FR2722797A1 - culture medium promoting cell growth endocrine cells - Google Patents

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cell
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Marie Therese Zabot
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Marie Therese Zabot
Zabot Jean Michel
De Leobardy Francis
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Abstract

A culture medium essentially consisting of a combination of a basic nutritive mixture in which the amino acid valine is present in racemic form D, and a dialysed foetal calf serum complement, as well as at least one epidermal growth factor, cholera toxin and hormones. The culture medium may be used for culturing certain endocrine cells capable of incorporating and decarboxylating bioamine precursors. The resulting cells may be used as organ substitutes in transplants.

Description

La présente invention concerne un milieu de culture favorisant la croissance cellulaire de cellules endocrines. The invention relates to a culture medium promoting cell growth endocrine cells.

On connait tous les problèmes que l'on rencontre quant on désire remédier aux insuffisances fonctionnelles organiques, innées ou acquises, des glandes endocrines. We all know the problems we encounter as we want organic remedy functional deficiencies, innate or acquired, the endocrine glands. On a propocé plusieurs solutions qui se sont avérées insuffisantes pour de multiples raisons We propocé several solutions that proved insufficient for many reasons
- dans certains cas, du fait de leur instabilité, ou de l'impossibilité de les produire, la ou les hormones manquantes ne peuvent être délivrées sous forme de médicament - in some cases, because of their instability, or the inability to produce them, the missing hormones may be issued in the form of medication
- quand cette ou ces hormones existent sous forme de médicament, la chronologie de leur administration est délicate il est nécessaire de l'adapter aux variations physiologiques des métabolismes régulés - when this or these hormones exist in the form of medication, the timing of their administration is tricky it is necessary to adapt to physiological changes in regulated metabolisms
- la greffe d'organes allogènes est impossible ou tout au moins hautement improbable du fait de leur très haute Immunogénicité - allogenic organ transplantation is impossible or at least highly unlikely because of their high immunogenicity
- les cellules endocrines normales, prises isolément en dehors de toute contamination par d'autres cellules du tissu concerné sont non immunogènes. - normal endocrine cells, taken in isolation without any contamination by other cells of the tissue in question are non-immunogenic.

La solution idéale consisterait donc à remplacer les seules cellules concernées. The ideal solution would therefore be to replace only cells involved.

Pour isoler ces cellules endocrines, il faut dissocier le tissu concerné puis préparer, par filtration ou centrifugation adaptée, une suspension cellulaire la plus enrichie possible en cellules endocrines. To isolate these endocrine cells, it is necessary to dissociate the tissue concerned then prepared by filtration or suitable centrifugation, the more enriched cell suspension as possible in endocrine cells.

C'est la culture cellulaire de cette suspension qui constitue la deuxième étape indispensable de cette purification Cette culture doit être sélective, pour ne conserver définitivement que les seules cellules endocrines , elle doit être adaptée pour permettre la conservation des caractères fonctionnels de ces cellules ainsi que leur multiplication in vitro. This is the cell culture suspension which is the second essential step of this purification This culture needs to be selective, to permanently maintain that the only endocrine cells, it must be adapted to enable the conservation of functional characteristics of these cells and multiplication in vitro.

A l'heure actuelle, aucun milieu de culture ne remplit ces conditions. At present, no culture medium meets these requirements.

La présente invention s'est donnée pour objet de résoudre ce problème en proposant un nouveau milieu de culture constitué de l'association d'éléments nutritionnels et stimulants capables de répondre à la double exigence définie ci dessous The present invention is given for the purpose of solving this problem by providing a new culture medium consisting of capable combination of nutrients and challenging to meet the dual requirements defined below
Pour définir ce mélange, les Inventeurs ont choisi de considérer les cellules selon différentes approches jusqu'ici toujours dissociées To set this mixture, the inventors have chosen to consider the cells using various approaches so far always dissociated
- les cellules ont été considérées selon leur origine exodermique, ce qui leur confère des exigences de cellules épithéliales - the cells were considered on their exodermic origin, which gives them the epithelial cells of requirements
- elles ont été considérées selon leur appartenance au système APUD (Amine Precursor Uptake Decarboxylation ou cellules capables d'incorporer et de décarboxyler les précurseurs des amines biogènes). - they were considered as belonging to APUD system (Amine Precursor Uptake Decarboxylation or cells capable of incorporating and decarboxylate precursors of biogenic amines).

Ces cellules, comme les celules de la glande mammaire, sont alors capables d'utiliser un substrat d'acide aminé de forme racémique D (tel que la D These cells, like celules of the mammary gland, are then able to use an amino acid substrate racemic form D (such as the D
Valine) capacité que ne possèdent pas les cellules les plus indésirables fibroblastes, macrophages Valine) capability not possessed the most undesirable fibroblast cells, macrophages
- elles ont été considérées selon leur nature endocrine, ce qui conduit à un enrichissement du mélange nutritionnel en plusieurs facteurs stimulants connus pour leur influence sur l'expression des fonctionnalités des cellules différenciées. - they were considered on their endocrine nature, which leads to an enrichment of the nutrient mixture in several stimulating factors known to influence the expression of the features of differentiated cells.

Au cours de leurs recherches, les inventeurs ont pu déterminer qu'il était essentiel que ce milieu de culture ne renferme aucune trace de L Valine ; During their research, the inventors were able to determine that it was essential that the culture medium contains no trace of L Valine; ils ont donc, d'une part remplacé dans la solution de base la L Valine par la D Valine et d'autre part employé, pour la complémentation, du sérum de veau foetal dialysé, additionné de facteurs de croissance et d'hormones. so they firstly replaced in the L Valine basic solution by D Valine and also used for supplementation, serum dialyzed fetal calf supplemented with growth factors and hormones.

Le milieu de culture favorisant la croissance cellulaire de cellules endocrines selon l'invention est donc essentiellement constitué de l'association d'un mélange nutritionnel de base dans lequel l'acide aminé Valine est apporté sous la forme racémique D et d'un complément en sérum de veau foetal dialysé, de facteurs de croissance et d'hormones The culture medium to promote cell growth endocrine cells according to the invention is therefore essentially consists of the combination of a nutritional base mixture in which the amino acid Valine is provided in the racemic form D and a complement dialyzed fetal calf serum, growth factors and hormones
Ce milieu de culture présente ainsi les trois propriétés désirées This culture medium and presents the three desired properties
- sélectivité - selectivity
- réponse aux besoins en facteurs différenciants - the needs in differentiating factors
- réponse aux besoins en facteurs stimulants - in response to the needs stimulating factors
Ce milieu est donc tout spécialement adapté à la culture cellulaire de certaines cellules endocrines. This medium is therefore especially suitable for cell culture certain endocrine cells.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le milieu de culture présente la composition suivante According to a particular embodiment of the invention, the culture medium has the following composition
- solution de base MEM (milieu essentiel minimum) D Valine (sel de Earle + D - basic solution MEM (minimum essential medium) D Valine (salt Earle + D
Valine) valine)
- complémentation: - complementation:
- Sérum de veau dialysé (18h contre une membrane de cellulose - dialyzed calf serum (18h against a cellulose membrane
régénérée, porosité 1000 da) 0,02 à 0,20 ml/ml regenerated, porosity 1000 da) 0.02 to 0.20 ml / ml
- Facteur de croissance épidermique 1 à 50 ng/ml - Insuline 0,001 à 20 sg/ml - Epidermal growth factor 1-50 ng / ml - Insulin 0.001 to 20 sg / ml
- Hydrocortisone 0,004 à 5 Cig/ml - Hydrocortisone 0.004 to 5 Cig / ml
- Transferrine 0,5 à 100 Icg/ml - Transferrin 0.5 to 100 Icg / ml
- Toxine cholérique 10-8à 10.12 M - cholera toxin 10-8à 10.12 million
- 3,3'-5 Triiodo L Thyronine 2.10 -7 à 2.10-11 M - 3,3'-5 Triiodo The Thyronine 2.10 -7 to 2.10-11 M
- Extrait pituitaire bovin 0,05 à 100 ug/ml - bovine pituitary extract 0.05 to 100 ug / ml
Ce milieu sera dénommé par la suite APUDCM This medium will be called hereinafter APUDCM
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le milieu de culture présente la composition suivante According to another preferred embodiment of the invention, the culture medium has the following composition
- solution de base MEM D Valine (sel de Earle + D Valine) - basic solution D Valine MEM (Earle's salt Valine + D)
- complémentation: - complementation:
- Sérum de veau dialysé ( 1 8h contre une membrane de cellulose régénérée, porosité 1000 da) 0,12 ml/ml - dialyzed calf serum (1 8h against a regenerated cellulose membrane, porosity 1000 da) 0.12 ml / ml
- Facteur de croissance épidermique 10 ng/ml - epidermal growth factor 10 ng / ml
- Insuline 5 Eng/ml - Insulin 5 Eng / ml
- Hydrocortisone 400 ng/ml - Hydrocortisone 400 ng / ml
- Transferrine 5 sg/ml - Transferrin 5 sg / ml
- Toxine cholérique 10-10 M - cholera toxin M 10-10
- 3,3'-5 Triiodo L Thyronine 2.10 -9 M - 3,3'-5 Triiodo The Thyronine 2.10 -9 M
- Extrait pituitaire bovin 5 stg/ml - bovine pituitary extract 5 stg / ml
Ce milieu de culture sera dénommé par la suite PTCM. This culture medium will be referred by the PTCM on.

Ce milieu a été utilisé plus particulièrement pour la culture des cellules parathyroidiennes obtenues à partir de glandes de sujets adultes hyperplasiques, adénomateuses ou normales, par digestion enzymatique, filtration ou centrifugation en gradient de Percoll discontinu. This medium has been more particularly used for the cultivation of parathyroid cells obtained from glands of adult subjects hyperplastic, adenomatous or normal, by enzymatic digestion, filtration or centrifugation in Percoll discontinuous gradient.

La présente invention sera bien comprise à l'aide de la description suivante qui l'illustre sans nullement la limiter ainsi que du dessin schématique annexé représentant certains des résultats obtenus. The invention will be better understood using the following description illustrated without in any way limiting and the attached schematic drawing showing some of the results. Dans le dessin schématique In the schematic drawing
Figure 1 représente les courbes de numération cellulaire Figure 1 shows the cell count curves
Figure 2 est un graphique-barre illustrant le dosage en Figure 2 is a bar-graph showing the assay
chimiluminescence pour une culture primaire de la parathormone (PTH) dans les chemiluminescence to a primary culture of parathyroid hormone (PTH) in
surnageants de culture culture supernatants
Figure 3 est un graphique-barre similaire au graphique-barre 2 après Figure 3 is a similar bar-graph in Figure 2 after-bar
premier passage First passage
Figure 4 représente des courbes de modifications de la sécrétion de Figure 4 shows the secretion of modifications of curves
PTH Induite par la variation du taux de calcium extra cellulaire. PTH-induced changes of extracellular calcium levels.

Obtention de la préparation cellulaire Obtaining the cell preparation
Des échantillons glandulaires ont été obtenus, après consentement des malades concernés. Glandular samples were obtained after consent of the patients concerned. Après vérification anatomo-pathologique de la pièce chirurgicale en extemporané. After pathological examination of the surgical piece extemporaneous. le fragment tissulaire est placé dans un flacon stérile contenant du sérum physiologique puis transporté au laboratoire de cultures cellulaires. the tissue fragment is placed in a vial containing sterile saline and transported to laboratory cell cultures. II est alors immédiatement traité ou cryopréservé en vue d'une mise en culture ultérieure. It is then treated immediately or cryopreserved for a setting higher culture.

Après un découpage fin de l'échantillon, les fragments obtenus sont rincés pour éliminer le sang résiduel puis pesés. After a cutting end of the sample, the resulting fragments are washed to remove residual blood and weighed. Un de ces échantillons est passé aux ultra-sons afin de déterminer son contenu en parathormone. One of these samples increased with ultrasound to determine its content of parathyroid hormone.

La digestion tissulaire est obtenue par incubation 45 à 60 minutes à 37"C, avec agitation mécanique, par pipettage toutes les 15 minutes dans le tampon suivant Tissue digestion is obtained by incubating 45 to 60 minutes at 37 "C, with mechanical stirring, pipetted every 15 minutes in the following buffer
- 20 mM HEPES,136 mM NaCI. - 20 mM HEPES, 136 mM NaCl. 4.7 mM KCI. 4.7 mM KCl. 0,65 mM MgSO4, 1,2 mM CaC12 0.65 mM MgSO4, 1.2 mM CaC12
- 1,5 mg/ml collagénase - 1.5 mg / ml collagenase
- 40 stg/ml DNAse - 40 stg / ml DNAse
- pH 7,45 - pH 7.45
La suspension cellulaire obtenue est filtrée à 25 tm puis incubée 3 minutes dans le tampon EGTA suivant The cell suspension obtained was filtered at 25 tm and then incubated for 3 minutes in the following buffer EGTA
-1 mM EGTA -1 mM EGTA
- 20 mM HEPES, 142 mM NaCI, 07 mM KCI - 20 mM HEPES, 142 mM NaCl, 07 mM KCI
- pH 7,4 - pH 7.4
On réalise ainsi la dissociation des agrégats cellulaires. This produces dissociation of cell aggregates.

La purification des cellules parathyroldiennes est effectuée par centrifugation de la suspension cellulaire sur gradient discontinu de Percoll. Purification of parathyroldiennes cells is done by centrifugation of the cell suspension on discontinuous Percoll gradient. La dilution d'une solution stock isotonique de Percoll (d = 1,123) avec une solution saline de Hanks (d = 1.006) permet d'obtenir 3 solutions de densité 1,035, 1,058 et 1,090. The dilution of a stock solution isotonic Percoll (d = 1.123) with saline Hanks (d = 1.006) yields 3 1.035 density solutions, 1.058 and 1.090. La centrifugation est réalisée à 2000 tours /mn pendant 20 mn avec une accélération et une décélération minimale. Centrifugation is performed at 2000 revolutions / min for 20 minutes with an acceleration and a minimum deceleration.

Les cellules sont récupérées délicatement à chaque interface, lavées de toute trace de Percoll puis comptées. The cells are gently retrieved each interface, washed all traces of Percoll and counted. La viabilité cellulaire est déterminée par exclusion au Bleu Trypan. Cell viability was determined by Trypan Blue exclusion. Un aliquote de chaque suspension est conservé pour permettre une mesure de son contenu cellulaire en PTH. An aliquot of each suspension is kept to allow a measurement of its cell content PTH.

Culture cellulaire Cellular culture
Les cellules sont ensemencées à la densité de 105 cellules/cm2 dans des plaques 24 puits et incubées 18 heures à 37"C dans un milieu de base supplémenté à 12 ?o de sérum de veau foetal. Après cette période, le milieu est remplacé par le milieu PCTM. The cells are seeded at a density of 105 cells / cm2 in 24-well plates and incubated 18 hours at 37 "C in a basal medium supplemented with 12? O fetal calf serum. After this period, the medium was replaced with the middle CTMP.

Tous les trois jours, le milieu de culture est prélevé, filtré, conservé à -20 C en vue du dosage de PTH et remplacé par du milieu frais. Every three days, the culture medium is removed, filtered and stored at -20 C in the PTH assay and replaced with fresh medium.

A confluence, les cellules sont détachées par l'action d'une solution de trypsine-EDTA. At confluence, cells are detached by the action of a trypsin-EDTA solution. La culture cellulaire est alors poursuivie sous deux formes The cell culture is then continued in two forms
- ensemencement en plaques 24 puits à raison de 1,5.105 celluleslpuit dans le but d'estimer la croissance cellulaire on effectue la numération 245 heures après l'ensemencement puis tous les 3 jours en triplicate. - seeding in 24-well plates at a rate of 1,5.105 celluleslpuit in order to estimate the cell growth is carried out count 245 hours after seeding and then every 3 days in triplicate.

- ensemencement en boîtes de Pétri. - seeding in Petri dishes. à la densité de 105 cellules/cm2 afin de poursuivre la culture at a density of 105 cells / cm2 to continue culture
Caractérisation cellulaire Les différents examens de caractérisation cellulaire ont été effectués selon les techniques suivantes Cell characterization cell characterization of the various examinations were carried out using the following techniques
- Microscopie optique une coloration cellulaire par le réactif May Grunwald - Optical microscopy cell staining with May Grunwald reagent
Giemsa permet de caractériser les différents types de cellules parenchymateuses Giemsa allows to characterize the different types of parenchymal cells
- Microscopie électronique on a observé des sections cellulaires ultrafines, réalisées en culture secondaire - Electron microscopy was observed ultrafine cellular sections made of subculture
- Immunomarquages: - Immunostaining:
Antikératine caractérisation de la nature épithéliale des cellules Antikeratin characterization of the epithelial nature of the cells
(anticorps monoclonal de souris) (Mouse monoclonal antibody)
Anti Facteur VIII Indication de la présence ou de l'absence de cellules Anti factor VIII Indication of the presence or absence of cells
endothéliales dans la monocouche cellulaire (anticorps monoclonal de souris) in the endothelial cell monolayer (mouse monoclonal antibody)
Anti PTH intacte mise en évidence du caractère endocrine Anti intact PTH demonstrated the endocrine character
parathyroïdien des cellules en culture par un marquage intra-cytoplasmique parathyroid cells in culture by intra-cytoplasmic staining
(anticorps polyclonal de lapin) (Rabbit polyclonal antibody)
Fonctionnalité des cellules en culture. Functionality of cells in culture.

Elle a été étudiée comme suit It was studied as follows
- Les dosages de la PTH intacte ont été réalisés en chimiluminescence à - assays intact PTH was made in chemiluminescence
l'aide de la trousse de dosage "Magic Lite Intact PTH" commercialisée par Ciba using the assay kit "Magic Lite Intact PTH" sold by Ciba
Corning, tant sur le tissu initial que sur les cellules purifiées et dans les Corning, both the initial fabric that on purified cells and in
surnageants de culture culture supernatants
- Pour la détermination de la sensibilité au calcium, les cellules, durant la - For the determination of calcium sensitivity, the cells during the
culture primaire et lors du premier repiquage, ont été exposées pendant 2 heures primary culture and in the first subculture, were exposed for 2 hours
à des variations de la concentration en calcium extracellulaire ' passage de 0,62 to changes in extracellular calcium concentration touring 0.62
mM (taux de base dans le milieu PTCM) à 1,8 mM. mM (base rate in the middle PTCM) to 1.8 mM. Au terme de cette incubation, After this incubation,
les surnageants ont été prélevés et l'on a effectué le dosage de la parathormone supernatants were collected and were performed the assay of parathyroid hormone
Immunoqénicité Immunogenicity
- L'expression des anticorps HLA DR a été étudié par immunomarquage - The expression of HLA-DR antibody was investigated by immunostaining
en fluorescence à l'aide d'un anticorps monoclonal de souris. fluorescence using a mouse monoclonal antibody. Ce marquage a This marking has
été réalisé durant toutes les étapes de la préparation cellulaire, de la culture primaire, lors du premier repiquage et après incubation durant 48 heures des monocouches cellulaires avec 200 U/ml d'interféron y. was performed during all stages of the cell preparation from primary culture, during the first passage and after incubation for 48 hours the cell monolayers with 200 U / ml interferon.

- Cultures mixtes cultures réalisées avec des cellules parathyroïdiennes irradiées à 2500 rad. - Mixed crops crops grown with parathyroid cells irradiated at 2500 rad. selon le protocole de Saxe (Surgery 1990 108 :56-62 : "In vitro assessment of parathyroid Immunogenicity") according to the protocol of Saxony (1990 Surgery 108: 56-62: "In vitro assessment of parathyroid Immunogenicity")
RESULTATS. RESULTS.

Purification et culture cellulaire Purification and cell culture
La centrifugation sur gradient de Percoll a permis la purification de cellules parathyroldiennes endocrines. The Percoll gradient centrifugation allowed purification parathyroldiennes endocrine cells.

Des aliquotes de suspension cellulaire, obtenus après centrifugation en gradient de Percoll, ont été cytocentrifugés et fixés. Aliquots of cell suspension, obtained after centrifugation in a Percoll gradient were cytocentrifuge and fixed.

Une coloration en réactif May Grunwald Giemsa a permis la caractérisation des types cellulaires isolés pour chaque densité (x 100): A coloring reagent in May Grunwald Giemsa allowed the characterization of isolated cell types for each density (x 100):
La microscopie optique en contraste de phase met en évidence les types cellulaires classiquement décrits dans le tissu parathyroïdien. Optical phase contrast microscopy reveals cell types conventionally described in parathyroid tissue.

- 1035 g/ml - essentiellement cellules graisseuses et débris cellulaires - 1035 g / ml - essentially fat cells and cellular debris
-1,058 g/ml - petites cellules principales avec quelques cellules oxyphiles -1.058 g / ml - small cells with few major oxyphil cells
-1,090 g/ml - cellules principales. -1.090 g / ml - chief cells.

La viabilité du tissu frais est de l'ordre de 80 à 90 %; The viability of fresh tissue is of the order of 80 to 90%; elle décroît légèrement pour le tissu cryopréservé. it decreases slightly for the cryopreserved tissue.

30 à 40 Cc du matériel glandulaire initial est récupéré après la centrifugation sur Percoil 52,82 ng à 120,68 ng de PTH/g de tissu initial pour 12,76 ng à 49,92 ng de PTH/g de cellules après Percoll. 30-40 Cc glandular initial material is recovered after centrifugation Percoil 52.82 to 120.68 ng ng PTH / g original tissue to 12,76 to 49,92 ng ng PTH / g cells after Percoll.

L'adhésion cellulaire est obtenue 24 heures après l'ensemencement dans le milieu PTCM avec une capacité d'adhésion de l'ordre de 70 %. Cell adhesion is obtained 24 hours after seeding in the middle with a capacity PTCM membership of around 70%. Des clones typiques des cellules épithéliales apparaissent dès le deuxième jour et une monocouche cellulaire est obtenue sous 6 à 8 jours. Typical epithelial cell clones appear on the second day and a cell monolayer is obtained in 6 to 8 days. Les quelques cellules de type fibroblastique visibles les premiers jours ( < 1%) ne prolifèrent pas par la suite. The few fibroblast-like cells seen the early days (<1%) do not proliferate thereafter.

Les courbes de numération cellulaire représentées à la figure 1 du dessin schématique annexé, (la durée, en jours, étant portée en abscisses et le nombre de cellules ensemencées en ordonnées) mettent en évidence que le nombre de cellules ensemencées en culture primaire est restauré sous 8 à 10 jours. The cell count of curves shown in Figure 1 of the accompanying diagrammatic drawing (the duration in days plotted on the abscissa and the number of cells seeded on the ordinate) show that the number of cells seeded in the primary culture is restored under 8 to 10 days. Sur la courbe A, la numération cellulaire a été réalisée en culture primaire et sur la courbe B en culture secondaire au premier repiquage. In curve A, the cell count was carried out in primary culture and on the curve B in the first subculture transplanting. Les résultats représentent la moyenne réalisée pour des essais en triplicate pour 3 souches The results represent the average achieved for tests in triplicate for 3 strains
cellulaires indépendantes. independent cell.

Sur la courbe A, on constate qu'au jour J + 1 de la culture primaire, 60 à 80 % des cellules ensemencées ont adhéré. On the curve A, on the day there is J + 1 of the primary culture, 60 to 80% of seeded cells have adhered. Leur nombre initial est restauré sous 8 à 10 jours Their initial number is restored in 8 to 10 days
Sur la courbe B, on constate que l'adhésion des cellules est diminuée lors du passage en culture secondaire , au jour J + 1, 30 à 50 % des cellules adhèrent , cependant, à J + 10, on atteint 80 ,/O du nombre initial de cellules. On the curve B, it is found that cell adhesion is decreased when on subculture on day J + 1, 30 to 50% of the cells adhere, however, D + 10, 80 is reached, / O initial cell number.

Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque le passage se fait à subconfluence il a été possible alors d'effectuer 3 à 5 passages avant l'apparition de la sénescence cellulaire The best results are obtained when the passage is subconfluent it was possible then to perform 3 to 5 passages before the onset of cell senescence
Caractérisation cellulaire cell Characterization
L'examen en microscopie électronique a démontré la nature endocrine des cellules en culture L'ultra structure correspond à celle de cellules principales actives contenant des grains de sécrétion, un appareil de Golgi et un réticulum endoplasmique actif, cellules décrites dans le tissu parathyroïdien normal ou adénomateux. The electron microscopy showed the nature of the endocrine cells in culture The ultra structure corresponds to that of active principal cells containing secretory granules, a Golgi apparatus and endoplasmic reticulum active, parathyroid cells described in normal tissue or adenomatous. (Weymouth RJ et Sheridans MN - 1966 - Acta (RJ Weymouth and Sheridans MN - 1966 - Acta
Endocrinol. Endocrinol. 53 529-546 et Thiele J Damer J. and Fischer R - 1988 : - J. 53 529-546 and Thiele J Damer J. and Fischer R - 1988 - J.

Submicros. Submicros. Cytol. Cytol. Pathol. Pathol. 20 (3) 491-500) 20 (3) 491-500)
Les immunomarquages. The immunostaining. réalisés sur des cultures primaires et lors du premier passage ont donné les résultats suivants performed on primary cultures and in the first pass gave the following results
- Dans le cas de l lmmunomarquage antikératine humaine, on relève un marquage positif des filaments Intermédiaires dans toute la population cellulaire le contrôle réalisé avec un sérum non-immun de souris à la place du premier anticorps est négatif, ce qui révèle la nature exclusivement épithéliale des cellules (Miettinen M. et al. 1985 - Arch. Pathol. Lab. Med. 109 :986-989). - In the case of lmmunomarquage human antikeratin, one notes a positive marking of filaments intermediaries throughout the cell population the control performed with a mouse non-immune serum instead of the first antibody is negative, indicating the nature exclusively epithelial cells (Miettinen, M. et al 1985 - Arch Pathol Lab Med 109:..... 986-989).

- Dans le cas de l'immunomarquage anti-facteur VIII humain, on constate l'absence de cellules endothéliales au cours de la phase de culture cellulaire. - In the case of the anti-human Factor VIII immunostaining, there is a lack of endothelial cells in the cell culture stage. La spécificité du marquage est confirmée par la présence de cellules marquées positivement après la digestion enzymatique. The specificity of labeling is confirmed by the presence of cells positively stained after enzymatic digestion.

- Dans le cas de l'lmmunomarquage anti-PTH intacte humaine, - In the case of the human anti-intact PTH lmmunomarquage,
I'anticorps anti-PTH marque positivement toutes les cellules fixées tant en culture primaire que lors du premier passage les contrôles réalisés avec un sérum de lapin à la place du premier anticorps ne révèlent aucune fluorescence. The antibody positive anti-PTH marks all cells fixed both in primary culture in the first pass the checks performed with rabbit serum in place of the first antibody do not reveal any fluorescence.

On met ainsi en évidence la nature endocrine des cellules : chaque cellule contient de la PTH, que ce soit en culture primaire ou à la fin du premier repiquage, ce qui exprime le maintien de la différenciation cellulaire. thus we highlight the nature of the endocrine cells: each cell contains PTH, whether in primary culture or at the end of the first passage, which expresses the maintenance of cell differentiation.

Fonctionnalité - Les dosages de PTH intacte sont représentés sur les graphiques-barre des figures 2 et 3 (la durée, en jours, est portée en abscisses et et la sécrétion de PTH en ordonnées). Functionality - intact PTH assays are shown in bar-graphs 2 and 3 (the time in days is plotted on the abscissa and PTH secretion and y-axis). Sur les deux figures, A, B et C sont 3 souches cellulaires représentatives les résultats expriment la moyenne des essais réalisés en triplicate pour chaque glande.Le dosage de la PTH dans les surnageants de culture a été réalisé en chimiluminescence In both figures, A, B and C are three representative cell lines results express the average of tests carried out in triplicate for each glande.Le PTH assay in the culture supernatants was performed by chemiluminescence
Pour la figure 2, correspondant à la mesure de l'activité de sécrétion pendant 3 jours d'une culture primaire, on obtient un taux de base moyen de 34,66 pg/105 cellules/h pour une concentration de calcium extraceliulaire de 0,62 mM. In Figure 2, corresponding to the measurement of secretory activity for 3 days primary culture, one obtains an average base rate of 34.66 pg / 105 cells / h for a extraceliulaire calcium concentration of 0, 62 mM.

Pour la figure 3, après un premier passage, on relève un taux de sécrétion moyen de 34,39 pg/105 cellules/h For Figure 3, after a first pass, one notes an average secretion rate of 34.39 pg / 105 cells / h
L'étude de la modification de la sécrétion de PTH induite par la variation du taux de calcium extracellulaire est représentée sur les courbes de la figure 4 (la durée, en heures, est portée en abscisses et la sécrétion de PTH en ordonnées). The study of the change in PTH secretion induced by the variation of extracellular calcium levels is shown in the curves of Figure 4 (the length, in hours, is plotted on the abscissa and PTH secretion ordinate). Sur ces courbes les résultats représentent une moyenne de 3 essais indépendants, réalisés en triplicate. On these curves results represent an average of 3 independent tests, performed in triplicate. Les cellules à confluence lors du premier passage ont été Incubées 2 h dans le milieu PCTM à des taux de calcium de 0,62 mM (taux de base) et de 1,8 mM. The confluent cells in the first pass were 2 pm When incubated in the middle CTMP calcium rate of 0.62 mM (base rate) and 1.8 mM.

On voit qu'une augmentation du taux de calcium de 0,62 mM à 1,8 mM induit une diminution de la sécrétion de PTH intacte d'environ 40 % du taux de base, cette modification correspond à la régulation normale des cellules parathyroldiennes dans les conditions physiologiques in vivo. We see an increase in calcium levels of 0.62 mM to 1.8 mM induces a decrease in the intact PTH secretion by about 40% of the base rate, this change corresponds to the normal regulation of cell in parathyroldiennes physiological conditions in vivo. (Brown et al. Am. (Brown et al. Am.

J. Med. J. Med. 66 923-931). 66 923-931).

Immunoqénéicité - Quelques cellules ont été marquées positivement lors de l'immunomarquage anti HLA DR réalisé aux différentes étapes de la purification cellulaire. Immunoqénéicité - Some cells were stained positively when anti HLA DR conducted at different stages of cell purification immunostaining.

Ce marquage positif n'est plus détecté au sein de la monocouche cellulaire tout le long de la culture même après une stimulation de l'expression de ces molécules de classe Il par l'lnterféron y. This positive labeling is no longer detected in the cell monolayer throughout culture even after stimulation of the expression of such class of molecules It lnterféron by it.

Les résultats présentés dans la table suivante montrent la capacité des lymphocytes T à réagir à une stimulation par la Concanavaline A ainsi que leur absence de réaction aux cellules parathyroldiennes purifiées, ce qui confirme la non immunogénicité de ces dernières The results presented in the following table demonstrate the ability of T cells to respond to stimulation with Concanavalin A and their lack of response to parathyroldiennes purified cells, which confirms the non-immunogenicity of the latter
Co-culture cellules sarathvroïdiennes (PT)-lvmphocvtes (Lvm) Co-culture cells sarathvroïdiennes (PT) -lvmphocvtes (Lvm)
Suspension cellulaire Cellules par puits Incorporation thymidine tritiée Cell suspension cells per well of tritiated thymidine incorporation
Lym PT (impulsions/min) Lym PT (pulse / min)
Moyenne SEM Mr. average
PT irradiées 105 342 38 PT irradiated 105 342 38
Lym/PT irradiées 105 105 444 175 Lym / PT irradiated 105105444175
Lym 105 148 94 Lym 105 148 94
Lym +Concanavalin A) i 105 1 1992 582 Lym + Concanavalin A) i 105 1 1992 582
(0,25 mg/puit) (0.25 mg / well)
La description qui précède montre bien l'originalité de la formulation du milieu de culture proposé, qui associe des constituants connus pour leur capacité à maintenir les propriétés des cellules endocrines et à permettre la prolifération des cellules épithéliales, avec un acide aminé particulier, la D The foregoing description shows the originality of the proposed formulation of the culture medium, combining the constituents known for their ability to maintain the properties of endocrine cells and allow the proliferation of epithelial cells with a particular amino acid, D
Valine qui assure, par l'élimination des cellules parasites fibroblastes, macrophages, la sélection des seules cellules endocrines. Valine which ensures, by eliminating parasites fibroblast cells, macrophages, selecting only endocrine cells.

Cette formulation originale autorise la survie et la multiplication cellulaire de cellules endocrines parathyroidiennes purifiées, fonctionnelles et non imunnocompétentes. This unique formulation allows cell survival and proliferation of purified parathyroid endocrine cells, functional and non imunnocompétentes.

La similitude d'équipement enzymatique qui permet aux cellules parathyroldiennes et aux cellules de la glande mammaire de convertir l'acide aminé D Valine et L Valine, ainsi que des résultats préliminaires avec les cellules t des îlots de Langerhaus permet de penser que cet équipement enzymatique peut être commun à de nombreuses cellules endocrines. The similarity of enzymatic equipment that allows parathyroldiennes cells and cells of the mammary gland to convert the D-amino acid valine and L Valine, as well as preliminary results with T cells of the islets of Langerhaus suggests that this enzyme equipment may be common to many endocrine cells.

Les cellules obtenues par culture sur le milieu selon l'invention sont susceptibles d'application par greffage comme substitut d'organe. The cells obtained by culture on the medium according to the invention are capable of application as graft member substitute.

Claims (5)

    REVENDICATIONS
  1. 1 - Milieu de culture favorisant la croissance cellulaire de cellules endocrines caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué de l'association d'un mélange nutritionnel de base dans lequel l'acide aminé Valine est apporté sous la forme racémique D et d'un complément en sérum de veau foetal dialysé, de facteurs de croissance et d'hormones. 1 - Culture medium promoting cell growth of endocrine cells characterized in that it consists essentially of the combination of a nutritional mixture wherein the basic amino acid Valine is provided in the racemic form D and a complement serum dialyzed fetal calf, growth factors and hormones.
  2. 2 - Milieu de culture selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il présente la composition suivante 2 - Culture medium according to claim 1 characterized in that it has the following composition
    - solution de base MEM D Valine (sel de Earle + D Valine) - basic solution D Valine MEM (Earle's salt Valine + D)
    - complémentation: - Sérum de veau dialysé (18h contre une membrane de cellulose régénérée, porosité 1000 da) 0,02 à 0,20 ml/ml - treatment: - dialyzed calf serum (18h against a regenerated cellulose membrane, 1000 da porosity) 0.02 to 0.20 ml / ml
    - Facteur de croissance épidermique 1 à 50 ng/ml - Epidermal growth factor 1-50 ng / ml
    - Insuline 0,001 à 20 g/ml - Insulin 0.001 to 20 g / ml
    - Hydrocortisone 0,004 à 5 tzg/ml - Hydrocortisone 0.004 to 5 TZG / ml
    - Transferrine 0,5 à 100 ig/ml - Transferrin 0.5 to 100 ug / ml
    - Toxine cholérique 10-8 à 10-12 M - cholera toxin 10-8 to 10-12 M
    - 3,3'-5 Triiodo L Thyronine 2.10 ~7 à 2.10-11 M - 3,3'-5 Triiodo The Thyronine 2.10 -7 to 2.10-11 M
    - Extrait pituitaire bovin 0,05 à 100 ug/ml - bovine pituitary extract 0.05 to 100 ug / ml
  3. 3 - Milieu de culture selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il présente la composition suivante 3 - Culture medium according to claim 2 characterized in that it has the following composition
    - solution de base MEM D Valine (sel de Earle + D Valine) - basic solution D Valine MEM (Earle's salt Valine + D)
    - complémentation: - Sérum de veau dialysé (18h contre une membrane de cellulose régénérée, porosité 1000 da) 0,12 ml/ml - treatment: - dialyzed calf serum (18h against a regenerated cellulose membrane, 1000 da porosity) 0.12 ml / ml
    - Facteur de croissance épidermique 10 ng/ml - epidermal growth factor 10 ng / ml
    - Insuline 5 stg/ml - Insulin 5 stg / ml
    - Hydrocortisone 400 ng/ml - Hydrocortisone 400 ng / ml
    - Transferrine 5 ltg/ml - Transferrin 5 ltg / ml
    - Toxine cholérique 10-1 M - cholera toxin M 10-1
    - 3,3'-5 Triiodo L Thyronine 2.10 -9 M - 3,3'-5 Triiodo The Thyronine 2.10 -9 M
    - Extrait pituitaire bovin 5 tzg/ml - bovine pituitary extract 5 TZG / ml
  4. 4 - Application du milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 à la culture cellulaire de certaines cellules endocrines capables d'incorporer et de décarboxyler les précurseurs des amines biogènes 4 - Application of the culture medium according to any one of claims 1 to 3 to the cell culture of some endocrine cells capable of incorporating and decarboxylating the precursors of biogenic amines
  5. 5. Cellules obtenues par culture suF le milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la préparation de substituts d'organes. 5. Cells obtained by culturing SUF the medium according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of organ substitutes.
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