FR2706907A1 - Beta-glucosidase, microorganism producing it and process for obtaining it - Google Patents

Abstract

Bêta-glucosidase thermostable et thermophile susceptible d'être activée par le glucose. Cet enzyme présente avantageusement une masse de l'ordre de 130 kD et une activité optimale à un pH d'environ 4,3. Il est produit par une souche appartenant au règne des Archaebactéries et peut être utilisé pour la dégradation de la cellulose ou la synthèse d'oligoglycosaccharides.

Description

La présente invention a pour objet une bêta-glucosidase

ainsi que le microorganisme la produisant.

Elle est en outre relative à un procédé d'obtention de

cet enzyme.

Les P-glucosidases hydrolysent les liaisons glucosidiques engageant un D-glucose par son résidu hydroxyle situé en position 1 et en configuration p. Le groupement fixé sur ce résidu glucose est appelé partie aglycone de la molécule. Il peut être une autre molécule de glucose ou un groupement alkyle ou aryle. Les P-glucosidases ne sont pas spécifiques d'un résidu particulier, cependant, les propriétés cinétiques des enzymes varient avec la nature de ce groupement. Bien souvent les P-glucosidases n'ont pas une activité exclusive sur les glucosides et il arrive que d'autres activités glycosidases soient associées. Celles-ci sont alors portées soit par le même site actif soit par des sites

différents sur la molécule. C'est le cas de l'activité 6-

galactosidase ( EC 3.2.1.23) comme l'ont montré Grover et al.

(1977 - Biochim. Biophys. Acta, 482, 98-124) pour la P-

glucosidase d'émulsine d'amande, ainsi que Aït et al. (1982-

J. Gen. Microbiol, 128,569-577) pour la P-glucosidase de Clostridium thermocellum. Une activité 3-xylosidase ( EC

3.2.1.37) peut également se trouver associée à l'activité A-

glucosidase ( Ishihara et Shimizu, 1983 - Mokusai Gakkaishi,

29(4), 315-323; De Gussen et al., 1978 Biochim. Biophys.

Acta, 525, 142-153; Uziie et al., 1985 Agric. Biol. Chem.,

49(4), 1167-1173).

Les applications des P-glucosidases sont: - l'hydrolyse du cellobiose en glucose dans l'industrie de la dégradation de la cellulose, - dans l'industrie laitière, si elle est associée à une activité 3galactosidase, l'hydrolyse du lactose, - dans la synthèse d'oligosaccharides intéressants les

industries agro-alimentaires, pharmaceutiques et cosmétiques.

Dans la littérature, plusieurs P-glucosidases ont été décrites. Quatre d'entre elles ont particulièrement été étudiées: celle de l'émulsine d'amande, non thermostable, mais très étudiée et celles de Thermus sp., de Sulfolobus solfataricus et de Pyrococcus furiosus, toutes trois

thermostables.

L'émulsine d'amande contient trois P-glucosidases, chacune associée à une activité P-galactosidase mais dans des

rapports différents (Grover et al., 1977 Biochim. Biophys.

Acta, 482, 98-108).

L'une de ces isoenzymes a été particulièrement étudiée.

Le rapport d'activité P-glucosidase: P-galactosidase de cet isoenzyme est de 1:3,33 et les deux activités dépendent de deux sites catalytiques différents selon Grover et Cushley (1977 Biochim. Biophys. Acta, 482, 109-124). Heyworth et Walker ( 1962, Biochem. J., 83; 331-335), puis Walker et Axelrod ( 1978 Arch. Biochem. Biophys., 187 (1), 102-107),

ont montré que cet enzyme présente également une activité P-

fucosidase ce qu'ont confirmé Kiss et al. ( 1981, Biochem. Biophys.Res. Comm., 98(3), 792-799) qui ont mis en outre en évidence une activité Pxylosidase. D'après ces auteurs, l'enzyme n'aurait qu'un seul site catalytique pour les activités enzymatiques 3-glucosidase et Pgalactosidase mais deux sites de fixation de substrat. Dale et al. (1985,Biochem., 24, 3530-3539) ont examiné de nombreux inhibiteurs réversibles de cet enzyme: sucres, dérivés sucrés, amines et phénols afin de déterminer son mécanisme catalytique. L'inconvénient majeur de cet enzyme est qu'il n'est pas

thermostable.

Takase et Horikjoshi ( 1988, Appl. Microbiol.

Biotechnol., 29, 55-60; 1989 Agric. Biol. Chem., 53(2), 559-

560) ont étudié l'activité P-glucosidase d'une espèce de bactérie thermophile appartenant au genre Thermus. La production de cet enzyme est stimulée par le cellobiose et le laminaribiose constitué de deux glucoses liés en P-1,3. La caractérisation de l'enzyme partiellement purifiée a montré qu'elle hydrolyse les glucoses liés en 3-1,4(cellobiose), P1,3(laminaribiose) et en J-1,6(gentiobiose) ainsi que le lactose ( galactose P-1,4 glucose). Elle n'a pas d'activité

sur le maltose ( glucose a-1,4 glucose).

La A-galactosidase de S. solfataricus a été décrite par Buonocore et al. ( 1980, J. Appl. Biochem., 2, 390-397), purifiée et étudiée par Pisani et al. (1990, Eur. J. Biochem.,734, 1-8), et Rossi et al. (1991, " Life under extreme conditions Biochemical adaptation " Springer Verlag, Ed. par G.di Prisco, 115-123). Une activité 3-glucosidase lui est associée. Cet enzyme a été immobilisé pour l'hydrolyse du lactose à 70'C ( Buonocore et al. 1980, J. Appl. Biochem., 2,

390-397); De Rosa et al., 1980, Biotechnol. Lett., 2(1), 29-

34). Grogen ( 1991 Arch. Microbiol., 154, 594-599) a mis en évidence d'autres activités P-glucosidases associées à la

protéine.

L'étude de l'hydrolyse du pNPGal(para-nitrophényl-p-

galactopyranoside) par Pulvin et al. (1990,Biochem. Biophys.

Acta, 1041, 97-100) a montré que les effets inhibiteurs ou activateurs de la concentration en substrat varient avec la température et que les cinétiques ne suivent pas la loi de Michaelis-Menten. Cet enzyme est inhibé par excès de substrat

aux températures faibles et activé aux températures élevées.

La P-glucosidase de Pyrococcus furiosus a été isolée par Kengen et al. (1992 Science et Technologie, Actes du colloque de Reykjavik 23-26 Août 1992, p.27; 1993, Eur. J. Biochem., 213, 305-312). La production par P.furiosus est inductible par le cellobiose. Elle est intracellulaire et représente 5% des protéines cellulaires. Elle a été purifiée

et notamment isolée d'une a-glucosidase et d'une B-

mannosidase. Cette protéine est la plus thermostable des E-

glucosidases décrites à l'heure actuelle.

D'autres glucosidases ont d'autre part été sommairement

décrites dans des comptes-rendus de Congrès.

Ainsi, Alayse-Danet (6th Deep Sea Biology Symposium, Copenhague, 1991) mentionnent qu'une activité P-glucosidase a

été détectée dans 37 souches isolées dans des fosses marines.

Ladrat (Congrès de Baltimore, 13-16 Octobre 1991) mentionne l'existence d'une P-glucosidase thermostable isolée

à partir d'un microorganisme thermophile. Selon ce compte-

rendu, l'enzyme aurait une activité maximale à pH 7,5 et à une température supérieure à 90'C. L'analyse par électrophorèse révèle une seule et unique bande présentant une

activité et ayant un poids moléculaire proche de 100 kD.

En Août 1992, le même auteur rapporte à la Conférence Internationale de Reykjavik en Islande ( "Thermophiles: Science et Technology " 23-26 Août 1992) que l'enzyme a été partiellement purifié par une succession de trois colonnes de chromatographie: une chromatographie d'affinité, une chromatographie sur hydroxylapatite et une chromatofocalisation. Outre ces quelques résultats, ces documents ne mentionnent pas d'autres caractéristiques permettant

d'identifier l'enzyme.

Il ressort de l'analyse de l'état de la technique qu'un nombre limité de P-glucosidases présentant une bonne

thermostabilité a été isolé et caractérisé.

Les 6-glucosidases ont une large gamme d'utilisations potentielles dans diverses industries et en particulier dans les industries de dégradation de la cellulose et de production

de glucose.

Cependant, la dégradation de la cellulose se fait à des températures importantes et nécessite ainsi des enzymes thermostables. De plus, une inhibition de ces enzymes par le glucose est un inconvénient dans le cadre de cette utilisation. En effet, la cellulose est hydrolysée en glucose à l'aide de plusieurs enzymes: l'endoglucanase et l'exocellobiohydrolase qui hydrolysent la cellulose en cellobiose puis des P-glucosidases qui dégradent le cellobiose en glucose. L'inhibition de la P-glucosidase par le glucose entraîne une accumulation de cellobiose qui inhibe les autres

enzymes du complexe cellulolytique.

Il existait donc un besoin que le demandeur s'est attaché à combler en recherchant un enzyme presentant une stabilité importante à haute température, une absence d'inhibition ou une inhibition moindre par les produits de

dégradation ainsi qu'un large spectre d'action.

Le demandeur a trouvé de manière surprenante qu'un enzyme, produit par une souche de microorganisme thermophile,

répondait à ces critères.

Il a d'autre part montré que cet enzyme pouvait être

produit par ce microorganisme.

La présente invention a donc pour objet une A-

glucosidase thermostable caractérisée en ce qu'elle est

susceptible d'être activée par le glucose.

Un tel enzyme a avantageusement un poids moléculaire de kD et peut se présenter sous la forme d'un dimère de deux sous-unités, chacune d'elle ayant une masse de l'ordre de 60

kD.

Avantageusement, une telle 3-glucosidase présente un

point isoélectrique de l'ordre de 4,3.

Outre le glucose elle peut être activée de manière séparée par le galactose, le sorbitol ou le glycérol, ainsi

que par l'ion Li+.

Elle peut aussi être inhibée par l'action séparée de NaCl, de l'acide éthylène diamine tétraacétique ( EDTA), de l'ion Fe3+ de l'ion Sn2+ et de l'ion Cu2+

Cet enzyme dégrade préférentiellement les liaisons /-

1-3, P-1-2, P-1-4 et 1-1-6.

Il peut présenter outre son activité 6-glucosidase,

des activités P-galactosidase, P-fucosidase et a-glucosidase.

La présente invention a d'autre part pour objet un microorganisme produisant cette P-glucosidase, et plus particulièrement un microorganisme appartenant au règne des Archaebactéries. Préférentiellement, un tel microorganisme est la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Culture

des Microorganismes sous le n I- 1318.

La souche 1-1318 a été obtenue à partir de sédiments prélevés dans le bassin Nord-Fidjien dans le sud du Pacifique occidental. L'observation en microscopie électronique à balayage révèle des sphères irrégulières de 0,5 à 1,2 pm de diamètre qui sont isolées, en paires ou en agrégats de plus de vingt cellules. Aucun flagelle ni pili n'a été observé; aucune mobilité n'a été visualisée sur des états frais au microscope optique. L'analyse lipidique de la membrane cellulaire a révélé entre autre la présence de tétraéthers (95 %) et de diéthers (5%). Résistante en outre aux antibiotiques tels que la vancomycine, la pénicilline, la kanamycine, la streptomycine, la rifampicine et le chloramphénicol, cette souche fait partie du règne des Archaebactéries. Elle est anaérobie stricte, chimioorganohétérotrophe et elle réduit le soufre élémentaire

qui est le meilleur accepteur d'électrons pour sa croissance.

La croissance nécessite la présence de substrats complexes (BHI, extrait de levure, peptone, mélange de 20 acides aminés). La souche 1-1318 est incapable de se développer en

autotrophie sur H2/C02.

La souche se développe dans une large gamme de

température: de 65 à 105'C avec une croissance maximale à 90-

'C. Elle peut croître dans une gamme de pH comprise entre 4,5 et 8,5 avec un pH optimum à 7,5. Une concentration minimale en sels de mer de 5 g 1i1 est nécessaire pour le développement de cette Archaebactérie; une croissance optimale est détectée pour une concentration de 30 à 40 gl 1.Cette souche est donc halophile modérée. L'identification taxonomique, en première approche a

permis de la classer dans la famille des thermococcales.

Compte-tenu de son caractère thermophile cette souche

peut être utilisée pour la recherche d'enzymes thermostables.

On notera que cette souche présente des activités

protéasiques et estérasiques.

La présente demande est d'autre part relative aux produits issus de cette souche tels que les enzymes thermostables et en particulier les enzymes vitaux de la

machinerie cellulaire ( polymérases, ligases....)..

La P-glucosidase objet principal de la présente invention est préférentiellement produite par l'un des microorganismes décrit ci- dessus mais elle peut aussi être produite par tout autre moyen connu de l'homme du métier, en

particulier par le génie génétique.

Cette P-glucosidase peut être isolée à l'aide d'un procédé, objet de la présente invention, et comprenant au moins une étape de chromatographie d'affinité sur une colonne

portant un résidu para-aminophényl-thio-p-galactopyranoside.

Cette étape peut être suivie par une électrophorèse de la fraction retenue sur la colonne d'affinité, puis par une élution de la bande de migration électrophorétique

correspondant à la P-glucosidase.

Elle peut aussi être suivie par une chromatographie

d'adsorption sur colonne d'hydroxylapatite.

Une chromatofocalisation peut aussi être introduite

dans le procédé.

Un tel enzyme peut en particulier être utilisé pour la dégradation de la cellulose, comme indiqué ci-dessus, ou

pour la synthèse d'oligo-glycosaccharides.

On notera que la P-glucosidase objet de la présente invention peut, de manière surprenante par rapport aux autres enzymes de sa catégorie, être activée par le glucose et d'autres polyols tels que le sorbitol et le glycérol. Cette activation est surprenante car généralement les sucres produits par les glucosidases, décrites dans l'état de la

technique, les inhibent.

Un autre avantage notable de la présente invention réside dans le fait que la souche 1-1318 objet de la présente invention peut être cultivée jusqu'à des densités importantes comparativement à celles obtenues avec d'autres Archaebactéries. Ainsi, on peut atteindre des densités

cellulaires de l'ordre de 109 cellules par millilitre.

La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent dans lesquels: La figure 1 illustre l'influence de divers composés

carbonés sur la production de glucosidase par la souche 1-

1318. La figure 2 illustre l'influence de la concentration en

cellobiose sur la production par la souche 1-1318 de la 1-

glucosidase. La figure 3 montre l'évolution fonction du temps ( en abscisse) de la croissance cellulaire, de la quantité d'hydrogène sulfuré produit et de l'activité 1-glucosidase

(en ordonnée).

Les figures 4A et 4B représentent respectivement les évolutions des activités aryl P-glucosidase et cellobiase ( en ordonnée) en fonction du pH ( tampon de citrate de phosphate, tampon phosphate, tampon borate et tampon Tris-HCl) à 70'C Les figures 5A et 5B représentent l'évolution de l'activité aryl P-glucosidase en fonction de la température à pH 6 et 7,5 ( tampon phosphate et tampon citrate de phosphate respectivement). La figure 5A représente l'activité aryl-p-glucosidase (en ordonnée) en fonction de la température ( en abscisse) tandis que la figure 5B représente l'évolution de l'activité aryl-p-glucosidase ( en ordonnée) en fonction de l'inverse de la température ( en abscisse). La figure 6 représente l'évolution de l'activité aryl P-glucosidase (en ordonnée) à des températures comprises

entre 70 C et 120 C ( en abscisse) à pH 7,5 et à pH 6.

Les figures 7A et 7B illustrent l'évolution de I'activité 6- glucosidase ( en ordonnée)respectivement à pH 7,5 et à pH 6 à différentes températures en fonction du temps

d'incubation (en abscisse).

Les figures 8A à 8C représentent respectivement les effets du NaCl, de l'EDTA et du Sodium Dodécyl Sulfate ( SDS) sur l'activité aryl Pglucosidase ( en ordonnée) en fonction

des concentrations de ces trois produits ( en abscisse).

Les figures 9, 10 et 11 illustrent l'activation de la

P-glucosidase par le glucose, en utilisant du para-

nitrophényle glucose ( figures 9 et 10) ou du cellobiose comme substrat ( figure 11). Dans les figures 10 et 11, on dose le glucose tandis que l'on dose le paranitrophénol dans

la figure 9.

La figure 12 représente l'évolution de l'absorbance et de l'activité 3glucosidase ( en ordonnée) au cours d'une chromatographie d'affinité d'un extrait brut provenant de culture de la souche 1-1318, en fonction des fractions ( en abscisse). La figure 13 représente l'évolution de l'absorbance et de l'activité f-glucosidase ( en ordonnée) au cours d'une chromatographie sur hydroxylapatite de fractions récupérées à partir de la chromatographie d'affinité, en fonction du

numéro de la fraction (en abscisse).

La figure 14 représente l'évolution de l'absorbance et de l'activité Pglucosidase ( en ordonnée) au cours d'une chromatofocalisation de fractions issues de la chromatographie

sur hydroxylapatite.

La figure 15 est une électrophorèse en condition non dénaturante d'un extrait brut de la souche 1-1318 ( puits I) de l'albumine (puits 3) et d'un échantillon issu de la colonne d'affinité ( puits 4). Sur cette figure les indices a, b et c représentent respectivement l'emplacement des puits dans lesquels ont été déposés les échantillons, la position de l'activité P-glucosidase et la position du fond de

migration.

La figure 16 représente l'électrophorèse en condition dénaturante d'un extrait brut de la souche 1-1318 ( puits 1), d'un échantillon après passage sur colonne d'affinité ( puits 2), d'un échantillon après passage sur colonne d'hydroxylapatite ( puits 3), d'un marqueur de poids moléculaire ( puits 4) et d'une préparation homogène après isoélectrofocalisation ( puits 6). La taille des fragments du marqueur de poids moléculaire est indiquée le long du gel d'électrophorèse. Les figures 17A à 17E illustrent respectivement l'effet du SDS, du sorbitol, du glycérol, de 1'EDTA, de l'urée sur l'activité aryl P-glucosidase ( en ordonnée) en fonction de la

concentration de ces produits ( en abscisse).

La figure 18 illustre l'évolution de l'activité f-

glucosidase ( en ordonnée) en fonction de la concentration en

para-nitrophényl- P-D-glucopyranoside (pNPGlu) ( en abscisse).

La figure 19 est une courbe montrant l'évolution de l'activité 3glucosidase ( en ordonnée) en fonction de la concentration en pNPGlu ( en abscisse) et en présence de différentes concentrations initiales en para-nitrophénol. On

mesure la production de glucose.

La figure 20 illustre l'évolution de l'activité -

glucosidase ( en ordonnée) en fonction de la concentration en

cellobiose ( en abscisse) à différentes températures.

il La figure 21 représente les mêmes données mais l'inverse de l'activité est portée en ordonnée tandis que l'inverse de la concentration en cellobiose est portée en abscisse. La figure 22 représente l'évolution des activités cellulase et P- glucosidase de Trichoderma reesei ( en

ordonnée) en fonction de la température ( en abscisse).

La figure 23 représente quant à elle l'évolution de la cellulolyse obtenue par la cellulose de Trichoderma reesei

(en ordonnée) concentrations de P-glucosidase de la souche 1-

1318 ( en abscisse) . La cellulolyse est présentée en ordonnée.

EXEMPLES:

Matériels et Méthodes 1 ) Etude de la croissance de la souche 1-1318 1.1 Inoculum et milieux Les milieux utilisés pour les études de croissance

microbienne sont décrits dans l'annexe 1.

1.2- Dénombrements cellulaires Pour les milieux sans soufre, les dénombrements ont été effectués par lecture de la turbidité à 620 nm (Spectrophotomètre Spectronic 401, Milton Roy) après prélèvement d'un aliquot de culture ou par lecture directe à

travers le tube de culture.

Cette méthode est inapplicable lorsque le milieu contient du soufre élémentaire. Dans ce cas, les dénombrement ont été faits par comptage après coloration à l'acridine orange d'après Hobbie et al. (1977 Use of nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy. Appl. Env

Microbiol, 33(5), 1225-1228).

1.3- Dosage de l'hydrogène sulfuré Le dosage de l'hydrogène sulfuré a été effectué par colorimétrie sur la base des méthodes de Cline (Spectrophotometric determination of hydrogen sulfide in natural waters. Limmol. & Oceanogr. 454-458 (1969)) et Fonselius ( Determination of hydrogen sulphide " Methods of seawater analysis " Verlag Chimie. Ed. by Grasshoff et al.,

73-80 (1983)).

La solution mère de sulfures utilisée pour l'étalonnage du dosage a été calibrée selon la méthode de Sakamoto-Arnold et al. ( Determination of hydrogen sulfite in seawater using

flow injection analysis and flow analysis. Limnol.

Oceanogr.31(4), 894-890 (1986)).

2) Préparations pour les mesures d'activités enzymatiques. Les activités enzymatiques ont été mesurées sur des extraits bruts ( protéines intracellulaires), des préparations pures ou partiellement purifiées ainsi que des surnageants de culture. Avant de décrire les méthodes de dosage, il est nécessaire d'exposer le protocole d'obtention des extraits bruts ainsi que l'obtention de surnageants de culture sans H2S.En effet, on a montré que l'hydrogène sulfuré, produit par les bactéries métabolisant le soufre élémentaire, dégrade certains substrats utilisés par un mécanisme chimique, créant

ainsi un artefact.

2.1- Préparation des extraits bruts Les extraits bruts ont été préparés à partir de cultures microbiennes de volumes divers par centrifugation puis cassage du culot cellulaire aux ultrasons en présence de

PMSF et de Triton X100 ( Annexe 2).

2.2- Elimination de l'hydrogène sulfuré du surnageant L'hydrogène sulfuré a été éliminé du surnageant de culture par barbotage d'azote après acidification légère

(jusqu'à un pH de 5,5).

L'absence d'H2S a été vérifiée par un test de précipitation de Cu2+ en CuS ( Cord-Ruwish R. 1985 J. Microb.Meth., 4, 33-36). Un précipité de couleur marron se forme lorsque l'on ajoute le surnageant de culture contenant H2S à une solution de sulfate de cuivre à 10-2 M ( proportion

volumique 1:4).

2.2. Variation des pH avec la température.

L'ajustement des pH a été fait à température ambiante mais les cinétiques enzymatiques ont été réalisées à température élevée. On a donc estimé les valeurs réelles des pH à cette température. Les pH des tampons citrate-phosphate et phosphate ne varient pas avec la température ( testé entre 20 et 70 C). Par contre, le pH du tampon KCl/acide borique/NaOH 100 mM ajusté à 8,65 à 250C, perd 0, 031 unités tous les 5 C jusqu'à 700C. Le tampon Tris/HC1 100 mM ajusté à 8,94 à 25 C perd 0,107 unités pH tous les 5 C. Tous les

tampons ont été préparés à 100 mM.

3. Etude de l'activité a-qlucosidase 3.1 - Hydrolyse d'aryl1lycosides Les arylglycosides sont des substrats synthétiques

contenant un glucose ou autre ose lié à du para- ou ortho-

nitrophénol (pNP ou oNP respectivement). Le substrat le plus

utilisé a été le pNPGlu ( para-nitrophényl-p-D-

glucopyranoside). 3.1.1 - Cinétique en point final La cinétique a été effectuée pendant une durée déterminée et arrêtée par ajout de Na2CO3 qui augmente le pH du milieu réactionnel et par une interruption de l'incubation

( annexe 3).

Dans ce cas, le coefficient d'extinction molaire du nitrophénol est constant. Il est de 18980 M-1 cm-1 à 401 nm

dans le cas de pNP et 4680 M-lcm-1 à 420 nm pour oNP.

Cette méthode a été utilisée pour les études de variation d'activités en fonction du pH ainsi que pour des cinétiques effectuées à une température supérieure à 85C à cause de l'impossibilité de faire de la spectrophotométrie en continu à très haute température ( limite d'utilisation du spectrophotomètre). La formule de calcul de l'activité enzymatique est

mentionnée en annexe 3.

3.1.2 - Cinétiques enzymatiques directes Les cinétiques enzymatiques directes ont été effectuées

grâce à un spectrophotomètre UVIKON 930 ou 940 (Kontron).

La formule de calcul de l'activité enzymatique est

mentionnée en annexe 3.

3.1.3- Dosaqe du glucose Lors de la cinétique enzymatique, des prélèvements du milieu réactionnel ont été réalisés toutes les 10 minutes pendant 40 minutes. Ils ont été immédiatement plongés dans la glace puis congelés. Le glucose libéré par l'hydrolyse du cellobiose ou du pNPGlu par la 3-glucosidase a été dosé dans chacun des prélèvements par la méthode TRINDER commercialisée

par SIGMA (cf. annexe 3).

3.2- Hydrolyse des oliqosaccharides à l'exception de la cellulose La J-glucosidase est capable d'hydrolyser des oligosaccharides comprenant au moins un résidu glucose lié par son carbone 1 en conformation ^.Le plus simple est le cellobiose (glucopyranosyl P 1-4 glucopyranoside). Mais elle

est également capable d'hydrolyser des tri-, tétra-, penta-

glucose. La mesure de l'activité sur ces différents substrats

a été faite par le dosage TRINDER (Annexe 3).

4- Autres activités enzymatiques D'autres activités enzymatiques ont été étudiées: cellulase, pullulanase, amylase et transférase. Deux méthodes ont été utilisées pour évaluer ces activités; dosage des sucres réducteurs (D.N.S.) ou du glucose (TRINDER, annexe 3) ainsi que la visualisation des produits après séparation par

chromatographie sur couche mince.

4.1 - Dosaqe au D.N.S.

La méthode au D.N.S. (Miller, 1959, Analytic

2706907

Chem.,31(3), 426-428) dose les sucres réducteurs par réaction

avec l'acide dinitro-3,5-salicylique (D.N.S.).

4.2 - Chromatographie sur couche mince La mise en évidence des oligosaccharides a été réalisée qualitativement par chromatographie ascendante sur plaque de Silica gel 60 d'épaisseur 2 mm (Merck). La phase mobile était

un mélange butanol-1/méthanol/acide borique 0,03 M (50/30/10).

Apres cinq heures de migration, la plaque a été mise à sécher avant d'être à nouveau soumise à une nouvelle migration qui a

pour effet de focaliser les taches et diminuer les traînées.

Les sucres ont été révélés par un système colorant comprenant 20 mg d'alpha-naphtorésorcinol, 10 ml d'éthanol et 0,3 ml d'acide sulfurique concentré et un chauffage de la

plaque à 100 C pendant plusieurs minutes.

5. Mesure de la thermostabilité La thermostabilité enzymatique a été déterminée par la mesure de l'activité résiduelle après incubation de l'échantillon à haute température. Pour cela, la solution enzymatique a été répartie en petits volumes dans des ampoules à lyophiliser de 1 ou 2 ml qui ont été scellées avant incubation. A chaque prélèvement, une ampoule était sortie du bain, plongée dans la glace afin d'arrêter la dénaturation, puis immédiatement congelée. Les mesures d'activités enzymatiques résiduelles ont été effectuées en même temps et

dans les mêmes conditions sur tous les prélèvements.

Lorsque la thermodénaturation était modélisable par une cinétique du premier ordre pendant les premières minutes, le temps de demi-vie (tl/2) ou temps au bout duquel il reste 50 % de l'activité initiale a été déterminé en fonction du modèle suivant: A = Ao e-kt et tl/2= (Ln2) k o A est l'activité résiduelle au temps t Ao est l'activité initiale k est la constante de vitesse de dénaturation 6. Purification Toutes les étapes de purification ont été effectuées à 4 C excepté la chromatographie sur hydroxylapatite, menée à température ambiante pour éviter les risques de cristallisation des tampons phosphate concentrés. Le matériel utilisé (Pharmacia) est un système de chromatographie standard. 6.1 -Colonne d'affinité L'extrait brut a été déposé sur une colonne d'affinité (1,6 x16,5 cm) équilibrée avec du tampon phosphate 100 mM pH

7,5. Le gel d'affinité était du para-aminophényl-3-D-thio-

galactopyranoside immobilisé sur agarose (SIGMA). Apres lavage de la colonne par le tampon d'équilibration, puis par NaCl 0,2 M, les protéines ont été éluées par du tampon KCl/acide

borique/NaOH pH 10.

6.2 Colonne d'hydroxylapatite Les fractions actives récupérées après la chromatographie précédente ont ensuite été déposées sur une colonne d'hydroxylapatite ( 1 x 20 cm et gel Fluka) après dialyse contre du tampon phosphate pH 7,5. Apres lavage de la colonne par ce même tampon, l'élution a été effectuée à pH 7,5

par un gradient linéaire de phosphate de 150 à 300 mM.

6.3 Chromatographie d'isoélectrofocalisation Cette colonne (1,6 x 14 cm) a été utilisée comme étape de purification mais également pour déterminer le point isoélectrique de la protéine. Le gel utilisé est le gel PBE 94 ( Pharmacia) équilibré par du tampon pipérazine-HCl 0,025 M pH 5,2. Le gradient de pH 5 à 4 a été obtenu par élution par Polybuffer 74 ( Pharmacia) dilué au dixième et ajusté à pH 4 par HC1. L'élimination du polybuffer dans l'échantillon actif a été obtenue par électroélution ( matériel Bio-Rad) après

électrophorèse ou précipitation au sulfate d'ammonium.

6.4 Filtration sur gel La colonne (2,6 x 70 cm) a été remplie par du gel Séphacryl S300 ( Pharmacia). Les protéines étalon proviennent

de kits de calibration de Pharmacia et de Touzart et Matignon.

6.5 Colonne échangeuse d'ions La colonne a été remplie par du gel DEAE Sépharose CL6B de Pharmacia ( 2,6 x 36 cm), équilibrée avec du tampon phosphate 100 mM pH 7,5 et éluée avec ce même tampon contenant

des concentrations croissantes de NaCl.

6.6. Dialyse La dialyse de solutions protéiques a été effectuée en sac à dialyse dont la membrane a un seuil de coupure de 10000 daltons, contre 2 1 de tampon phosphate pH 7,5 ou citrate phosphate pH 6. Après 2 heures, le tampon a été renouvelé et

la dialyse poursuivie pendant une nuit.

6.7 Suivi de la purification Chaque chromatographie a été suivie par détection de l'activité enzymatique dans les fractions collectées lors de l'élution. Pour cela, chaque puits d'une microplaque a été rempli par 250 pl de substrat et 10 ou 20 pl de la fraction étudiée. Les microplaques ont été incubées 20 minutes à 70 C puis lues sur un lecteur de plaque. L'activité enzymatique a été exprimée en unités arbitraires (UA). La concentration protéique dans chaque fraction a été évaluée par mesure de

l'absorbance à 280 nm dans des cuves en quartz.

A chaque étape, le taux de purification et le rendement ont été évalués en dosant la concentration protéique ainsi que

l'activité enzymatique sur les fractions récupérées.

6.8 Electrophorèse- électroélution Cette étape a été effectuée en deux parties: migration électrophorétique en condition non dénaturante. A l'issue de l'électrophorèse, deux bandes fines correspondant à une partie d'une piste de migration ont été découpées dans le sens de la migration. L'une d'elle a été

colorée au bleu de Coomassie et sur l'autre, l'activité -

glucosidase a été mise en évidence afin de déterminer sa position dans le gel. Les pistes du gel non utilisées pour les colorations ont été découpées uniquement au niveau de la bande de P-glucosidase déterminée. électroélution. La protéine contenue dans le morceau de gel récupéré a été éluée par un champ électrique à l'aide d'un électroéluteur commercialisé par Bio-Rad. Le tampon d'élution

est constitué de Tris à 3 g 1-1 et de glycine à 14,4 gl-1.

7. Dosage des protéines

7.1 - Méthodes de dosage.

Les dosages de protéines ont été effectués selon deux méthodes différentes en fonction de la gamme de sensibilité désirée: - Méthode de Lowry ( Lowry et ai, 1952 J. Biol. Chem, 265-275) pour une gamme de concentrations protéiques comprises

entre 0,01 h 11.

- Microdosage de Bradford, (1976 Analytic Biochem, 72, 248-254.) pour une gamme de concentrations protéiques 1-1 comprises entre 1 et 25 mg 7.2 Méthodes de concentration des solutions protéiques

7.2.1 Précipitation au sulfate d'ammonium.

Pour obtenir la précipitation de toutes les protéines, le sulfate d'ammonium a été ajouté de façon à avoir 80 % de

saturation.

Apres solubilisation complète du sulfate d'ammonium,

les protéines ont été récupérées par centrifugation à 10lOOg.

7.2.2. Concentration par ultrafiltration Les échantillons ont été filtrés à travers une membrane dont le seuil de coupure est de 10000 daltons par centrifugation soit à l'aide des unités Ultrafree-20 ( pour des volumes initiaux de 2 à 17 ml) soit à l'aide d'unités Ultrafree-MC pour des volumes allant jusqu'à 400 Ml. Des Ultrafree-PF ont également été utilisés pour des volumes

allant jusqu'à 2 ml (commercialisées par Millipore).

8. Analyses électrophorétiques Les électrophorèses ont été effectuées en chambre froide (4 C) dans des cuves pour électrophorèses verticales Les gels après révélation des protéines ont été séchés sous

vide à 80 C pendant 1 heure ( sécheur Modèle 583 Bio-Rad).

8.1. Electrophorèses natives

8.1.1 Préparation des gels et échantillons.

Les compositions des gels et des tampons sont

mentionnées en annexe 4.

* Avant dépôt, l'échantillon a été préparé en ajoutant un demi-volume de tampon d'échantillon à la solution protéique. La migration a été réalisée à 100 V dans le gel

d'alignement et 180 V dans le gel de séparation.

Des gels précoulés en gradient d'acrylamide 4-20 % ont

également été utilisés (Bio-Rad).

8.1.2-Révélation: coloration des protéines.

Dès que le front de migration du colorant est parvenu à l'extrémité du gel, la migration est arrêtée et le gel coloré

au bleu de Coomassie pendant une heure puis décoloré.

Solution de coloration: Solution de décoloration: Bleu de Coomassie 0,1 % Méthanol 30% Méthanol 50 % Acide acétique 10% Acide acétique 10 % Eau 60 % Eau 40 % 8.1.3 Révélation des activités enzymatiques sur gel

0-glucosidases et autres 0-glycosidases.

Cette activité a été détectée par hydrolyse du substrat nitrophénylé ( para-nitrophényl-glycoside): - directement sur le gel après incubation à 70 C: une bande jaune apparaît au bout de 45 minutes, elle est accentuée par humidification de gel avec Na2CO3 1 M. - après fractionnement du gel en petits morceaux de 5 mm dans le sens de la migration: chaque morceau a été incubé à 70 C dans un tube en présence de 1 ml de substrat. La

visualisation est ainsi plus facile.

L'activité 3-glycosidase a également été détectée grâce à un dérivé du naphtol. 37 mg de 3-naphthyl-3-glycopyranoside sont solubilisés dans du diméthyl formamide puis 37 mg de "Fast Garnet GBC salt" ( SIGMA) sont ajoutés ainsi que 100 ml de tampon citrate phosphate 100 mM pH 6. Apres incubation du gel à 70 C dans ce mélange, une bande rouge est visible au

niveau de l'hydrolase.

8.2- Electrophorèses dénaturantes Ces électrophorèses ont été effectuées en suivant la méthode de Laemmli ( Nature, 227, 680-685 (1970)). On a utilisé des gels précoulés et commercialisés par Touzart et Matignon à 10 % T. Les échantillons ont été préparés et dénaturés selon la méthode préconisée par SIGMA pour les marqueurs de poids moléculaires MW-SDS-200: ovalbumine (45000), albumine bovine (66000), phosphorylase B (97400), 3-galactosidase ( 116000),

myosine ( 205000).

Les gels ont été colorés comme les gels natifs au bleu

de Coomassie puis décolorés et séchés de la même façon.

ANNEXE 1

Composition des milieux de culture a) Milieux à base d'extrait de levure et de peptone:

Milieu 2216S (2S) ( Belkin et Jannasch, 1985, Appl.Env.

Microbiol.,51(6),1180-1185) Extrait de levure 0,5 g Peptone 1 g Sels de mer 30 g Soufre 5 g Pipérazine-N,N'-bis- (acide 2-éthane sulfonique) (PIPES) 6,05 g pour les pH 7,5 et 6,5 Acide 2-[N-morpholino]éthane sulfonique (MES) 3,09 g pour les pH 5,5 et 3, 5 Réazurine Eau distillée qsp 1000 b) Milieux à base d'infusion coeur-cerveau Milieu BHI soufre (BHIS ou BS) BHI 0,25 g NaCl 23 g PIPES 6,05 g pour les pH 7,5 MES 3, 09 g pour les pH 7,5 Soufre 5 g Réazurine Eau distillée qsp 1 1 Les pH ont été ajustés à température ambiante. Les milieux en anaérobiose ont été réduits par addition de Na2S

stérile à 2,5 % en enceinte anaérobie.

ANNEXE 2

Obtention des extraits bruts - centrifugation de la culture à 10000 g pendant 40 minutes, - reprise du culot contenant le soufre élémentaire ainsi que les cellules dans du tampon phosphate 100 mM pH 7,5 NaCl 0, 5 M, - deuxième centrifugation puis reprise du culot dans du tampon phosphate 100 mM sans NaCl mais contenant du fluorure de phénylméthane sulfonyl (PMSF) 1 mM Du Triton X100O de 1% a également été ajouté afin d'augmenter l'extraction des

protéines notamment celles liées aux membranes.

Une concentration en Triton X100 de 1 % augmente l'extraction de la 3glucosidase de l'isolat 1-1318 de 20 % et la récupération de l'activité enzymatique augmente de 10 % en

présence de PMSF.

- ultrasonication du mélange.

ANNEXE 3

Mesures et calculs des activités 3-qlucosidase Cinétiques en point final de l'hydrolyse d'arvl-qlvcosides: Méthode de mesure: - addition au temps t = O de la cinétique de 1/2 volume du mélange réactionnel à 1/2 volume de carbonate de sodium Na2CO3 1M; la réaction enzymatique se poursuit sur le reste du

mélange réactionnel.

- addition à la fin de la cinétique de 1/2 volume de Na2CO3. - calcul de l'activité à partir de l'augmentation de la

densité optique en se référant à un étalonnage.

Calcul de l'activité: L'activité enzymatique en U ml-1 définie comme le nombre de pmol de produit libéré par minute et par unité de volume d'enzyme ( millilitre) a été calculée selon la formule: Act = DO x 103 (E x Ve) o Act est l'activité en U ml-1 V est le volume réactionnel total après ajout de Na2CO3 en ml Ve est le volume d'enzyme utilisé en ml DO est l'augmentation de densité optique par minute Z est le coefficient d'extinction molaire du produit

détecté en M-1 cm-i1.

Cinétiques directes de l'hydrolyse d'aryl-qlycosides: Calcul de l'activité: L'activité enzymatique a été calculée par la formule

indiquée ci-dessus.

Cinétiques par dosaqe du glucose selon TRINDER: Réactif: Le réactif reconstitué contient les substances actives suivantes: 4-aminoantipyrine 0,5 mM p-hydroxybenzène sulfonate 20 mM glucose oxydase (Aspergillus niger) 15000 Ul-1

peroxydase (Raifort) 10000 Ul1-

Protocole de dosaqe: - addition de 150 pl du prélèvement à 1 ml du réactif

TRINDER/SIGMA préincubé 5 minutes à 37 C.

- lecture de la densité optique à 505 nm après une

incubation de 10 minutes exactement.

La concentration en glucose correspondante est déterminée grâce à une courbe de calibration effectuée dans les mêmes conditions de dosage. La détermination des concentrations dans chacun des prélèvements d'une cinétique permet de calculer la vitesse de production du glucose en g

(1 min)-l.

Calcul de l'activité: L'activité 3-glucosidase exprimée en pmol de glucose produit par minute et par unité de volume d'enzyme (millilitre)( U ml-1) a alors été calculée selon la formule: Act = P x 10+3 x V / ( 180 x Ve) o Act est l'activité en U ml-1 V est le volume réactionnel de la cinétique enzymatique 3-glucosidase en ml P est la vitesse de production de glucose en g ( 1 min)-1 Ve est le volume d'enzyme en ml

ANNEXE 4

Gels et tampons d'électrophorèse - gel d'alignement ( 6% T): Solution d'acrylamide/bisacrylamide à 30,8 % T et 2,6 % C 2 ml Tampon Tris HC1 0,5 M pH 6,8 2,5 ml Eau 5,3 ml Persulfate d'ammonium 100 gl-1 0,1 ml N,N,N',N'-tétraméthylène diamine (TEMED) dilué au 1/2 0,01 ml - gel de séparation - 10% T): Solution d'acrylamide/bisacrylamide à ,8 % T et 2,6 % C 20 ml Tampon Tris HC1 1,5 M pH 8,8 15 ml Eau 24 ml Persulfate d'ammonium 100 gl-1 0,6 ml TEMED au 1/2 0,06 ml - Tampon d'échantillon: Tris HCl 0,5 M pH 6,8 2,5 ml Glycérol 2 ml Eau 3 ml Bleu de bromophénol 0,1 % - Tampon de migration Tris 6 g Glycine 28,8 g Eau 1 1 EXEMPLE 1: Production enzymatique de la souche 1-1318 La 3-glucosidase de 1-1318 est liée aux cellules. On a donc travaillé sur des extraits bruts. De très faibles taux

de production de l'enzyme ont été observés sur milieu BHIS.

Aucune activité 3-glucosidase, cellulase, chitinase, amylase ni pullulanase n'a été mise en évidence au bout de 12 h de culture dans le surnageant de culture après élimination de

l'hydrogène sulfuré.

1.1 Influence des carbohydrates On a étudié l'influence de divers carbohydrates ajoutés en concentration finale de 10 g 1-1, au milieu complexe de

base BHIS pour optimiser la production de l'activité -

glucosidase.

La figure 1 montre les taux de production (activité enzymatique par millilitre de culture / nombre de cellules par millilitre) obtenus pour divers composés carbonés. Ce sont des rendements relatifs, rapportés à la production obtenue sur BHIS. Ces résultats montrent que le cellobiose est le meilleur activateur de la production de l'enzyme; il a augmenté le taux de production d'un facteur 4 tandis que l'amidon l'a augmenté d'un facteur 2 environ. La plupart des autres composés donne une production équivalente à celle obtenue sur BHIS. Cependant, le lactate, le glycérol, le sorbitol, le mannitol, le glucose, le maltose et la cellulose ont partiellement inhibé la production de la P- glucosidase. Aucune croissance n'a pu être obtenue sur chitine. Une concentration initiale en cellobiose dans le milieu de 5 g 1-1 est optimale pour le rendement de production

( figure 2).

1.2 Croissance et production enzymatique La croissance microbienne obtenue sur le milieu optimisé BHIS Cellobiose 5 g 1-1 à 92 C est représentée sur la

figure 3.

1-1318 produit de l'hydrogène sulfuré; un témoin, c'est-à-dire le milieu incubé mais non ensemencé, montre une

production d'hydrogène sulfuré abiologique négligeable.

L'activité P-glucosidase a été mesurée à 700C sur pNPGlu. -Elle est intracellulaire pendant la phase exponentielle de croissance, puis elle diminue très vite après 12 h de culture. Elle est relarguée, au moins en partie, dans

le surnageant de culture.

La concentration cellulaire maximale atteinte est de 1,2.109 cellules par millilitre. A 92 C, sur milieu BHIS - Cellobiose, le taux de croissance obtenu est de 0,62 h -1. Il n'y a pratiquement pas de phase stationnaire: la lyse

cellulaire intervient très tôt.

Le rendement enzymatique atteint au bout de 12 h de culture est de 2,2. 10 -11 U par cellule. Afin de récupérer l'activité enzymatique dans les cellules, les cultures

suivantes ont été arrêtées après 12 h d'incubation à 920C.

EXEMPLE 2: Etude des activités enzymatiques de l'extrait brut de la souche 1-1318

1l) Propriétés enzymatiques de l'extrait brut.

Toutes les études ont été effectuées sur des extraits bruts de caractéristiques identiques: 3,1 + /-0,4 g 1-1 de

protéines (déterminées selon la méthode de Lowry) et 0,35 + /-

0,02 U ml-1 à 70 C et pH 6 ( tampon citrate phosphate).

D'après la purification effectuée ultérieurement, la p-

glucosidase a une activité spécifique de 24,8 U mg 1, ce qui signifie que la 3-glucosidase représente 0,5 % des protéines

solubles dans les extraits bruts.

1.1 Conservation des échantillons Afin de déterminer les meilleures conditions de conservation des échantillons enzymatiques, on a effectué des suivis de l'évolution de l'activité sur un aliquot conservé à 4 C ainsi que sur des aliquots congelés en présence ou non de composés utilisés classiquement pour stabiliser les enzymes:

sorbitol, albumine, sulfate d'ammonium.

A 4 C, l'enzyme a été conservée dans différents tampons de pH 3,0 à 9,0. Quels que soient la nature du tampon et le pH de la solution, aucune perte d'activité n'a été

observée pendant 5 jours.

L'extrait brut congelé a perdu 5% de son activité au bout de quatre semaines. Apres quatre semaines à -20 C, aucune perte d'activité n'a été observée en présence de sorbitol 0,4 M, d'albumine 0,6 g 1-1, ou de sulfate d'ammonium 3,5 M. Compte tenu de la faible perte d'activité observée, les échantillons ont été conservés à -20 C sans additifs pour des raisons de facilité de maintenance et pour se libérer des effets éventuels de ces additifs. Pour les essais fréquents et réguliers, les échantillons ont été

conservés à 4 C quelques jours.

1.2 Activité en fonction du pH et de la température L'étude de la variation d'activité en fonction du pH par la vitesse d'hydrolyse de pNPGlu ( 10 mM) et du cellobiose

(3,4 g 1-) a été menée à 70C ( figures 4A et 4B).

L'activité a été maximale dans le tampon citrate phosphate 100

mM à pH 6 pour pNPGlu et pH 5,3 pour le cellobiose.

La variation de la vitesse de réaction enzymatique avec la température a été étudiée sur un seul substrat (pNPGlu) à deux pH différents: 6 et 7,5. Jusqu'à 90 C, les cinétiques

ont été effectuées en continu.

Les figures 5A et 5B montrent qu'aux deux pH l'activité augmente continuellement et de manière similaire jusqu'à la température maximale atteinte. Les courbes tracées selon l'équation d'Arrhénius qui représentent le logarithme de l'activité en fonction de l'inverse de la température absolue,

présentent une rupture de pente à 690C pour les deux pH.

Respectivement, à pH 7,5 et pH 6, les énergies d'activation sont 74,8 kJ moi-1 et 69,5 kJ mol-1 pour les températures inférieures à 69 C et 48,1 et 51,4 kJ mol-1 pour les

températures supérieures à 690C.

Compte tenu de l'impossibilité d'utiliser le spectrophotomètre au-delà de 90 C, des mesures de vitesse de réaction ont été effectuées en point final dans des tubes scellés et légèrement pressurisés pour des températures de réaction entre 80 et 115 C. Les températures optimales déterminées pour une durée de cinétique de 10 min sont 90'C et

1000C à pH 7,5 et pH 6 respectivement ( figure 6).

1.3 Stabilité vis-à-vis du PH et thermostabilité L'activité 3- glucosidase est stable à 4 C quel que soit

le pH de l'échantillon pendant au moins cinq jours.

On a testé la stabilité vis-à-vis du pH à 90 C. A cette température, la zone de stabilité est plus restreinte: l'enzyme est stable à 100 % pendant 1,5 h entre les pH 5,5 et 7,0 seulement ( tampon phosphate). A pH 4 ( tampon citrate phosphate) et 90 C, il ne reste plus aucune activité au bout de 1,5 h. A pH 8 (tampon phosphate), il ne reste que 50% de

l'activité initiale après 1,5 heures.

La thermostabilité enzymatique a été testée à deux pH:

7,5 et 6 et à différentes températures ( figures 7A et 7B).

Pendant les 20 premières minutes, au moins, les cinétiques de dénaturation thermique sont modélisables selon une réaction d'ordre 1 et nous avons calculé les temps de demi-vie de

l'enzyme ont été calculés ( tableau 1).

1.4 Activité en présence d'effecteurs 1.4.1 Effet de NaCl, EDTA et SDS Le NaCl et EDTA, utilisés généralement lors des purifications de protéines pour stabiliser les enzymes, inhibent l'activité 3-glucosidase ( figures 8A et 8B), le SDS semble induire une activation aux faibles concentrations jusqu'à 0,13 % w/v puis inhibe l'activité ( figure 8C). On n'a donc pas ajouté EDTA aux tampons utilisés lors des mesures

d'activité ni lors de la purification enzymatique.

1.4.2 Effet d'ions sur l'activité.

Les effets de onze cations sur l'activité A-glucosidase ont aussi été étudiés afin de rechercher un possible activateur ( tableau 2). Les résultats sont exprimés en

pourcentage par rapport à l'activité mesurée sans additifs.

Tous les ions sont utilisés sous leur forme chlorure. Le lithium, seul cation monovalent testé, semble activer

faiblement la 3-glucosidase, tous les autres ions l'inhibent.

Les plus forts inhibiteurs sont Fe3+, Sn2+, Cu2+

1.4.3 Activité 0-glucosidase en présence d'oses.

Les effets de différents oses sur l'activité 1-

glucosidase, en premier lieu, sur l'hydrolyse de pNPGlu ont été étudiés. Ni le lactose ni le cellobiose ne semblent avoir d'effet sur l'activité alors que l'on aurait pu attendre une inhibition compétitive entre les substrats cellobiose et pNPGlu ou lactose et pNPGlu. Le glucose ainsi que le galactose, mais plus faiblement pour ce dernier, activent la dégradation enzymatique de pNPGlu. Les figures 9, 10 et 11 montrent que la dégradation enzymatique de pNPGlu et du

cellobiose est augmentée en présence de glucose.

1.4.4 - Hydrolyse de différents substrats L'extrait brut a été testé sur différents disaccharides ou oligosaccharides à 65 C ( tableau 3). L'activité est

exprimée en glucose produit et non en substrat hydrolysé.

L'activité obtenue sur cellobiose a été arbitrairement fixée à , les autres hydrolyses étant exprimées en valeur relative. L'extrait brut n'est pas actif sur la cellulose mais hydrolyse des chaînes oligoglucosidiques à liaison / 1-4 jusqu'à au moins 5 résidus glucose liés. Plus la chaîne est longue, plus l'activité est faible. L'extrait brut contient une faible activité a-glucosidase. L'activité 3- glucosidase hydrolyse préférentiellement les liaisons p 1-3 puis les liaisons / 1 - 2, le cellobiose vient ensuite et les liaisons

p 1-6 sont le moins bien hydrolysées.

EXEMPLE 3 -

Purification de la 0-glucosidase thermostable de la souche ST 549 1) Schéma de purification Pour purifier l'enzyme, différentes méthodes ont été testées: précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium, chromatographies échangeuses d'ions à pH 7,5 et 6,

chromatographie d'affinité ( sur para-aminophényl-thio-

galactopyranoside), chromatographie d'interactions hydrophobiques ( sur Phénylagarose), chromatographie de chélation avec des métaux ( sur Chelating Sepharose Fast Flow de Pharmacia, métal Zn2+), chromatographie d'adsorption ( sur hydroxylapatite), chromatographie d'isoélectrofocalisation

(sur PBE Pharmacia).

Les méthodes de précipitation, échangeuses d'ions, interaction hydrophobique, chélation métallique ont donné un taux de purification faible et entraîné une perte d'activité totale importante. Aussi on a choisi des étapes de purification plus efficaces de colonne d'affinité,

d'hydroxylapatite et isoélectrofocalisation.

Chaque purification constituée de trois étapes a été effectuée sur un extrait brut ( environ 200 ml) provenant de 27 1 de culture de 1- 1318. Plusieurs purifications ont été effectuées avec le schéma choisi afin d'obtenir suffisamment d'enzyme. La première étape de la purification est une chromatographie d'affinité sur gel d'agarose sur lequel est greffé un résidu de para-aminophényl-thio-3- galactopyranoside, connu pour inhiber les 3-galactosidases. L'enzyme a été élué de la colonne lorsque le pH a été augmenté jusqu'à 10 ( tampon KCl)/ Borate / NaOH) ( figure 12). Apres cette première étape, le rendement de récupération de l'activité 3-glucosidase a été de 59,1% et le taux de purification de 8,2 en moyenne sur cinq

purifications identiques effectuées ( tableau 4).

La seconde étape consiste en une chromatographie d'adsorption sur hydroxylapatite à pH 7,5 après une dialyse des fractions récupérées sur la colonne d'affinité. La protéine a été élué lors du gradient linéaire de phosphate à une concentration d'environ 225mM ( figure 13). Par rapport à l'extrait brut de départ, le rendement de récupération est de 32,5 % et le taux de purification de 50 en moyenne (tableau 4). La troisième étape est une chromatofocalisation après

concentration des fractions récupérées précédemment c'est-à-

dire une chromatographie qui sépare les protéines par leur point isoélectrique. La colonne avait été prééquilibrée avec un tampon pipérazine HC1 à pH 5,2; ainsi, le gradient obtenu par élution avec le tampon (polybuffer) à pH 4 s'étend sur une plage de pH restreinte: de 5 à 4. La J-glucosidase a ainsi été élué à un pH de 4,3 ( figure 14). En moyenne sur cinq purifications complètes identiques effectuées, le rendement de récupération obtenu après cette dernière étape est de 12,6 % et le taux de purification de 131 par rapport à l'extrait brut

de départ (tableau 4).

Afin d'améliorer le procédé de purification l'efficacité de la méthode électrophorèse-élution a été testée. Quatre migrations- électroélutions ont été effectuées sur des échantillons contenant l'activité f-glucosidase obtenus après une colonne d'affinité. Les rendements de récupération de l'activité totale ont été les suivants: 87, 47, 63 et 73 %. Une nouvelle électrophorèse a montré que les échantillons récupérés étaient purs. Cette étape est donc très intéressante pour obtenir l'enzyme pure avec un très bon rendement à partir par exemple de l'échantillon obtenu après

colonne d'affinité.

2) Caractérisation de la molécule enzymatiaue Le point isoélectrique de la protéine a été déterminé à partir d'une chromatofocalisation ainsi que sa taille par une

filtration sur gel sur Sephacryl S300.

Ils sont respectivement de 4,3 et 13.kD environ.

3) Analyse électrophorétique du produit de la purification Afin de vérifier l'évolution de la purification,

diverses électrophorèses ont été effectuées.

Sur le gel natif ( figure 15A) la bande protéique dont l'intensité relative a augmenté correspondant à la position d'une activité Pglucosidase. A partir de la troisième étape de la purification, les colorations n'ont révélé qu'une seule

bande sur les gels: la 3-glucosidase est donc homogène.

Sur les électrophorèses dénaturantes (figure 15B), il apparaît que la taille de la sous-unité de la 3-glucosidase

est de 60000 daltons. L'enzyme est donc un dimère.

EXEMPLE 4: Etude de l'enzyme purifiée Deux lots enzymatiques purs ont été préparés: le premier contient 0,066 mg ml-1 de protéine ( déterminé selon la méthode de Lowry); le second contient 0,103 mg ml-1 de protéine et du tampon polybuffer 74. En effet, afin de limiter les pertes d'activité, on a éliminé le polybuffer résultant de la dernière étape de purification que dans une des préparations. L'échantillon avec Polybuffer a été utilisé uniquement pour les études de spécificités de substrats o le

Polybuffer n'interfère pas.

L'enzyme a une activité spécifique de 24,8 +/- 0,3 U

mg-1 à pH 6 et 70 C ( tampon citrate phosphate).

1- Etude de la thermostabilité.

L'étude de la thermostabilité de l'enzyme dans la préparation homogène a montré qu'il n'y a aucune perte d'activité lors d'une incubation à 90 C pendant 2 heures. A cette température, l'enzyme pur est au moins aussi

thermostable que l'enzyme dans l'extrait brut.

2- Effet de différents effecteurs.

Les effets du SDS, du sorbitol, du glycérol, de l'EDTA et de l'urée ont été étudiés sur la préparation pure. Elle semble plus sensible au SDS et à i'EDTA que l'enzyme dans l'extrait brut ( figures 7A à 17 E). Le sorbitol et le

glycérol activent l'enzyme.

3. Hydrolyse de divers substrats.

a) Hydrolyse d'aryl-glucosides L'activité P-glucosidase est associée àdiverses

activités P-glycosidases: 3-galactosidase, P-fucosidase, 1-

mannosidase, 3-N-acétylglucosaminidase ( tableau 5 et 6). Les valeurs d'activité sont rapportées à l'activité sur le cellobiose pour les di- et tri-saccharides et à l'activité sur

pNPGlu pour les dérivés nitrophénylés. Les activités 1-

galactosidase, P-glucosidase et 3-fucosidase sont majoritaires

( proportion 81,9/100/158,3).

La 3-glucosidase de 1-1318 possède une faible activité a-glucosidase et une certaine sélectivité pour les résidus aglycones des composés nitrophénylés: elle présente une

activité plus forte pour pNP que pour oNP ( tableau 6).

b) Hydrolyse d'oliqosaccharides La 3-glucosidase de 1-1318 hydrolyse en plus du cellobiose des diglucoses à liaison / variable ( gentiobiose, laminaribiose, sophorose). La vitesse d'hydrolyse augmente pour les liaisons suivantes: 1-6 < p 1-4 < / 1-3 < p 1-2. L'activité enzymatique est cependant très voisine pour ces

trois derniers types de liaisons ( tableau 6).

La /-glucosidase est capable d'hydrolyser faiblement des liaisons ad'oligosaccharides (maltose, isomaltose, panose) et des chaînes à liaison / plus longues que le cellobiose; l'activité diminue lorsque la longueur de la

chaîne augmente ( tableau 6).

4) Activité en fonction de la concentration en substrat. Les cinétiques ont été effectuées à 750C pH 6 dans le tampon citrate phosphate 100 mM. Deux types de réaction ont

été étudiés, hydrolyse du cellobiose et hydrolyse de pNPGlu.

Dans ce dernier cas, on a utilisé deux types de dosages: dosage du glucose et dosage de pNP. Ces deux produits sont

libérés en proportion équimolaire lors de l'hydrolyse.

L'étude de la variation de l'activité /-glucosidase avec la concentration de pNPGlu a révélé un comportement particulier de l'enzyme selon que le produit détecté est le

glucose ou pNP ( figure 18).

La courbe selon Lineweaver et Burk ( ( 1934) J. Am.Chem.Soc., 56, 658-666) est linéaire dans le cas du dosage du glucose produit ( figure 18). Les paramètres cinétiques de la /-glucosidase sur pNPGlu sont: KM = O,145 mM et VM= 0,075 U ( ml d'extrait brut)-1. Ce dosage montre une légère

inhibition de l'activité par excès de substrat pNPGlu.

On a également montré que pNP inhibe l'activité, avec un KI = 6,86 mM ( figure 19) lorsque le produit détecté est le glucose. Par contre, lorsque l'activité est mesurée par détection du para-nitrophénol produit, l'activité apparente est d'une part plus élevée et non linéarisable selon

Lineweaver et Burk ( figure 18).

L'étude de la dégradation du cellobiose à pH 6 (tampon citrate phosphate 100 mM) montre également un comportement non michaélien de l'enzyme dans l'extrait brut puisque la courbe en double inverse montre une légère concavité ( figures 20 et 21). Ces expériences ont été répétées sur des extraits bruts, à quatre températures différentes ainsi que sur la préparation purifiée. On a toujours obtenu le même type de courbe non linéarisable. On a également obtenu ce type de

courbe sur oNPGlu et pNPGal.

EXEMPLE 5: Utilisation de la 0-qlucosidase pour l'hydrolyse de

la cellulose.

La cellulose est l'une des sources d'énergie les plus répandues dans la nature. Sa valorisation passe par une

dégradation microbienne ou enzymatique.

La dégradation de la cellulose se fait au moyen d'un complexe cellulolytique multienzymatique comprenant trois

types d'enzymes agissant en synergie: une endo-s-D-1,4-

glucanase ( EC 3.2.1.4), une cellobiohydrolase ( EC 3.2.1.91)

et une cellobiase ou f-glucosidase ( EC 3.2.1.21).

L'activité 3-glucosidase est en général en petite quantité par rapport aux autres enzymes de complexe; ainsi la dernière étape concernant l'hydrolyse du cellobiose en glucose

est limitante dans l'hydrolyse de la cellulose.

Afin de pallier cette limitation ainsi que la rétroinhibition des enzymes dépolymérisantes par le cellobiose accumulé, des études d'efficacité de la dégradation de la

cellulose par des cellulases ont été faites en présence de /-

glucosidase additionnelles ( Sternberg et al., 1977; Can. J. Microbiol., 23, 139-147; Breuil et al., 1992 Bioresource

Technol., 39(2)139-142).

L'influence de l'ajout d'extrait brut de 1-1318 contenant la Pglucosidase à la cellulase commercialisée de

Trichoderma reesei ( SIGMA) a été étudiée.

Pour mesurer l'activité celluloase, on a utilisé la carboxyméthylcellulase ((Carboxyl Méthyl Cellulase) à 1 % (w/v) comme substrat. Des prélèvements successifs lors de l'incubation permettent de suivre l'évolution de la concentration en glucose ( par le dosage TRINDER tel que décrit dans "Matériel et Méthodes ") ainsi que celle des extrémités réductrices ( par le dosage au D.N.S.). Toutes les cinétiques ont été effectuées à pH 6 dans le tampon citrate

phosphate 100 mM.

a) Etude préliminaire de la cellulase de Trichoderma reesei. Afin de déterminer la température de travail, les activités cellulase et 3-glucosidase (substrat pNPGlu) dans la préparation de T. reesei ont été mesurées à différentes températures ( figure 22). Bien que la p-glucosidase semble

très thermophile, l'activité cellulase est très faible à 620C.

Afin de se placer dans des conditions optimales de dégradation

de la cellulose, on a travaillé à 54 C.

Une vérification préalable de l'effet du glucose sur l'activité cellulase de T. reesei a montré que celui-ci n'avait aucun effet pour des concentrations entre O et 4 g 1-1

( dosage au D.N.S. ainsi que dosage TRINDER). L'ajout de la /-

glucosidase selon l'invention qui augmente la concentration du glucose dans le milieu ne modifie pas l'activité des autres

enzymes du complexe cellulolytique.

b) Essai en présence de la a-qlucosidase de 1-1318 Cet essai a été effectué en présence d'un extrait brut de 1-1318; dans cet extrait brut, l'activité cellulose est

nulle et à 54 C, l'activité /-glucosidase est de 0,35 U ml-1.

Pour 3 ml de Carboxyl Méthyl Cellulose (CMC) on a ajouté 20 Ml de cellulase de T. reesei ( 0,32 U cellulase par D.N.S. et 0,074 U 3glucosidase sur pNPGiu) et des quantités d'extrait 1-1318 variables mais toujours ajustées à 1 ml par

du tampon.

La figure 23 montre que l'addition de la 3-glucosidase n'a aucun effet sur la production de sucres totaux mais augmente la production de glucose. La P-glucosidase de T. reesei est donc limitante dans le complexe cellulolytique mais le cellobiose ne semblerait pas inhiber les enzymes de ce complexe. L'utilisation de la 3- glucosidase de 1-1318 permet donc

d'augmenter la dégradation de la cellulose.

Conclusion: Il ressort des exemples que l'enzyme objet de la présente invention présente un grand nombre d'avantages par rapport aux enzymes déjà décrits: - il est thermostable, - il est activé par le glucose, qui habituellement se comporte comme un inhibiteur des P- glucosidases, ainsi que par diverses molécules et ions, - il présente outre son activité 3-glucosidase des activités f- galactosidase, 3-fucosidase et a-glucosidase, - il peut être produit par une souche qui peut être cultivée à des densités cellulaires relativement importantes

comparativement aux autres Archaebactéries.

Ces caractéristiques sont résumées et comparées avec celles de 3glucosidase de souches déjà connues dans le

tableau 7.

TABLEAU 1

Temps de demi-vie de la 1-glucosidase lors de la dénaturation thermique Temperature (OC) tl/2 à pH 7,5 tl/2 à pH 6 80 14h27' 16h 86,1 -- 11h lhll' 8h20' 36' 3h13'

97,1 20' --

104,3 6'

106,3 3'

TABLEAU 2

Etude de l'activité de la B-qlucosidase en présence de différents ions cationiques Cation Activité (%) Aucun 100 Cu2+ 41,4 Fe2+ 59,9 Fe3+ 25,7 Ni2+ 63,0 Zn2+ 60,9 Ca2+ 71,9 Mg2+ 78,8 Co2+ 68,8 Sr2+ 57,9 Sn2+ 39,0 Li+ 106,8

TABLEAU 3

Hydrolyse d'oligosaccharides par la alucosidase Substrat Structure * Activité relative Cellobiose 2 mM Glu f 1-4 Glu 100 Maltose 2 mM Glu a 1-4 Glu 8,2 Sophorose 2 mM Glu f 1-2 Glu 113,6 Gentiobiose 2 mM Glu f 1-6 Glu 10,4 Laminaribiose 2 mM Glu f 1-3 Glu 135,5 Panose 2 mM Glu a 1-6 Glu 4,5 a 1-4 Glu 4, 5 Tréhalose 2 mM Glu al-al Glu 4,5 Cellobiose 1 mM (Glu f 1-4)2 100 Cellotriose 1 mM (Glu f 1-4)3 90,1 Cellotétraose 1 mM (Glu f 1-4)4 93,5 Cellopentaose 1 mM (Glu A 1-4)5 66,5 Cellulose 1 m o

*: Glu est un résidu glucopyranoside.

TABLEAU 4

Schéma d'une purification type Rendement (%) Taux de purification (- fois) Extrait brut 100 1 Chromatographie d'affinité 59,1 8,2 Hydroxylapatite 32,5 50 Chromatofocalisation 12,6 131

TABLEAU 5

Libération de glucose par la B-qlucosidase en présence de divers substrats Substrat Activité Cellobiose (Glucose 1-4 Glucose) 100 Salicine (2[hydroxyméthyl]phényl m Glucose) 38,8 Lactose (Galactose 31-4 Glucose) 17,4 Saccharose (Glucose a-P2 Fructose) 3,1 Arbutine (Hydroquinone P Glucose) 2,5 Méthylglucose 1,7 Maltose (Glucose a-4 Glucose) 2,1 Trehalose (Glucose a-1-a-1 Glucose) 0 Isomaltose (Glucose a-1-6 Glucose) 0, 8 Panose (Glucose al-6 Glucose al-4 Glucose 0,4 Gentiobiose (Glucose 11-6 Glucose) 4,4 Laminaribiose ( Glucose 11-3 Glucose) 104,9 Sophorose (Glucose 81-2 Glucose) 109,1 Cellotriose (Glucose 1-4)3 79,7 Cellotetraose (Glucose 1-4)4 78,9 Cellopentaose (Glucose 1-4)5 72,0

TABLEAU 6

Dosage du Dara ou ortho-Nitrophénol libéré en présence de divers substrats Substrat Activité pNP A Glucopyranoside 100 pNP p Galactopyranoside 81,9 oNP / <glucopyranoside 27, 7 oNP p Galactopyranoside 47,8 oNP 3 Galactopyranoside 6 Phosphate O pNp a Glucopyranoside 2,1 pNP a Galactopyranoside O pNP Cellobioside 1,6 pNP i Glucuronide O pNP / Mannopyranoside 34,9 pNP p Fucoside 158,3 pNP p Xyloside 43,4 pNP / N Acétylglucosaminide 30,5 pNP a N Acétylglucosaminide O

TABLEAU 7

Caractéristiques de la P-glucosidase selon l'invention et d'enzymes décrits dans l'état de la technique Emulsine Trichoderma Thermus Sulfolobus Pyrococcus 1-1318 d'amande reesei solfataricus furiosus

Localisation surnageant - surnageant intracellu- intracellu- intra-

de culture de culture laire cellulaire cellu-

laire poids moléc.(D) 135 000 75 000 48 000 240 000 232 000 130 000 sous-unités (D) 65 000 81 000 60 000 58 000 60 000 dimère monomère tétramère tétramère dimère pH opt 4,5-5,0 4,5-6,5 6,0 5, 0 6,0 T C opt 850C > 900C 1050C 90 C à pH 7,5 C à pH 6 thermostabilité 5j 75'C 24h 75'C 17011 1000C 8h20 pH6 900C tl/2 17h 80'C 3h 850C 16H11 PH6 800C pI 7,3 8, 5 4,5 4,4 4,3 KM pNGLu (mM) 2,5 0,19 0,28 pNPGal 0,67 0,15 0,145

KM cellobiose 1,25 2,0 lactose 61, 5 20 --

inhibiteurs glucose cellobiose glucose glucose glucose glucose

activateurs glycé-

rol, sor- bitol P-gal P-gal,p-fuc P-glu E-man, P-gal, P-man,p-xyl P-xyl 8-fuc, 3- gal P-man, P-xyl -NAG TABLEAU 7 (Suite) Sources:Emulsine d'amande: Grover et al., 1977, biochim. Biophys. Acta 482 109-124 Grover et Cushley,1977, Biochim. Biophys. Acta,482, 98-108 Dale et al.,1985, Biochem., 24, 3530-3539 Trichoderma reesei: Chirico et Brown,1987, Eur.J. Biochem., 165, 333-341; Estrada et al., 1990,Biochem. Biophys. Acta, 1033,298-304 Thermus sp.: Takase et Horikoshi.,1988, Appl. Microbiol. Biotechnol., 29,55-60

Takase et Horikoshi, 1989, Agric. Biol. Chem., 53(2), 559-560.

Sulfolobus solfataricus: Pisani et al., 1990, Eur. J. Biochem., 734, 1-8; Rossi et al., 1991,Springer Verlag, Ed. par G. di Prisco, 115-123; Pyrococcus furiosus: Kengen et al., 1992, Actes du colloque. Reykjavik 23-26 Août 1992,p27. Abréviations: /-gal: P-galactosidase, P-glu: Pglucosidase,p-xyl: /-xylosidase, P-fuc: /-fucosidase, P-man: Pmannosidase, P-NAG: P-N acétylglucosaminidase pH opt.= pH d'activité optimale T C opt= température d'activité optimale pI = point isoélectrique KM = constante de Michaelis-Menten

Claims (20)

REVENDICATIONS

1. P-glucosidase thermostable et thermophile caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être activée par

le glucose.

2. 3-glucosidase selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente un poids moléculaire de

l'ordre de 130 kD.

3. P-glucosidase selon l'une des revendication 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'un

dimère de deux sous unités d'environ 60 kD.

4. f-glucosidase selon l'une des revendications 1 à 3,

caractérisée en ce qu'elle présente un point isoélectrique

d'environ 4,3.

5. P-glucosidase selon l'une des revendications 1 à 4,

caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être activée par Li.

6. 3-glucosidase selon l'une des revendications 1 à 5,

caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être activée par

l'action séparée du galactose, du sorbitol et du glycérol.

7. P-glucosidase selon l'une des revendications 1 à 6,

caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être inhibée par l'action séparée du NaCl, de l'EDTA, du Fe3+, du Sn2+ et du Cu2+

8. 3-glucosidase selon l'une des revendications 1 à 7,

caractérisée en ce qu'elle dégrade préférentiellement les

liaisons P 1 -- 3, - 1--- 2, 1 > 4 et g 1- 6.

9. 3-glucosidase selon l'une des revendications 1 à 8,

caractérisée en ce qu'elle présente, outre une activité P-

glucosidase, des activités P-galactosidase, 3-fucosidase et

a-glucosidase.

10. Microorganisme caractérisé en ce qu'il produit une

P-glucosidase selon l'une des revendications 1 à 9.

11. Microorganisme selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il appartient au règne des Archae bactéries.

12. Souche de microorganisme selon l'une des

revendications 10 et 11 déposée auprès de la Collection

Nationale de Culture des Microorganismes selon le n I-1318.

13. Produit issu de la souche selon la revendication 12.

14. Produit selon la revendication 13, caractérisé en

ce qu'il est un enzyme thermostable.

15. Procédé d'obtention de la P-glucosidase selon l'une

des revendications 1 à 9 comprenant au moins une étape de

chromatographie d'affinité sur une colonne portant un résidu paraaminophénol-thio-/-galactopyranoside.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la chromatographie d'affinité est suivie par une électrophorèse de la fraction retenue sur la colonne d'affinité puis par et une élution de la bande de migration

électrophorétique correspondant à la P-glucosidase.

17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'étape de chromatographie d'affinité est suivie par une chromatographie d'adsorption sur colonne d'hydroxy lapatite.

18. Procédé selon l'une des revendications 15 et 17,

caractérisé en ce qu'on introduit une étape de chromatofocalisation.

19. Utilisation d'un enzyme selon l'une des

revendications 1 à 9 pour la dégradation de la cellulose.

20. Utilisation d'un enzyme selon l'une des

revendications 1 à 9 pour la synthèse d'oligo-

glycosaccharides.