FR2699190A1 - Procédé pour favoriser la différenciation de cellules, substances protéiques possédant une activité de transfert de lipides, compositions les contenant, séquences d'ADN et sondes d'oligonucléotides correspondantes. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé pour favoriser la différenciation de cellules en culture, notamment en vue de la différenciation tissulaire, de l'embryogénèse, et/ou de l'organogénèse, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture en concentration efficace pour obtenir la différenciation des cellules, au moins une protéine de transfert de lipide ou "LTP" ou un analogue de LTP. Elle concerne également une plante obtenue par un tel procédé, des substances protéiques et protéines possédant une activité de transfert de lipides et une composition comportant au moins une telle substance. Elle concerne enfin une séquence d'ADN codant pour une LTP et une sonde dont la séquence est déduite de la séquence de ladite protéine.

Description

La présente invention concerne un procédé destiné à favoriser la différenciation de cellules en culture, notamment au cours des processus de différenciation tissulaire, d'embryogénèse, ou d'organogénèse ; elle concerne plus particulièrement un procédé destiné à l'obtention d'embryons à partir de culture de cellules somatiques végétales en utilisant des protéines de transfert de lipides qui seront dénommées ci-après LTP, ainsi que ces protéines elles-mêmes et leurs applications.

Le principe de l'obtention d'embryons à partir de culture de cellules somatiques in vitro est bien connu, en théorie. On peut se reporter en particulier à la publication de D.J. Gray & J.A. Mortensen dans la revue
Plant Cell, Tissue and Organ Culture (1987) vol. 9 p. 73-80. En ce qui concerne en particulier les embryons somatiques de vigne, on pourra se reporter au document US 4 532 733. Si l'embryogénèse somatique est praticable pour certaines espèces de plantes, pour d'autres par contre ce procédé est très difficile, voire impossible à mettre en oeuvre.

Pour comprendre les problèmes posés il faut rappeler brièvement les principes de culture de cellules somatiques destinées à la formation d'embryons.

L'embryogénèse somatique comporte essentiellement deux étapes 1- l'induction du potentiel embryogène par des auxines exogènes,
généralement en fortes concentrations, qui permettent l'apparition
d'agrégats (ou masses) proembryogènes (PEM) qui correspondent à des
groupes de 10 à 50 cellules, notamment méristèmatiques.

2- le transfert de ces cellules sur des milieux exempts d'auxines qui
conduisent à la formation d'embryons somatiques à partir de ces PEM,
en suivant les différents stades d'évolution de l'embryogénèse végétale,
à savoir : globules, coeur et torpille.

Pour certaines espèces végétales, l'obtention d'embryons somatiques s'avère très difficile, voire impossible. Par exemple, avec certains cultivars de vigne, les capacités embryogènes des cellules somatiques peuvent être stoppées, la plupart du temps au stade de la formation des agrégats proembryogènes, ou bien, la maturation des embryons est bloquée, notamment au stade globulaire.

Ceci est d'autant plus gênant qu'il existe, en particulier pour la vigne, un très grand besoin d'obtention à grande échelle d'embryons somatiques, in vitro. En effet, les méthodes in vivo de production d'embryons sont souvent insuffisantes et non souhaitables, car elles conduisent en règle générale à des recombinaisons génétiques, ce qui entraîne la perte des caractères génétiques originaux du cépage ou du porte-greffe que l'on souhaite multiplier.

La demande EP 281375, a proposé l'addition de calmoduline et de calcium à une culture cellulaire pour favoriser la différenciation des racines et des embryons.

La demande EP 455597 décrit une méthode de stimulation de la croissance et l'embryogénèse des plantes cultivées in vitro, par addition d'arabino-galactane protéines. I1 a cependant été démontré (de Vries et al, 1989, Proceedings of the International Symposium of Biotechnology for
Major Crops (A.D.E.B.I.O. ed.), pages 22-23) qu'une glycoprotéine extracellulaire de 52/54 kDa induit un arrêt du développement embryonnaire au stade coeur.

La présente invention repose sur la mise en évidence de protéines permettant d'assurer ou de stimuler la différenciation cellulaire, et notamment l'embryogénèse somatique, même dans certaines conditions non permissives, notamment à partir de cellules somatiques de vigne, lesdites protéines pouvant également avoir d'autres applications.

Au sens du paragraphe précédent, on entend par "conditions non permissives" par rapport à la réalisation d'un phénomène donné, des conditions connues de l'état de la technique qui empêchent partiellement ou totalement le phénomène de se réaliser.

C'est pourquoi, suivant un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé pour favoriser la différenciation de cellules en culture, notamment en vue de la différenciation tissulaire, de l'embryogénèse, ou de l'organogénèse, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture en concentration efficace pour obtenir la différenciation des cellules au moins une protéine de transfert de lipide ou "LTP", ou un analogue de LTP. Par analogue de LTP, on entend toute substance protéique, telle que protéine, fragment de protéine ou polypeptide, présentant au moins 30% d'homologie avec une LTP ou avec un fragment de LTP.

De préférence, la protéine de transfert de lipides est une LTP pouvant être obtenue à partir de cellules appartenant au même genre ou à la même espèce que les cellules en culture.

Suivant un deuxième aspect, la présente invention concerne un procédé d'obtention d'embryons somatiques végétaux à partir d'une culture de cellules somatiques in vitro, caractérisée en ce qu'on ajoute au milieu de culture, en concentration efficace pour assurer l'embryogénèse, au moins une protéine de transfert de lipides ou LTP, ou un analogue de LTP.

Les raisons pour lesquelles l'embryogénèse somatique de la vigne est bloquée sont multiples. De façon générale on utilisera pour les conditions dans lesquelles la formation d'embryons n'est pas possible ou au mieux très difficile ou faible, la terminologie "conditions non permissives", comme définie plus haut.

De même, dans ce qui suit, on utilisera de façon générale le terme maturation pour désigner les phénomènes de développement et de germination de l'embryon végétal somatique, passant ainsi par les stades de développement suivants : globule, coeur, torpille et plantule.

La technologie de culture cellulaire in vitro de cellules somatiques est connue et devra bien entendu être adaptée à chacune des cellules en cause, les conditions physico-chimiques, milieux de culture et environnement étant adaptés de façon à permettre la multiplication et la formation d'agrégats proembryogènes, puis ensuite l'embryogénèse. Les milieux correspondants seront appelés "milieux de culture pour embryogénèse".

Les LTP utilisables selon l'invention peuvent être introduites à tout moment dans le milieu de culture. Ainsi on a pu mettre en évidence que dans le cas où les cellules somatiques étaient placées dans des conditions non permissives d'embryogénèse, il était possible néanmoins d'observer la formation d'embryons dans la mesure où l'on rajoutait au milieu de culture des protéines de transfert de lipides.

Kader et al (Methods Enzymol., 1987, 148, 661-666) ont identifié une LTP isolée de jeunes plants de maïs. Des protéines de transfert de lipides non spécifiques ont pu être caractérisées dans l'endosperme de graine de ricin, les feuilles d'épinard, et dans l'aleurone d'orge. Des LTP sont présentes également chez la carotte et le millet. Les
LTP connues du domaine végétal sont des protéines ayant généralement un poids moléculaire d'environ 10 kDa ; les LTP non spécifiques et la plupart des LTP spécifiques sont des protéines basiques, présentant un point isoélectrique supérieur à 8.

Les inventeurs ont pu mettre en évidence le fait que la présence d'auxine dans le milieu, qui très souvent entraîne l'apparition de conditions non permissives, n'était pas un obstacle à la formation d'embryons si l'on rajoute des LTP.

Selon un mode de mise en oeuvre du procédé, la LTP ou l'analogue de LTP est ajoutée dans le milieu d'induction et/ou de multiplication des agrégats de cellules proembryogènes, contenant généralement une auxine. On observe alors une augmentation du pouvoir embryogène de la souche et une augmentation du nombre d'agrégats proembryogènes formés.

Le procédé selon la présente invention est également particulièrement intéressant pour obtenir la formation d'embryons et leur maturation, surtout dans le cas où il s'agit de cellules transformées. Ainsi selon l'invention, les LTP peuvent être introduites dans le milieu de maturation des embryons, qui est, selon l'art antérieur, généralement exempt d'auxine, voire sensiblement exempt d'auxine. Cependant, c'est un avantage de l'invention que, même en présence d'auxine, et malgré cette présence, l'addition de LTP favorise ou permet la maturation des embryons.

Ainsi, suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, la LTP ou l'analogue de LTP est ajoutée dans le milieu de maturation des embryons. Ce milieu de maturation peut être sensiblement exempt d'auxine. Mais selon une autre variante du procédé d'obtention d'embryons somatiques végétaux, le milieu de maturation contient une auxine, notamment en quantité nécessaire pour assurer la viabilité de la culture cellulaire.

Parmi les auxines, on peut citer l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4 D), l'acide l-naphtalèneacétique (NAA), l'acide 2-naphtoxyacétique (NOA).

En particulier il peut être intéressant d'utiliser des LTP dans des milieux de culture de cellules transformées, notamment de cellules de vigne, surtout dans le cas où la souche cellulaire présente une embryogénèse somatique perturbée. Par exemple, ces cellules ont été transformées par biolistique (par canon à particules) ou par des vecteurs de clonage appropriés, tels que des vecteurs dérivés d'Agrobactérium ou d'autres systèmes de type viraux. Dans ce cas, l'étape de multiplication n'a pas forcément lieu d'être, et la maturation peut avoir lieu directement.

Suivant un mode particulier de réalisation du procédé selon l'un ou l'autre des deux aspects précités, la LTP ou l'analogue de LTP est présente dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 1 et 1 001lg/ml de milieu, de préférence entre 1 et 501lg/ml.

Suivant un autre mode particulier selon l'un ou l'autre de ces deux aspects, la culture de cellules précitée est une culture de cellules de vigne.

Suivant différents autres modes de mise en oeuvre du procédé selon l'un ou l'autre des deux aspects précités, la LTP ou l'analogue de
LTP, comporte au moins une séquence d'acides aminés présentant au moins 80% d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 2.

En particulier la LTP ou l'analogue de LTP précitée comporte au moins une séquence d'acides aminés présentant pratiquement 100% d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 2.

Egalement, la LTP ou l'analogue de LTP, possède un poids moléculaire d'environ 9 kDa.

De préférence, la protéine de transfert de lipides est une LTP pouvant être obtenue à partir de cellules appartenant au même genre ou à la même espèce que les cellules en culture. Par exemple, dans le cas de l'embryogénèse de la vigne, il est intéressant d'utiliser comme cela sera décrit plus en détail ci-après, des protéines PI, P2, P3 ou P4 de la vigne, de même que leurs dérivés, les polypeptides et leurs fragments ayant de préférence des propriétés de transfert de lipides.

En particulier, on peut utiliser une LTP de vigne, de carotte, d'épinard, de millet, de maïs, d'orge ou de colza.

Suivant un troisième aspect, l'invention concerne également une plante obtenue par l'un quelconque des procédés de l'invention précités.

Parmi les LTP utilisables, notamment dans le cas des embryons de vignes, il faut citer plus particulièrement quatre protéines qui ont été mises en évidence dans le cadre de la présente invention, à savoir
P1, P2, P3 et P4, ainsi que les protéines ou fragments desdites protéines ou polypeptides présentant au moins 80% d'homologie avec au moins l'une de ces protéines, ou les fragments correspondant desdites protéines, notamment les protéines partiellement délétées mais qui, de préférence ont gardé les capacités de transfert des lipides.

La séquence N-terminale de ces quatre protéines est indiquée dans la figure 1 ci-annexée, la pureté de ces protéines a été confirmée par la présence d'un seul type d'extrémité N-terminale pour chaque échantillon.

Les protéines correspondantes sont des protéines qui sont non N-glyco stylées.

Ainsi, suivant un quatrième aspect, la présente invention concerne une substance protéique constituée en particulier d'une protéine, d'un fragment de protéine ou d'un polypeptide, caractérisée en ce que ladite substance protéique comporte une séquence d'acides aminés, située de préférence à son extréminé N-terminale, présentant au moins 80% d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 1, et possédant de préférence une activité de tranfert de lipides, notamment de phospholipides.

En particulier, ladite substance protéique comporte une séquence d'acides aminés présentant pratiquement 100% d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 1.

Les protéines P1, P2, P3 et P4 qui seront décrites plus en détails ci-après, correspondent à la définition précédente.

Les protéines P1 et P2 présentent la même séquence sur les 40 premiers amino-acides à compter de l'extrémité N-terminale, alors que les compositions en amino-acides des protéines P3 et P4 sont différentes. I1 ressort de cette observation que les protéines P1 et P2 ayant la même séquence, pourraient représenter une même protéine, ayant subi des modifications post-traductionnelles, alors que P3 et P4 représentent deux autres isoformes. Les séquences de ces protéines présentent également de grandes similarités avec d'autres séquences de protéines établies pour d'autres espèces végétales.

L'analyse des homologies entre les séquences des 40 premiers acides aminés à compter de l'extrémité N-terminale, appartenant à des LTP de différentes origines, a été effectuée par le progiciel de l'University of
Wisconsin Genetic Computer Group (Nucleic Acid Research. 12, 387-395, 1984). Elle est représentée sur la figure 2.

La numérotation des acides aminés est donnée en fonction du système utilisé pour la détermination des homologies entre les différentes
LTP telle qu'elle est montrée à la figure 2. Cette numérotation tient compte du décalage nécessaire à l'apparition des alignements de l'homologie maximum.

On constate que, pour ces protéines, certains acides aminés conservent les positions suivantes - 2 cystéine, respectivement en position 4 et 14, - 1 ou 2 cystéine, respectivement en position 30 et 31, - 1 valine, en position 7, - 1 tyrosine, en position 17, - 1 leucine, en position 37, et avec une très forte probabilité - 3 glycine, respectivement en position 5, 22 et 33 - 1 proline en position 25 - 1 lysine en position 35 - 1 alanine en position 40
Les masses moléculaires des protéines de vigne P1, P2, P3 et
P4 sont rassemblées dans le tableau I: :
TABLEAU I
Protéines Calcul de la masse moyenne (Da)
P1 9102.5 + 3.0
P2 9270.5 + 0.4
P3 9273.0 + 3.1
P4 9090.2 + 7.0
Les quatre protéines en cause possèdent une activité de transfert de lipides, comme cela a été démontré par des essais de transfert in vitro de phosphatidyl-choline tritiée, entre des liposomes (système membranaire donneur) constitués de ce phospholipide et des mitochondries constituant le système membranaire receveur, suivant la méthode décrite par Douady D. et al. dans la revue Biochim. Biophys. Acta (1982) vol. 710 p.

143-153.

Les activités spécifiques de ces protéines sont toutefois assez différentes, comme indiqué dans le tableau II.

TABLEAU II
Protéines Activité spécifique
(nmol.min mg~l prot)
P1 15
P2 17,8
P3 4,3
P4 5,3
LTP de maïs purifié 5,7
On constate que les protéines P1 et P2 présentent une très haute activité spécifique tandis que l'activité des protéines P3 et P4 est trois fois plus faible.

Dans les exemples on donnera un procédé permettant d'isoler ces protéines par des méthodes physicochimiques, mais il est bien entendu que connaissant l'enchaînement des quarante premiers aminoacides, il est possible d'en déduire une séquence d'ADN codant pour les protéines et donc de faire synthétiser ces protéines par le moyen de cellules recombinantes.

Ainsi, suivant un cinquième aspect, la présente invention a également pour objet une séquence d'ADN codant pour une protéine telle que définie dans l'aspect précédent
Suivant un sixième aspect, la présente invention concerne également les différentes utilisations de substances protéiques telles que définies précédemment lors de la description du quatrième aspect de l'invention, notamment dans des compositions les comportant seules ou en association avec d'autres principes actifs, notamment des composés lipidiques. Ces compositions peuvent être utilisées, par exemple comme additif pour des cultures cellulaires, mais peuvent être également utilisées pour d'autres applications dans le domaine biologique dans lequel leur activité de transfert de lipide et/ou sur la différenciation tissulaire peut se révéler précieux.

Suivant enfin un dernier aspect, la présente invention a également pour objet une sonde constituée par au moins un oligonucléotide, caractérisée en ce que la séquence en bases dudit oligonucléotide est déduite d'une partie de la séquence en acides aminés d'une substance protéique telle que précédemment définie, en particulier de l'une des protéines P1 à P4. Ces sondes, marquées par des méthodes connues de l'homme de métier (Molecular cloning, A. Laboratory Manual, T. Maniatis,
E.F. FRITSCH, J. SAMBROOK, Cold Spring Harbour Laboratory 1982) seront utilisées pour détecter les LTP endogènes et objectiver les processus de différenciation cellulaire.

Plus particulièrement, la séquence précitée de l'oligonucléotide est déduite d'une séquence en acides aminés qui comporte au moins 6 ou 7 acides aminés, de préférence à compter de la position 3 de l'extrémité N-terminale de la substance protéique, notamment de la protéine.

La sonde peut également être constituée d'un mélange d'oligonucléotides tels que définis précédemment.

Les exemples ci-après sont destinés à illustrer d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.

Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes
Figure 1 : Séquences des protéines P1, P2, P3 et P4
Figure 2 : Séquences comparées des LTP de différentes espèces
Figure 3 : Effet de l'addition de la fraction F1 (protéines P1, P2 et P3)
sur la maturation des embryons en présence de différentes
concentrations d'auxine et à deux densités cellulaires
différentes, comparé à une culture témoin.

Figure 4 : Effet de l'addition de la fraction F1 sur la différenciation au
stade pré globul aire, en présence de différentes concentrations
d'auxine et à deux densités cellulaires différentes
Figure 5 : Effet de l'addition à différentes concentrations de la
fraction F2 (protéine P4) sur la maturation des embryons.

EXEMPLE 1 : Préparation des protéines P1, P2, P3 et P4
On utilise une suspension de cellules de vigne dérivée de la lignée 41 B (Vitis vinifera cv. Chasselas x Vitis berlandieri). La croissance indifférenciée de ces cellules est maintenue par des sous-cultures hebdomadaires en présence d'auxine, l'acide 2-naphtoxy acétique (NOA) à la concentration de 5 pM, comme cela a été décrit précédemment par
Coutos-Thevenot, et al. dans le document Plant Cell Tissue Organ Culture 29, 125-133 (1992).

Afin d'initier la différenciation embryogène, les cellules filtrées sont lavées dans un milieu exempt d'auxines et inoculées à raison de 1 ul dans un milieu de culture CMo selon le protocole décrit dans le même document
Après 15 jours d'incubation, le milieu est récolté en séparant tout d'abord les PEMs ou les embryons avec un filtre particulaire en verre n"2 et n04 respectivement (Pyrex France). Le milieu conditionné est clarifié en le passant sous vide à travers une membrane en fibre de verre (GF/C
Whatman) et concentré 100 à 200 fois en utilisant un système d'ultrafiltration AMICON avec une membrane AMICON YM3 (seuil de coupure 3 kDa). Le contenu en protéines est déterminé par la méthode de Lowry.

Les protéines sont purifiées à l'aide d'un système HPLC (Waters Massachussets USA) utilisant un détecteur UV M 440 dans les conditions suivantes 1) le milieu récolté après 15 jours d'incubation et concentré 100 fois, est
chargé sur une colonne d'échange de cations (modèle SP5PW de Waters
Massachussets USA) préalablement équilibré avec un tampon 25mM de
phosphate de sodium pH 6,5 (vitesse 0,8 ml/minute). Environ 4mg de
protéines sont disposés sur la colonne. Les protéines basiques sont
éluées en 30 minutes par un gradient linéaire de solutions aqueuses de
chlorure de sodium 0 à 0,3 M. Les fractions correspondant aux
différents pics observés sur le profil d'élution sont collectées et
analysées par électrophorèse SDS-PAGE.On obtient deux fractions
présentant un poids moléculaire d'environ 10 kDa, qui sont ensuite
soumises à une seconde étape de purification. La fraction F1
représente 15,3% en poids des protéines basiques initiales, et la
fraction F2 représente 10,2% 2) Les échantillons (lv/v) dilués avec un tampon (3,6 M de sulfate
d'ammonium, 100mM de phosphate de sodium pH 7) sont chargés sur
une colonne hydrophobe (HIC PH214 de Shodex Tokyo Japon), dont la
phase mobile est une solution tampon à pH 7 contenant 1,8 mole de
sulfate d'ammonium et 100mM de phosphate de sodium. La vitesse de
passage est de de lml/mn. Les protéines fixées sont éluées par un
gradient linéaire décroissant de 1,8M à OM de sulfate d'ammonium en
30 mn. Les fractions correspondant aux différents pics sont assemblées
et désalées sur Sephadex G25M (PD-10 de Pharmacia). Après
détermination de la concentration en protéines selon la méthode de
Lowry, les fractions sont concentrées en utilisant un concentrateur
Speedvac (modèle SPD2DVAC modèle SVC 100H de Savant Instrument
Inc. New-York, USA).

Le profil d'élution obtenu pour le premier pic majeur (fraction F1) de l'étape 1 fournit 3 pics secondaires correspondant aux protéines P1,
P2, et P3. La protéine P4 est récupérée dans L'éluvion du second pic majeur (fraction F2) de l'étape 1.

Pour 100 llg de la fraction F1, on recueille après ce traitement chromatographique 42,5 ug de P1, 6,54 pg de P2 et 0, 33 pg de
P3. A partir de 100 pg de la fraction F2, on recueille 46 ug de P4.

EXEMPLE 2 : Analyse des protéines P1, P2, P3 et P4
a) détermination des masses moléculaires
Les masses moléculaires des protéines P1, P2, P3 et P4 ont été déterminées de manière conventionnelle par spectrométrie de masse. Les résultats figurent au tableau I.

b) détermination des séquences d'aminoacides
La séquence N-terminale sur 40 acides aminés a été analysée au moyen d'un séquenceur 470A en phase gaz liquide (ABI, Foster City,
Californie). Les acides aminés phénylhydantoine sont analysés sur analyseur on line 120A.

Les résultats de cette analyse sont représentés en figure 1 ci-annexée.

Les séquences P1 à P4 ont été comparées aux séquences de protéines LTP de carotte (c) épinard (s) de millet (Mi) et de maïs (M).

Les pourcentages d'homologie entre ces protéines sur les 40 premiers aminoacides figurent au tableau III.

TABLEAU III
LTP P1 P2 P3 P4 C S Mi M
P1 100 100 32 53 35 63 45 37
P2 100 32 53 35 63 45 37
P3 100 32 35 43 35 43
P4 100 36 39 38 41
C 100 32 36 44
S 100 37 39
Mi 100 74
M 100
On remarque une homologie totale pour les protéines P1 et
P2, tandis que les protéines P3 et P4 présentent une plus faible homologie entre elles.

c) Détermination de l'activité sur les transferts de
lipides
Les quatre fractions protéiques et une LTP purifiée de maïs utilisée comme témoin sont testées pour leur activité de transfert de lipides, par la technique décrite par Douady, D., Grosbois, M., Guerbette, F.

and Kader, J.C. (1982) Biochim. Biophys. Acta 710, 143-153. Les protéines sont incubées pendant 30 minutes à 30"C avec des mitochondries purifiées de maïs et avec une préparation de liposomes radioactifs. Le marquage est effectué d'une part avec de la phosphatidylcholine tritiée et d'autre part avec un lipide non transférable par ces LTP : le cholestéryle (1-14C) oléate. Après centrifugation, les mitochondries sont remises en suspension dans 1% de Triton X 100 et l'on mesure le rapport des activités (en cpm) entre 3H et 14C pour déterminer l'activité de transfert qui est exprimée en pourcentage de phosphatidylcholine tritiée transférée après correction de la radioactivité contaminante due au cholestéryle oléate non échangé.

Les protéines peuvent être classées en deux groupes en fonction de leur capacité à transférer les phospholipides (cf. Tableau II).

Les protéines P1 et P2 présentent de hautes activités spécifiques, alors que les activités des protéines P3 et P4 sont trois fois plus basses et proches de celles trouvées pour la LTP de maïs.

EXEMPLE 3 Effet des protéines P1, P2 et P3 sur l'initiation et maturation
des embryons
1) Matériel et méthodes
Le milieu de culture employé pour le développement d'embryons somatiques est un milieu de culture liquide MS modifié, comprenant notamment 18 g/l de maltose et 4,6 g/l de glycérol remplaçant le sucrose et 1 g/l d'hydrolysat de caséine.

Ce milieu est employé à un pH de 5,8 ajusté par l'addition de soude 0,yin ; soit tel que, soit additionné de NOA (acide naphtoxyacétique) à des concentrations de 0,5 uM ou 5 ,uM.

Le milieu de culture est autoclavé 20 min à 120"C. Les cultures cellulaires indifférenciées, provenant de la culture cellulaire entretenue selon le protocole de l'exemple 1, sont filtrées successivement au travers de filtres de nylon ayant des pores d'une taille de 500 um, puis de 200 pm, de manière à ne conserver pour l'inoculation de la culture que des agrégats cellulaires de taille comprise entre ces deux valeurs.

Les agrégats cellulaires indifférenciés retenus sur le second filtre sont alors lavés 3 fois avec du milieu MS modifié, puis mis en suspension dans 30 ml de ce milieu.

La densité cellulaire exprimée en ul de volume cellulaire par ml de milieu est déterminée après sédimentation (lxg) des cellules dans un tube gradué conique.

On inocule alors 80 ml de milieu de culture MS modifié, (contenant selon les cas NOA à 0, 0,5 ou 5 pM) avec une suspension d'agrégats cellulaires à une densité de 0,1 ou 1 ,ul/ml, dans une fiole
Erlenmeyer de 250 ml.

Pour des applications expérimentales, les volumes de milieu de culture peuvent être réduits à environ 1 ml, en boîtes de microtitration 24 puits (Falcon) mais la densité cellulaire doit être respectée.

Les milieux de culture sont alors complémentés à To de l'expérience par des doses croissantes de la fraction protéique F1 isolée selon l'exemple 1 et contenant essentiellement les LTP P1, P2 et P3. Les doses respectives sont de 2 et 10 pg/mI ; un témoin sans LTP est également cultivé.

2) Effets sur l'initiation
La figure 4 représente le développement des agrégats proembryogènes vers le premier stade globulaire de l'embryon, en présence d'auxine à des concentrations respectives de 0,5 et 5 pM pour des densités d'agrégats cellulaires de 0,1 et 1 ,ul/ml exprimés en unité de volume cellulaire sédimenté (PCV = packed cell volume) par unité de volume du milieu.

Les courbes de développement des structures proembryogènes sont établies en utilisant des unités arbitraires : 0 pour des PEM indifférenciés, 4 pour des embryons au stade globulaire, les valeurs 1, 2 et 3 correspondant à des stades intermédiaires d'embryons pro globulaires dans la masse cellulaire.

Pour 0,5 pM NOA et une densité d'agrégats de 0,1 ,ul/ml sans addition de LTP, les premiers globules n'apparaissent qu'après 21 jours.

Ce délai d'apparition des premiers globules est raccourci à 11 jours quand le milieu est complémenté par 2 ,ug/ml de LTP, et à 6 jours quand le milieu est complémenté par 10 pg/ml de LTP. On observe le même effet pour une densité de 1 Ill/ml, avec un léger retard.

Il y a donc une accélération très importante du développement des embryons lorsque le milieu contient une LTP.

En présence de 5 pM NOA, il n'y a pas de formation de globules dans les cultures s'il n'y a pas eu complémentation par des LTPs.

Pour une densité cellulaire initiale de 0, 1 pl/ml, on obtient des globules parfaitement différenciés à 21 jours dans le milieu complémenté par 10 pg/ml de fraction F1.

Avec une densité cellulaire initiale de 1 ul/ml, l'auxine est rapidement métabolisée et il y a un début de différenciation même en l'absence de LTP. La différenciation est accélérée par la complémentation en fraction F1.

3) Résultats sur la maturation des embryons
En l'absence d'auxine, la durée totale du développement des embryons, passant par les différents stades de développement globulaire, coeur puis torpille, est d'environ 15 jours en présence de 10 pg/ml de LTP.

La figure 3 montre la progression de l'embryogénèse par comptage des proportions des embryons aux différents stades de leur développement dans un milieu ne contenant pas d'auxine, par rapport au nombre total d'embryons. La complémentation du milieu de culture est effectuée au début de la culture avec la fraction F1 à une concentration en protéines de 10 ,ug/ml(10)ou un volume équivalent de tampon (0). En A sont représentés les résultats pour une densité cellulaire initiale de 0,1 Ill/ml; et en B pour une densité initiale de 1 pl/ml.

(A) à 0,1 'il PCV/ml.

A cette densité cellulaire, les embryons ne sont pas bloqués en conditions classiques de culture et peuvent atteindre le stade plantule.

En présence de LTP, à 17 jours il y a déjà présence de plantules alors que dans le contrôle, les embryons sont encore au stade torpille.

I1 y a donc accélération du développement des embryons.

(B) à 1 1ll de PCV/ml.

Dans ces conditions de densité les embryons sont en général bloqués au stade coeur.

Sans LTP, à 17 jours, la majorité des embryons sont au stade coeur et y restent bloqués.

Avec LTP la majorité des embryons sont au stade torpille : il y a donc une accélération du développement des embryons, sans que ne se produise de blocage à un stade déterminé.

Par ailleurs, il a été montré qu'en présence d'auxine, et en l'absence de LTP, le développement des embryons est bloqué au stade globule. Par contre, grâce à l'ajout de LTP au milieu de culture, il n'est observé aucun blocage. Par exemple, l'addition de 10 ug/ml de la fraction
F1 au temps To dans le milieu de culture contenant l'auxine NOA à la concentration de 0,5 pM, permet d'obtenir au bout de 21 jours de culture, pour 100 embryons comptés : 59 au stade globule, 20 au stade coeur, 11 au stade torpille et 9 au stade plantule.

EXEMPLE 4 : Effet de la protéine P4 sur la maturation des embryons
La complémentation du milieu est réalisée selon un protocole similaire à celui décrit dans l'exemple 3, en utilisant la fraction F2, qui contient essentiellement la LTP P4.

La figure 5 montre les résultats obtenus après 21 jours de culture, en présence de NOA à la concentration de 5 pM pour une densité cellulaire initiale de 0,1 ,ul/ml, et en présence de différentes concentrations de la fraction F2 : 0, 1, 2 et 3 ug/ml.

En l'absence de LTP, il n'y a pas de différenciation. Celle-ci est induite par la complémentation du milieu en fraction F2.

L'effet de la fraction F2 est plus lent à apparaître. A 21 jours de culture, une faible proportion d'embryons seulement a atteint le stade coeur.

Claims (21)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour favoriser la différenciation de cellules en culture, notamment en vue de la différenciation tissulaire, de l'embryogénèse, et/ou de l'organogénèse, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture en concentration efficace pour obtenir la différenciation des cellules, au moins une protéine de transfert de lipide ou "LTP" ou un analogue de LTP.

2. Procédé d'obtention d'embryons somatiques végétaux à partir d'une culture de cellules somatiques in vitro, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu de culture, en concentration efficace pour assurer

I'embryogénèse, au moins une protéine de transfert de lipide ou "LTP", ou un analogue de LTP.

3. Procédé d'obtention d'embryons somatiques végétaux selon la revendication 2, caractérisé en ce que la LTP ou l'analogue de LTP est ajoutée dans le milieu d'induction et/ou de multiplication des agrégats de cellules proembryogènes, contenant généralement une auxine.

4. Procédé d'obtention d'embryons somatiques végétaux selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que la LTP ou l'analogue de LTP est ajoutée au milieu de maturation des embryons.

5. Procédé d'obtention d'embryons somatiques végétaux selon la revendication 4, caractérisé en ce que le milieu de maturation est sensiblement exempt d'auxine.

6. Procédé d'obtention d'embryons somatiques végétaux selon la revendication 4, caractérisé en ce que le milieu de maturation contient une auxine, notamment en concentration nécessaire pour assurer la viabilité de la culture.

7. Procédé selon 11 une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la LTP ou l'analogue de LTP est présente dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 1 et 100 Ug/ml de milieu, de préférence ente 1 et 50 llg/ml.

8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la culture cellulaire est une culture de cellules de vigne.

9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la LTP ou l'analogue de LTP comporte au moins une séquence d'acides aminés présentant au moins 80% d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 2.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la

LTP ou l'analogue de LTP précitée comporte au moins une séquence d'acides aminés présentant pratiquement 100% d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 2.

11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la LTP ou l'analogue de LTP a un poids moléculaire d'environ 9 kDa.

12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la protéine de transfert de lipide est une LTP pouvant être obtenue à partir de cellules appartenant au même genre que les cellules en culture.

13.-Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la LTP est une LTP de vigne, de carotte, d'épinard, de millet, de maïs, d'orge ou de colza.

14. Plante obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 13.

15. Substance protéique constituée en particulier d'une protéine, d'un fragment de protéine ou d'un polypeptide, caractérisée en ce que ladite substance protéique comporte une séquence d'acides aminés, située de préférence à son extrémité N-terminale, présentant au moins 80% d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 1, et possédant de préférence une activité de transfert de lipides, notamment de phospholipides.

16. Substance protéique selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle comporte une séquence d'acides aminés présentant pratiquement 100 % d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 1.

17. Séquence d'ADN codant pour une protéine selon la revendication 15 ou 16.

18. Composition comportant au moins une substance protéique selon la revendication 15 ou 16.

19. Sonde constituée par au moins un oligonucléotide, caractérisée en ce que la séquence en bases dudit oligonucléotide est déduite d'une partie de la séquence en acides aminés de la substance protéique selon la revendication 15 ou 16.

20. Sonde selon la revendication 19, caractérisée en ce que la séquence en acides aminés précitée comporte au moins 6 ou 7 acides aminés, de préférence à compter de la position 3 de l'extrémité

N-terminale de la substance protéique.

21. Sonde constituée d'un mélange d'oligonucléotides tels que définis à la revendication 19 ou 20.