a pathogenic activity of a target molecule of viral origin, such as defined above,
the addition to the microorganism in culture of a test compound, this compound being capable of penetrating inside the cells of the microorganism, and not interfering with the natural multiplication of the latter, in a manner which renders the unusable test.
La culture du microorganisme étant réalisée dans des conditions permettant, au moment de l'addition dudit composé, une expression de la molécule cible conduisant à l'apparition d'un caractère phénotypique détectable,
- l'examen de la culture pour vérifier si le caractère phénotypique est modifié, voire supprimé ou, au contraire, est maintenu, afin de déterminer si le composé testé est respectivement un inhibiteur de l'activité virale pathogène ou s'il n'a pas d'effet sur cette activité.The culture of the microorganism being carried out under conditions allowing, at the time of the addition of said compound, an expression of the target molecule leading to the appearance of a detectable phenotypic character,
- the examination of the culture to verify whether the phenotypic character is modified or suppressed or, on the contrary, is maintained, in order to determine whether the test compound is respectively an inhibitor of the pathogenic viral activity or if it has not no effect on this activity.
En effet, la disparition du caractère phénotypique, malgré la présence du produit de gène viral, permettra d'établir que le composé exerce un effet inhibiteur vis-à-vis de ce produit. Au contraire, le maintien de ce caractère signifiera que le composé testé est inactif vis-à-vis du produit viral. Indeed, the disappearance of the phenotypic character, despite the presence of the viral gene product, will establish that the compound has an inhibitory effect vis-à-vis this product. On the contrary, the maintenance of this character will mean that the tested compound is inactive vis-à-vis the viral product.
La séquence d 'ADN introduite dans le microorganisme comprend l'information nécessaire pour coder au moins pour la partie active de la molécule cible, c'est-à-dire celle capable de provoquer l'apparition du caractère phénotypique vis-à-vis du microorganisme dans lequel elle est introduite. The DNA sequence introduced into the microorganism comprises the information necessary to code at least for the active part of the target molecule, that is to say that capable of causing the appearance of the phenotypic character vis-à-vis the microorganism into which it is introduced.
Comme indiqué plus haut, l'activité qui produit le caractère phénotypique dans le microorganisme doit correspondre à celle qui est nécessaire au déroulement du cycle viral lors de l'infection chez l'homme ou l'animal. As indicated above, the activity which produces the phenotypic character in the microorganism must correspond to that which is necessary for the course of the viral cycle during infection in humans or animals.
Cette condition peut être testée par exemple en modifiant par mutagénèse dirigée la molécule cible de manière à la rendre inactive dans le cycle viral et en déterminant si cette modification supprime également le caractère phénotypique dans le microorganisme.This condition can be tested, for example, by modifying the target molecule by site-directed mutagenesis so as to render it inactivated in the viral cycle and determining whether this modification also removes the phenotypic character in the microorganism.
Avantageusement, la séquence d'ADN est sous le contrôle d'un promoteur inductible, ce qui permet de déclencher l'expression de la molécule cible ou de la réprimer par simple modification de la teneur en composé responsable de l'induction dans le milieu de culture. Advantageously, the DNA sequence is under the control of an inducible promoter, which makes it possible to trigger the expression of the target molecule or to repress it by simple modification of the content of the compound responsible for induction in the medium of culture.
Pour la réplication de la séquence d'ADN dans le microorganisme, on a recours à un vecteur comportant, outre cette séquence, une origine de réplication fonctionnant dans le microorganisme. For the replication of the DNA sequence in the microorganism, there is used a vector comprising, in addition to this sequence, an origin of replication operating in the microorganism.
En variante, la séquence d'ADN sera intégrée dans un chromosome du microorganisme hôte et se répliquera donc en même temps que le chromosome. Des phages tempérés pourront être utilisés dans le cas de la transformation de bactéries. Alternatively, the DNA sequence will be integrated into a chromosome of the host microorganism and will replicate at the same time as the chromosome. Temperate phages may be used in the case of transformation of bacteria.
L'activité pathogène de la molécule cible exprimée par la séquence d'ADN provoque, par exemple, une modification de la forme des cellules ou des colonies une inhibition de la multiplication du microorganisme ou un effet létal sur le microorganisme. Dans ce dernier cas, la séquence d'ADN doit nécessairement comporter un promoteur inductible. The pathogenic activity of the target molecule expressed by the DNA sequence causes, for example, a change in the shape of the cells or colonies an inhibition of the multiplication of the microorganism or a lethal effect on the microorganism. In the latter case, the DNA sequence must necessarily comprise an inducible promoter.
On utilise avantageusement, dans le procédé de l'invention, des séquences d'ADN codant pour au moins la partie active d'enzymes nécessaires à la multiplication de rétrovirus responsables de pathologies graves chez l'homme ou l'animal. In the method of the invention, it is advantageous to use DNA sequences coding for at least the active part of enzymes necessary for the multiplication of retroviruses responsible for serious pathologies in humans or animals.
On citera en particulier les enzymes de lentivirus à pouvoir cytopathogène et tout spécialement des rétrovirus du type HIV-1 et HIV-2 isolés à ce jour chez l'homme et ceux de type SIV isolés chez le singe. Mention may in particular be made of cytopathic lentivirus enzymes and especially retroviruses of the HIV-1 and HIV-2 type isolated to date in humans and those of SIV type isolated from monkeys.
Ce procédé peut être étendu à d'autres rétrovirus tels que des oncornavirus (HTLV-1 et HTLV-2, isolés chez l'homme). This method can be extended to other retroviruses such as oncornaviruses (HTLV-1 and HTLV-2, isolated from humans).
Une séquence d'ADN présentant un intérêt particulier à cet égard correspond à celle codant pour l'intégrase ou des fragments actifs de cette dernière. A DNA sequence of particular interest in this regard corresponds to that encoding the integrase or active fragments thereof.
D'après les résultats obtenus avec HIV-1, celle-ci exerce un effet mutagène létal sur la levure.According to the results obtained with HIV-1, it has a lethal mutagenic effect on the yeast.
Le système cellulaire servant de cellule hôte est plus spécialement constitué par un microorganisme tel qu'un champignon unicellulaire, notamment une levure, ou une bactérie. The cellular system serving as a host cell is more especially constituted by a microorganism such as a unicellular fungus, especially a yeast, or a bacterium.
Les systèmes élaborés à partir de levures sont particulièrement préférés. Par rapport aux cellules humaines ou de mammifères en culture, qui constituent l'hôte naturel de HIV, ces systèmes levures présentent l'avantage de permettre la réalisation de cultures en milieu solide, facilitant l'obtention de clones, et l'obtention d'une disruption aisée des gènes. Systems made from yeasts are particularly preferred. Compared to human or mammalian cells in culture, which constitute the natural host of HIV, these yeast systems have the advantage of allowing the production of cultures in solid medium, facilitating the obtaining of clones, and the obtaining of easy disruption of genes
Selon une disposition avantageuse de l'invention, on utilise des souches de levures génétiquement modifiées, plus spécialement par mutation rad 52 et/ou par mutation protéases (-), et/ou obtenues par diploïdisation. According to an advantageous arrangement of the invention, genetically modified yeast strains are used, more especially by mutation rad 52 and / or by mutation proteases (-), and / or obtained by diploidization.
L'utilisation de souches protéases (-) permet en effet d'éviter une destruction, par les protéases cellulaires, de l'enzyme exprimée par la séquence d'ADN introduite. The use of protease (-) strains makes it possible in fact to prevent destruction by the cellular proteases of the enzyme expressed by the introduced DNA sequence.
Dans le cas de l'expression d'intégrase, on notera que, de manière surprenante, des résultats satisfaisants sont obtenus avec des souches diploïdes, alors qu'aucun effet n'est observé avec les souches haploïdes correspondantes. In the case of integrase expression, it should be noted that, surprisingly, satisfactory results are obtained with diploid strains, whereas no effect is observed with the corresponding haploid strains.
Ce résultat peut s'expliquer par l'existence de recombinaisons mitotiques entraînant l'apparition de cassures dans l'ADN, si l'on suppose que l'ADN cassé est particulièrement sensible à l'intégrase de rétrovirus. This result can be explained by the existence of mitotic recombinations leading to the appearance of breaks in the DNA, if it is supposed that the broken DNA is particularly sensitive to the retrovirus integrase.
Ceci peut constituer une explication du phénotype létal dû à l'intégrase. Une autre explication de ce phénotype létal pourrait être l'effet endonucléolytique dû à l'intégrase même en l'absence de
LTR.This may be an explanation of the lethal phenotype due to integrase. Another explanation for this lethal phenotype could be the endonucleolytic effect due to integrase even in the absence of
LTR.
Dans l'un ou l'autre cas, l'effet de l'intégrase de HIV-1 sur 1'ADN de levure provoque l'apparition d'un phénotype létal dû à la destruction de gènes indispensables à la survie des levures (effet mutagène létal). In either case, the effect of HIV-1 integrase on yeast DNA causes the appearance of a lethal phenotype due to the destruction of genes essential for yeast survival (effect mutagenic lethal).
L'étude de l'effet létal de l'intégrase, rapportée dans les exemples, montre que cet effet résulte d'une action sur différentes cibles cellulaires, mais qu'il s'exerce principalement sur l'ADN. En effet, l'expression d'intégrases sauvages et mutantes, dans des conditions d'expression conduisant à des concentrations maximales d'intégrase (utilisation d'un milieu sans leucine, donnant un nombre élevé de copies de plasmides et, comme source de carbone, de lactate, qui permet une dérépression maximale du promoteur ADH2/GAP) montre que l'effet létal dû à l'intégrase sauvage n'est pas levé par des mutations faux-sens connues pour inactiver totalement l'action de l'enzyme au niveau de l'ADN. Ceci suggère que l'intégrase de HIV-1 peut agir sur la levure de différentes manières.Cependant, 1'ADN constitue la cible la plus sensible comme il a été prouvé en diminuant la concentration intracellulaire d'intégrase par répression partielle du promoteur ADH2/GAP. Il a été en effet ainsi possible de supprimer totalement l'effet létal de l'intégrase portant les mutations faux-sens supprimant l'interaction entre l'intégrase et 1'ADN. Ce résultat a été obtenu, en utilisant, comme décrit dans les exemples, un nombre de plasmides par cellules élevé et une concentration en glucose de 5,6 %, qui n'entraîne pas de répression totale du promoteur de l'intégrase, en raison de l'existence de fuites du promoteur. The study of the lethal effect of integrase, reported in the examples, shows that this effect results from an action on different cellular targets, but that it is exerted mainly on DNA. Indeed, the expression of wild-type and mutant integrases, under expression conditions leading to maximal concentrations of integrase (use of a medium without leucine, giving a high number of plasmid copies and, as a carbon source , lactate, which allows maximum derepression of the promoter ADH2 / GAP) shows that the lethal effect due to wild-type integrase is not lifted by missense mutations known to completely inactivate the action of the enzyme at level of DNA. This suggests that HIV-1 integrase may act on yeast in different ways. However, DNA is the most sensitive target as has been proven by decreasing intracellular integrase concentration by partial repression of the ADH2 promoter. GAP. It was indeed possible to completely eliminate the lethal effect of the integrase carrying the missense mutations suppressing the interaction between the integrase and the DNA. This result was obtained using, as described in the examples, a high plasmid number per cell and a 5.6% glucose concentration, which does not result in complete repression of the integrase promoter due to the existence of leaks from the promoter.
Le composé à tester dans le procédé de l'invention est choisi parmi les composés capables de pénétrer spontanément dans le microorganisme originel ou dans un microorganisme génétiquement modifié pour permettre cette pénétration. The compound to be tested in the process of the invention is chosen from compounds capable of spontaneously entering the original microorganism or a genetically modified microorganism to allow this penetration.
Il est bien entendu que ce composé ne doit pas interférer avec la multiplication naturelle du microorganisme d'une manière qui rende le procédé inutilisable. It is understood that this compound should not interfere with the natural growth of the microorganism in a manner that renders the process unusable.
L'addition dans le milieu de culture d'un composé à tester, lorsqu'on déclenche l'expression de l'enzyme, conduit selon les propriétés du composé, soit à un maintien du phénotype létal, soit, au contraire, à une restauration de la multiplication du microorganisme. Pour augmenter le niveau d'expression de la molécule cible dans la cellule de levure, il est avantageux d'utiliser en plus du promoteur inductible, le gène leu2d faiblement exprimé, qui augmente le nombre de plasmides par cellule de levure, sur milieu dépourvu de leucine. The addition in the culture medium of a test compound, when triggering the expression of the enzyme, leads according to the properties of the compound, either to a maintenance of the lethal phenotype, or, conversely, to a restoration of the multiplication of the microorganism. To increase the level of expression of the target molecule in the yeast cell, it is advantageous to use in addition to the inducible promoter, the leu2d gene slightly expressed, which increases the number of plasmids per yeast cell, on medium lacking leucine.
Les tests seront réalisés en milieu solide, comme décrit dans les exemples, mais également en milieu liquide, ce qui permet d'utiliser de plus faibles quantités de composés à tester. The tests will be carried out in a solid medium, as described in the examples, but also in a liquid medium, which makes it possible to use smaller quantities of compounds to be tested.
L'invention fournit ainsi les moyens pour disposer d'une nouvelle famille de produits anti-viraux, et notamment anti-rétroviraux permettant de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. The invention thus provides the means to have a new family of anti-viral products, including anti-retroviral products to develop new therapeutic strategies.
Les composés isolés par mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus, ou en utilisant un système cellulaire tel que décrit plus haut qui ont permis d'établir des propriétés anti-virales chez ces derniers, font également partie de l'invention. Compounds isolated by carrying out the method defined above, or by using a cellular system as described above which made it possible to establish antiviral properties in the latter, also form part of the invention.
D'une manière avantageuse, le procédé de l'invention permet de tester rapidement et aisément un très grand nombre de composés. Advantageously, the method of the invention makes it possible to quickly and easily test a very large number of compounds.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont rapportés dans la partie expérimentale qui suit dans laquelle le modèle cellulaire utilisé est la levure Saccharomyces cerevisiae transformée par des constructions plasmidiques exprimant le gène de l'intégrase de HIV-1. Other features and advantages of the invention are reported in the following experimental part in which the cell model used is the yeast Saccharomyces cerevisiae transformed by plasmid constructs expressing the HIV-1 integrase gene.
Dans une première partie appelée "Matériels et
Méthodes", on indique I) les milieux de culture, 11) la nature des souches, III) leur transformation par des plasmides, IV) les méthodes d'obtention de 1'ADN plasmidique, V) la détermination des concentrations en cellules des suspensions de levure et VI) les conditions utilisées pour la culture des levures. In a first part called "Materials and
Methods ", indicate I) culture media, 11) the nature of the strains, III) their transformation by plasmids, IV) the methods for obtaining plasmid DNA, V) the determination of cell concentrations of the suspensions yeast and VI) conditions used for the cultivation of yeasts.
Une deuxième partie (Exemples 1 à 3) concerne des expériences réalisées pour démontrer la corrélation entre l'effet létal observé et l'action de l'intégrase de
HIV-1 sur l'ADN de levures et son application au criblage d'inhibiteurs de l'activité intégrase.A second part (Examples 1 to 3) concerns experiments carried out to demonstrate the correlation between the observed lethal effect and the action of the integrase of
HIV-1 on yeast DNA and its application to the screening of inhibitors of integrase activity.
Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 6 qui représentent
- les figures 1 et 2 les cartes de restriction, respectivement des plasmides pHIVlSF2IN et pBS24.1,
- les figures 3A à 3C, des photos de tests en goutte, de levures illustrant l'effet de l'induction du promoteur ADH2/GAP régulant la transcription du gène de l'intégrase sur les levures,
- la figure 4, une quantification du phénomène décrit dans la figure 3,
- la figure 5, une photo de tests en gouttes illustrant l'effet d'intégrases sauvages ou mutées de
HIV-1 sur des souches de levures rad 52 mutées dans la réparation de l'ADN,
- la figure 6, une photo de tests en goutte illustrant l'effet induit par l'intégrase de HIV-1 sur des souches de levures haploïdes ou diploïdes dérivées, et
- les figures 7A à 7C, une photo de tests en goutte illustrant l'effet de l'expression de l'intégrase sur la croissance de souches diploïdes transformées par des plasmides exprimant l'intégrase sauvage de HIV-1 ou des intégrases de HIV-1 modifiées par des mutations fauxsens. In these examples, reference is made to Figures 1 to 6 which represent
FIGS. 1 and 2 show the restriction maps, respectively plasmids pHIV1SF2IN and pBS24.1,
FIGS. 3A to 3C, photos of drop tests, yeasts illustrating the effect of induction of the ADH2 / GAP promoter regulating the transcription of the integrase gene on yeasts,
FIG. 4, a quantification of the phenomenon described in FIG.
FIG. 5, a photo of drop tests illustrating the effect of wild or mutated integrases of
HIV-1 on mutated rad 52 yeast strains in DNA repair,
FIG. 6, a photo of drop tests illustrating the effect induced by the integrase of HIV-1 on strains of haploid or diploid derived yeasts, and
FIGS. 7A to 7C, a photo of drop tests illustrating the effect of the expression of integrase on the growth of diploid strains transformed with plasmids expressing the wild-type integrase of HIV-1 or HIV-1 integrases. 1 modified by false mutations.
PARTIE EXPERIMENTALE ) MATERIEL ET METHODES
I) MILIEUX DE CULTURE
On indique tout d'abord les milieux complets, les milieux minimums et les milieux de sporulation utilisés pour la culture des levures,
- milieux complets : yeast extract 1 %, bactopeptone Difco (2 %), glucose (2 %). Le milieu YPDA correspond au milieu YPD ci-dessus, mais est supplémenté en adénine (100 mg/l),
- milieux synthétiques sélectifs : le milieu
YNB contenant 0,67 % de nitrogen base (Difco), sans acide aminé ni base azotée, le milieu YCA contenant en plus 0,5 % d'extraits de caséine et le milieu YCAS du sorbitol 1M. Comme sources carbonées, on utilise du glucose 0,1 %, 2 % ou 5,6 % ; du lactate 2 % (v/v). Dans ce dernier cas, le milieu est ajusté à pH 5 par l'addition de pastilles de soude avant autoclavage.EXPERIMENTAL PART) MATERIAL AND METHODS
I) MIDDLE CULTURE
The complete media, the minimal media and the sporulation media used for the yeast culture are indicated first.
- complete media: yeast extract 1%, Bactopeptone Difco (2%), glucose (2%). The YPDA medium corresponds to the YPD medium above, but is supplemented with adenine (100 mg / l),
- selective synthetic media: the medium
YNB containing 0.67% of nitrogen base (Difco), without amino acid or nitrogen base, YCA medium additionally containing 0.5% of casein extracts and YCAS medium of 1M sorbitol. As carbon sources, 0.1%, 2% or 5.6% glucose is used; lactate 2% (v / v). In the latter case, the medium is adjusted to pH 5 by the addition of sodium hydroxide pellets before autoclaving.
L'expression de l'intégrase sous le contrôle d'un promoteur inductible sensible à la répression glucose sera ainsi modulée en fonction des différentes sources carbonées dont la levure dispose dans son milieu de culture. The expression of integrase under the control of an inducible promoter sensitive to glucose repression will thus be modulated according to the different carbon sources that the yeast has in its culture medium.
On utilise le glucose à 0,1 % ou le lactate à 2 % pour déréprimer le promoteur de l'intégrase, et le glucose à 5,6 % pour le réprimer. 0.1% glucose or 2% lactate is used to depress the integrase promoter, and 5.6% glucose to repress it.
On peut ajouter au milieu YNB tous les acides aminés ou bases azotées correspondants aux marqueurs d'auxotrophie des levures à la concentration de 20 à 30 mg par 1. Any amino acids or nitrogen bases corresponding to yeast auxotrophy markers at the concentration of 20 to 30 mg per liter may be added to the YNB medium.
Les milieux de culture solides sont obtenus en supplémentant le mélange décrit avec 2,5 % d'agar (Difco). La stérilité est réalisée par autoclavage, 30 minutes à 120 C. Solid culture media are obtained by supplementing the mixture described with 2.5% agar (Difco). Sterility is achieved by autoclaving, 30 minutes at 120 C.
Pour la culture des bactéries, on utilise un milieu riche de Luria Bertani modifié (LB), composé de 1 % de tryptone, 0,5 % d'extraits de levure, 0,5 % de
NaCl (pH 7,5), et supplémenté en ampicilline (100 ug/ml). For culturing bacteria, a medium rich in modified Luria Bertani (LB), consisting of 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5%
NaCl (pH 7.5), and supplemented with ampicillin (100 μg / ml).
11) SOUCHES DE LEWRES ET SOUCHES BACTERIENNES
a) souches de levure.11) LEWRES STRAINS AND BACTERIAL STRAINS
a) yeast strains.
Les souches utilisées sont rapportées dans le tableau 1 suivant Tableau 1
TYPE
<tb> SOUCHES <SEP> SEXUEL <SEP> G <SEP> E <SEP> N <SEP> O <SEP> T <SEP> Y <SEP> P <SEP> E
<tb> ET <SEP> DEGRE
<tb> DE <SEP> PLOIDIE
<tb> AUXOTROPHIES <SEP> MUTATIONS <SEP> MUTATIONS
<tb> DANS <SEP> LES <SEP> GENES <SEP> DANS <SEP> LES <SEP> GENES
<tb> DE <SEP> REPARATION <SEP> DES <SEP> PROTEASES
<tb> DE <SEP> L'ADN
<tb> ura3-52 <SEP> ; <SEP> prbl-1122
<tb> JSC <SEP> 302 <SEP> MAT <SEP> a <SEP> trpl <SEP> pep4-3
<tb> n <SEP> leu <SEP> 2, <SEP> prcl-407
<tb> ura3-1, <SEP> trpl-1
<tb> W <SEP> 303 <SEP> 1A <SEP> MAT <SEP> a <SEP> leu2-3, <SEP> 112
<tb> n <SEP> ade2-1
<tb> his3-11, <SEP> 15
<tb> ura3-1, <SEP> trpl-1
<tb> W <SEP> 303 <SEP> 1B <SEP> MAT <SEP> α <SEP> leu2-3, <SEP> 112
<tb> n <SEP> ade2-1
<tb> his3-11, <SEP> 15
<tb> ura3-1, <SEP> rad <SEP> 52:<SEP> :TRP <SEP> 1
<tb> W <SEP> 839 <SEP> 5C <SEP> MAT <SEP> a <SEP> leu2-3, <SEP> 112
<tb> n <SEP> ade2-1
<tb> his3-11, <SEP> 15
<tb> ura3-1, <SEP> trpl-1
<tb> AB2* <SEP> leu2-3, <SEP> 112
<tb> 2 <SEP> n <SEP> ade2-1
<tb> his3-11, <SEP> 15
<tb> * obtenue par le croisement de W 303 1-A et W 303 1-B
I1 est fait référence à la souche JSC 302 décrite par Nevinsky et al dans Eur. J. Biochem. 207, 351-358, 1992, et aux souches W 303 1A et W 303 1B décrites par Bailis et al dans Molecular and Cellular
Biology, p 4988-4993, Nov. 1992.TYPE
<tb> STRAINS <SEP> SEX <SEP> G <SEP> E <SEP> N <SEP> O <SEP> T <SEP> Y <SEP> P <SEP> E
<tb> AND <SEP> DEGRE
<tb> DE <SEP> PLOIDIE
<tb> AUXOTROPHIES <SEP> MUTATIONS <SEP> MUTATIONS
<tb> IN <SEP> THE <SEP> GENES <SEP> IN <SEP> THE <SEP> GENES
<tb> DE <SEP> REPAIR <SEP> OF <SEP> PROTEASES
<tb> DE <SEP> DNA
<tb> ura3-52 <SEP>;<SEP> prbl-1122
<tb> JSC <SEP> 302 <SEP> MAT <SEP> a <SEP> trp <SEP> pep4-3
<tb> n <SEP> leu <SEP> 2, <SEP> prcl-407
<tb> ura3-1, <SEP> trpl-1
<tb> W <SEP> 303 <SEP> 1A <SEP> MAT <SEP> a <SEP> leu2-3, <SEP> 112
<tb> n <SEP> ade2-1
<tb> his3-11, <SEP> 15
<tb> ura3-1, <SEP> trpl-1
<tb> W <SEP> 303 <SEP> 1B <SEP> MAT <SEP>α<SEP> leu2-3, <SEP> 112
<tb> n <SEP> ade2-1
<tb> his3-11, <SEP> 15
<tb> ura3-1, <SEP> rad <SEP> 52: <SEP>: TRP <SEP> 1
<tb> W <SEP> 839 <SEP> 5C <SEP> MAT <SEP> a <SEP> leu2-3, <SEP> 112
<tb> n <SEP> ade2-1
<tb> his3-11, <SEP> 15
<tb> ura3-1, <SEP> trpl-1
<tb> AB2 * <SEP> leu2-3, <SEP> 112
<tb> 2 <SEP> n <SEP> ade2-1
<tb> his3-11, <SEP> 15
<tb> * obtained by crossing W 303 1-A and W 303 1-B
Reference is made to strain JSC 302 described by Nevinsky et al in Eur. J. Biochem. 207, 351-358, 1992, and strains W 303 1A and W 303 1B described by Bailis et al in Molecular and Cellular
Biology, 4988-4993, Nov. 1992.
Comme on peut le voir dans ce tableau, ces souches sont auxotrophes pour l'uracile (ura3-52) et la leucine (leu2). Les deux gènes correspondants, URA3 et LEU2, sont présents sur les vecteurs utilisés et servent à la sélection des souches transformées. Celles-ci seront alors cultivées sur milieu sans uracile et/ou sans leucine pour exercer une pression de sélection pour le maintien du vecteur dans les levures. As can be seen in this table, these strains are auxotrophic for uracil (ura3-52) and leucine (leu2). The two corresponding genes, URA3 and LEU2, are present on the vectors used and serve for the selection of the transformed strains. These will then be cultured on medium without uracil and / or without leucine to exert a selection pressure for the maintenance of the vector in the yeasts.
Les autres mutations concernent : a) un gène de réparation de 1'ADN, à savoir le gène RAD 52, et b) des gènes de structure des trois principaux types de protéases présents chez les levures. The other mutations concern: a) a DNA repair gene, namely the RAD 52 gene, and b) structural genes of the three main types of proteases present in yeasts.
a) Le gène RAD 52 est impliqué dans la réparation des cassures double brin de 1'ADN qui peuvent être provoquées par l'intégrase. Les souches mutées pour ce type de gènes seront notées rad 52. a) The RAD 52 gene is involved in the repair of DNA double-strand breaks that can be caused by integrase. The mutated strains for this type of gene will be noted rad 52.
b) Les mutations concernant les protéases portent sur le gène PEP4 pour la protéinase A, le gène
PRB1 pour la protéinase B et le gène PRC1 pour la carboxypeptidase Y.b) The protease mutations concern the PEP4 gene for proteinase A, the gene
PRB1 for Proteinase B and the PRC1 Gene for Carboxypeptidase Y.
Les souches mutées correspondantes seront appelées souches protéases (-). La souche W 303 1A, qui ne possède aucune mutation dans les gènes des protéases, sera notée protéases (+). The corresponding mutated strains will be called protease (-) strains. The strain W 303 1A, which has no mutation in the protease genes, will be denoted proteases (+).
Les souches transformées par un plasmide seront désignées comme suit : tT] lorsqu'elles sont transformées par le plasmide témoin T, EIN], lorsqu'elles sont transformées par le plasmide IN dont il sera question ciaprès. The strains transformed with a plasmid will be designated as follows: when transformed by the control plasmid T, EIN], when transformed by the IN plasmid which will be discussed below.
La souche diploïde utilisée dans les différentes expériences rapportées ci-après a été obtenue à partir des souches haploïdes isogéniques selon les méthodes de micromanipulation classiques. The diploid strain used in the various experiments reported hereinafter was obtained from isogenic haploid strains according to conventional micromanipulation methods.
b) souches bactériennes
Les bactéries utilisées, sensibles à l'ampicilline, sont les DH5a. Les plasmides utilisés possédant le gène de résistance à l'ampicilline, les souches transformées seront cultivées sur milieu LB contenant cet antibiotique.b) bacterial strains
The bacteria used, sensitive to ampicillin, are DH5a. The plasmids used having the ampicillin resistance gene, the transformed strains will be cultured on LB medium containing this antibiotic.
III) TRANSFORMTION DES SOUCHES DE LEVURES ET
DES SOUCHES BacTERIENNEs
On utilise des plasmides navette pouvant se répliquer à la fois chez la levure et chez la bactérie.III) TRANSFORMATION OF YEAST STRAINS AND
BRATERIAN STRAINS
Shuttle plasmids that can replicate in both yeast and bacteria are used.
Ils possèdent en effet la séquence 2 p qui permet leur réplication autonome chez la levure sous forme multicopies et l'origine de réplication bactérienne de E, coli (ori).In fact, they possess the 2 p sequence which allows their autonomous replication in yeast in multicopy form and the origin of bacterial replication of E. coli (ori).
Ils comportent des gènes de sélection s'exprimant dans la levure, permettant la sélection des plasmides dans les cellules de levure. Les gènes choisis sont URA3 et LEU2 comme indiqué plus haut. Le gène LEU2 est faiblement exprimé et noté LEU2d. Une croissance normale des levures sur milieu sans leucine nécessitera alors une augmentation du nombre de copies du plasmide. They include yeast-expressing selection genes, allowing the selection of plasmids in yeast cells. The genes chosen are URA3 and LEU2 as indicated above. The gene LEU2 is weakly expressed and noted LEU2d. Normal yeast growth in leucine-free medium will then require an increase in plasmid copy number.
Ainsi, URA3 permettra de réaliser une sélection des souches transformées contenant un nombre faible de copies du plasmide, tandis que LEU2d permettra de sélectionner les souches ayant un nombre élevé de copies du plasmide.Thus, URA3 will make it possible to select transformed strains containing a low number of copies of the plasmid, while LEU2d will make it possible to select the strains having a high copy number of the plasmid.
Ces plasmides possèdent de plus le gène AMP qui s'exprime chez la bactérie E. coli, et qui permet leur sélection dans E. coli. These plasmids additionally possess the AMP gene which is expressed in the E. coli bacterium, and which allows their selection in E. coli.
Le plasmide pHIVlSF2IN (IN en abrégé), dont la carte de restriction est donnée sur la figure 1, contient le gène de l'intégrase de HIV-1. The plasmid pHIV1SF2IN (IN abbreviated), whose restriction map is given in FIG. 1, contains the HIV-1 integrase gene.
La synthèse de l'intégrase est sous la dépendance du promoteur ADH2/GAP qui a la particularité d'être soumis à la répression par le glucose. Synthesis of integrase is under the control of the ADH2 / GAP promoter, which has the particularity of being subjected to repression by glucose.
Le terminateur de transcription du facteur a servira de terminateur de transcription de la protéine. The factor a transcription terminator will serve as the transcription terminator of the protein.
Le plasmide pBS24.1 (T en abrégé), qui est similaire au précédent, mais ne contient pas le gène de l'intégrase, est utilisé comme témoin. Sa carte de restriction est donnée sur la figure 2. The plasmid pBS24.1 (abbreviated T), which is similar to the previous one, but does not contain the integrase gene, is used as a control. Its restriction map is given in Figure 2.
Des plasmides ont également été construits pour la synthèse d'une intégrase comportant des mutations faux-sens résultant de la substitution d'un seul nucléotide, provoquant un changement unique d'acide aminé abolissant l'activité catalytique. Ces mutations ont été obtenues par la technique de PCR recombinant ou par clonage dans le vecteur pUc. Plasmids have also been constructed for the synthesis of an integrase with missense mutations resulting from single nucleotide substitution, resulting in a single amino acid change that abolishes catalytic activity. These mutations were obtained by the recombinant PCR technique or by cloning into the pUC vector.
Les plasmides dérivés du plasmide IN par introduction des différentes mutations ont été appelés pD116N, pD116A et pE152A. Plasmids derived from the IN plasmid by introducing the different mutations were named pD116N, pD116A and pE152A.
Dans pD116A et pD116N , les codons GAC codant pour un motif aspartate en position 116 de l'intégrase ont été remplacés respectivement par un codon GCC et AAC dont l'un code pour un motif alanine et l'autre pour un motif asparagine. In pD116A and pD116N, the GAC codons encoding an aspartate motif at position 116 of the integrase were replaced by a GCC and AAC codon, one of which codes for an alanine motif and the other for an asparagine motif.
Dans pE152A le codon GAA codant pour un motif glutamate en position 152 a été remplacé par un motif GCA codant pour une alanine. In pE152A the GAA codon encoding a glutamate unit at position 152 has been replaced by a GCA motif encoding an alanine.
Les caractéristiques des gènes des intégrases mutées portées par le plasmide ont été vérifiées par séquençage. The characteristics of the mutated integrase genes carried by the plasmid were verified by sequencing.
Les souches de levure ont été transformées par électroporation selon les techniques classiques. Les transformants ont été obtenus après quatre à six jours d'incubation. The yeast strains were transformed by electroporation according to conventional techniques. Transformants were obtained after four to six days of incubation.
Les bactéries ont été transformées selon la technique de Hanahan, 1983, Studies on transformation of
E. coli with plasmides, J. Mol. Biol., 557-580.The bacteria were transformed according to Hanahan's technique, 1983, Studies on transformation of
E. coli with plasmids, J. Mol. Biol., 557-580.
IV) OBTENTION DE L' ADN PLASMIDIOUL
La transformation de bactéries a été réalisée en opérant selon la technique de Hanahan mentionnée cidessus. La préparation des plasmides selon la méthode appelée boiling method a été décrite par Maniatis et al, 1989, dans Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, New-York.IV) OBTAINING DNA PLASMIDIOUL
The transformation of bacteria was performed by operating according to the Hanahan technique mentioned above. The preparation of the plasmids according to the method called boiling method has been described by Maniatis et al, 1989, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, New York.
V) ETUDE DU DEVELOPPEMENT DE La CULTURE
On a recours à deux tests pour étudier l'effet de l'intégrase sur les cellules : 1) on utilise un test en goutte (des gouttes de 3 pl d'eau contenant 20000 cellules de levures sont déposées sur un milieu gélosé, séchées, puis incubées pendant 4 à 6 jours à 30"C). Un effet létal se traduit par une absence de multiplication des levures ; 2) Les cellules obtenues selon le test cidessus sont mises en suspension dans l'eau, traitées aux ultrasons pour obtenir des cellules isolées, diluées par un facteur connu, comptées au microscope, puis étalées sur milieu solide après une seconde dilution par un facteur connu. Le nombre de colonies obtenues après incubation des boîtes permet de déterminer le nombre de cellules vivantes dans la suspension originelle et donc le taux de létalité.V) STUDY OF THE DEVELOPMENT OF CULTURE
Two tests are used to study the effect of integrase on the cells: 1) a drop test is used (drops of 3 μl of water containing 20000 yeast cells are deposited on an agar medium, dried, then incubated for 4 to 6 days at 30 ° C) A lethal effect results in a lack of yeast multiplication 2) The cells obtained according to the test above are suspended in water, sonicated to obtain isolated cells, diluted by a known factor, counted under a microscope, then spread on a solid medium after a second dilution by a known factor.The number of colonies obtained after incubation of the boxes makes it possible to determine the number of living cells in the original suspension and therefore the case fatality rate.
B) ETUDE DE L'EFFET DE L' INTEGRaSE DE HIV-1 EXPRIKEE DANS La LEVURE ET APPLICATIONS. B) STUDY OF THE EFFECT OF INTEGRATION OF HIV-1 EXPRIKEE IN YEAST AND APPLICATIONS.
1 - Etude de l'effet induit par l'intégrase de
HIV-1 sur la levure
nature de la molécule responsable de l'effet létal
Les expériences rapportées sur les figures 3A à 3C ont été effectuées en milieu solide, en opérant comme suit.1 - Study of the effect induced by the integrase of
HIV-1 on yeast
nature of the molecule responsible for the lethal effect
The experiments reported in FIGS. 3A to 3C were carried out in a solid medium, operating as follows.
Des suspensions de souches protéases (-) JSC 302 et protéases (+) W 303 1A, transformées par le plasmide tIN] exprimant l'intégrase de HIV-1, ou le plasmide témoin (TJ n'exprimant pas l'intégrase, ont été testées par tests en gouttes su milieu minimum YNB permettant la dérépression du promoteur de l'intégrase (glucose 0,1 *), en conditions de nombre de copies du milieu YNB réprimant le promoteur de l'intêgrase (glucose 5,6 %) en condition de nombre faible de copies du plasmide par cellule (C). Suspensions of protease strains (-) JSC 302 and proteases (+) W 303 1A, transformed by the plasmid tIN] expressing the integrase of HIV-1, or the control plasmid (TJ not expressing the integrase, were tested by drops of minimum medium YNB allowing the derepression of the integrase promoter (glucose 0.1 *), under conditions of copy number of the YNB medium repressing the promoter of the integrase (glucose 5.6%) in low copy number condition of the plasmid per cell (C).
Toutes les gouttes contiennent environ 20000 cellules. Lorsque les gouttes sont sèches, les boîtes sont mises à incuber à 28"C ; les photos sont prises après 4 jours d'incubation. Ces photos sont données sur les figures A, B et C qui correspondent respectivement aux conditions énoncées ci-dessus. All drops contain about 20000 cells. When the drops are dry, the dishes are incubated at 28 ° C. The photos are taken after 4 days of incubation These photos are given in Figures A, B and C which respectively correspond to the conditions stated above.
Sur ces photos, les gouttes correspondent aux souches suivantes : 1, 2, 3 : JSC 302 (T] ; 4, 5, 6 : JSC 302 tIN] ; 7, 8, 9 : W 303 1A LT), et 10, 11, 12: W 303 1A LIN]. In these photos, the drops correspond to the following strains: 1, 2, 3: JSC 302 (T]; 4, 5, 6: JSC 302 tIN]; 7, 8, 9: W 303 1A LT), and 10, 11 , 12: W 303 1A LIN].
Dans l'expérience A (glucose 0,1 %, nombre faible de copies de plasmides par cellule), on constate que l'expression de l'intégrase n'entraîne aucun effet détectable sur la souche protéases (+). Pour la souche protéases (-), un faible effet d'inhibition de croissance est observé lorsque l'intégrase est exprimée. In experiment A (0.1% glucose, low number of plasmid copies per cell), it is found that the expression of the integrase causes no detectable effect on the (+) protease strain. For the (-) protease strain, a weak growth inhibition effect is observed when the integrase is expressed.
Dans l'expérience B (glucose 0,1 %, nombre élevé de copies de plasmides par cellules), l'inhibition sous l'effet de l'intégrase est à peine détectable pour la souche protéases (+), mais en revanche, une inhibition complète est obtenue pour la souche protéases (-) exprimant l'intégrase, par rapport aux témoins 1, 2 et 3. In Experiment B (0.1% glucose, high number of plasmid copies per cell), the integrase inhibition is barely detectable for the (+) protease strain, but on the other hand, Complete inhibition is obtained for the protease (-) protease strain expressing integrase, relative to controls 1, 2 and 3.
Ces expériences mettent donc bien en évidence que les plasmides portant le gène de l'intégrase de
HIV-1, dans des conditions permettant l'expression du gène, provoquent une inhibition de croissance des souches de levures. These experiments therefore clearly show that the plasmids carrying the integrase gene of
HIV-1, under conditions allowing the expression of the gene, cause growth inhibition of the yeast strains.
Des résultats similaires ont été obtenus par des expériences sur un autre milieu permettant aussi la dérépression du promoteur ADH2/GAP : le lactate (2 %). Similar results were obtained by experiments on another medium also allowing the derepression of the ADH2 / GAP promoter: lactate (2%).
Dans l'expérience C (conditions où le promoteur est réprimé et nombre faible de copies du plasmide par cellules), on n'observe aucune inhibition de croissance des souches. In experiment C (conditions where the promoter is repressed and low number of plasmid copies per cell), no growth inhibition of the strains is observed.
Les expériences décrites dans les figures 3A à 3C permettent de conclure que
1) l'effet létal est déclenché par la dérépression du promoteur ADH2/GAP (comparaison des tests 4-5-6 fig. 3A et 4-5-6 fig. 3C). Ceci indique que l'intégrase est responsable de l'effet létal
2) l'inhibition de croissance observée étant plus accentuée lorsque les souches sont protéases (-), les résultats de la figure 3 confirment que cet effet est bien dû à une protéine (fig. 3B, tests 4-5-6 comparés à 10-11-12).The experiments described in FIGS. 3A to 3C make it possible to conclude that
1) the lethal effect is triggered by the derepression of the ADH2 / GAP promoter (comparison of tests 4-5-6 Fig. 3A and 4-5-6 Fig. 3C). This indicates that integrase is responsible for the lethal effect
2) the inhibition of growth observed being more accentuated when the strains are proteases (-), the results of figure 3 confirm that this effect is indeed due to a protein (FIG 3B, tests 4-5-6 compared to 10 -11 to 12).
L'inhibition de croissance observée peut donc bien être corrélée à l'expression de l'intégrase chez la levure. The growth inhibition observed may well be correlated with the expression of integrase in yeast.
Quantification des tests en gouttes. Quantification of the tests in drops.
Les levures obtenues par le test en goutte défini ci-dessus peuvent être mises en suspensions dans 1 ml d'eau distillée ; la mesure de la densité optique de la suspension obtenue indique le nombre de levures obtenues. La figure 4 donne les résultats d'une telle quantification. The yeasts obtained by the drop test defined above can be suspended in 1 ml of distilled water; the measurement of the optical density of the suspension obtained indicates the number of yeasts obtained. Figure 4 gives the results of such quantification.
Les colonnes
correspondent à JSC 302 ET] et 3 à JSC 302 [IN].The columns
correspond to JSC 302 ET] and 3 to JSC 302 [IN].
La colonne 2 montre, en outre, que, même en milieu glucose 5,6 %, on observe en condition de nombre de copies de plasmides par cellule élevé, une inhibition de croissance due à l'intégrase de HIV-1, ce qui met en évidence que la répression du promoteur ADH2/GAP n'est pas totale. Column 2 further shows that, even in 5.6% glucose medium, growth inhibition due to the integrase of HIV-1 is observed under condition of plasmid copy number per high cell. evidence that repression of the ADH2 / GAP promoter is not complete.
2 - Arguments montrant que 1'intégrase agit au niveau de 1'ADN
- effet de mutations affectant la réparation de 1'ADN sur l'inhibition de croissance due à l'intégrase.2 - Arguments showing that integrase acts at DNA level
effect of mutations affecting DNA repair on growth inhibition due to integrase.
On a testé par tests en gouttes des souches mutées ou non dans les gènes de réparation de 1'ADN. Pour cela, on a utilisé les souches de levure protéases (+)
W 303 1A ou les souches W 839 5C qui en dérivent uniquement par disruption du gène rad 52. Les levures W 839 5C, aussi notées rad 52 sont déficientes pour la réparation des cassures double brin de 1'ADN. Les deux types de souches utilisées, transformées avec le plasmide exprimant l'intégrase sauvage [IN], ou le plasmide exprimant une intégrase mutée [D116N] ou [E152A], ou le plasmide témoin n'exprimant pas l'intégrase ET] ont été testées sur un milieu permettant une dérépression partielle du promoteur ADH2/GAP (glucose 5,6 %, nombre de copies du plasmide élevé par cellule). Les conditions sont celles de la figure 3. Les résultats sont donnés sur la photo de la figure 5.Diped and non-mutated strains in the DNA repair genes were tested by drop tests. For this, the yeast protease (+) strains were used
W 303 1A or the W 839 5C strains derived therefrom only by disruption of the rad 52 gene. The yeasts W 839 5C, also noted rad 52 are deficient for the repair of double-strand breaks of the DNA. The two types of strains used, transformed with the plasmid expressing wild-type integrase [IN], or the plasmid expressing a mutated integrase [D116N] or [E152A], or the control plasmid expressing non-integrase ET] were tested on a medium allowing a partial derepression of the promoter ADH2 / GAP (glucose 5.6%, number of copies of the high plasmid per cell). The conditions are those of FIG. 3. The results are given in the photo of FIG.
1: W 839 5C ET] ; 2: W 839 5C [IN] ; 3: W 839 5C tD116N]; 4: W 839 5C tE152A]. 1: W 839 5C ET]; 2: W 839 5C [IN]; 3: W 839 5C tD116N]; 4: W 839 5C tE152A].
5: W 303 1A LT] ; 6: W 303 1A LIN] ; 7: W 303 1A [D116N]; 8: W 303 1A LEî52AJ. 5: W 303 1A LT]; 6: W 303 1A LIN]; 7: W 303 1A [D116N]; 8: W 303 1A LEI52AJ.
On retrouve le résultat rapporté plus haut indiquant que l'intégrase n'entraîne aucun effet sur les souches protéases (+) W 303 1A tIN] (figure 5, goutte 6). The result reported above indicates that the integrase has no effect on the protease strains (+) W 303 1A tIN] (FIG. 5, drop 6).
En revanche, l'expression de l'intégrase produit une forte létalité dans le cas de la souche disruptée au niveau du gène rad 52 (figure 5, goutte 2), et cet effet est totalement levé par les mutations fauxsens inactivant l'intégrase, décrites précédemment (figure 5, gouttes 3 et 4), à condition que la concentration d'intégrase ait été diminuée par répression partielle du promoteur ADH2/GAP. On the other hand, the expression of the integrase produces a high lethality in the case of the disrupted strain at the level of the rad 52 gene (FIG. 5, drop 2), and this effect is totally lifted by the false mutations inactivating the integrase, previously described (FIG. 5, drops 3 and 4), provided that the integrase concentration was decreased by partial repression of the ADH2 / GAP promoter.
Les tests de viabilité sur W 839 5C LT] et
W 839 5C LIN] montrent que 12 % de cellules contenant le plasmide survivent (la mutation rad 52 entraînant par elle-même une létalité) dans le cas de la souche portant le plasmide témoin, mais seulement 0,14 % lorsque la souche exprime le gène de l'intégrase.Viability tests on W 839 5C LT] and
W 839 5C LIN] show that 12% of cells containing the plasmid survive (the rad 52 mutation itself leading to a lethality) in the case of the strain carrying the control plasmid, but only 0.14% when the strain expresses the plasmid. integrase gene.
Ce résultat confirme que l'inhibition de croissance des levures due à l'intégrase telle qu'on la détecte par test en goutte (par exemple fig. 5 test 2 comparé au test 1) s'explique bien par un effet létal sur les cellules. This result confirms that yeast growth inhibition due to integrase as detected by a drop test (for example, FIG 2 test 2 compared to test 1) can be explained by a lethal effect on the cells. .
L'augmentation de la létalité due à l'intégrase de HIV-1, lors de l'utilisation de la souche rad 52, et le fait que les mutations faux-sens suppriment l'effet létal, permettent d'établir que l'effet obtenu résulte de l'action de l'enzyme sur 1'ADN des levures. The increased lethality due to the integrase of HIV-1, when using the rad 52 strain, and the fact that the missense mutations suppress the lethal effect, make it possible to establish that the effect The result is the action of the enzyme on yeast DNA.
- Comparaison de l'effet induit par l'intégrase de HIV-1 sur les souches haploïdes et diploïdes de levures. - Comparison of the effect induced by the integrase of HIV-1 on the haploid and diploid yeast strains.
Les souches haploïdes W 303 1A (Mat a) et W 303 1B (Mat a), et les souches diploïdes dérivées AB2, transformées chacune par le plasmide exprimant l'intégrase de HIV-1 [IN], ou le plasmide témoin (T) n'exprimant pas l'intégrase, ont été testées par test en gouttes sur un milieu réprimant partiellement le promoteur ADH2/GAP (glucose 5,6 %, nombre élevé de copies du plasmide par cellule). Les tests ont été réalisés comme pour la figure 3. The haploid strains W 303 1A (Mat a) and W 303 1B (Mat a), and diploid strains derived AB2, each transformed with the plasmid expressing the integrase of HIV-1 [IN], or the control plasmid (T) not expressing the integrase, were tested by drop test on a medium partially repressing the ADH2 / GAP promoter (glucose 5.6%, high copy number of the plasmid per cell). The tests were performed as for Figure 3.
Les photos obtenues sont données sur la figure 6 où les gouttes correspondent aux sources suivantes 1, 2, 7, 8: W 303 1A (T]; 13, 14, 19, 20 : W 303 1A tIN]; 3, 4, 9, 10: AB2 (T]; 15, 16, 21, 22:AB2 (IN]; 5, 6, 11, 12: W 303 1B (T] et 17, 18, 23, 24: W 303 1B (IN]
Les résultats obtenus montrent que l'intégrase n'a aucun effet sur les souches haploïdes protéases (+) de signe sexuel a ou a, mais exerce au contraire une très forte létalité sur les souches diploïdes correspondantes.The photos obtained are given in FIG. 6 where the drops correspond to the following sources 1, 2, 7, 8: W 303 1A (T]; 13, 14, 19, 20: W 303 1A tIN]; 3, 4, 9 , 10: AB2 (T); 15, 16, 21, 22: AB2 (IN); 5, 6, 11, 12: W 303 1B (T) and 17, 18, 23, 24: W 303 1B (IN)
The results obtained show that integrase has no effect on haploid protease (+) strains of sex sign a or a, but on the contrary exerts a very high lethality on the corresponding diploid strains.
Les souches diploïdes, dans lesquelles le génome se trouve en deux exemplaires et dont on aurait pu s'attendre à une sensibilité moindre des cellules vis-àvis de l'intégrase, apparaissent donc constituer en fait un modèle intéressant pour mettre en évidence un effet de l'intégrase. The diploid strains, in which the genome is in two copies and which would have been expected to be less sensitive to the cells vis-à-vis the integrase, therefore appear to be an interesting model for highlighting an effect of integrase.
- effet de mutations faux sens dans la séquence codante de l'intégrase sur la croissance de souches diploïdes. effect of false-sense mutations in the coding sequence of the integrase on the growth of diploid strains.
Cette expérience montre que les résultats obtenus avec la souche rad 52 sont aussi valables pour la souche diploïde AB2. This experiment shows that the results obtained with the strain rad 52 are also valid for the diploid strain AB2.
L'étude de cet effet permet de vérifier que l'absence de croissance de la levure observée dans les expériences rapportées ci-dessus résulte de l'activité intégrase (conditionnant l'activité virale). The study of this effect makes it possible to verify that the absence of growth of the yeast observed in the experiments reported above results from the integrase activity (conditioning the viral activity).
En effet cette létalité ne peut être qu'abolie lorsqu'on utilise les plasmides portant les mutations faux-sens, si elle est liée à l'activité intégrase de l'enzyme. Indeed, this lethality can only be abolished when the plasmids carrying the missense mutations are used, if it is linked to the integrase activity of the enzyme.
En revanche, si cette inhibition est due à un mécanisme indépendant, les mutations introduites n'auront pas d'effet sur celle-ci. On the other hand, if this inhibition is due to an independent mechanism, the mutations introduced will have no effect on it.
Comme pour l'expérience correspondant à la figure 5, la source de carbone utilisée est le glucose 5,6 % qui, du fait de l'existence de fuites, ne réprime pas totalement le gène de l'intégrase, et le milieu ne contient ni uracile ni leucine, ce qui conduit à un nombre élevé de copies du plasmide par cellules. As for the experiment corresponding to FIG. 5, the carbon source used is 5.6% glucose which, because of the existence of leaks, does not totally repress the integrase gene, and the medium contains neither uracil nor leucine, which leads to a high number of copies of the plasmid per cell.
On rapporte sur les photos des figures 7A à 7D les expériences réalisées sur les souches diploïdes AB2 en utilisant le test en goutte, où
- 2 et 8 correspondent à des souches AB2 transformées par des plasmides IN, exprimant l'intégrase sauvage,
- 1 et 7, par les plasmides T correspondants, ne contenant pas le gène de l'intégrase,
- 3 et 9, à des souches [D116N], c'est-à-dire exprimant une intégrase dans laquelle l'asparte, en position 116 est remplacé par le motif asparagine,
- 4 et 10, à une souche [D116N] dans laquelle la mutation a été réalisée par la méthode de PCR recombinante (comme pour 5 et 6)
- 5 et 11 à une souche (Dîî6A], e'est-à-dire exprimant une intégrase dans laquelle l'asparte en position 116 est remplacé par le motif alanine, et
- 6 et 12, à une souche tE152A], c'est-à-dire exprimant une intégrase dans laquelle le motif glutamate en position 152 est remplacé par un motif alanine.The photos of Figures 7A-7D show the experiments carried out on diploid AB2 strains using the drop test, where
2 and 8 correspond to AB2 strains transformed with IN plasmids, expressing wild-type integrase,
1 and 7, by the corresponding T plasmids, not containing the integrase gene,
- 3 and 9, strains [D116N], that is to say expressing an integrase in which the aspart in position 116 is replaced by the asparagine unit,
- 4 and 10, to a strain [D116N] in which the mutation was carried out by the recombinant PCR method (as for 5 and 6)
- 5 and 11 to a strain (DI6A), that is to say expressing an integrase in which the aspart in position 116 is replaced by the alanine motif, and
6 and 12, to a strain tE152A], that is to say expressing an integrase in which the glutamate unit at position 152 is replaced by an alanine unit.
Les photos (A) représentent les résultats obtenus au bout de 1 jour d'incubation, (B) de deux jours, (C) de trois jours, et (D) de quatre jours. The pictures (A) represent the results obtained after 1 day of incubation, (B) of two days, (C) of three days, and (D) of four days.
L'examen de ces figures montre clairement que les mutations apportées à l'intégrase suppriment totalement l'effet de cette dernière. The examination of these figures clearly shows that the mutations made to the integrase completely eliminate the effect of the latter.
L'évolution des levures en fonction de la durée d'incubation montre que les levures exprimant les intégrases mutées (tests 3, 4, 5, 6 et 9, 10, 11, 12) se comportent comme celles n'exprimant pas l'intégrase (tests 1 et 7), toutes ces souches évoluant de la même façon). The yeast evolution as a function of the incubation time shows that the yeasts expressing the mutated integrases (tests 3, 4, 5, 6 and 9, 10, 11, 12) behave like those not expressing the integrase. (tests 1 and 7), all these strains evolving in the same way).
3 : Criblage de composés a l'aide d'un urodèle de levure selon l'invention. 3: Screening compounds using a yeast urodele according to the invention.
Les composés testés répondent aux deux conditions déjà énoncées : ils sont capables de pénétrer dans la levure et n'inhibent pas la multiplication propre de la levure d'une manière rendant le test inutilisable. The compounds tested meet the two conditions already stated: they are capable of penetrating the yeast and do not inhibit the yeast's own multiplication in a manner rendering the test unusable.
On utilise par exemple la souche diploïde AB2. For example, the diploid strain AB2 is used.
La culture est réalisée soit sur boîte dans un milieu solide dépourvu de leucine et d'uracile, et contenant du glucose 5,6 % comme source de carbone, soit en milieu liquide, dans le même milieu sans agar.The culture is carried out either on a box in a solid medium lacking leucine and uracil, and containing 5.6% glucose as a carbon source, or in a liquid medium, in the same medium without agar.
Si l'expérience est réalisée en milieu solide, après 3 ou 4 jours d'incubation, on photographie les boites et on vérifie en opérant selon la partie V de matériel et méthodes" le développement ou l'arrêt de croissance de la culture des levures exprimant le gène de l'intégrase, selon les propriétés anti-intégrase ou non du composé testé. If the experiment is carried out in solid medium, after 3 or 4 days of incubation, the boxes are photographed and checked according to Part V of material and methods "the development or cessation of growth of yeast culture expressing the integrase gene, according to the anti-integrase or non-integrase properties of the test compound.
Si l'expérience est réalisée en milieu liquide, l'activité intégrase provoque un arrêt de croissance décelable par mesure de la densité optique à 600 nm. If the experiment is carried out in a liquid medium, the integrase activity causes a detectable growth stop by measuring the optical density at 600 nm.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5930680A (en) * | 1994-06-17 | 1999-07-27 | Terrastar, Inc. | Method and system for transceiving signals using a constellation of satellites in close geosynchronous orbit |
| FR2871169A1 (en) * | 2004-06-02 | 2005-12-09 | Univ Aix Marseille Ii | METHOD FOR DETERMINING THE SENSITIVITY OR RESISTANCE OF RETROVIRUS ISOLATES TO RETROVIRAL THERAPEUTIC TREATMENTS BASED ON VIRAL PROTEASE INHIBITORS |
| US9493769B2 (en) | 2004-06-02 | 2016-11-15 | Universite D'aix-Marseille | Yeast-based assay for measuring the functional activity of an HIV-1 protease in response to an antiviral agent |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0467049A1 (en) * | 1990-07-16 | 1992-01-22 | American Cyanamid Company | DNA sequences and amino acid sequences of class b beta-lactamase enzymes from bacteroides fragilis |
| WO1993009248A1 (en) * | 1991-10-30 | 1993-05-13 | Tepnel Medical Limited | Testing animal fluids |
| WO1993012252A1 (en) * | 1991-12-18 | 1993-06-24 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepastnatuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | Method for testing antiviral agents; experimental animals useful therefor |
| WO1993022422A1 (en) * | 1992-04-27 | 1993-11-11 | Northwestern University | Genetically engineered eukaryotic organism capable of detecting the expression of heterologous ion channels |
-
1995
- 1995-01-26 FR FR9500904A patent/FR2729973B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0467049A1 (en) * | 1990-07-16 | 1992-01-22 | American Cyanamid Company | DNA sequences and amino acid sequences of class b beta-lactamase enzymes from bacteroides fragilis |
| WO1993009248A1 (en) * | 1991-10-30 | 1993-05-13 | Tepnel Medical Limited | Testing animal fluids |
| WO1993012252A1 (en) * | 1991-12-18 | 1993-06-24 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepastnatuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | Method for testing antiviral agents; experimental animals useful therefor |
| WO1993022422A1 (en) * | 1992-04-27 | 1993-11-11 | Northwestern University | Genetically engineered eukaryotic organism capable of detecting the expression of heterologous ion channels |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5930680A (en) * | 1994-06-17 | 1999-07-27 | Terrastar, Inc. | Method and system for transceiving signals using a constellation of satellites in close geosynchronous orbit |
| US6075969A (en) * | 1994-06-17 | 2000-06-13 | Terrastar, Inc. | Method for receiving signals from a constellation of satellites in close geosynchronous orbit |
| FR2871169A1 (en) * | 2004-06-02 | 2005-12-09 | Univ Aix Marseille Ii | METHOD FOR DETERMINING THE SENSITIVITY OR RESISTANCE OF RETROVIRUS ISOLATES TO RETROVIRAL THERAPEUTIC TREATMENTS BASED ON VIRAL PROTEASE INHIBITORS |
| WO2006000693A1 (en) * | 2004-06-02 | 2006-01-05 | Universite De La Mediterranee | Method for determining sensitivity or resistance of retrovirus isolates to therapeutic retroviral treatments based on viral protease inhibitors, and diagnostic kit derived from implementing said method |
| US7989161B2 (en) | 2004-06-02 | 2011-08-02 | Université de la Méditérranée | Methods for determining human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) protease sensitivity or resistance to antivirals utilizing an inducible yeast expression system |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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