FR2721030A1 - New leucine contg. peptide(s) that modify serotoninergic transmission - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention a pour objet desThe subject of the present invention is
composés possédant la propriété de modifier la transmis- compounds with the property of modifying the transmission
sion sérotoninergique ainsi que les applications théra- serotonergic sion as well as therapeutic applications
peutiques de ces composés.canics of these compounds.
Le système sérotoninergique cérébral est un système de neurotransmission cérébral et périphérique, qui met en oeuvre la sérotonine ou 5hydroxytryptamine The cerebral serotonergic system is a cerebral and peripheral neurotransmission system, which implements serotonin or 5 hydroxyxyptamine
(5-HT) découverte dans les années 1949-50. (5-HT) discovered in the years 1949-50.
Au niveau central, ce système est particu- At the central level, this system is particu-
lier, dans la mesure o il est extrêmement centralisé (tous les corps cellulaires sont localisés dans la région postérieure du cerveau, le raphé) et o il se projette dans pratiquement toutes les régions du cerveau. Il est to bind, insofar as it is extremely centralized (all the cellular bodies are located in the posterior region of the brain, the raphe) and where it is projected in practically all the regions of the brain. It is
caractérisé par un nombre extrêmement élevé de varicosi- characterized by an extremely high number of varicosi-
tés (ou équivalent de terminaisons neuronales) le long des axones; cette disposition multiplie ses points d'interactions avec les autres systèmes neuronaux cérébraux. De plus, une très grande partie de ces tees (or equivalent of neural endings) along the axons; this arrangement multiplies its points of interaction with other cerebral neural systems. In addition, a very large part of these
varicosités ne présente pas de profil synaptique, c'est- spider veins does not have a synaptic profile, that is
à-dire que la 5-HT libérée par ces "terminaisons" va diffuser et atteindre les cibles (récepteurs) situées à une certaine distance; ce mécanisme nécessite la mise en oeuvre de récepteurs particuliers possédant une that is to say that the 5-HT released by these "endings" will diffuse and reach the targets (receptors) located at a certain distance; this mechanism requires the use of specific receivers having a
affinité élevée pour l'amine. Cette disposition structu- high affinity for the amine. This structured arrangement
rale est tout à fait favorable à une fonction de contrôle de l'ensemble des cellules neuronales du cerveau, et par là à un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie rale is entirely favorable to a function of control of all the neuronal cells of the brain, and thereby to an essential role in the maintenance of homeostasis
du système nerveux central.of the central nervous system.
Pour exercer ce contrôle, le système 5-HT met To exercise this control, the 5-HT system puts
en oeuvre une grande variété de récepteurs spécifiques. uses a wide variety of specific receptors.
Il s'agit en effet de plusieurs familles dont certaines sont bien caractérisées (5-HT,, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4) et d'autres mises en évidence plus récemment sont encore peu connues (5-HT5, 5-HT., 5-HT). Certaines d'entre elles sont représentées par de nombreux sous-types; c'est le cas en particulier de la famille 5-HTJ, caractérisée par une affinité nanomolaire de la 5-HT pour ces sites, et qui comporte les sous-types 5-HT1ABDEF Les récepteurs de type 5-HT1. et 5-HTlD sont These are indeed several families, some of which are well characterized (5-HT ,, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4) and others highlighted more recently are still little known (5-HT5, 5-HT., 5-HT). Some of them are represented by many subtypes; this is particularly the case for the 5-HTJ family, characterized by a nanomolar affinity for 5-HT for these sites, and which comprises the 5-HT1ABDEF subtypes 5-HT1 type receptors. and 5-HTlD are
localisés sur les terminaisons sérotoninergiques et non- located on the serotonergic and non-serotonin terminations
sérotoninergiques, o ils modulent la libération du neurotransmetteur contenu dans ces terminaisons, en particulier ils peuvent réguler la libération de la 5-HT elle-même (autorécepteurs) et jouer alors un rôle déterminant dans l'activité de la neurotransmission sérotoninergique. D'un point de vue fondamental, le système sérotoninergique est impliqué dans de très nombreuses serotonergic, where they modulate the release of the neurotransmitter contained in these terminations, in particular they can regulate the release of 5-HT itself (autoreceptors) and then play a determining role in the activity of serotoninergic neurotransmission. From a fundamental point of view, the serotonergic system is involved in very many
fonctions physiologiques et dans de nombreuses patholo- physiological functions and in many patholo-
gies, et notamment dans le syndrome dépressif. gies, especially in depressive syndrome.
La dépression est un désordre psychiatrique encore mal connu malgré les très nombreuses études qui lui ont été consacrées. Cependant, il est maintenant assez clair qu'une très grande partie sinon la totalité des dépressions implique le système sérotoninergique et notamment, il est généralement accepté qu'il existe une Depression is a psychiatric disorder still poorly understood despite the very many studies that have been devoted to it. However, it is now fairly clear that a very large part if not all of the depressions involve the serotonergic system and in particular, it is generally accepted that there is a
relation entre un déficit sérotoninergique et le suicide. relationship between a serotonergic deficit and suicide.
En outre, les médicaments antidépresseurs interagissent pour un grand nombre d'entre eux avec le système sérotoninergique et les plus récents, qui sont les plus efficaces et qui possèdent le moins d'effets In addition, many of the antidepressant drugs interact with the newer, more effective, and less effective serotonergic system.
indésirables, sont le plus souvent de type "sérotoniner- are most often of the "serotoniner-" type
gique". Ces substances aboutissent toutes, par des these substances all end up, by
mécanismes divers, à faciliter la transmission sérotoni- various mechanisms, to facilitate serotoni-
nergique (inhibiteurs de monoamine oxydases, inhibiteurs de recapture, agonistes 5-HTlA). Mais d'une part, leur efficacité est limitée, et d'autre part, ils possèdent encore pour nombre d'entre eux des effets secondaires importants, et enfin, leur délai d'action est important nergic (monoamine oxidase inhibitors, reuptake inhibitors, 5-HTlA agonists). But on the one hand, their effectiveness is limited, and on the other hand, they still possess for many of them important side effects, and finally, their time of action is important
(> 2 semaines).(> 2 weeks).
Les résultats récents de la littérature et des inventeurs indiquent que les récepteurs 5-HT18/lD1 pourraient jouer un rôle important dans le syndrome Recent results from the literature and the inventors indicate that the 5-HT18 / lD1 receptors could play an important role in the syndrome
dépressif et dans le mécanisme d'action des antidépres- depressive and in the mechanism of action of antidepressants-
seurs. Il a en effet été montré que non seulement ils modulent la libération d'acétylcholine, mais ils modulent aussi celle de la 5-HT elle-même, et par là même régulent de façon efficace la transmission sérotoninergique dont on sait l'importance dans le syndrome dépressif. De plus, ils sont la cible des antidépresseurs qui interagissent de façon vraisemblablement non compétitive; autrement dit, les antidépresseurs reconnaitraient un site distinct des récepteurs 5- HTD', mais étroitement interactif avec sisters. It has indeed been shown that not only do they modulate the release of acetylcholine, but they also modulate that of 5-HT itself, and thereby effectively regulate serotonergic transmission, the importance of which is known in the depressive syndrome. In addition, they are the target of antidepressants which interact in a likely non-competitive manner; in other words, antidepressants would recognize a site distinct from the 5-HTD 'receptors, but closely interactive with
ces derniers.these latter.
Les travaux des inventeurs ont permis la mise en évidence d'un composé endogène cérébral reconnaissant un site porté par les récepteurs 5HTlB/iD qui modulent la The work of the inventors has made it possible to demonstrate an endogenous cerebral compound recognizing a site carried by the 5HTlB / iD receptors which modulate the
libération de la 5-HT elle-même.release of 5-HT itself.
Le composé endogène cérébral mis en évidence est un tétrapeptide de séquence: The brain endogenous compound highlighted is a tetrapeptide of sequence:
Leu - Ser - Ala - Leu (séquence LSAL). Leu - Ser - Ala - Leu (LSAL sequence).
Les inventeurs ont également testé l'activité de peptides comprenant la séquence LSAL modifiée et montré qu'une modification (par exemple une acétylation) de l'extrémité NH2 terminale aboutissait à un composé n'ayant plus l'activité de ligand sur le récepteur 5-HT, The inventors also tested the activity of peptides comprising the modified LSAL sequence and showed that a modification (for example an acetylation) of the NH2 terminal end results in a compound no longer having ligand activity on the receptor 5 -HT,
alors que des modifications de l'extrémité COOH permet- while modifications to the COOH end allow
taient d'obtenir un peptide qui présentait encore une were to get a peptide that still had a
activité importante.important activity.
Par exemple, l'adjonction de la séquence Gly- For example, the addition of the sequence Gly-
Gly-Gly-Tyr à l'extrémité COOH permet d'obtenir un composé ayant une activité encore importante. Cependant, l'adjonction de la même séquence, mais dont le résidu Tyr Gly-Gly-Tyr at the COOH end makes it possible to obtain a compound having a still significant activity. However, the addition of the same sequence, but whose residue Tyr
était iodé aboutissait à un composé n'ayant plus d'acti- was iodized resulted in a compound no longer active
vité de ligand du récepteur 5-HT, probablement en raison de l'encombrement stérique dû à la taille importante des atomes d'iode qui empêcherait la liaison du peptide ainsi ligand activity of the 5-HT receptor, probably due to steric hindrance due to the large size of the iodine atoms which would prevent the binding of the peptide as well
modifié sur son récepteur.modified on its receiver.
Les inventeurs ont en outre montré que les peptides de séquence Leu-Ser, Ala-Leu et Ala-Leu-Ser avaient la propriété de se lier au récepteur 5-HT et exerçaient à des concentrations élevées une activité The inventors have further shown that the peptides of sequence Leu-Ser, Ala-Leu and Ala-Leu-Ser have the property of binding to the 5-HT receptor and exert at high concentrations an activity
similaire à celle du tétrapeptide endogène. similar to that of the endogenous tetrapeptide.
Il apparaît par conséquent que c'est par son extrémité NH2 terminale que le peptide endogène se fixe It therefore appears that it is by its NH2 terminal end that the endogenous peptide binds
sur le récepteur 5-HT.on the 5-HT receiver.
Il a également été démontré au laboratoire que certains antidépresseurs (qu'ils soient ou non inhibiteurs de la recapture des amines) sont capables d'interagir avec la fonction du récepteur 5-HTlB/D mis en jeu dans le fonctionnement du système sérotoninergique It has also been shown in the laboratory that certain antidepressants (whether or not they are amine reuptake inhibitors) are capable of interacting with the function of the 5-HTlB / D receptor involved in the functioning of the serotonergic system.
cérébral (Harel-Dupas et al., Eur. Neuro-Psychopharma- cerebral (Harel-Dupas et al., Eur. Neuro-Psychopharma-
col., 1, 1991, 157-164; Bolanos-Jimenez et al., Eur. J. col., 1, 1991, 157-164; Bolanos-Jimenez et al., Eur. J.
Pharmacol., 1993, 242, 1-6).Pharmacol., 1993, 242, 1-6).
Cette interaction pourrait être due à une This interaction could be due to a
liaison directe de ces molécules sur le récepteur 5- direct binding of these molecules to the 5- receptor
HTlB/D. Un support à cette dernière hypothèse est consti- HTlB / D. Support for the latter hypothesis is
tué par le fait que divers antidépresseurs altèrent la liaison de la 5- HT sur les récepteurs de type 5-HT1 killed by the fact that various antidepressants alter the binding of 5-HT to 5-HT1 receptors
(Fillion et Fillion, Nature, 1981, 292, (5821) 349-351). (Fillion and Fillion, Nature, 1981, 292, (5821) 349-351).
Dans cette hypothèse, le fait que l'interac- On this assumption, the fact that the interaction
tion observée n'apparaisse pas comme compétitive suggère que s'il y a une interaction directe des antidépresseurs observed does not appear competitive suggests that if there is a direct interaction of antidepressants
avec le récepteur 5-HT: D, celle-ci se ferait par l'in- with the 5-HT: D receptor, this would be done by the
termédiaire d'un site d'interaction différent stricto- through a different interaction site stricto-
sensu du site de liaison de la 5-HT. En d'autres termes, sensu of the 5-HT binding site. In other words,
ces antidépresseurs interagiraient avec le récepteur 5- these antidepressants would interact with the 5-
HT 1B/D comme des modulateurs allostériques de ce récep- HT 1B / D as allosteric modulators of this receptor
teur. L'invention a donc pour objet un composé de séquence peptidique suivante: Leu - Ser - Ala - Leu - Y tor. The subject of the invention is therefore a compound of the following peptide sequence: Leu - Ser - Ala - Leu - Y
dans laquelle Y représente OH, NH2, un reste hydrocarby- in which Y represents OH, NH2, a hydrocarbon residue
loxy substitué ou non substitué, ou une séquence peptidi- substituted or unsubstituted loxy, or a peptide sequence
que ayant de 1 à 10 aminoacides, ainsi que les composés correspondants dans lesquels la liaison peptidique est remplacée par une liaison résistante à la dégradation enzymatique des protéases ou dans lesquels le squelette peptidique comporte un ou plusieurs groupes intercalés rendant la liaison peptidique résistante à la dégradation enzymatique. that having from 1 to 10 amino acids, as well as the corresponding compounds in which the peptide bond is replaced by a bond resistant to the enzymatic degradation of the proteases or in which the peptide backbone comprises one or more intercalated groups making the peptide bond resistant to the degradation enzymatic.
Ainsi, le groupe de liaison peptidique (-CO- Thus, the peptide linkage group (-CO-
NH-) est avantageusement remplacé par un groupe de liaison -CO-NR'-, -CR1R2-CR3R4-, -CO-CR1R2-, R1, R2, R3 et R4, identiques ou différents, représentant H ou un groupe alkyle en CQ-C6, notamment un groupe méthyle, et R' NH-) is advantageously replaced by a linking group -CO-NR'-, -CR1R2-CR3R4-, -CO-CR1R2-, R1, R2, R3 and R4, identical or different, representing H or a CQ alkyl group -C6, in particular a methyl group, and R '
représentant un groupe alkyle en C1-C6. representing a C1-C6 alkyl group.
Parmi les groupes pouvant être intercalés dans le squelette peptidique, on peut citer les groupes suivants -CR1R2-, -NR,- et -O-, R1 et R2 étant définis Among the groups which can be intercalated in the peptide backbone, mention may be made of the following groups -CR1R2-, -NR, - and -O-, R1 and R2 being defined
comme précédemment.like before.
La nature des aminoacides de X est indiffé- The nature of the amino acids of X is indifferent
rente, la limite étant que lorsqu'il s'agit d'aminoacides modifiés (non codés génétiquement), ceux-ci ne soient pas substitués par un groupe encombrant (ayant une taille rent, the limit being that when it comes to modified amino acids (not genetically coded), these are not substituted by a bulky group (having a size
supérieure à celle du rayon de l'atome d'iode. greater than that of the radius of the iodine atom.
Par reste hydrocarbyloxy, on entend notamment un groupe alkyloxy, alcènyloxy ou alcynyle, à chaîne linéaire ou ramifiée, ayant de 1 à 10 atomes de carbone non substitué ou substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi OH, NH2, NO-, Cl, Br, F, CF3, par exemple le groupe OCH3, 0C2H5, OCHOH, OCH3, OCHOH-CH20H, OCH2CH2NH2, The term “hydrocarbyloxy residue” is understood to mean in particular an alkyloxy, alkenyloxy or alkynyl group, with a straight or branched chain, having from 1 to 10 carbon atoms unsubstituted or substituted by one or more groups chosen from OH, NH2, NO-, Cl, Br , F, CF3, for example the group OCH3, 0C2H5, OCHOH, OCH3, OCHOH-CH20H, OCH2CH2NH2,
0C3H7, etc...0C3H7, etc ...
Les composés selon l'invention comprennent notamment les peptides de séquence suivante: Leu - Ser - Ala - Leu Leu - Ser - Ala - Leu - OCH3 Leu - Ser - Ala - Leu - NH2 Leu - Ser - Ala - Leu - Gly - Gly - Gly - Tyr ainsi que les composés analogues dans lesquels la liaison peptidique est remplacée par une liaison telle que définie ci-dessus, ou dont le squelette comprend un The compounds according to the invention include in particular the peptides of the following sequence: Leu - Ser - Ala - Leu Leu - Ser - Ala - Leu - OCH3 Leu - Ser - Ala - Leu - NH2 Leu - Ser - Ala - Leu - Gly - Gly - Gly - Tyr as well as analogous compounds in which the peptide bond is replaced by a bond as defined above, or whose backbone comprises a
groupe intercalé tel que défini ci-dessus. interleaved group as defined above.
Les composés les plus actifs sont ceux dont The most active compounds are those of which
les aminoacides constitutifs sont sous la forme L, c'est- the constituent amino acids are in the L form,
à-dire la forme naturelle pour les structures peptidiques ie the natural form for peptide structures
définies ci-dessus.defined above.
Les composés selon l'invention sont préparés par extraction à partir de cerveau lyophilisé comme décrit ci-après ou plus avantageusement par synthèse peptidique classique, par exemple par la méthode en phase The compounds according to the invention are prepared by extraction from lyophilized brain as described below or more advantageously by conventional peptide synthesis, for example by the phase method
solide de MERRIFIELD lorsqu'ils sont de nature exclusive- solid from MERRIFIELD when they are of an exclusive nature-
ment peptidique, ou encore par modification des groupes terminaux des aminoacides et condensation des résidus ainsi obtenus, les fonctions réactives autres que celles engagées dans la liaison entre les résidus successifs ayant été préalablement protégées à l'aide des groupes peptide ment, or alternatively by modification of the amino acid end groups and condensation of the residues thus obtained, the reactive functions other than those involved in the connection between the successive residues having been previously protected using the groups
protecteurs bien connus de l'homme du métier. protectors well known to those skilled in the art.
Selon un exemple de préparation d'un peptide According to an example of preparation of a peptide
selon l'invention, on fixe sur une résine, par l'intermé- according to the invention, a resin is fixed, by means of
diaire de son groupe carboxylique, le résidlu Ser dont la diary of its carboxylic group, the residue Ser whose
fonction amine est protégée par un groupe terbutyloxycar- amine function is protected by a terbutyloxycar- group
bonyle, puis, après avoir déprotégé la fonction amino en lavant la résine avec de l'acide trifluoroacétique dans du dichlorométhane, on couple dans le diméthylformamide le second résidu d'acide aminé dont la fonction amino est protégée comme précédemment, on fixe ainsi les uns après les autres les résidus aminoacides qui vont constituer bonyle, then, after deprotecting the amino function by washing the resin with trifluoroacetic acid in dichloromethane, we couple in dimethylformamide the second amino acid residue whose amino function is protected as above, thus fixing each after the others the amino acid residues which will constitute
la portion du peptide selon l'invention. Après déprotec- the portion of the peptide according to the invention. After deprotec-
tion, la fonction amino du résidu N-terminal peut être acétylée par action d'un excès d'anhydride acétique en tion, the amino function of the N-terminal residue can be acetylated by the action of an excess of acetic anhydride in
présence de diisopropyléthylamine. presence of diisopropylethylamine.
La chaîne latérale de la sérine peut être The side chain of serine can be
protégée par exemple par un groupe benzyle. protected for example by a benzyl group.
Après avoir éliminé le groupe protecteur,le peptide selon l'invention est libéré du support solide, par exemple avec de l'acide fluorhydrique. Le produit brut est lyophilisé et soumis à une chromatographie en phase liquide à moyenne pression, permettant d'obtenir After removing the protective group, the peptide according to the invention is released from the solid support, for example with hydrofluoric acid. The crude product is lyophilized and subjected to liquid pressure chromatography at medium pressure, making it possible to obtain
un produit pratiquement pur; celui-ci est alors caracté- a practically pure product; this one is then character-
risé par chromatographie en phase liquide à haute pression ainsi que par l'analyse de sa composition en risé by high pressure liquid chromatography as well as by analysis of its composition
aminoacides et par spectrométrie de masse. amino acids and by mass spectrometry.
Les peptides caractérisés possèdent la propriété de modifier la transmission sérotoninergique par ses interactions avec les autorécepteurs (et aussi les hétérorécepteurs) et pourraient jouer un rôle clef dans diverses pathologies psychiatriques o le système -HT est notoirement mis en jeu (stress, anxiété, The characterized peptides have the property of modifying serotonergic transmission by its interactions with autoreceptors (and also heteroreceptors) and could play a key role in various psychiatric pathologies where the -HT system is notoriously involved (stress, anxiety,
dépression, obsessions compulsives, troubles de l'appé- depression, compulsive obsessions, impaired appetite
tit, du sommeil, troubles du comportement, agressivité, tit, sleep, behavioral problems, aggression,
etc...).etc ...).
L'invention a également pour objet un composé apte à remplir le rôle de ligand du récepteur sur lequel se fixe le peptide endogène de séquence Leu-Ser-Ala-Leu (LSAL), caractérisé en ce qu'il comprend un groupement dont la structure spatiale est sensiblement identique à celle d'un peptide de séquence x - Leu - Y' dans laquelle X représente H, Ala ou Leu-Ser-Ala, Y' représente Y tel que défini précédemment ou Ser, X et Y A subject of the invention is also a compound capable of fulfilling the role of ligand of the receptor on which the endogenous peptide of sequence Leu-Ser-Ala-Leu (LSAL) is fixed, characterized in that it comprises a group whose structure spatial is substantially identical to that of a peptide of sequence x - Leu - Y 'in which X represents H, Ala or Leu-Ser-Ala, Y' represents Y as defined above or Ser, X and Y
ne représentant pas simultanément H et OH, respective- not simultaneously representing H and OH, respectively-
ment. Un tel composé peut être un agoniste ou una is lying. Such a compound can be an agonist or a
ntagoniste du peptide LSAL.ntagonist of the LSAL peptide.
Par structure "spatiale sensibement identi- By "sensitively identifiable" spatial structure
que", on entend au sens de la présente invention que la position moyenne des atomes formant le groupement qui se lie au récepteur ne diffère qu'au plus de 5 %, et de préférence au plus de 2 % de la position moyenne des that ", it is understood within the meaning of the present invention that the average position of the atoms forming the group which binds to the receptor differs only by more than 5%, and preferably by more than 2% from the average position of
atomes formant le peptide correspondant. atoms forming the corresponding peptide.
Parmi les composés préférés, on peut citer ceux comprenant un groupement dont la structure spatiale est sensiblement identique aux di-, tri- et tétrapeptides suivants: Ala-Leu Leu-Ser Ala-Leu-Ser Leu-Ser-Ala-Leu. Les composés selon l'invention sont élaborés à partir de(s) la (les) structure(s) spatiale(s) des peptides selon l'invention par modélisation informatique et synthèse chimique classique à partir de la structure Among the preferred compounds, mention may be made of those comprising a group whose spatial structure is substantially identical to the following di-, tri- and tetrapeptides: Ala-Leu Leu-Ser Ala-Leu-Ser Leu-Ser-Ala-Leu. The compounds according to the invention are developed from the spatial structure (s) of the peptides according to the invention by computer modeling and conventional chemical synthesis from the structure
obtenue après modélisation.obtained after modeling.
Avantageusement, ces composés sont élaborés en outre en s'appuyant sur la structure spatiale de molécules d'antidépresseur connues actives sur ce même site. Advantageously, these compounds are further developed by relying on the spatial structure of known antidepressant molecules active on this same site.
La technique par modélisation permet notam- The modeling technique allows in particular
ment de définir et caractériser la structure de molécules n'affectant pas les sites de transport des amines (à la différence de la plupart des antidépresseurs connus actuellement) mais affectant le seul site allostérique to define and characterize the structure of molecules which do not affect the amine transport sites (unlike most antidepressants currently known) but which affect the only allosteric site
porté par les récepteurs 5-HTlB/D. carried by 5-HTlB / D receptors.
Les composés de l'invention possèdent la pro- The compounds of the invention have the pro-
priété de modifier la transmission sérotoninergique par ses interactions avec les autorécepteurs (et aussi les hétérorécepteurs) et jouent un rôle clef dans diverses pathologies psychiatriques o le système 5-HT est notoirement mis en jeu (stress, anxiété, dépression, obsessions compulsives, troubles de l'appétit, du request to modify serotonergic transmission by its interactions with autoreceptors (and also heteroreceptors) and play a key role in various psychiatric pathologies where the 5-HT system is notoriously involved (stress, anxiety, depression, compulsive obsessions, appetite,
sommeil, troubles du comportement, agressivité, etc...). sleep, behavioral problems, aggression, etc.).
L'invention a également pour objet une composition thérapeutique comprenant un composé tel que défini ci-dessus, capable de traverser la barrière hématoencéphalique. The subject of the invention is also a therapeutic composition comprising a compound as defined above, capable of crossing the blood-brain barrier.
Pour traverser la barrière hématoencéphali- To cross the blood-brain barrier
que, le peptide est de préférence administré sous la that, the peptide is preferably administered under the
forme d'une pro-drogue, notamment de type glycosyl- form of a pro-drug, especially of the glycosyl type
phospho-triester, dans laquelle le peptide est lié par exemple par la sérine au groupe phosphate, comme décrit phospho-triester, in which the peptide is linked for example by serine to the phosphate group, as described
dans J. MED. CHEM. 92, Vol. 35, p. 30-39. in J. MED. CHEM. 92, Vol. 35, p. 30-39.
Une telle pro-drogue, ainsi que de manière générale une molécule précurseur susceptible de libérer in vivo un composé selon l'invention, constitue un autre Such a pro-drug, as well as in general a precursor molecule capable of releasing in vivo a compound according to the invention, constitutes another
objet de l'invention.subject of the invention.
La composition thérapeutique est utilisée avantageusement dans des pathologies dans lesquelles est impliqué le système sérotoninergique, notamment dans les pathologies liées à une déficience de la transmission sérotoninergique. La composition selon l'invention peut également être utilisée au niveau périphérique dans des o pathologies telles que les troubles de la circulation, The therapeutic composition is advantageously used in pathologies in which the serotonergic system is involved, in particular in pathologies linked to a deficiency in serotonergic transmission. The composition according to the invention can also be used at peripheral level in o pathologies such as circulation disorders,
la migraine et les troubles de la réponse immunitaire. migraine and immune response disorders.
Ainsi, lorsque le composé selon l'invention est un peptide ou un composé mimant l'effet du peptide LSAL, la composition selon l'invention peut être utilisée en particulier dans le traitement de la dépression, mais également dans toutes les indications actuellement couvertes par les antidépresseurs, comme les troubles obsessionnels compulsifs, l'anxiété généralisée, la crise de panique, les troubles de l'appétit, du sommeil, l'impulsivité, les troubles sexuels, l'agressivité, et plus généralement celles des composés facilitant la Thus, when the compound according to the invention is a peptide or a compound mimicking the effect of the LSAL peptide, the composition according to the invention can be used in particular in the treatment of depression, but also in all the indications currently covered by antidepressants, such as obsessive compulsive disorder, generalized anxiety, panic attack, appetite, sleep disorders, impulsivity, sexual disorders, aggression, and more generally those of the compounds facilitating the
transmission sérotoninergique.serotonergic transmission.
Lorsque le composé selon l'invention est un analogue spatial du peptide LSAL antagonisant l'effet du peptide endogène LSAL, la composition thérapeutique peut être utilisée dans les troubles de l'humeur et du comportement ou les troubles vasculaires et immunitaires impliquant l'action du peptide endogène sur son site When the compound according to the invention is a spatial analog of the LSAL peptide antagonizing the effect of the endogenous LSAL peptide, the therapeutic composition can be used in mood and behavioral disorders or vascular and immune disorders involving the action of endogenous peptide on its site
récepteur.receiver.
La composition selon l'invention se présente avantageusement sous forme injectable ou orale, ou sous The composition according to the invention is advantageously in injectable or oral form, or in
toute autre forme pharmaceutique connue. any other known pharmaceutical form.
La dose thérapeutique efficace est aisément déterminée par l'homme du métier en fonction de la nature et de la gravité de la pathologie à traiter, ainsi que du poids et de l'âge du patient. Les composés selon l'invention ne sont pas toxiques. Ils sont ajoutés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable ou à un excipient The effective therapeutic dose is easily determined by those skilled in the art depending on the nature and severity of the pathology to be treated, as well as the weight and age of the patient. The compounds according to the invention are not toxic. They are added to a pharmaceutically acceptable vehicle or an excipient
bien connu de l'homme du métier.well known to those skilled in the art.
L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro d'une affection liée au système sérotoninergique chez un patient, caractérisé en ce que l'on effectue un dosage dans un fluide biologique du patient d'un peptide de séquence Leu - Ser - Ala - Leu Le dosage est effectué notamment par une méthode immunologique comprenant la mise en présence d'un prélèvement biologique avec un anticorps spécifiquement dirigé contre un peptide selon l'invention et la mise en The invention also relates to a method for in vitro diagnosis of a condition linked to the serotonergic system in a patient, characterized in that an assay is carried out in a biological fluid of the patient of a peptide of sequence Leu - Ser - Ala - Leu The assay is carried out in particular by an immunological method comprising bringing a biological sample into the presence of an antibody specifically directed against a peptide according to the invention and
évidence du complexe antigène-anticorps ainsi formé. evidence of the antigen-antibody complex thus formed.
Ces procédés peuvent être basés sur une méthode radioimmunologique de type RIA, RIPA ou IRMA, ou sur une méthode immunoenzymatique, par exemple de type These methods can be based on a radioimmunological method of the RIA, RIPA or IRMA type, or on an immunoenzymatic method, for example of the
ELISA.ELISA.
Le fluide biologique peut être le sang, The biological fluid can be blood,
l'urine ou le liquide céphalo-rachidien. urine or cerebrospinal fluid.
Les anticorps peuvent être monoclonaux ou polyclonaux et constituent, ainsi que leurs fragments The antibodies can be monoclonal or polyclonal and constitute, as well as their fragments
Fab, Fab', F(ab')2 et Fc, un autre objet de l'invention. Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fc, another object of the invention.
Les anticorps sont obtenus par couplage d'un peptide selon l'invention sur un peptide ou une protéine The antibodies are obtained by coupling a peptide according to the invention to a peptide or a protein
porteurs immunogènes.immunogenic carriers.
L'invention a également pour objet un kit de diagnostic pour le dosage d'un peptide selon l'invention dans un fluide corporel d'un patient chez lequel on suspecte une pathologie liée à une déficience de la transmission sérotoninergique, notamment une dépression masquée, comprenant au moins un anticorps tel que défini ci-dessus et éventuellement les réactifs pour la mise en The subject of the invention is also a diagnostic kit for assaying a peptide according to the invention in a body fluid of a patient in whom a pathology linked to a deficiency in serotonergic transmission is suspected, in particular masked depression, comprising at least one antibody as defined above and optionally the reagents for the
oeuvre du dosage.dosage work.
Les peptides de l'invention se sont révélés The peptides of the invention have been found
inactifs sur le site de recapture de la 5-HT. inactive at the 5-HT reuptake site.
L'existence d'un facteur endogène cérébral non actif sur le site de recapture constitue un standard The existence of an inactive brain endogenous factor at the reuptake site constitutes a standard
de référence en terme d'activité et permet ainsi d'envi- benchmark in terms of activity and thus allows for approxi-
sager un procédé de sélection de substances antidépres- a process for the selection of antidepressant substances
sives, consistant à discriminer entre l'effet de recap- sives, consisting in discriminating between the recap-
ture et l'effet d'interaction sur le site 5-HTlB/lD. ture and interaction effect on the 5-HTlB / lD site.
Ce procédé s'applique aux antidépresseurs This process applies to antidepressants
connus et permet également la mise au point de médica- known and also allows the development of
ments nouveaux.new things.
En pratique, la discrimination entre l'effet de recapture et l'effet sur le site 5-HTB/5D peut être effectuée en réalisant des essais d'inhibition de liaison entre d'une part l'activité de quantités croissantes d'antidépresseurs et la capture de la 5-HT dans les synaptosomes, la 5-HT étant radiomarquée et d'autre part In practice, the discrimination between the reuptake effect and the effect on the 5-HTB / 5D site can be carried out by carrying out tests of inhibition of binding between on the one hand the activity of increasing amounts of antidepressants and the capture of 5-HT in synaptosomes, 5-HT being radiolabelled and on the other hand
en réalisant des essais de même type sur le récepteur 5- by carrying out tests of the same type on the receiver 5-
HTB/1D en faisant varier la quantité d'antidépresseurs en présence d'un ligand radiomarqué spécifique du site du peptide sur les récepteurs 5HT1B/1D, et en déterminant les HTB / 1D by varying the quantity of antidepressants in the presence of a radiolabeled ligand specific for the site of the peptide on the 5HT1B / 1D receptors, and by determining the
Ki respectifs ou de façon plus générale les CIs0. Respective Ki or more generally the CIs0.
Le choix d'antidépresseurs ayant une activité The choice of antidepressants with activity
sélective sur le site 5-HT1B ID sera dicté par les substan- selective on the 5-HT1B ID site will be dictated by the substan-
ces présentant un Ki élevé ou une CI50 faible dans l'essai de recapture et inversement un Ki faible ou une CI50 élevée dans l'essai de liaison sur le site de reconnaissance du peptide du récepteur 5-HTl1/lD. On peut these exhibiting a high Ki or a low IC50 in the reuptake assay and conversely a low Ki or a high IC50 in the binding test at the recognition site of the peptide of the 5-HT11 / lD receptor. We can
également et plus aisément utiliser le peptide radiomar- also and more easily use the radiomar- peptide
qué (tritium) pour identifier et caractériser le site spécifique de reconnaissance du peptide, et ainsi directement étudier les capacités de diverses substances à déplacer (compétition) ce peptide en mesurant leur Ki et en comparant ce dernier aux valeurs de Ki obtenues pour ces mêmes substances pour inhiber la capture de la -HT (ou déplacer un inhibiteur de recapture (3H paroxe- qué (tritium) to identify and characterize the specific site of recognition of the peptide, and thus directly to study the capacities of various substances to move (competition) this peptide by measuring their Ki and by comparing this last to the values of Ki obtained for these same substances to inhibit uptake of -HT (or displace a reuptake inhibitor (3H paroxe-
tine par exemple).tine for example).
Un autre objet de l'invention consiste également en un procédé de mise en évidence de ligands du site du récepteur 5-HT1, iD pour le peptide LSAL, caractérisé en ce que l'on effectue les étapes consistant a: - mettre en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées avec une cellule recombinée exprimant à sa surface le récepteur 5-HTlB/lD en présence d'un composé Another object of the invention also consists in a process for detecting ligands of the site of the 5-HT1 receptor, iD for the peptide LSAL, characterized in that the steps consisting in: - bringing into contact a molecule or a mixture containing different molecules, possibly not identified with a recombinant cell expressing on its surface the 5-HTlB / lD receptor in the presence of a compound
selon l'invention dans des conditions permettant l'inte- according to the invention under conditions allowing the inte-
raction entre le récepteur 5-HT1B1/D et ladite (lesdites) molécule(s), dans le cas o celle-ci posséderait une affinité pour le récepteur 5HTlB/lD; - détecter la quantité dudit composé selon l'invention liée au récepteur; - en déduire la fixation éventuelle de ladite reaction between the 5-HT1B1 / D receptor and the said molecule (s), in the event that the latter has an affinity for the 5HTlB / lD receptor; - detecting the amount of said compound according to the invention linked to the receptor; - deduce from it the possible fixing of said
(desdites) molécule(s).(said) molecule (s).
Ce procédé peut être utilisé pour la mise en This process can be used for setting up
évidence d'agonistes ou d'antagonistes du peptide LSAL. evidence of agonists or antagonists of the LSAL peptide.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de mise en évidence de modulateurs du site du récepteur 5-HTlB/lD pour le peptide LSAL caractérisé en ce que l'on effectue les étapes consistant à: - mettre en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées, avec une cellule recombinée exprimant à sa surface le récepteur 5-HT18/lD en présence d'un composé selon l'invention, dans des conditions permettant l'interaction entre le récepteur 5-HTlB/lDet ledit composé selon l'invention; - détecter les molécules capables de moduler Another subject of the invention relates to a method for demonstrating modulators of the site of the 5-HTlB / lD receptor for the LSAL peptide, characterized in that the steps consisting in: - bringing a molecule or a mixture containing different molecules, possibly unidentified, with a recombinant cell expressing on its surface the 5-HT18 / lD receptor in the presence of a compound according to the invention, under conditions allowing interaction between the 5-HTlB / lDet receptor said compound according to the invention; - detect molecules capable of modulating
l'activité du composé selon l'invention sur ledit récep- the activity of the compound according to the invention on said receptor
teur. Des ligands ou des modulateurs obtenus selon un procédé tel que décrit ci-dessus peuvent être utilisés comme principe actif d'un composition thérapeutique utile dans le traitement de troubles psychiatriques tels que la dépression, circulatoires tels que la migraine, ou tor. Ligands or modulators obtained according to a process as described above can be used as active principle of a therapeutic composition useful in the treatment of psychiatric disorders such as depression, circulatory disorders such as migraine, or
immunologiques liés aux récepteurs 5-HTîB/lD. immunologicals linked to 5-HTÎB / lD receptors.
Les composés selon l'invention sont également utiles comme outils de diagnostic pour marquer les récepteurs 5-HTlB,/D, et plus particulièrement le site de The compounds according to the invention are also useful as diagnostic tools for labeling the 5-HTlB, / D receptors, and more particularly the site of
liaison du peptide endogène sur ces récepteurs. binding of the endogenous peptide to these receptors.
A cette fin, on utilise avantageusement une composition de diagnostic comprenant un composé selon l'invention radiomarqué dans une technique d'imagerie mettant en oeuvre un scanner de tomographie par émission To this end, it is advantageous to use a diagnostic composition comprising a compound according to the invention radiolabelled in an imaging technique using an emission tomography scanner
de positons.of positons.
On décrira ci-après l'isolement et la The isolation and the
caractérisation du peptide Leu-Ser-Ala-Leu selon l'inven- characterization of the Leu-Ser-Ala-Leu peptide according to the invention
tion, ainsi que les propriétés de liaison et les activi- tion, as well as the binding properties and activi-
tés pharmacologiques sur les récepteurs 5-HT1./1. du peptide LeuSer-Ala-Leu en se reportant aux figures annexées sur lesquelles: - La Figure 1 représente les interactions de pharmacological tees on the 5-HT1./1 receptors. of the LeuSer-Ala-Leu peptide with reference to the appended figures in which: - Figure 1 represents the interactions of
liaison avec le [125I]cyanopindolol. bond with [125I] cyanopindolol.
La liaison du [125I]cyanopindolol a été mesurée comme décrit dans HOYER D. et al., Eur. J. The binding of [125I] cyanopindolol was measured as described in HOYER D. et al., Eur. J.
Pharmacol. 118, 1-12 (1985).Pharmacol. 118, 1-12 (1985).
- La Figure 1A représente les résultats obtenus avec des membranes corticales de cerveau de rat (50 pg de protéines), incubées pendant 60 minutes à 37 C - Figure 1A represents the results obtained with cortical membranes of rat brain (50 pg of proteins), incubated for 60 minutes at 37 C
dans un volume total de 100 pl en présence de [125I]cyano- in a total volume of 100 μl in the presence of [125I] cyano-
pindolol 0,3 nM.0.3 nM pindolol.
L'incubation a été effectuée dans un tampon tris-HCl 5 mM, pH 7,5, contenant 154 mM NaCl, 1 pM de The incubation was carried out in a 5 mM tris-HCl buffer, pH 7.5, containing 154 mM NaCl, 1 μM of
pargyline, 30 pM d'isoprotérénol et différentes concen- pargyline, 30 µM isoproterenol and various concentrates
trations du peptide (10- à 10-8 M). Chaque point corres- peptide trations (10- to 10-8 M). Each point corresponds to
pond à une moyenne plus ou moins l'écart type de cinq spends an average plus or minus the standard deviation of five
déterminations indépendantes.independent determinations.
- La Figure lB représente les résultats - Figure lB represents the results
obtenus avec des membranes de cellules NIH 3T3 trans- obtained with membranes of NIH 3T3 cells trans-
fectées avec le gène du récepteur 5-HT1, (50 pg de protéines), incubées pendant 60 minutes à 37 C en présence de [:25I]cyanopindolol 0,3 nM. La liaison a été fected with the 5-HT1 receptor gene (50 μg of proteins), incubated for 60 minutes at 37 ° C. in the presence of 0.3 nM cyanopindolol. The liaison was
mesurée comme pour la Figure 1A.measured as in Figure 1A.
- La Figure 1C représente les résultats obtenus des membranes corticales de cerveau de rat (50 pg de protéines) incubées pendant 60 minutes à 37 C dans un volume total de 100 pl en présence de concentrations croissantes de [125I]cyanopindolol (0,06 à 0,35 nM) avec FIG. 1C represents the results obtained from the cortical membranes of the rat brain (50 μg of proteins) incubated for 60 minutes at 37 ° C. in a total volume of 100 μl in the presence of increasing concentrations of [125I] cyanopindolol (0.06 to 0.35 nM) with
(0) ou sans (O) le peptide à 1 nM. Chaque point corres- (0) or without (O) the 1 nM peptide. Each point corresponds to
pond à la moyenne plus ou moins l'écart type de trois lays the mean plus or minus the standard deviation of three
déterminations indépendantes.independent determinations.
- La Figure 1D représente la courbe de - Figure 1D represents the curve of
Scatchard des courbes de saturation. Scatchard of saturation curves.
- La Figure 2 représente les résultats des effets de LSAL sur l'activité adénylylcyclase stimulée - Figure 2 shows the results of the effects of LSAL on the stimulated adenylylcyclase activity
par la forskoline.by forskolin.
Des membranes de cellules NIH 3T3 exprimant le gène du récepteur 5-HT, de souris ont été mises en suspension et homogénéisées avec un homogénisateur Dounce dans un tampon tris-HCl 50 mM pH 7,4 contenant MgCl2 à Membranes of NIH 3T3 cells expressing the gene for the 5-HT receptor, of mice were suspended and homogenized with a Dounce homogenizer in a 50 mM tris-HCl buffer pH 7.4 containing MgCl2 to
3 mM et EGTA à 0,2 mM (tampon TME). 3 mM and 0.2 mM EGTA (TME buffer).
Les activités adénylyl cyclase ont été mesurées dans des fractions aliquotes de 50 pl (30-50 pg de protéines) d'homogénats dans un volume final de 100 pi contenant 0,1 mM, [a32P]ATP (lpCi), 1 mM MgCl2, 50 pM GTP, 10 pM forskoline, 100 mM NaCl, 10 mM théophylline, mM phosphocréatinine, 0,2 mg/ml créatine kinase, 1 mM [3H]AMPc (= 15 000 cpm/essai) et les substances à étudier. Les membranes ont été incubées pendant 20 minutes à 30 C. La réaction a été arrêtée par addition de 200 pl d'ATP à 5 mM, 5 mM d'AMPc et du dodécyl sulfate The adenylyl cyclase activities were measured in 50 μl aliquots (30-50 μg of proteins) of homogenates in a final volume of 100 μl containing 0.1 mM, [a32P] ATP (lpCi), 1 mM MgCl2, 50 pM GTP, 10 pM forskolin, 100 mM NaCl, 10 mM theophylline, mM phosphocreatinine, 0.2 mg / ml creatine kinase, 1 mM [3H] cAMP (= 15,000 cpm / test) and the substances to be studied. The membranes were incubated for 20 minutes at 30 C. The reaction was stopped by adding 200 μl of 5 mM ATP, 5 mM cAMP and dodecyl sulfate
de sodium à 1% dissous dans 50 mM de tampon Tris-HCl. 1% sodium dissolved in 50 mM Tris-HCl buffer.
Le [32P]AMPc formé a été isolé par la méthode de chromatographie à deux colonnes décrite par Salomon et al. (Adv. Cyclic Nucleotide Res., 10, 35-55 (1979)., The [32P] cAMP formed was isolated by the two-column chromatography method described by Salomon et al. (Adv. Cyclic Nucleotide Res., 10, 35-55 (1979).,
modifié par De Vivo et Maayani (J. Pharmacol. Exp. modified by De Vivo and Maayani (J. Pharmacol. Exp.
Therap. 238, 248-253 (1986)).Therap. 238, 248-253 (1986)).
- La Figure 2A exprime l'effet de LSAL en fonction de sa concentration sur l'activité enzymatique stimulée par la forskoline en présence de 0,1 pM de 5-HT. - La Figure 2B exprime la courbe dose-réponse de l'effet de 5-HT sur l'activité enzymatique stimulée par la forskoline en l'absence ( ---0), ou en présence - Figure 2A expresses the effect of LSAL as a function of its concentration on the enzymatic activity stimulated by forskolin in the presence of 0.1 pM of 5-HT. - Figure 2B expresses the dose-response curve of the effect of 5-HT on the enzymatic activity stimulated by forskolin in the absence (--- 0), or in the presence
(O ---- O) de LSAL (10-9 M).(O ---- O) from LSAL (10-9 M).
- La Figure 3 représente l'effet du peptide sur la libération de sérotonine dans des synaptosomes de l'hippocampe de cerveau de rat. Les résultats sont exprimés en pourcentages de la libération de [3H]5-HT (rapport P2/Pl)en l'absence de peptide. Chaque point est la moyenne plus ou moins l'écart type de déterminations en triple obtenue à l'aide de 3-6 homogénats d'hippocampe distincts. - Figure 3 represents the effect of the peptide on the release of serotonin in synaptosomes of the hippocampus of rat brain. The results are expressed as percentages of the release of [3H] 5-HT (P2 / Pl ratio) in the absence of peptide. Each point is the mean plus or minus the standard deviation of triplicate determinations obtained using 3-6 distinct hippocampal homogenates.
La méthode mise en oeuvre est la méthode dé- The method used is the method
crite précédemment (BOLANOS-JIMENEZ B. et al., Eur. J. Pharmacol. 242, 1-6 (1993)) avec les modifications suivantes: la [3H]acétylcholine était substituée par 60 nM [3H]5-HT et 0,01% d'acide ascorbique était ajouté au previously cited (BOLANOS-JIMENEZ B. et al., Eur. J. Pharmacol. 242, 1-6 (1993)) with the following modifications: [3H] acetylcholine was substituted with 60 nM [3H] 5-HT and 0 0.01% ascorbic acid was added to the
milieu d'incubation.incubation medium.
1. Isolement et purification du peptide Leu- 1. Isolation and purification of the peptide Leu-
Ser-Ala-Leu En utilisant comme critère de discrimination la capacité d'un facteur potentiel à interagir avec la reconnaissance de la 5-HT par le récepteur 5-HT1,l1 de membranes de synaptosomes de cerveau de rat, comme décrit dans FR-2 657 784, un composé actif a été purifié à partir d'extraits de cerveaux de rat, de cheval et de bovin. La méthodologie depurification a fait appel à des séparations par permeation sur gel, des phases normales Ser-Ala-Leu Using as a discrimination criterion the ability of a potential factor to interact with the recognition of 5-HT by the 5-HT1, l1 receptor of rat brain synaptosome membranes, as described in FR- 2,657,784, an active compound was purified from extracts of rat, horse and bovine brains. The purification methodology used gel permeation separations, normal phases
ou inversées ou encore des échanges ioniques. or reversed or ion exchanges.
Elle est résumée sur le tableau ci-dessous: Etapes de purification du peptide endogène It is summarized in the table below: Steps in the purification of the endogenous peptide
ETAPES DE LA CONDITIONS DE LA FRACTION STEPS OF THE CONDITIONS OF THE FRACTION
CHROMATOGRAPHIE CHROMATOGRAPHIE ACTIVE CHROMATOGRAPHY ACTIVE CHROMATOGRAPHY
(Temps d'élion __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ oude rétention) EXCLUSION DE TAILLE Elution isocratique avec un tampon (TSK HW 40S, Merck, d'acétate d'ammonium TE = 80 min. 600 x 26 mm) (CH3COONH4) 50mM (pH 5) Vitesse d'écoulement: 2 ml.min-' Gradient d'elution linéaire de A a B pendant 12 minutes: PHASE INVERSE A: 50 mM CH3 COONH4 (pH 5); (C,, Ultrabase. Shandon, B:50 mM CH3 COONH, (pH 5)/CH3CN, 88/12 TR = 20 min. 250 x 10 mm) Gradient par étapes pendant 5 min. avec C. C: 50 mM CH3 COONH, (pH 5)/CH3CN, 50/50 Vitesse d'écoulement: 4 ml.min' EXCLUSION DE TAILLE Elution isocratique avec (Sephadex G, 10 mM CH3 COONH, (pH 5) TE = 240 min. Pharmacia, Vitesse d'ecoulement: 0,3 ml.min' 450 x 16 mm) Gradient d'elution linéaire de A à B pendant 15 minutes PHASE INVERSE A 50 mM CH3 COONH. (pH 5)/CH3CN, 85/15 (C,,. Ultrabase, Shandon, B: 50 mM CH3 COONH4 (pH 5)/CH3CN, 75/25 TR = 5.75 min. 250 x 10 mm) Gradient par étapes pendant 5 min. avec C. C: 50 mM CH, COONH, (pH 5)/CHCN. 50/50 Vitesse d'écoulement: 4 ml. min-' PHASE INVERSE Gradient d'élution lineaire de A à B (C,". Ultrabase, Shandon, pendant 35 minutes 250 x 10 mm) A: 50 mM CH3 COONH, (pH 5); TR = 28 min. B: 50 mM CH3 COONH, (pH 5)/CH3CN, 70/30 Vitesse d'écoulement:4 ml.min-' PHASE Gradient d'élution linéaire de A à B PSEUDO-INVERSE pendant 30 minutes (Colonne de charbon, A: 50 mM CH3 COONH, (pH 5), TR = 12,71 min. Hypercarb., B:50 mM CH3 COONH, (pH 5)/CH3CN, 70/30 Shandon, 100 x 3 mm) Vitesse d'écoulement: 1 mlmin' PHASE INVERSE Elution isocratique avec 0,05% (C,., Ultrabase, Shandon,TFA/CHCN, 83/17 T = 5,14 min. x 4 mm) Vitesse d'écoulement: 1 ml.min-' La caractérisation des fractions obtenues a été réalisée essentiellement sur la base d'analyse par (Elution time __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ or retention retention) SIZE EXCLUSION Isocratic elution with a buffer (TSK HW 40S, Merck, of ammonium acetate TE = 80 min 600 x 26 mm) (CH3COONH4) 50 mM (pH 5) Flow rate: 2 ml.min- 'Linear elution gradient from A to B for 12 minutes: REVERSE PHASE A: 50 mM CH3 COONH4 (pH 5); (C ,, Ultrabase. Shandon, B: 50 mM CH3 COONH, (pH 5) / CH3CN, 88/12 TR = 20 min. 250 x 10 mm) Gradient in stages for 5 min. with C. C: 50 mM CH3 COONH, (pH 5) / CH3CN, 50/50 Flow rate: 4 ml.min 'SIZE EXCLUSION Isocratic elution with (Sephadex G, 10 mM CH3 COONH, (pH 5) TE = 240 min Pharmacia, Flow rate: 0.3 ml.min '450 x 16 mm) Linear elution gradient from A to B for 15 minutes INVERSE PHASE AT 50 mM CH3 COONH. (pH 5) / CH3CN, 85/15 (C ,,. Ultrabase, Shandon, B: 50 mM CH3 COONH4 (pH 5) / CH3CN, 75/25 TR = 5.75 min. 250 x 10 mm) Gradient in stages for 5 min. with C. C: 50 mM CH, COONH, (pH 5) / CHCN. 50/50 Flow speed: 4 ml. min- 'REVERSE PHASE Linear elution gradient from A to B (C, ". Ultrabase, Shandon, for 35 minutes 250 x 10 mm) A: 50 mM CH3 COONH, (pH 5); TR = 28 min. B: 50 mM CH3 COONH, (pH 5) / CH3CN, 70/30 Flow rate: 4 ml.min- 'PHASE Linear elution gradient from A to B PSEUDO-INVERSE for 30 minutes (Coal column, A: 50 mM CH3 COONH, (pH 5), TR = 12.71 min Hypercarb., B: 50 mM CH3 COONH, (pH 5) / CH3CN, 70/30 Shandon, 100 x 3 mm) Flow rate: 1 mlmin 'INVERSE PHASE Isocratic elution with 0.05% (C,., Ultrabase, Shandon, TFA / CHCN, 83/17 T = 5.14 min. X 4 mm) Flow rate: 1 ml.min-' Characterization of the fractions obtained was carried out essentially on the basis of analysis by
RMN, d'analyse d'aminoacides et de séquencage d'aminoa- NMR, amino acid analysis and amino acid sequencing
cides. Le composé purifié consistait en Leu-Ser-Ala-Leu. cides. The purified compound consisted of Leu-Ser-Ala-Leu.
La même fraction a été obtenue également à partir de cerveau de cheval et de bovin, ce qui signifie The same fraction was also obtained from horse and bovine brain, which means
que ce peptide est conservé chez les mammifères. that this peptide is conserved in mammals.
2. Interactions du peptide purifié avec les récepteurs 5-HTlB/lD Le peptide synthétique LSAL a été testé pour sa capacité à "mimer" les effets de la fraction purifiée obtenue à partir d'extraits de cerveau. LSAL inhibe la liaison de [3H]-5-HT aux récepteurs 5-HT1 avec une CI50 proche de 10-1M et un effet inhibiteur maximum de 30à % se produisant à une concentration de 10-9M. La liaison 5-HT1o, qui dans les conditions expérimentales 2. Interactions of the purified peptide with the 5-HT1B / 1D receptors The synthetic peptide LSAL was tested for its capacity to "mimic" the effects of the purified fraction obtained from brain extracts. LSAL inhibits the binding of [3H] -5-HT to 5-HT1 receptors with an IC50 close to 10-1M and a maximum inhibitory effect of 30%, occurring at a concentration of 10-9M. The 5-HT1o bond, which under experimental conditions
mises en oeuvre, représente principalement les sites 5- implemented, mainly represents sites 5-
HT1 B/D, est inhibée jusqu'à une valeur maximale de 75%, comme représenté au tableau 2 ci-dessous avec une CI50 identique. Cette dernière observation indique que les récepteurs 5-HT l B/D sont particulièrement sensibles au peptide. C'est pourquoi des essais ont été réalisés sur des homogénats de tissu cérébral de rat dans lesquels les récepteurs 5-HTîB étaient marqués spécifiquement avec du [125I] cyanopindolol avec une CI50 de 10-1M et un effet maximum de 60%d'inhibition, comme représenté à la Figure HT1 B / D, is inhibited up to a maximum value of 75%, as shown in Table 2 below with an identical IC50. This last observation indicates that the 5-HT 1 B / D receptors are particularly sensitive to the peptide. This is why tests have been carried out on homogenates of rat brain tissue in which the 5-HTib receptors were specifically labeled with [125I] cyanopindolol with an IC50 of 10-1M and a maximum effect of 60% inhibition. , as shown in Figure
1A.1A.
* En outre, l'activité de ce peptide sur les récepteurs 5-HTD a été démontrée chez le cobaye et sur le cerveau humain à l'aide de [3H]5-HT. La valeur de la CI50 était à nouveau de 10-'1lM. Ces résultats suggèrent* In addition, the activity of this peptide on the 5-HTD receptors has been demonstrated in the guinea pig and on the human brain using [3 H] 5-HT. The IC50 value was again 10-1m. These results suggest
fortement que in vitro, les récepteurs 5-HT 1 B/D consti- strongly that in vitro 5-HT 1 B / D receptors are
tuent la cible du peptide LSAL.kill the target of the LSAL peptide.
L'activité du peptide a également été évaluée sur la liaison aux récepteurs 5-HT1. dans des cellules NIH 3T3 transfectées avec le gène du récepteur 5-HT,, de The activity of the peptide was also evaluated on the binding to 5-HT1 receptors. in NIH 3T3 cells transfected with the 5-HT receptor gene,
la souris.the mouse.
L'effet inhibiteur du peptide était très similaire à celui observé dans les homogénéisats de tissu The peptide inhibitory effect was very similar to that observed in tissue homogenates
cérébral (Figure lB).cerebral (Figure 1B).
L'effet maximum correspondait à 70% d'inhibi- The maximum effect corresponded to 70% inhibition
tion de la liaison spécifique du [125I] cyanopindolol avec une valeur de la CId0 de 10-"M. Ce résultat démontre clairement que LSAL interagit directement avec les tion of the specific binding of [125I] cyanopindolol with a CId0 value of 10- "M. This result clearly demonstrates that LSAL interacts directly with
récepteurs 5-HT1B.5-HT1B receptors.
Pour étudier plus loin le type d'interaction du tétrapeptide avec les récepteurs 5-HT1 B/D des courbes de saturation du ligand radiomarqué ont été établies en présence du peptide. Les résultats de liaison obtenus To further study the type of interaction of the tetrapeptide with the 5-HT1 B / D receptors, saturation curves for the radiolabelled ligand were established in the presence of the peptide. The binding results obtained
suggèrent que l'activité inhibitrice du peptide corres- suggest that the inhibitory activity of the corresponding peptide
pond à une interaction non compétitive (Figures lC, 1D). lies in a non-competitive interaction (Figures lC, 1D).
Ce résultat a été observé avec la [3H]5-HT, aussi bien qu'avec le ['25I]cyanopindolol pour marquer les récepteurs 5-HT1B et est en accord avec l'hypothèse précédente de l'existence d'un site spécifique pour le peptide distinct mais étroitement apparenté au site de This result was observed with [3H] 5-HT, as well as with ['25I] cyanopindolol to label the 5-HT1B receptors and is in agreement with the previous hypothesis of the existence of a specific site for the distinct but closely related peptide at the site of
liaison de 5-HT.5-HT binding.
La spécificité pharmacologique des fractions partiellement purifiées a été étudiée au cours d'une purification ultérieure en utilisant des homogénéisats de cerveau de rat. Les essais ont été effectués en utilisant le LSAL synthétique pour déterminer si le The pharmacological specificity of the partially purified fractions was studied during a subsequent purification using rat brain homogenates. The tests were performed using synthetic LSAL to determine if the
peptide interagissait ou non avec d'autres récepteurs 5- peptide interacted or not with other receptors 5-
HT, ou ceux d'autres neuro-transmetteurs. HT, or those of other neuro-transmitters.
Les récepteurs 5-HT 1A n'étaient pas affectés à une concentration du peptide qui antagonisait fortement la liaison au 5-HT 1,B-' The 5-HT 1A receptors were not affected at a concentration of the peptide which strongly antagonized the binding to 5-HT 1, B- '
De manière analogue, la liaison de radio- Similarly, the radio link
ligands aux récepteurs 5-HT,E 5-HTl,F 5-HT2 et 5-HT3 n'était pas affectée (Tableau 2), ce qui indique que parmi les récepteurs sérotoninergiques étudiés, seule la classe 5-HT. é,D était sensible au peptide. La liaison d'autres radio-ligands spécifiques à des récepteurs de neurotransmetteurs variés a été examinée: les récepteurs a et P adrénergiques, dopaminergiques, muscariniques, histaminergiques, aux opiacées et aux benzodiazépines. La liaison à ces récepteurs n'était pas sigriificativement réduite par LSAL à des concentrations qui avaient un effet inhibiteur maximum pour la liaison aux récepteurs -HT 1B/D (Tableau 2). ligands to the 5-HT, E 5-HT1, F 5-HT2 and 5-HT3 receptors were not affected (Table 2), which indicates that among the serotonergic receptors studied, only the 5-HT class. é, D was sensitive to the peptide. The binding of other specific radio-ligands to receptors of various neurotransmitters has been examined: adrenergic, dopaminergic, muscarinic, histaminergic, opioid and benzodiazepine receptors a and P. The binding to these receptors was not significantly reduced by LSAL at concentrations which had a maximum inhibitory effect for binding to the -HT 1B / D receptors (Table 2).
Tableau 2Table 2
Effet inhibiteur du peptide sur différentes liaisons de radioligands dans des tissus de cerveau de rat Inhibitory effect of the peptide on different radioligand bonds in rat brain tissue
EFFET INHIBITEURINHIBITOR EFFECT
RECEPTEURS L!GANDS EN %L! GANDS RECEIVERS IN%
DU TEMOINWITNESS
SEROTONINERGIQUESSEROTONINERGIC
5-HTlA [3H]8-OH-DPAT (3 nM) 0 -HT,B ['251lcyanopindolol (0.3 nM) + 30 pM isoproterénol 70 + 2 + 0,1 nM 8-OH DPAT -HT, NONA [3H]5-HT (30 nM) + 0,1 pM 8-OH-DPAT 75 + 3 5-HT,EFC [3H]5-HT (30 nM) + 20 nM 5-CT 0 + 10 -HT2A [3H]ketanserine (5 nM) 10 + 5 -HT2A [3H]DOB (5 nM) 2 + 8 -HT3 [3H]BRL 43694 (3 nM O +_ 10 5-HTlA [3H] 8-OH-DPAT (3 nM) 0 -HT, B ['251lcyanopindolol (0.3 nM) + 30 pM isoproterenol 70 + 2 + 0.1 nM 8-OH DPAT -HT, NONA [3H] 5-HT (30 nM) + 0.1 pM 8-OH-DPAT 75 + 3 5-HT, EFC [3H] 5-HT (30 nM) + 20 nM 5-CT 0 + 10 -HT2A [3H] ketanserine (5 nM) 10 + 5 -HT2A [3H] DOB (5 nM) 2 + 8 -HT3 [3H] BRL 43694 (3 nM O + _ 10
ADRENERGIQUESADRENERGIC
a, [3H]prazos:rne (2 nM) 5 + 3 f3 [3H]dihyarca!preno!ol <3 nM) 10 15 + 5-HT 10-r M a, [3H] prazos: rne (2 nM) 5 + 3 f3 [3H] dihyarca! preno! ol <3 nM) 10 15 + 5-HT 10-r M
DOPAMINERGIQUESDOPAMINERGICS
D2 [3H]spiperone (2 nM) + 10 pM 5-HT 2 3 D2 [3H] spiperone (2 nM) + 10 pM 5-HT 2 3
HISTAMINERGIQUESHISTAMINERGIC
Hi [3H]mépyramine (5 nM) 10 10 MUSCARINIQUES [3H]benzylate de quinuclidinyle (3 nM) 0 2 OPIACEES [3H]naloxone (2 nM) 10 10 BENZODIAZEPINES [3H]flunitrazépam (3 nM) 2 2 Léqendes du Tableau 2: Des membranes cérébrales de cerveau de rat (200 pg) ont été incubées pendant 30 minutes à 250C avec différents radio-ligands spécifiques (voir Tableau) en Hi [3H] mepyramine (5 nM) 10 10 MUSCARINICS [3H] quinuclidinyl benzylate (3 nM) 0 2 OPIACEATES [3H] naloxone (2 nM) 10 10 BENZODIAZEPINES [3H] flunitrazepam (3 nM) 2 2 Legends from Table 2 : Rat brain brain membranes (200 pg) were incubated for 30 minutes at 250C with different specific radio-ligands (see Table) in
présence ou en absence de 1 nM du peptide. presence or absence of 1 nM of the peptide.
Les différentes conditions de liaisons utilisées pour les récepteurs sérotoninergiques sont celles décrites précédemment (PALACIOS J.M. et al., Methods in Neurosciences 12, 238-262 (1993)). Pour les autres liaisons, le milieu d'incubation consistait en 50 mM Tris-HCl pH 7,4 contenant 120 mM de NaCl et 50 mM de KCl ([3H]spiropéridol, [3H] benzylate de quinuclidinyle, The different binding conditions used for serotonergic receptors are those described above (PALACIOS J.M. et al., Methods in Neurosciences 12, 238-262 (1993)). For the other bonds, the incubation medium consisted of 50 mM Tris-HCl pH 7.4 containing 120 mM NaCl and 50 mM KCl ([3H] spiroperidol, [3H] quinuclidinyl benzylate,
[3H]naloxone, ou 4 mM de CaCl2 et 4 mM de MgCl2 ([3H]flu- [3H] naloxone, or 4 mM CaCl2 and 4 mM MgCl2 ([3H] flu-
nitrazépam), ou 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2 et 1 mM de MgSO4 ([3H]prazosin), ou 90 mM de NaCl nitrazepam), or 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM CaCl2 and 1 mM MgSO4 ([3H] prazosin), or 90 mM NaCl
([3H]dihydroalprénolol).([3H] dihydroalprenolol).
Chaque point correspond à une moyenne plus ou Each point corresponds to an average plus or
moins l'écart type de cinq déterminations indépendantes. minus the standard deviation of five independent determinations.
Le tétrapeptide identifié n'a pas montré The identified tetrapeptide did not show
d'autre effet sur la recapture de 5-HT dans les prépara- other effect on the uptake of 5-HT in preparations
tions synaptosomales. Il n'a pas non plus montré d'effet sur la recapture d'autres neurotransmetteurs (ou leurs synaptosomal tions. It also did not show any effect on the reuptake of other neurotransmitters (or their
précurseurs), par exemple la choline, le GABA, l'histami- precursors), for example choline, GABA, histami-
ne, la dopamine et la noradrénaline. ce résultat indique que le peptide est différent des composés endogènes suspectés antérieurement d'interagir avec le transport ne, dopamine and norepinephrine. this result indicates that the peptide is different from endogenous compounds previously suspected of interacting with transport
des amines.amines.
3) Interaction de LSAL avec l'activité 3) Interaction of LSAL with the activity
fonctionnelle des récepteurs 5-HT1. (système de transduc- of the 5-HT1 receptors. (transducer system-
tion) Les récepteurs 5-HT1 B/D sont connus pour être majoritairement couplés à la protéine Gi, en inhibant l'activité de l'adénylyl cyclase. L'interaction de LSAL a été examinée sur l'activité enzymatique corrélée à la tion) The 5-HT1 B / D receptors are known to be mainly coupled to the Gi protein, by inhibiting the activity of adenylyl cyclase. The interaction of LSAL was examined on the enzymatic activity correlated with
stimulation du récepteur 5-HT1 exprimée dans des cellu- stimulation of the 5-HT1 receptor expressed in cells
les NIH 3T3.NIH 3T3.
Le peptide n'avait pas d'effet sur la production basale d'AMPc. Toutefois, il augmentait significativement l'effet inhibiteur de la 5-HT sur l'activité adénylyl cyclase stimulée par la forskoline (Figure 2). Cet effet était dépendant de la concentration The peptide had no effect on basal cAMP production. However, it significantly increased the inhibitory effect of 5-HT on the adenylyl cyclase activity stimulated by forskolin (Figure 2). This effect was dependent on the concentration
avec une courbe dose-réponse en forme de cloche. L'acti- with a bell-shaped dose-response curve. The acti-
vité du peptide sur les homogénéisats de substance noire speed of the peptide on the homogenates of substantia nigra
de rat était pratiquement similaire. Ces résultats indi- was almost similar. These results indicate
quent clairement que LSAL interagit avec l'activité du that LSAL interacts with the activity of the
récepteur 5-HTIB.5-HTIB receptor.
4) Effets du peptide sur l'activité fonc- 4) Effects of the peptide on the functional activity
tionnelle cellulaire des récepteurs 5-HT 1B/D L'activité du peptide sur la libération de [3H]5-HT à partir de synaptosomes d'hippocampe, de cellular concentration of 5-HT 1B / D receptors The activity of the peptide on the release of [3H] 5-HT from hippocampal synaptosomes,
cerveau de rat préalablement chargées a été examinée. previously charged rat brain was examined.
La libération de [3H]5-HT suscitée par K' a diminué de manière dosedépendante en présence de LSAL avec une CI50 apparente proche de 10-1lM. L'effet maximum, observé à une concentration de 1-10M, correspond à une inhibition de 20 à 25% de la libération provoquée et The release of [3H] 5-HT elicited by K 'decreased dosedependently in the presence of LSAL with an apparent IC50 close to 10-1lM. The maximum effect, observed at a concentration of 1-10M, corresponds to a 20 to 25% inhibition of the induced release and
diminue à des concentrations plus élevées (Figure 3). decreases at higher concentrations (Figure 3).
Ces résultats démontrent que LSAL interagit avec la fonction cellulaire corrélée à l'activité des récepteurs 5-HT1 B/D et régule l'activité inhibitrice de These results demonstrate that LSAL interacts with cellular function correlated with the activity of 5-HT1 B / D receptors and regulates the inhibitory activity of
la 5-HT.5-HT.
5) Effets in vivo de LSAL Des essais ont été réalisés in vivo chez la 5) In vivo effects of LSAL Tests have been carried out in vivo in
souris, pour examiner les effets comportementaux de LSAL. mouse, to examine the behavioral effects of LSAL.
Dans la mesure o des études neuro-pharmaco- Insofar as neuro-pharmacological studies
logiques antérieures avaient montré l'implication des récepteurs 5- HT IB dans les désordres liés au stress et à l'anxiété, les effets du peptide ont été examinés dans previous logic had shown the involvement of the 5 HT HT IB receptors in stress and anxiety disorders, the effects of the peptide were examined in
deux modèles animaux d'anxiété.two animal models of anxiety.
Test du champ ouvert L'activité de LSAL a été déterminée dans le test du champ ouvert sur des souris C57/Black-6. A des doses de 50 pg ICV par animal, l'activité exploratrice a été significativement diminuée par rapport à des animaux témoins qui recevaient l'excipient dans les mêmes Open field test The activity of LSAL was determined in the open field test on C57 / Black-6 mice. At doses of 50 pg ICV per animal, the exploratory activity was significantly reduced compared to control animals which received the excipient in the same
conditions (tableau 3).conditions (table 3).
TABLEAU 3TABLE 3
Effets d'injections intracérébroventriculaires de LSAL chez la souris Effects of intracerebroventricular injections of LSAL in mice
COMPORTEMENTBEHAVIOUR
CHAMP OUVERTOPEN FIELD
Substance Nombre Nombre de Nombre de Temps injectée d'animaux carrés redressements d'immobilisation (sec.) traversés ___ Contrôle 12 115 + 9 23 + 3 12 + 5 (NaCI) Substance Number Number of Number of Times injected with square animals restorations of immobilization (sec.) Crossed ___ Control 12 115 + 9 23 + 3 12 + 5 (NaCI)
LSAL 12 88 + 9* 15 + 3* 47+ 8*LSAL 12 88 + 9 * 15 + 3 * 47+ 8 *
pgpg
LABYRINTHE EN CROIX SURELEVERaised Cross Labyrinth
Substance Nombre Bras ouverts Bras ouverts Total Bras injectée d'animaux ENTREES (%) TEMPS (%) ENTREES Contrôle 18 61 9 66 + 8 10 + 2 (NaCI) LSAL 2 pg 8 68 + 4 55 4 24 4** pg 8 71 t 6 58 + 6 15 3 pg 10 28 t 9* 22 7** 3 + 1 Légendes du Tableau 3 Champ ouvert: Des souris mâles C57/BL/6 (20-25 g) ont été utilisées. Le champ ouvert consistait en une boite de plastique blanc (35 x 35 x 20 cm) divisée en 25 carrés Substance Number Open arms Open arms Total Arm injected with animals INPUTS (%) TIME (%) INPUTS Control 18 61 9 66 + 8 10 + 2 (NaCI) LSAL 2 pg 8 68 + 4 55 4 24 4 ** pg 8 71 t 6 58 + 6 15 3 pg 10 28 t 9 * 22 7 ** 3 + 1 Legends of Table 3 Open field: Male C57 / BL / 6 mice (20-25 g) were used. The open field consisted of a white plastic box (35 x 35 x 20 cm) divided into 25 squares
égaux. Du LSAL dissous dans 5 ml de 0,9% de solution sa- equal. LSAL dissolved in 5 ml of 0.9% saline solution
line dans un volume de 5 pl a été injecté icv aux souris, qui ont été placées à un angle de la boite. Après deux minutes, le nombre de carrés traversés, les demi-tours line in a volume of 5 μl was injected icv into the mice, which were placed at an angle to the box. After two minutes, the number of squares crossed, the U-turns
effectués et le temps d'immobilisation ont été mesurés. performed and downtime were measured.
Les résultats sont exprimés comme la moyenne plus ou moins l'écart type. Différence avec le témoin: The results are expressed as the mean plus or minus the standard deviation. Difference with the witness:
*p < 0,05, **p < 0,005 (Test de Student). * p <0.05, ** p <0.005 (Student's Test).
Labyrinthe en croix surélevé Des souris mâles BALB/C pesant de 20 & 24 g Raised cross maze Male BALB / C mice weighing 20 & 24 g
ont été utilisées.have been used.
Le labyrinthe en croix surélevé était fait de plexiglas avec bras ouverts et deux bras fermés de la même taille (12,5 x 5 cm) avec des murs de 15 cm de hauteur, ces bras partant d'une plateforme centrale de x 5 cm, placée 40 cm au-dessus du sol. Du LSAL dissous dans 5 ml de solution saline à 0,9% dans un volume de 5 pl a été injecté icv aux souris. Trois heures plus tard, l'animal a été placé sur la plateforme centrale du labyrinthe. Chaque entrée dans un bras ainsi que le temps passé dans chaque bras a été enregistré. La durée du test était de 5 minutes. Le The raised cross labyrinth was made of plexiglass with open arms and two closed arms of the same size (12.5 x 5 cm) with walls 15 cm high, these arms starting from a central platform of x 5 cm, placed 40 cm above the ground. LSAL dissolved in 5 ml of 0.9% saline in a volume of 5 μl was injected icv into the mice. Three hours later, the animal was placed on the central platform of the labyrinth. Each entry into an arm and the time spent in each arm was recorded. The duration of the test was 5 minutes. The
labyrinthe a été nettoyé après chaque essai. labyrinth was cleaned after each test.
Le LSAL a été testé dans des conditions de basse intensité lumineuse (BENJAMIN D. et al., Life Sci. The LSAL was tested under conditions of low light intensity (BENJAMIN D. et al., Life Sci.
47, 195-203 (1990)).47, 195-203 (1990)).
Les résultats ont été exprimés comme la moyenne plus ou moins l'écart type du pourcentage des entrées dans les bras ouverts (% d'entrées dans les bras ouverts), pourcentage du temps passé dans les bras ouverts (% temps dans le bras ouvert) et nombre total d'entrées dans les bras. Différence avec le témoin: The results were expressed as the mean plus or minus the standard deviation of the percentage of entries in the open arms (% of entries in the open arms), percentage of time spent in the open arms (% time in the open arm) and total number of entries in the arms. Difference with the witness:
*p < 0,05, **p < 0,01 (Test de Student). * p <0.05, ** p <0.01 (Student's Test).
La tendance au redressement était significa- The recovery trend was significant.
tivement diminuée (60 à 65%) et les actes de toilettage étaient abolis. Des résultats similaires ont été observés chez souris BALB/C. Ces résultats indiquent que LSAL est potentiellement anxiogène à forte concentration, car il induit un comportement "d'immobilisation" distinct de tively decreased (60 to 65%) and acts of grooming were abolished. Similar results were observed in BALB / C mice. These results indicate that LSAL is potentially anxiety-provoking at high concentration, because it induces a behavior of "immobilization" distinct from
l'effet sédatif.the sedative effect.
Test du "labyrinthe en croix surélevé" Ce test expérimental est utilisé pour Test of the "raised cross labyrinth" This experimental test is used to
déterminer le degré d'anxiété et consiste en un labyrin- determine the degree of anxiety and consists of a labyrin-
the surélevé à deux bras, l'un protégé par des parois et the raised with two arms, one protected by walls and
l'autre non protégé.the other unprotected.
L'animal est supposé anxieux lorsqu'il évite The animal is supposed to be anxious when it avoids
l'entrée et réduit le temps passé dans les bras ouverts. entry and reduces the time spent in open arms.
L'administration du tétrapeptide à des concentrations faibles (2 pg ICV) augmentait le nombre total d'entrées dans les bras de l'appareil, ce qui correspondait à une activité locomotrice augmentée, alors qu'à 10 et 15 pg, il réduisait de façon significative le Administration of tetrapeptide at low concentrations (2 pg ICV) increased the total number of entries in the arms of the apparatus, which corresponded to increased locomotor activity, while at 10 and 15 pg, it reduced significantly the
temps passé par l'animal dans les bras ouverts (Ta- time spent by the animal in open arms (Ta-
bleau 3).3).
Ce résultat suggère que dans les conditions expérimentales mises en oeuvre, le peptide a des effets This result suggests that under the experimental conditions used, the peptide has effects
sur le comportement. L'augmentation de l'activité locomo- on behavior. The increase in locomotive activity
trice observée à 2 pg peut correspondre à un état de désinhibition permettant une exploration plus intense ou à un état de faible anxiété (nervosité ou agitation non productrice). A 10 et 15 pg, la diminution significative trice observed at 2 pg can correspond to a state of disinhibition allowing a more intense exploration or to a state of low anxiety (nervousness or restlessness restless). At 10 and 15 pg, the significant decrease
du temps passé dans les bras ouverts correspond vraisem- of the time spent in open arms is probably
blablement à une effet anxiogène.frankly to an anxiety-provoking effect.
Ces modifications comportementales observées après administration in vivo de LSAL montrent fortement que les modifications moléculaires et cellulaires induites par le peptide conduisent effectivement à des These behavioral modifications observed after in vivo administration of LSAL strongly show that the molecular and cellular modifications induced by the peptide actually lead to
modifications de la fonction du système nerveux central. changes in the function of the central nervous system.
En fait, LSAL semble capable de modifier l'état d'anxiété après administration in vivo. LSAL apparaît comme un régulateur endogène, capable de moduler finement le contrôle exercé par la 5-HT sur la neurotransmission au In fact, LSAL seems capable of modifying the state of anxiety after administration in vivo. LSAL appears as an endogenous regulator, capable of finely modulating the control exerted by 5-HT on neurotransmission to
niveau du système nerveux central. Il joue vraisemblable- central nervous system level. He probably plays-
ment un rôle-clé dans les fonctions physiologiques (sommeil, thermorégulation, apprentissage et mémoire, play a key role in physiological functions (sleep, thermoregulation, learning and memory,
comportement, douleur,...), ainsi que dans des mécanis- behavior, pain, ...), as well as in mechanisms
mes physio-pathologiques (stress, anxiété, dépression, agressivité, désordres alimentaires, etc...) connus ou my known pathophysiology (stress, anxiety, depression, aggression, eating disorders, etc.) or
fortement soupçonnés pour impliquer le système sérotoni- strongly suspected to involve the serotoni-
nergique. Il devrait également jouer un rôle important dans les pathologies liées à la tension artérielle et la migraine, car des récepteurs de type 5-HT1 (5-HTl-like (probablement des 5-HTlD)) ont été localisés dans les vaisseaux de cerveau humain et dans d'autres muscles energetic. It should also play an important role in pathologies linked to blood pressure and migraine, because 5-HT1 (5-HTl-like (probably 5-HTlD)) receptors have been located in the vessels of the human brain. and in other muscles
lisses.smooth.
Il régule sans doute également la réponse immune dans la mesure o les récepteurs 5-HT1 t/D sont sans doute présents dans des tissus immunocompétents, et dans la mesure o la transmission de la 5-HT est connue pour It undoubtedly also regulates the immune response insofar as the 5-HT1 t / D receptors are undoubtedly present in immunocompetent tissues, and insofar as the transmission of 5-HT is known to
interagir avec la réponse immunitaire. interact with the immune response.
Claims (24)
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Also Published As
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