FR2711143A1 - Process for the identification of a fruit genus, species or variety; test kit, oligonucleotide and hybridisation probe for this indentification - Google Patents
Process for the identification of a fruit genus, species or variety; test kit, oligonucleotide and hybridisation probe for this indentification Download PDFInfo
- Publication number
- FR2711143A1 FR2711143A1 FR9412235A FR9412235A FR2711143A1 FR 2711143 A1 FR2711143 A1 FR 2711143A1 FR 9412235 A FR9412235 A FR 9412235A FR 9412235 A FR9412235 A FR 9412235A FR 2711143 A1 FR2711143 A1 FR 2711143A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- dna
- species
- fruit
- variety
- juice
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
La présente invention concerne un procédé d'identification de l'origine de tissus et extraits dérivés des fruits, et notamment des jus de fruits qui peuvent être sous forme liquide, purs ou dilués, des pulpes, des purées, des vins, des confitures et des yaourts, et d'autres produits des fruits destinés à la consommation humaine, et elle concerne aussi des amorceurs d'acide nucléique et des sondes destinés à etre utilisés dans ce procédé ainsi que des kits de test les contenant. The present invention relates to a process for identifying the origin of tissues and extracts derived from fruits, and in particular fruit juices which may be in liquid form, pure or diluted, pulps, purees, wines, jams and yoghurts, and other fruit products intended for human consumption, and it also relates to nucleic acid initiators and probes intended for use in this process as well as test kits containing them.
Des fraudes sur des jus de fruits constituent un problème très important, car des producteurs peu scrupuleux utilisent des matières d'altération pour accroître leur profit. Ce genre de fraude rend nécessaire des tests d'authenticité portant sur ces jus et sur les purées et pulpes de fruits utilisées pour la production des produits alimentaires, tels que les vins, les confitures et les yaourts. Il est aussi nécessaire de réaliser des tests lorsqu'on produit de jeunes plants pour la vérification de la constitution génétique des arbres et arbustes. Fraud on fruit juices is a very important problem, as unscrupulous producers use spoilage materials to increase their profit. This kind of fraud makes it necessary to carry out authenticity tests on these juices and on fruit purees and pulps used for the production of food products, such as wines, jams and yogurts. It is also necessary to perform tests when producing young plants to verify the genetic makeup of trees and shrubs.
Les problèmes varient d'un Etat à un autre. Par exemple, aux Etats-Unis d'Amérique, les produits de l'espèce citrus "Ambersweet" sont vendus comme produits sous le nom d'"oranges" mais, suivant les règlements européens, cette vente n'est pas autorisée. Les principaux revendeurs de produits à base de jus doivent donc disposer de tests d'authenticité, réalisés soit par soit eux-mêmes, soit par leurs fournisseurs. En outre, différents produits tirés des fruits relèvent de règlements d'importation différents, si bien qu'une identification de l'origine est nécessaire aux autorités douanières. The problems vary from state to state. For example, in the United States of America, citrus products "Ambersweet" are sold as products under the name "oranges" but, according to European regulations, this sale is not authorized. The main retailers of juice-based products must therefore have authenticity tests, carried out either by themselves or by their suppliers. In addition, different fruit products are subject to different import regulations, so identification of origin is necessary for customs authorities.
Les chimistes analytiques ont mis au point toute une gamme de techniques de tests, et certaines sont très sophistiquées. Par exemple, on sait caractériser une variété de tissus à l'aide d'une "empreinte génétique", au cours d'une opération dans laquelle des acides nucléiques sont isolés de la matière à analyser et soumis à une détection et une identification. Habituellement, on utilise l'une de deux techniques suivant que des séquences conser vees ou des marqueurs sont présents dans la matière soumise aux essais. On utilise en particulier des procédés à base de sondes à iu(s) ifliléi;(s) et des procédés à base de la réaction en chaîne de polymérase (PCR). Toute une gamme de sondes à acide(s) nuclêie(S) du commerce assurant la liaison des séquences conservées a e(s) r 5p(s) ont été mises au point pour la détection des organismes pathogènes bactériens. Des exemples sont les systèmes à sondes colorimétriques ("Genetrak") et à sondes génétiques chimioluminescentes ("Eugenetics") pour Salmonella et Listeria monocytogenes. L'utilisation de telles sondes pour le typage et l'identification humaine est bien documentée dans la technique des sondes génétiques. Analytical chemists have developed a variety of testing techniques, some of which are very sophisticated. For example, it is known to characterize a variety of tissues using a "genetic fingerprint", during an operation in which nucleic acids are isolated from the material to be analyzed and subjected to detection and identification. Usually, one of two techniques is used depending on whether canned sequences or markers are present in the material being tested. In particular, methods based on iil (s) probes and methods based on the polymerase chain reaction (PCR) are used. A whole range of commercial nucleic acid (S) probes ensuring the binding of conserved sequences to 5p (s) have been developed for the detection of bacterial pathogenic organisms. Examples are the colorimetric probe ("Genetrak") and chemiluminescent genetic probe ("Eugenetics") systems for Salmonella and Listeria monocytogenes. The use of such probes for human typing and identification is well documented in the technique of genetic probes.
L'amplification des séquences cibles conservées par la réaction PCR avant détection du produit PCR amplifié est une autre technologie puissante récemment mise au point et qui s'est révélée précieuse dans les sciences cliniques et légales. La portée de la technique PCR est considérable dans d'autres industries, y compris les industries de production alimentaire, agricoles et des eaux. Cette technique permet la création de quantités de séquences cibles de l'ordre du microgramme à partir de quantités de l'ordre du nanogramme en un temps de 3 à 4 h. Dans le cas d'une analyse d'éléments pathogènes microbiens, on obtient des économies considérables de temps par utilisation du procédé PCR à la place des procédés classiques de culture qui nécessitent des jours pour donner le même résultat. Amplification of the target sequences conserved by the PCR reaction before detection of the amplified PCR product is another powerful technology recently developed and which has proved invaluable in the clinical and legal sciences. The scope of PCR is considerable in other industries, including the food, agricultural and water production industries. This technique allows the creation of quantities of target sequences of the order of the microgram from quantities of the order of the nanogram in a time of 3 to 4 h. In the case of an analysis of microbial pathogens, considerable time savings are obtained by using the PCR method in place of the conventional culture methods which require days to give the same result.
Les inventeurs ont maintenant déterminé que les acides nucléiques pouvaient être isolés de toute une gamme de fruits, et en particulier des jus de fruits, c'est-àdire de fluides dérivés des fruits entiers et vendus avec ou sans autres tissus. En outre, ils ont déterminé que l'acide désoxyribonucléique (ADN) pouvait être mis sous forme de sondes ou soumis au procédé PCR de manière que la caractérisation de la source des fruits puisse être effectuée, et ils ont aussi déterminé des séquences spécifiques de sondes et d'amorceurs convenant à cette caractérisation. The inventors have now determined that nucleic acids can be isolated from a variety of fruits, and in particular fruit juices, that is, fluids derived from whole fruits and sold with or without other tissue. In addition, they determined that deoxyribonucleic acid (DNA) could be probed or subjected to the PCR process so that fruit source characterization could be performed, and they also determined specific probe sequences and initiators suitable for this characterization.
L',application de ces techniques aux jus de fruits permet une détection rapide de la fraude sans qu'il soit nécessaire de disposer d'un échantillon de tissus de fruits qui en est dérivé. The application of these techniques to fruit juices allows rapid detection of fraud without the need for a sample of fruit tissue derived therefrom.
L'invention concerne un procédé d'identification d'un genre, d'une espèce ou d'une variété d'une source de tissus de fruits ou de jus dérivés de tels tissus, comprenant (a) l'amplification de séquences d'ADN dans des acides nucléiques présents dans le tissu ou le jus à l'aide d'une réaction en chaîne de polymérase et/ou l'analyse des acides nucléiques, (b) la com- paraison de 1'ADN obtenu avec celui qui est obtenu d'un tissu ou jus de fruits d'un genre, espèce ou variété connu, et (c) la détermination de la présence des éléments d'ADN dun genre, d'espèce ou variété connu d'après la présence de tissus ou de jus dérivés de ce genre, cette espèce ou cette variété. The invention relates to a method of identifying a genus, a species or a variety of a source of fruit tissue or juice derived from such tissue, comprising (a) amplifying sequences of DNA in nucleic acids present in tissue or juice using a polymerase chain reaction and / or nucleic acid analysis, (b) the comparison of the DNA obtained with that which is obtained from a tissue or fruit juice of a known genus, species or variety, and (c) determining the presence of DNA elements of a known genus, species or variety based on the presence of tissue or juices derived from this genus, species or variety.
L'invention repose sur la détermination, par des inventeurs, du fait que, bien que les concentrations d'acide nucléique présentes dans de nombreux jus soient insuffisantes pour permettre l'application directe d'une sonde d'ADN, elles sont suffisantes pour permettre l'application des techniques à base du procédé PCR pour l'obtention d'une quantité suffisante d'ADN. En outre, ils ont constaté que cet acide nucléique était caractéristique du fruit, et que l'ADN souche n'apparaissait pas dans des échantillons de descendants en quantités qui peuvent être détectées. Les inventeurs ont en outre déterminé la séquence de plusieurs amorceurs PCR donnant des profils distincts lors de leur application à l'acide nucléique des fruits ou tissus de fruits. The invention is based on the inventors' determination that, although the nucleic acid concentrations present in many juices are insufficient to allow direct application of a DNA probe, they are sufficient to allow the application of techniques based on the PCR process to obtain a sufficient quantity of DNA. In addition, they found that this nucleic acid was characteristic of the fruit, and that the strain DNA did not appear in samples of descendants in amounts that can be detected. The inventors have also determined the sequence of several PCR initiators giving distinct profiles when they are applied to the nucleic acid of fruit or fruit tissue.
Le profil de l'ADN est obtenu de façon très avantageuse par application de la technique PCR à l'amplification des séquences d'ADN présentes dans l'ADN des fruits, si bien que des produits d'ADN caractéristiques sont obtenus et peuvent être comparés à des produits connus afin qu'ils puissent être identifiés. Par exemple, les inventeurs ont constaté, par comparaison des profils d'ADN des oranges et des pamplemousses, qui sont des fruits de même genre, qu'il existait des différences nettes et que leurs mélanges présentaient un aspect de dessin combinatoire. The DNA profile is very advantageously obtained by applying the PCR technique to the amplification of the DNA sequences present in the DNA of the fruits, so that characteristic DNA products are obtained and can be compared to known products so that they can be identified. For example, the inventors have found, by comparison of the DNA profiles of oranges and grapefruits, which are fruits of the same kind, that there are clear differences and that their mixtures have an aspect of combinatorial design.
On a constaté en particulier que l'application de l'amplification statistique d'ADN polymorphe (RAPD) à l'ADN extrait permettait la caractérisation satisfaisante des jus et tissus de fruits avec une différenciation suffisante pour permettre l'identification de l'origine des éléments constituants des mélanges. L'utilisation de la technique préférée permet une distinction facile entre différentes espèces de fruits récoltés et, avec une plus faible fréquence, entre différentes variétés de fruits, par exemple de variétés d'oranges, de pamplemousses et de pommes. Les inventeurs ont déterminé que la souche n'affectait pas le profil de l'ADN du descendant et ainsi que les gènes ne se déplaçaient pas entre les cellules, et ont ainsi démontré la fiabilité de la technique appliquée à de telles plantes à "double génome". It was found in particular that the application of the statistical amplification of polymorphic DNA (RAPD) to the extracted DNA allowed the satisfactory characterization of fruit juices and tissues with sufficient differentiation to allow the identification of the origin of the constituents of mixtures. The use of the preferred technique allows an easy distinction between different species of harvested fruit and, with less frequency, between different varieties of fruit, for example varieties of oranges, grapefruits and apples. The inventors determined that the strain did not affect the DNA profile of the progeny and thus that the genes did not move between cells, and thus demonstrated the reliability of the technique applied to such "double genome" plants. ".
Le procédé préféré de l'invention comprend une procédure d'extraction d'ADN de haute qualité d'un fruit intact ou d'un jus de fruits traité. Cette procédure comprend, pour les tissus, la congélation qui donne une matière solide qui est alors transformée mécaniquement en une poudre qui subit une extraction par un solvant capable de prélever 1'ADN. L'étape de congélation comprend une congélation suffisante du tissu dans l'azote liquide et la mise mécanique en poudre est avantageusement réalisée par broyage. L'extraction par un solvant est avantageusement réalisée par les procédés connus au bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) et/ou au phénol-chloroforme. L'utilisation de ces techniques permet l'obtention d'ADN convenant à la formation de profils pour des fruits de variétés très diverses, tels que les oranges Navel Valencia et satsuma, les pommes rouges et Granny Smith, les citrons, les limes, les pamplemousses, les bananes, les fruits du kiwi, les fruits de la passion, les papayes, les pêches, les pamplemousses, le raisin et les prunes. The preferred method of the invention includes a procedure for extracting high quality DNA from an intact fruit or processed fruit juice. This procedure involves freezing tissue which gives a solid which is then mechanically transformed into a powder which is extracted by a solvent capable of taking DNA. The freezing step comprises sufficient freezing of the tissue in liquid nitrogen and the mechanical powdering is advantageously carried out by grinding. Solvent extraction is advantageously carried out by known methods using cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) and / or phenol-chloroform. The use of these techniques allows obtaining DNA suitable for the formation of profiles for fruits of very diverse varieties, such as Navel Valencia and satsuma oranges, red apples and Granny Smith, lemons, limes, grapefruit, bananas, kiwi fruit, passion fruit, papaya, peaches, grapefruit, grapes and plums.
L'utilisation de telles techniques d'extraction donne des rendements variables d'ADN entre différents genres et espèces de fruits (voir tableau 1), mais on constate qu'elles suffisent toutes pour le procédé préféré
RAPD.The use of such extraction techniques gives variable DNA yields between different genera and species of fruit (see Table 1), but it is found that all of them are sufficient for the preferred process.
RAPD.
TABLEAU 1
Fruit Pays d'origine Rendement d'ADN ,ug/g
Pomme
Rouge France 0,14
Granny Smith France 0,98
Citron Afrique du Sud 1,71
Citron Argentine 0,54
Lime E.U.A. 3,92
Pamplemousse Afrique du Sud 1,09
Banane Antilles 0,27
Kiwi Nouvelle-Zélande 5,58
Fruit de la
passion Kenya 9,48
Papaye Brésil 4,20
Pêche Italie 2,71
Ananas Costa-Rica 49,92
Prune Angleterre 1,46
Mangue Kenya 5,50
Melon Galia Israël 7,82
Orange
Navel N1-625 Afrique du Sud 3,70
N5-J1207 Maroc 3,64
Jus Maroc 0,128/cm3
Jus conc. Maroc 6,16
Jus traité Maroc 0,094/cm3
N6-1207.1 Espagne 3,83
N6-1207.2 Espagne 1,25
L'invention concerne aussi des séquences particulières d'amorceurs qui ont été déterminées comme donnant des profils satisfaisants pour l'identification du genre, de l'espèce ou de la variété de fruits, ainsi que des séquences cibles permettant l'amplification PCR à l'extrémité 5' de séquences correspondant aux séquences d'identification n 1 à 6 suivantes
N ident. séqu. 1 : GGTCTAGAGG
2 2 : ACTCCAGTCC
3 3 : TGGAGGGCTC
4 4 : AGACGGCCCT
5 5 : GTCCCAGCAG
6 6 : TGTCGGTCGT
Ainsi, les amorceurs repérés par ces séquences peuvent varier des séquences complémentaires aux séquences cibles à l'extrémité 5' de la cible, mais permettent aussi l'hybridation à l'extrémité 3'. De telles séquences d'amorceurs comprennent les séquences ayant les numéros d'identification de séquences 7 à 12 qui suivent et sont de préférence formées de ces séquences.TABLE 1
Fruit Country of origin DNA yield, ug / g
Apple
France Red 0.14
Granny Smith France 0.98
Lemon South Africa 1.71
Argentine lemon 0.54
EUA file 3.92
Grapefruit South Africa 1.09
West Indian banana 0.27
Kiwi New Zealand 5.58
Fruit of the
passion Kenya 9.48
Papaya Brazil 4.20
Fishing Italy 2.71
Pineapple Costa Rica 49.92
Plum England 1.46
Mango Kenya 5.50
Melon Galia Israel 7.82
Orange
Navel N1-625 South Africa 3.70
N5-J1207 Morocco 3.64
Juice Morocco 0.128 / cm3
Juice conc. Morocco 6.16
Processed juice Morocco 0.094 / cm3
N6-1207.1 Spain 3.83
N6-1207.2 Spain 1.25
The invention also relates to specific initiator sequences which have been determined to give satisfactory profiles for the identification of the genus, species or variety of fruits, as well as target sequences enabling PCR amplification at 1 'end 5' of sequences corresponding to the following identification sequences 1 to 6
Ident. that is. 1: GGTCTAGAGG
2 2: ACTCCAGTCC
3 3: TGGAGGGCTC
4 4: AGACGGCCCT
5 5: GTCCCAGCAG
6 6: TGTCGGTCGT
Thus, the initiators identified by these sequences can vary from sequences complementary to the target sequences at the 5 'end of the target, but also allow hybridization at the 3' end. Such initiator sequences include the sequences having the sequence identification numbers 7 to 12 which follow and are preferably formed from these sequences.
N ident. séqu. 7 : CCTCTAGACC 8 8 : GGACTGGAGT
" 9 : GAGCCCTCCA
10 : AGGGCCGTCT
11 : CTGCTGGGAC
12 : ACGACCGACA
I1 est possible, avec ces amorceurs, de caractériser et ainsi d'identifier un grand nombre de tissus de fruits et plus précisément de jus de fruits, comme indiqué dans le tableau 2 qui suit.Ident. that is. 7: CCTCTAGACC 8 8: GGACTGGAGT
"9: GAGCCCTCCA
10: AGGGCCGTCT
11: CTGCTGGGAC
12: ACGACCGACA
It is possible, with these initiators, to characterize and thus to identify a large number of fruit tissues and more precisely fruit juices, as indicated in Table 2 which follows.
La technique préférée utilisée pour l'obtention des profils RAPD est celle qui est classique pour les techniques d'analyse PCR, c'est-à-dire comme décrit par
Mazurier et al (1990), Nucleic Acid Res. 18. 6531-6535 et
Mazurier et Werners (1992), Res. Microbiol. 14. 260-262.The preferred technique used for obtaining RAPD profiles is that which is conventional for PCR analysis techniques, that is to say as described by
Mazurier et al (1990), Nucleic Acid Res. 18. 6531-6535 and
Mazurier and Werners (1992), Res. Microbiol. 14. 260-262.
Dans un autre aspect de l'invention, celle-ci concerne des kits de test comprenant des oligonucléotides ayant des séquences complémentaires des séquences d'identification n 1 à 6 et comprenant notamment des séquences respectives d'identification n" 7 à 12, comprenant essentiellement ces dernières séquences. In another aspect of the invention, the latter relates to test kits comprising oligonucleotides having sequences complementary to identification sequences n 1 to 6 and comprising in particular respective identification sequences n "7 to 12, essentially comprising these last sequences.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne des kits de test contenant des oligonucléotides tels que décrits précédemment et ayant en outre des motifs comparatifs de fruits connus dérivés d'une ou plusieurs techniques RAPD mettant en oeuvre chacun de ces amorceurs, considérés ensemble ou séparément. In another embodiment, the invention relates to test kits containing oligonucleotides as described above and having, in addition, comparative motifs of known fruits derived from one or more RAPD techniques using each of these initiators, considered together or separately.
Les oligonucléotides décrits précédemment peuvent être utilisés comme amorceurs PCR pour une analyse RAPD des tissus et jus de fruits et peuvent être utilisés pour la formation de sondes d'hybridation d'oligonucléotides qui sont elles-mêmes utiles pour l'analyse et la caractérisation des acides nucléiques des tissus et jus de fruits par hybridation sur papier "Southern". The oligonucleotides described above can be used as PCR initiators for RAPD analysis of tissues and fruit juices and can be used for the formation of oligonucleotide hybridization probes which are themselves useful for the analysis and characterization of acids. tissue nuclei and fruit juices by hybridization on "Southern" paper.
Lors de l'utilisation comme amorceurs PCR, les oligonucléotides peuvent subir une augmentation de longueur permettant l'utilisation de conditions plus sévères d'hybridation et ainsi l'augmentation de la spécificité de la méthode. Par exemple, l'amorceur de la séquence d'identification n" 12 peut être étendu afin qu'il forme des amorceurs direct et inverse capables d'assurer la liaison de l'ADN cible dans des conditions plus sévères par addition d'une ou plusieurs bases à son extrémité 3' comme indiqué par les séquences suivantes
séquence directe d'amorceur : (les bases 1 à 10 sont celles de la séquence d'identification n" 12, l'amorceur est agrandi par addition d'un nombre voulu de bases dans l'ordre des bases 11 à 51 de la séquence qui suit) 5'-ACGACCGACA AACGATGAAA ATACTCACGG CTGTGCATAA AGACGCGCAA
TATTAGAGAA GGTGGGTTGA TTTGGATTTG GCGT-3'
séquence inverse d'amorceur : (les bases 1 à 10 sont celles de la séquence d'identification n" 12, l'amorceur est agrandi par addition d'un nombre voulu de bases dans l'ordre des bases 11 à 51 de la séquence qui suit) 5'-ACGACCGACA CCAAAACCAA AGTCAAGAAC TTCGGCGCAA TAGAGCATAC
TTCCAATGAA TTTCACATAT GATCACTA-3'
Il est manifeste pour l'homme de métier que des amorceurs constitués par exemple de 5 bases ou plus, avantageusement 10 bases ou plus et de préférence 15 bases ou plus, de ces séquences peuvent être utilisés pour l'amplification de l'ADN des oranges et pour l'obtention d'un fragment d'environ 1 kb (kilobase) caractéristique de l'espèce orange. La spécificité de ces amorceurs est accrue par augmentation de leur longueur correspondant aux séquences spécifiées. La séquence n" 12 est connue (Operon
Technologies), mais les oligonucléotides dérivés du reste de la séquence sont nouveaux.When used as PCR initiators, the oligonucleotides may undergo an increase in length allowing the use of more severe hybridization conditions and thus the increase in the specificity of the method. For example, the initiator of the identification sequence No. 12 can be extended so that it forms direct and reverse initiators capable of ensuring the binding of the target DNA under more severe conditions by the addition of one or more multiple bases at its 3 'end as shown by the following sequences
direct initiator sequence: (bases 1 to 10 are those of identification sequence No. 12, the initiator is enlarged by adding a desired number of bases in the order of bases 11 to 51 of the sequence which follows) 5'-ACGACCGACA AACGATGAAA ATACTCACGG CTGTGCATAA AGACGCGCAA
TATTAGAGAA GGTGGGTTGA TTTGGATTTG GCGT-3 '
reverse initiator sequence: (bases 1 to 10 are those of identification sequence No. 12, the initiator is enlarged by adding a desired number of bases in the order of bases 11 to 51 of the sequence which follows) 5'-ACGACCGACA CCAAAACCAA AGTCAAGAAC TTCGGCGCAA TAGAGCATAC
TTCCAATGAA TTTCACATAT GATCACTA-3 '
It is obvious to those skilled in the art that initiators consisting for example of 5 bases or more, advantageously 10 bases or more and preferably 15 bases or more, of these sequences can be used for the amplification of the DNA of oranges and for obtaining a fragment of approximately 1 kb (kilobase) characteristic of the orange species. The specificity of these initiators is increased by increasing their length corresponding to the specified sequences. The sequence no. 12 is known (Operon
Technologies), but the oligonucleotides derived from the rest of the sequence are new.
Ainsi, ces produits réalisés avec d'autres amorceurs dérivés peuvent être utilisés eux-mêmes comme sondes d'hybridation sur papier "Southern". En particulier, ces sondes comprennent des produits individuels PCR marqués de la réaction PCR des tissus dérivés du fruit à l'aide d'amorceurs PCR de la séquence décrite précédemment. Thus, these products produced with other derived initiators can themselves be used as hybridization probes on "Southern" paper. In particular, these probes comprise individual PCR products labeled with the PCR reaction of tissues derived from the fruit using PCR initiators of the sequence described above.
Un ensemble préféré de sondes à polynucléotidesoligonucléotides comprend celles qui sont dérivées par exécution d'une réaction PCR sur l'ADN dérivé du tissu hybride d'orange-pamplemousse "Ambersweet" de Floride, notamment les feuilles, à l'aide de la seule séquence d'amorceur ayant le numéro d'identification n" 12 pour déclencher l'amplification. Le polynucléotide, qui a une longueur d'environ 1 kpb (kilopaire de bases) est propre à l'espèce "Ambersweet". A preferred set of polynucleotideoligonucleotide probes includes those derived by performing a PCR reaction on DNA derived from Florida orange-grapefruit hybrid tissue, including leaves, using the single sequence initiator having the identification number "12" to trigger the amplification. The polynucleotide, which has a length of about 1 kbp (kilopair of bases) is specific to the species "Ambersweet".
Un autre polynucléotide préféré pour le marquage et l'utilisation comme sonde est un fragment "Aval/Bgl Il" qui peut être obtenu à partir de ce polynucléotide de 1 kilobase, et ayant une longueur d'environ 200 pb. Le produit préféré de 200 pb s'hybride spécifiquement avec l'acide nucléique de génome dérivé d'orange et d'"Ambersweet", mais non avec celui du pamplemousse ou d'une lime. Another preferred polynucleotide for labeling and use as a probe is a "Downstream / Bgl II" fragment which can be obtained from this 1 kilobase polynucleotide, and having a length of approximately 200 bp. The preferred 200 bp product hybridizes specifically with the orange and "Ambersweet" genome nucleic acid, but not with that of grapefruit or a lime.
Un second groupe de tels polynucléotides obtenus selon l'invention est rendu disponible par utilisation de la séquence ayant le numéro d'identification 11 pour l'amplification de 1'ADN dérivé de l'un quelconque des cultivars d'oranger indiqués dans le présent mémoire. Le produit a un fragment d'environ 1 kpb à 500 pb et peut être dérivé par utilisation de "EcoRV/Bgl II". Ni ce produit ni le fragment de 500 pb n'ont été trouvés dans l'ADN dérivé du pamplemousse ou d'une lime. D'autres polynucléotides peuvent être dérivés par clivage de ce fragment d'une manière qui est aussi spécifique de l'ADN des oranges. A second group of such polynucleotides obtained according to the invention is made available by using the sequence having the identification number 11 for the amplification of the DNA derived from any of the orange cultivars indicated in the present specification. . The product has a fragment of about 1 kbp to 500 bp and can be derived using "EcoRV / Bgl II". Neither this product nor the 500 bp fragment was found in DNA derived from grapefruit or a lime. Other polynucleotides can be derived by cleavage of this fragment in a manner which is also specific for the DNA of oranges.
Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé de production d'un polynucléotide de 200 pb selon l'invention comprenant le clonage d'un produit dérivé par le procédé PCR d'environ 1 kpb, qui peut être obtenu à l'aide de la séquence ayant le numéro d'identification 12 pour l'amplification de l'ADN d'"Ambersweet" et notamment de 1'ADN de feuille d"'Ambersweet", dans un système vectoriel, et par clivage du produit nécessaire d'environ 200 pb à partir du produit obtenu par utilisation des enzymes de restriction "Aval" et "Bgl II", puis par une étape de marquage. Le marquage est réalisé par l'un quelconque des procédés classiques d'incorporation d'un marqueur biologique, chimique ou radioactif, connu dans la technique. In another aspect, the invention relates to a method for producing a 200 bp polynucleotide according to the invention comprising the cloning of a derivative product by the PCR process of approximately 1 kbp, which can be obtained using of the sequence having the identification number 12 for the amplification of the DNA of "Ambersweet" and in particular of the leaf DNA of "Ambersweet", in a vector system, and by cleavage of the necessary product of approximately 200 bp from the product obtained by using the restriction enzymes "Downstream" and "Bgl II", then by a labeling step. The labeling is carried out by any of the conventional methods of incorporating a biological, chemical or radioactive marker, known in the art.
Le procédé, les oligonucléotides et les kits selon l'invention sont maintenant décrits à titre purement illustratif en référence aux exemples qui suivent. D'autres modes de réalisation entrant dans le cadre de l'invention sont évidents pour l'homme du métier à la lecture de ces exemples. The method, the oligonucleotides and the kits according to the invention are now described purely by way of illustration with reference to the examples which follow. Other embodiments within the scope of the invention are obvious to a person skilled in the art on reading these examples.
Exemples
Exemple 1 : procédure d'isolement de l'ADN de jus de fruits disponibles dans le commerce.Examples
Example 1: Procedure for isolating DNA from commercially available fruit juices.
Des tentatives initiales d'isolement de 1'ADN de 100 cm3 de jus de fruits du commerce ont été réalisées, mais les valeurs de la densité optique (à 260 nm) étaient négatives et aucunes bandes de 1'ADN du génome n'ont pu être visualisées après électrophorèse sur gel de gélose. On a alors essayé un isolement à l'aide de 400 cm3 de jus de fruits, et on a obtenu des valeurs positives de la densité optique, mais 1'ADN du génome n'a pas pu être observé après électrophorèse sur gel. Les produits obtenus par la technique PCR ont été tels que, bien que 1'ADN n'ait pas pu être observé sur les gels de gélose, la quantité disponible était suffisante pour l'amplification. Une telle condition de volume dépend évidemment de l'origine et du traitement antérieur du jus. Initial attempts to isolate DNA from 100 cm3 of commercial fruit juice were made, but the optical density values (at 260 nm) were negative and no DNA genome bands could be visualized after agar gel electrophoresis. Isolation was then attempted using 400 cc of fruit juice, and positive optical density values were obtained, but the genome DNA could not be observed after gel electrophoresis. The products obtained by the PCR technique were such that, although the DNA could not be observed on the agar gels, the quantity available was sufficient for amplification. Such a volume condition obviously depends on the origin and previous treatment of the juice.
3
Le pH de 400 cm de jus de fruits du commerce a été ajusté à 7,0 avec de l'hydroxyde de sodium 8,33N, et le jus a été centrifugé à 10 000 g pour l'obtention d'une phase solide et d'une phase qui surnage, et les deux phases ont été séparées. L'ADN a été isolé de la phase qui surnage par addition d'acétate d'ammonium 3M et d'isopropanol destinés à provoquer la précipitation. La centrifugation à 10 000 g a donné un culot d'ADN précipité qui a été traité par une solution d'un détergent cationique (bromure de cétyltri méthylammonium, CTAB) à une concentration de 0,8 % en poids/volume afin que la contamination par les polysaccharides soit réduite et que l'inhibition des enzymes impliquées lors des procédures de clonage soit évitée. On a ajouté du chloroforme à l'ADN traité, et on a centrifugé le mélange qui s'est séparé en deux phases. La phase aqueuse contenant 1'ADN a été retirée et 1'ADN a été précipité par de l'isopropanol. On a obtenu un culot d'ADN par centrifu- gation et ce culot a été remis en suspension dans un milieu
TE (Tris-HCl, Na2EDTA).3
The pH of 400 cm of commercial fruit juice was adjusted to 7.0 with 8.33N sodium hydroxide, and the juice was centrifuged at 10,000 g to obtain a solid phase and d 'one phase which floats, and the two phases have been separated. DNA was isolated from the supernatant phase by the addition of 3M ammonium acetate and isopropanol intended to cause precipitation. Centrifugation at 10,000 g gave a precipitated DNA pellet which was treated with a solution of a cationic detergent (cetyltri methylammonium bromide, CTAB) at a concentration of 0.8% w / v so that contamination by the polysaccharides is reduced and the inhibition of the enzymes involved in the cloning procedures is avoided. Chloroform was added to the treated DNA, and the mixture, which separated into two phases, was centrifuged. The aqueous phase containing the DNA was removed and the DNA was precipitated with isopropanol. A DNA pellet was obtained by centrifugation and this pellet was resuspended in medium.
TE (Tris-HCl, Na2EDTA).
On a utilisé un traitement au phénol et chloroforme pour dénaturer les protéines éventuellement présentes qui ont formé une couche à l'interface des phases organique et aqueuse, et l'opération a été répétée jusqu'à ce qu'il ne reste plus de protéines à l'interface. On a effectué un traitement "Sevag" (chloroforme/alcool isoamylique) par addition d'alcool isoamylique destiné à empêcher le moussage du mélange lors du tourbillonnement ultérieur destiné à faciliter la séparation des deux phases. On a retiré l'acide ribonucléique ARN à l'aide de
ARNse, puis on a effectué une extraction au phénol chloroforme et "Sevag", comme précédemment, on a précipité 1'ADN avec de l'isopropanol et de l'acétate d'ammonium 3N, on a fait subir une centrifugation au culot d'ADN, et on a lavé le culot résultant avec de l'éthanol à 70 %. Le culot final a subi un séchage sous vide et une remise en suspension dans de l'eau distillée stérile.A phenol and chloroform treatment was used to denature the proteins which may have been present, which formed a layer at the interface of the organic and aqueous phases, and the operation was repeated until no proteins remained. the interface. A "Sevag" treatment (chloroform / isoamyl alcohol) was carried out by adding isoamyl alcohol intended to prevent foaming of the mixture during the subsequent swirling intended to facilitate the separation of the two phases. RNA ribonucleic acid was removed using
RNAse, then phenol chloroform and "Sevag" extraction was carried out, as before, the DNA was precipitated with isopropanol and 3N ammonium acetate, and the pellet was centrifuged. DNA, and the resulting pellet was washed with 70% ethanol. The final pellet was vacuum dried and resuspended in sterile distilled water.
Exemple 2 : extraction d'ADN d'un tissu de fruits
30 g de 'tissu de fruits ont été congelés dans l'azote liquide et broyés sous forme d'une poudre pour l'extraction de l'ADN. On a ajouté un tampon d'extraction "TES" (Tris-HCl,
Na2EDTA et SDS) à la matière qui s'est décongelée pour provoquer la destruction des cellules, si bien qu'on a obtenu une activité réduite de nucléase. On a ajouté des agents réducteurs PAH (hydrate de phénanthroline) 1M et
DTT (dithiotreitol) 1M pour inactiver les protéines, et on a ajouté du phénol pour provoquer leur dénaturation. On a soumis le mélange à une centrifugation et on a traité la phase aqueuse résultante de la même manière que la phase aqueuse "qui surnage',produite après le traitement initial par NaOH de l'exemple 1.EXAMPLE 2 Extraction of DNA from a Fruit Tissue
30 g of the fruit tissue were frozen in liquid nitrogen and ground into a powder for the extraction of DNA. "TES" extraction buffer (Tris-HCl,
Na2EDTA and SDS) to the material that thawed to cause cell destruction, resulting in reduced nuclease activity. 1M PAH (phenanthroline hydrate) reducing agents were added and
1M DTT (dithiotreitol) to inactivate proteins, and phenol was added to cause their denaturation. The mixture was subjected to centrifugation and the resulting aqueous phase was treated in the same manner as the "floating" aqueous phase produced after the initial NaOH treatment of Example 1.
Exemple 3 : analyse RAPD de l'ADN dérivé de tissus et jus de fruits
La technique RADP a été mise en oeuvre avec six amorceurs de ADN comprenant les séquences de numéros d'identification 7 à 12 respectivement (Operon
Technologies) avec des amplifications séparées, les amorceurs agissant aux deux extrémités de l'ADN cible à analyser. Les amplifications ont été réalisées dans un volume
3 total de 25 mm contenant
2,5 mm3 d'un tampon x10 (dépourvu de Mg+)
3
0,1 mm de mélange dNTP (100 mM chacun)
2,0 mm3 de MgCi2 25 mM
3
5,0 mm d'un seul des amorceurs d'oligonucléotides
à 10 bases (3 ng/mm ) 3 3
2,5 mm d'ADN de matrice de génome (10 ng
0,2 mm de Taq ADN polymérase (1 unité)
3
12,7 mm d'eau distillée stérile. Example 3 RAPD Analysis of DNA Derived from Tissues and Fruit Juices
The RADP technique was implemented with six DNA initiators comprising the sequences of identification numbers 7 to 12 respectively (Operon
Technologies) with separate amplifications, the initiators acting at both ends of the target DNA to be analyzed. Amplifications were carried out in a volume
3 total of 25 mm container
2.5 mm3 of a x10 buffer (devoid of Mg +)
3
0.1 mm dNTP mixture (100 mM each)
2.0 mm3 of 25 mM MgCi2
3
5.0 mm from a single oligonucleotide initiator
at 10 bases (3 ng / mm) 3 3
2.5 mm genome template DNA (10 ng
0.2 mm Taq DNA polymerase (1 unit)
3
12.7 mm sterile distilled water.
A l'exception de la matrice de génome, de l'amorceur et de Taq ADN polymérase, toutes les matières précédentes constituent la solution tampon de base préparée en volume et conservée à -20 "C. Toutes les amplifications ont été réalisées avec un appareil de commande de cycle thermique "Perkin-Elmer" avec le programme suivant de température
1 cycle comprenant 3 min à 94 "C
1 min à 36 "C
2 min à 72 "C
44 cycles comprenant 1 min à 94 "C
1 min à 36 "C
2 min à 72 "C
1 cycle final comprenant 10 min à 72 "C
999 min à 18 "C
On a analysé les produits d'amplification par électrophorèse sur gel de gélose à 1,4 % à 150 V (tension constante) pendant 2 h et à l'aide de bromure d'éthidiumde coloration pour la visualisation des profils obtenus.With the exception of the genome matrix, the initiator and Taq DNA polymerase, all the above materials constitute the basic buffer solution prepared in volume and stored at -20 "C. All the amplifications were carried out with an apparatus "Perkin-Elmer" thermal cycle control with the following temperature program
1 cycle including 3 min at 94 "C
1 min at 36 "C
2 min at 72 "C
44 cycles including 1 min at 94 "C
1 min at 36 "C
2 min at 72 "C
1 final cycle including 10 min at 72 "C
999 min at 18 "C
The amplification products were analyzed by electrophoresis on 1.4% agar gel at 150 V (constant voltage) for 2 h and using staining ethidium bromide to visualize the profiles obtained.
On a utilisé une série de tissus et de jus de fruits pour la mise en oeuvre des techniques PCR en présence de chacun des amorceurs d'oligonucléotides séparés décrits précédemment, avec des séquences constituées de celles qui ont les numéros d'identification 7 à 12. A series of tissues and fruit juices were used for the implementation of the PCR techniques in the presence of each of the separate oligonucleotide initiators described above, with sequences made up of those which have the identification numbers 7 to 12.
Les combinaisons d'amorceurs et d'ADN ont donné soit aucun produit (NP), soit des profils de produits analogues (+) pour tous les ADN testés, soit des profils distincts de produits (-). Les résultats de ces techniques
PCR figurent dans le tableau 2 qui suit. Les espaces indiquent que l'amorceur particulier n'a pas été appliqué.The combinations of initiators and DNA gave either no product (NP), or analogous product profiles (+) for all the DNAs tested, or distinct product profiles (-). The results of these techniques
PCR are shown in Table 2 below. The spaces indicate that the particular initiator has not been applied.
Ainsi, les compositions donnant le résultat (-) conviennent pour l'identification de 1'ADN spécifique et ainsi du tissu-jus de fruits particulier dans une application RAPD. Thus, the compositions giving the result (-) are suitable for the identification of the specific DNA and thus of the tissue-particular fruit juice in a RAPD application.
TABLEAU 2 N" ident. séq. amorceur 7 8 9 10
FRUIT
Pomme rouge NP
Granny Smith
Citron d'Afrique du Sud NP +
Citron d'Argentine NP
Lime
Pamplemousse NP +
Banane
Orange Valencia V3-805 - +
Navel N5-1207 + +
" N5-PJ1207 + +
Jus traité
Navel N5-J1207 +
Jus
Navel N5-CJ1207 + +
Jus concentré
En plus de ces résultats, l'amorceur d'oligonucléotides ayant la séquence de numéro d'identification 10 a été appliqué aux techniques PCR sur des tissus d'un certain nombre de variétés d'oranges Navel Valencia et satsuma.TABLE 2 N ° initiator sequence 7 8 9 10
FRUIT
Red apple NP
Granny smith
South African Lemon NP +
Argentine Lemon NP
Lime
NP + Grapefruit
Banana
Orange Valencia V3-805 - +
Navel N5-1207 ++
"N5-PJ1207 ++
Processed juice
Navel N5-J1207 +
Juice
Navel N5-CJ1207 ++
Concentrated juice
In addition to these results, the oligonucleotide initiator having the sequence of identification number 10 was applied to PCR techniques on tissues of a number of varieties of Navel Valencia and satsuma oranges.
Tous les résultats, sauf pour l'accession N2-625, ont donné le même profil par les accessions suivantes : N1-625,
N2-625, N3-805, N3-625, N4-805, N5-1207, N6-1207-1,
N6-1207-2, V1-625, V2-805, V3-805, V4-1016, V5-805,
V6-1016, V7-1016, VL-1207, S1-1207.All the results, except for accession N2-625, gave the same profile by the following accessions: N1-625,
N2-625, N3-805, N3-625, N4-805, N5-1207, N6-1207-1,
N6-1207-2, V1-625, V2-805, V3-805, V4-1016, V5-805,
V6-1016, V7-1016, VL-1207, S1-1207.
On a noté que tous les échantillons de tissus et de jus pouvaient donner un profil par utilisation de l'un ou l'autre des amorceurs utilisés. Certains amorceurs ont donné des profils semblables à des espèces voisines, par exemple les séquences ayant les numéros d'identification 8 et 9. Des différences ont pu être déterminées entre des accessions différentes d'oranges Navel et entre des pommes rouges et Granny Smith, comme indiqué par la séquence ayant le numéro d'identification 7. It was noted that all tissue and juice samples could give a profile by using either of the initiators used. Some initiators have given similar profiles to neighboring species, for example the sequences having the identification numbers 8 and 9. Differences could be determined between different accessions of Navel oranges and between red apples and Granny Smith, as indicated by the sequence with the identification number 7.
Les amorceurs ayant les séquences de numéros d'iden- tification 11 et 12 ont été particulièrement utiles pour la distinction de l'espèce orange des autres fruits ou de l'orange "Ambersweet", et d'hybrides de pamplemousse des variétés d'oranges. The initiators having the sequences of identification numbers 11 and 12 were particularly useful for distinguishing the orange species from other fruits or from the orange "Ambersweet", and grapefruit hybrids from the orange varieties .
Exemple 4 : préparation d'une sonde d'oligonucléotides capable de distinguer les oranges
Un amorceur de séquence d'ADN de numéro d'identification 12 a été utilisé pour l'amplification d'un fragment d'ADN de feuilles d'"Ambersweet" dérivé d'ADN de génome à l'aide de la technique PCR, ce fragment de produit ayant une longueur d'environ 1 kb . Le produit a subi une nouvelle amplification en 16 cycles et a été analysé sur gel de gélose, et une bande polymorphe de 1 kb a été découpée et purifiée à l'aide du kit "Geneclean Kit" (Bio 101 Inc.,
E.U.A.). La quantité d'ADN produite a alors été déterminée.Example 4: Preparation of an oligonucleotide probe capable of distinguishing oranges
A DNA sequence initiator of identification number 12 was used for the amplification of a DNA fragment from leaves of "Ambersweet" derived from genome DNA using the PCR technique. product fragment having a length of approximately 1 kb. The product underwent further amplification in 16 cycles and was analyzed on agar gel, and a 1 kb polymorphic band was cut and purified using the "Geneclean Kit" (Bio 101 Inc.,
USA). The amount of DNA produced was then determined.
Le fragment de 1 kb a été cloné dans un système vectoriel de plasmide pGEM-T ("Promega") et des digestions d'enzymes à simple et double restriction ont été établies pour la localisation relative des sites d'enzymes présents dans le vecteur. Les enzymes choisies "Aval" et "Bgl Il" n'affectaient pas les sites natifs du vecteur. Le produit d'oligonucléotides de fragment "Aval/Bgl Il" d'environ 200kpb a été extrait du reste de la matière, purifié et marqué pour être utilisé comme sonde par les procédés classiques. On a constaté, par utilisation de l'analyse par hybridation/transfert "Southern", que cette sonde permettait l'hybridation de 1'ADN de génome d'orange, mais non de pamplemousse ou de lime.The 1 kb fragment was cloned into a vector system of plasmid pGEM-T ("Promega") and single and double restriction enzyme digests were established for the relative localization of the enzyme sites present in the vector. The enzymes chosen "Downstream" and "Bgl II" did not affect the native sites of the vector. The oligonucleotide product of "Downstream / Bgl II" fragment of about 200 kbp was extracted from the rest of the material, purified and labeled for use as a probe by conventional methods. It has been found, by using the Southern hybridization / transfer analysis, that this probe allows the hybridization of DNA from the orange genome, but not from grapefruit or lime.
Exemple 5 : utilisation de la technique RAPD pour la distinction entre des raisins
Le procédé de l'exemple 3 a été répété à la fois sur des variétés de raisins noirs et blancs à l'aide d'un certain nombre d'amorceurs, y compris ceux des séquences ayant les numéros d'identification 9, 10 et 17. Example 5: Use of the RAPD technique to distinguish between grapes
The process of Example 3 was repeated on both varieties of black and white grapes using a number of initiators, including those of the sequences having the identification numbers 9, 10 and 17 .
L'utilisation d'un amorceur de numéro d'identification 9 a donné des diagrammes RAPD identiques pour les deux variétés alors qu'un amorceur de numéro d'identification 12 a donné des diagrammes différents pour les raisins noirs et blancs et un amorceur de numéro d'identification 10 a donné des bandes uniquement avec les raisins noirs.The use of an initiator with identification number 9 gave identical RAPD diagrams for the two varieties while a initiator with identification number 12 gave different diagrams for black and white grapes and an initiator for number identification 10 gave bands only with black grapes.
Exemple 6 : utilisation de la technique RAPD pour la distinction d'un hybride interspécifique "Sweetie" de pamplemousse
L'amorceur ayant le numéro d'identification 8 a été utilisé pour la production de diagrammes d'ADN RAPD à partir d'échantillons d'ADN d'un hybride interspécifique "Sweetie" et de pamplemousse. Plusieurs bandes ont été produites avec 1'ADN de "Sweetie" et n'ont pas apparu avec 1'ADN de pamplemousse sous forme d'une matrice.Example 6: Use of the RAPD technique for the distinction of an interspecific hybrid "Sweetie" of grapefruit
The initiator having the identification number 8 was used for the production of RAPD DNA diagrams from DNA samples of an interspecific hybrid "Sweetie" and grapefruit. Several bands were produced with "Sweetie" DNA and did not appear with grapefruit DNA as a template.
Il est bien entendu que l'invention n'a été décrite et revendiquée qu'à titre d'exemple préférentiel et qu'on pourra apporter toute équivalence dans ses éléments constitutifs sans pour autant sortir de son cadre. It is understood that the invention has only been described and claimed as a preferred example and that it is possible to provide any equivalence in its constituent elements without going beyond its ambit.
Claims (18)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB939321113A GB9321113D0 (en) | 1993-10-13 | 1993-10-13 | Government of the united kingdom of great britain and northern ireland identification of fruit juice components |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR2711143A1 true FR2711143A1 (en) | 1995-04-21 |
FR2711143B1 FR2711143B1 (en) | 1996-05-31 |
Family
ID=10743475
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR9412235A Expired - Fee Related FR2711143B1 (en) | 1993-10-13 | 1994-10-13 | Method for identifying a genus, a species or a variety of fruit; test kit, oligonucleotide and hybridization probe for this identification. |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
FR (1) | FR2711143B1 (en) |
GB (1) | GB9321113D0 (en) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990006375A1 (en) * | 1988-12-02 | 1990-06-14 | The British Petroleum Company Plc | Method of identifying dna sequences in chromosomes of plants |
EP0395398A2 (en) * | 1989-04-27 | 1990-10-31 | Life Technologies Inc. | Amplification of nucleic acid sequences using random sequence oligonucleotides as primers |
WO1992007095A1 (en) * | 1990-10-15 | 1992-04-30 | Stratagene | Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes |
WO1992011372A1 (en) * | 1990-12-20 | 1992-07-09 | Imperial Chemical Industries Plc | Plant dna |
WO1992013956A1 (en) * | 1991-02-08 | 1992-08-20 | Plant Genetic Systems, N.V. | Stamen-specific promoters from rice |
WO1993003758A1 (en) * | 1991-08-23 | 1993-03-04 | Scios Nova Inc. | Production of homogeneous neurotrophic factor |
-
1993
- 1993-10-13 GB GB939321113A patent/GB9321113D0/en active Pending
-
1994
- 1994-10-13 FR FR9412235A patent/FR2711143B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990006375A1 (en) * | 1988-12-02 | 1990-06-14 | The British Petroleum Company Plc | Method of identifying dna sequences in chromosomes of plants |
EP0395398A2 (en) * | 1989-04-27 | 1990-10-31 | Life Technologies Inc. | Amplification of nucleic acid sequences using random sequence oligonucleotides as primers |
WO1992007095A1 (en) * | 1990-10-15 | 1992-04-30 | Stratagene | Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes |
WO1992011372A1 (en) * | 1990-12-20 | 1992-07-09 | Imperial Chemical Industries Plc | Plant dna |
WO1992013956A1 (en) * | 1991-02-08 | 1992-08-20 | Plant Genetic Systems, N.V. | Stamen-specific promoters from rice |
WO1993003758A1 (en) * | 1991-08-23 | 1993-03-04 | Scios Nova Inc. | Production of homogeneous neurotrophic factor |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MÖLLER, E. ET AL.: "a simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi, fruit bodies and infected plants.", NUCLEIC ACIDS RESEARCH., vol. 20, no. 22, 25 November 1992 (1992-11-25), ARLINGTON, VIRGINIA US, pages 6115- - 16 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2711143B1 (en) | 1996-05-31 |
GB9321113D0 (en) | 1993-12-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Gibb et al. | Studies on sweet potato little-leaf phytoplasma detected in sweet potato and other plant species growing in Northern Australia | |
Cheng et al. | Development of a DNA marker for V m, a gene conferring resistance to apple scab | |
Golan-Goldhirsh et al. | Genetic relationships among Mediterranean Pistacia species evaluated by RAPD and AFLP markers | |
Inan et al. | Efficacy of ISSR and SRAP techniques for molecular characterization of some Cucurbita genotypes including naked (hull-less) seed pumpkin | |
WO1987005907A1 (en) | Oligonucleotidic probes and methods for the detection of bacterial and other living beings by hybridization of nucleic acids | |
Grando et al. | RAPD markers in wild and cultivated Vitis vinifera | |
CA2581347A1 (en) | Universal primers and their use for detecting and identifying plant materials in complex mixtures | |
Antonius-Klemola | Molecular markers in Rubus (Rosaceae) research and breeding | |
Yamamoto et al. | DNA profiling of fresh and processed fruits in pear | |
Stella Grando et al. | Characterization of Vitis germplasm using random amplified polymorphic DNA markers | |
RUWAIDA et al. | Variability analysis of Sukun durian plant (Durio zibethinus) based on RAPD marker | |
FR2694768A1 (en) | Oligonucleotide sequences for the specific detection of mollicutes by amplification of conserved genes. | |
KR101271822B1 (en) | Primer sets for distinguishing persimmon cultivars | |
CN110607391A (en) | Molecular marker closely linked with character control of Indian pumpkin red fruit peel, primer and application | |
El Sheikha | Molecular Techniques and Lactic Acid‐Fermented Fruits and Vegetables | |
FR2711143A1 (en) | Process for the identification of a fruit genus, species or variety; test kit, oligonucleotide and hybridisation probe for this indentification | |
CN113403417B (en) | SSR molecular marker AerM01 for sex identification of actinidia arguta and application thereof | |
GB2283568A (en) | Identification of the origin of fruit or fruit juice | |
Shehzadi et al. | MORPHOLOGICAL, BIOCHEMICAL AND GENETIC CHARACTERIZATION OF CITRUS CANKER PATHOGEN (XANTHOMONASAXONOPODIS) FROM CITRUS CULTIVARS OF PUNJAB, PAKISTAN. | |
WO2002101090A2 (en) | Method for determining the existence of animal or vegetable mixtures in organic substrates | |
Jankar et al. | Molecular characterization of Alternaria alternata causing fruit rot of chilli through RAPD marker | |
Zhu et al. | RAPD markers useful for the identification of the'Annurca'apple variety and its sport'Rossa del Sud' | |
Gichuru | Characterization of genetic resistance to Coffee Berry Disease (Colletotrichum kahawae Waller and Bridge) in Arabica coffee (Coffea arabica L.) that is introgressed from Coffea canephora Pierre | |
CN113755635B (en) | Specific nucleotide sequence of myxoplasma, labeled primer and identification method | |
KR19980082207A (en) | Multi-Range DNA Markers for Genotyping of Species |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
CL | Concession to grant licences | ||
ST | Notification of lapse |