FR2688005A1

FR2688005A1 - MEANS FOR THE CONTROL OF PRODUCTS CONTAINING DAIRY PROTEINS.

Info

Publication number: FR2688005A1
Application number: FR9202398A
Authority: FR
Inventors: Rolland Marie-Paule; Bitri Lotfi; Lafont Jacques; Besancon Pierre
Original assignee: Universite Montpellier 2 Sciences et Techniques
Current assignee: Universite Montpellier 2 Sciences et Techniques
Priority date: 1992-02-28
Filing date: 1992-02-28
Publication date: 1993-09-03
Anticipated expiration: 2012-02-28
Also published as: FR2688005B1; WO1993017042A1

Abstract

Peptides capable of forming antibodies which are able to react specifically with a milk protein of a given species. Said antibodies and antiserums containing them are used to test for the presence of milk proteins in products, for example, foods or cosmetics.

Description

MOYENS POUR LE CONTROLE DE PRODUITS RENFERMANT DES
PROTEINES LAITIERES
L'invention a pour objet des moyens pour le contrôle de produits renfermant des protéines laitières.MEANS FOR THE CONTROL OF PRODUCTS CONTAINING
DAIRY PROTEINS
The invention relates to means for the control of products containing milk proteins.

Elle se rapporte plus spécialement à des peptides immunogènes et aux anticorps formés contre ces peptides ainsi qu'à l'utilisation de ces anticorps dans une méthode immunologique de détection de protéines laitières d'une espèce animale donnée dans un produit à contrôler. It relates more specifically to immunogenic peptides and to the antibodies formed against these peptides as well as to the use of these antibodies in an immunological method for detecting milk proteins of a given animal species in a product to be checked.

Par "protéines laitières", on désigne, dans la description et les revendications, aussi bien les protéines de lait, que des fractions protéiques de lait ou des dérivés protéiques de lait, quelles que soient leur nature et leur origine ; ou les peptides dérivés. I1 s'agit de protéines naturelles, ou obtenues par voie de synthèse, ou encore de protéines recombinantes telles que préparées selon les techniques du génie génétique. By "dairy proteins", is meant, in the description and the claims, both milk proteins, as milk protein fractions or milk protein derivatives, whatever their nature and origin; or the derived peptides. These are natural proteins, or proteins obtained by synthesis, or alternatively recombinant proteins as prepared according to the techniques of genetic engineering.

L'invention vise, notamment, la détection d'adultérations ou de mélanges de produits laitiers provenant d'une espèce animale donnée avec des laits ou composants laitiers d'autres espèces. The invention relates, in particular, to the detection of adulterations or mixtures of dairy products originating from a given animal species with milk or milk components of other species.

En matière par exemple de fabrication de produits laitiers, dans les pays industrialisés, les usages vernaculaires ont peu à peu été codifiés. Dans le but de garantir au consommateur la conformité du produit, l'un des critères exigés est l'indication de l'espèce animale dont doit provenir le lait utilisé pour l'élaboration du produit laitier. In the area of the manufacture of dairy products, for example, in industrialized countries, vernacular uses have gradually been codified. In order to guarantee the conformity of the product to the consumer, one of the criteria required is the indication of the animal species from which the milk used to prepare the dairy product must come.

Si, en Europe, l'essentiel des productions laitières et fromagères provient de l'espèce bovine, les pays méditerranéens produisent aussi du lait de brebis et du lait de chèvre à des coûts très différents du lait de vache, ce dernier étant par exemple trois à quatre fois moins cher que le lait de brebis. Il en résulte des risques de fraudes par coupage. If in Europe most of the milk and cheese production comes from the bovine species, the Mediterranean countries also produce sheep's milk and goat's milk at very different costs from cow's milk, the latter being for example three four times cheaper than sheep's milk. This results in risks of cutting fraud.

On sait que certains mélanges sont autorisés sous certaines conditions en particulier d'étiquetage, par exemple l'addition de lait de vache, ou dérivés, à du lait de chèvre. Il est donc indispensable de pouvoir contrôler le mélange effectué. It is known that certain mixtures are authorized under certain conditions, in particular labeling, for example the addition of cow's milk, or derivatives, to goat's milk. It is therefore essential to be able to control the mixing carried out.

Par ailleurs, l'addition de produits laitiers issus de technologies séparatives peut être autorisée. Ces additifs, jusqu'à présent exclusivement issus du lait de vache, sont des protéines purifiées : caséinates, protéines du lactosérum. Leur utilisation constitue donc un autre type d'adultération possible. In addition, the addition of dairy products from separation technologies may be authorized. These additives, so far exclusively from cow's milk, are purified proteins: caseinates, whey proteins. Their use therefore constitutes another possible type of adulteration.

Enfin, le marché des produits laitiers évolue - importations de lait de brebis ou de chèvre - mise sur le marché de fromages mixtes (mélanges de
vache ou chèvre dans brebis, de vache dans chèvre),
certains en provenance de pays dans lesquels les
codifications ne sont pas clairement établies.Finally, the market for dairy products is changing - imports of sheep's or goat's milk - marketing of mixed cheeses (mixtures of
cow or goat in sheep, cow in goat),
some from countries where
codifications are not clearly established.

- utilisation de produits laitiers comme ingrédients
dans de nombreuses préparations.- use of dairy products as ingredients
in many preparations.

La recherche d'adultérations interspécifiques, accidentelles ou frauduleuses, des produits laitiers, ou de manière générale de produits renfermant des protéines laitières, correspond donc à une préoccupation majeure. The search for interspecific, accidental or fraudulent adulterations of dairy products, or generally of products containing dairy proteins, therefore corresponds to a major concern.

De nombreuses méthodes analytiques ont été proposées pour identifier le lait de différentes espèces (en particulier celui de vache, brebis et chèvre) au travers de ses composants et le détecter spécifiquement dans des produits plus ou moins remaniés comme par exemple les fromages, pour lesquels les procédés technologiques de fabrication (tels que pasteurisation, stérilisation, ultrafiltration) et les processus d'affinage amènent un remaniement qualitatif et quantitatif complet du produit. Many analytical methods have been proposed to identify the milk of different species (in particular that of cow, sheep and goat) through its components and to detect it specifically in more or less reworked products such as cheeses, for which the technological manufacturing processes (such as pasteurization, sterilization, ultrafiltration) and the ripening processes lead to a complete qualitative and quantitative reworking of the product.

Actuellement, les méthodes les plus sensibles et les plus rapides de mise en oeuvre font appel aux techniques d'isoêlectrofocalisation et aux techniques immunologiques. Cependant, ces techniques présentent toutes des inconvénients
- sensibilité à la protéolyse dans le cas de l'isoélectrofocalisation, l'interprétation des électrophorégrammes devenant compliquée lorsque les protéines ont été protéolysées puisque de nombreuses bandes parasites apparaissent,
- présence de faux négatifs dans le cas de l'isoélectrofocalisation et des techniques immunologiques utilisant comme marqueurs des protéines sériques thermocoagulables, qui ne sont plus détectées si le lait de départ a subi un traitement thermique.Currently, the most sensitive and fastest methods of implementation call upon isoelectrofocusing techniques and immunological techniques. However, these techniques all have drawbacks
- sensitivity to proteolysis in the case of isoelectric focusing, the interpretation of electropherograms becoming complicated when the proteins have been proteolysed since numerous parasitic bands appear,
- presence of false negatives in the case of isoelectric focusing and immunological techniques using thermocoagulable serum proteins as markers, which are no longer detected if the starting milk has undergone heat treatment.

Le choix de marqueurs caractéristiques d'une espèce à rechercher, en l'occurence l'espèce bovine, est le principal problème à résoudre vu la faible distance phylogénétique entre les trois espèces de polygastriques considérées (bovine, ovine, caprine). The choice of markers characteristic of a species to be sought, in this case the bovine species, is the main problem to be solved given the short phylogenetic distance between the three polygastric species considered (bovine, ovine, caprine).

Les travaux effectués par les inventeurs dans ce domaine les ont conduits à constater que le choix dans une protéine laitière d'une séquence peptidique particulière permettait de disposer par voie de synthèse de produits se révélant de manière inattendue fortement immunogènes, et capables en conséquence de former des immunsérums monospécifiques vis-à-vis des protéines à rechercher. The work carried out by the inventors in this field has led them to note that the choice in a dairy protein of a particular peptide sequence made it possible to have, by way of synthesis, products which unexpectedly prove to be highly immunogenic, and capable consequently of forming monospecific immune sera against the proteins to be sought.

L'invention a donc pour but de fournir des peptides possédant des propriétés immunogènes, capables de conduire à des immunsérums et des anticorps utilisables comme marqueurs de protéines laitières d'une espèce donnée. The invention therefore aims to provide peptides having immunogenic properties, capable of leading to immunsera and antibodies usable as markers of milk proteins of a given species.

Elle vise également à fournir un procédé de préparation de ces immunsérums et anticorps. It also aims to provide a process for the preparation of these immune sera and antibodies.

L'invention vise en outre à fournir une méthode immunologique de détection qualitative et d'évaluation quantitative d'adultérations ou de mélanges interspécifiques dans les produits renfermant des protéines laitières, cette méthode permettant de résoudre les problèmes posés jusqu alors, en particulier ceux résultant de la protéolyse et des traitements thermiques, tout en maintenant les seuils de sensibilité et la rapidité de mise en oeuvre. The invention further aims to provide an immunological method for qualitative detection and quantitative evaluation of adulterations or interspecific mixtures in products containing dairy proteins, this method making it possible to solve the problems posed until now, in particular those resulting from proteolysis and heat treatments, while maintaining the sensitivity thresholds and the speed of implementation.

Les peptides selon 1 invention sont caractérisés en ce qu'ils sont capables de former des anticorps polyclonaux susceptibles de reconnaître de manière spécifique, en donnant lieu à une réaction du type antigène-anticorps, une protéine laitière d'une espèce donnée. The peptides according to 1 invention are characterized in that they are capable of forming polyclonal antibodies capable of specifically recognizing, by giving rise to a reaction of the antigen-antibody type, a milk protein of a given species.

L'expression de manière spécifique" signifie que les anticorps forment un complexe avec la protéine laitière considérée, en utilisant la méthode ELISA décrite dans les exemples. De plus, ils ne réagissent pas significativement de manière croisée avec des séquences peptidiques de protéines laitières d'autres espèces. The expression "specifically" means that the antibodies form a complex with the milk protein in question, using the ELISA method described in the examples. In addition, they do not significantly cross-react with peptide sequences of milk proteins of other species.

Dans une disposition préférée de l'invention, la séquence en acides aminés des peptides est formée par un fragment de la protéine laitière reconnue par les anticorps polyclonaux. Ce fragment correspond plus spécialement à une région de la séquence primaire de la protéine laitière d'une espèce donnée où le nombre d'acides aminés différents est important par rapport à la région correspondante dans les séquences primaires de cette même protéine dans d'autres espèces. Il s'agit en particulier d'un fragment de 5 à 20 acides aminés environ. In a preferred arrangement of the invention, the amino acid sequence of the peptides is formed by a fragment of the milk protein recognized by the polyclonal antibodies. This fragment corresponds more specifically to a region of the primary sequence of the milk protein of a given species where the number of different amino acids is large compared to the corresponding region in the primary sequences of this same protein in other species. . It is in particular a fragment of approximately 5 to 20 amino acids.

Compte tenu des applications immunologiques envisagées pour la détection de protéines laitières, bovines, des peptides préférés de l'invention sont constitués par des fragments de telles protéines. In view of the immunological applications envisaged for the detection of milk and bovine proteins, preferred peptides of the invention consist of fragments of such proteins.

Ces peptides correspondent avantageusement à un fragment de la kappa caséine bovine ou de caséinomacropeptide ou de l'asi caséine bovine. En variante, il s'agit de fragments da la p caséine. These peptides advantageously correspond to a fragment of bovine casein kappa or caseinomacropeptide or bovine casein asi. Alternatively, these are fragments of p casein.

L'invention vise également les peptides ci-dessus dans lesquels un ou plusieurs acides aminés de leurs séquences sont différents, substitués, ou délétés, par rapport au fragment correspondant de la protéine laitière, dès lors que ces altérations n'affectent pas la reconnaissance spécifique avec les anticorps comme défini ci-dessus. The invention also relates to the above peptides in which one or more amino acids of their sequences are different, substituted, or deleted, with respect to the corresponding fragment of the milk protein, provided that these alterations do not affect specific recognition with the antibodies as defined above.

Les peptides de l'invention sont aisément obtenus selon les techniques classiques de synthèse peptidique en phase solide telles que celles décrites par Hanin V. Thèse
Université de Montpellier II, 1990. La chaîne peptidique est construite sur un support, en particulier une résine du type des résines acryliques. La présence de liaisons amides dans la composition de ces résines polyacryliques les rend relativement proches d'une structure protéique. On peut alors faire jouer à la résine le rôle de la protéine porteuse en utilisant directement le complexe résinepeptide comme immunogène, sachant que les peptides seuls sont trop courts pour induire une réponse immunitaire appréciable. Cette méthodologie présente l'avantage de conduire à une configuration plus homogène du complexe peptide-résine par rapport à celle d'un complexe peptideprotéine porteuse.The peptides of the invention are easily obtained according to conventional techniques of solid phase peptide synthesis such as those described by Hanin V. Thesis
University of Montpellier II, 1990. The peptide chain is constructed on a support, in particular a resin of the type of acrylic resins. The presence of amide bonds in the composition of these polyacrylic resins makes them relatively close to a protein structure. The resin can then play the role of the carrier protein by directly using the resinpeptide complex as an immunogen, knowing that the peptides alone are too short to induce an appreciable immune response. This methodology has the advantage of leading to a more homogeneous configuration of the peptide-resin complex compared to that of a carrier peptide-protein complex.

L'invention vise également, en tant que nouveaux produits, les immunsérums contenant des anticorps capables de reconnaître spécifiquement une protéine laitière d'une espèce donnée et les anticorps correspondants. The invention also relates, as new products, to the immune sera containing antibodies capable of specifically recognizing a milk protein of a given species and the corresponding antibodies.

Les immunsérums et anticorps polyclonaux sont avantageusement tels qu'obtenus, de manière classique, par immunisation d'animaux avec un peptide tel que défini cidessus dont la séquence est spécifique d'une espèce donnée. The immunsera and polyclonal antibodies are advantageously as obtained, in a conventional manner, by immunization of animals with a peptide as defined above whose sequence is specific for a given species.

En suivant les méthodes usuelles, on administre un complexe peptide-support, notamment peptide-résine à l'animal, par voie intradermique, à raison d'environ 0,3 à 1 mg de peptide, en émulsion dans un adjuvant capable de stimuler au maximum la réponse immunitaire, tel que l'adjuvant complet ou incomplet de Freund. L'injection est renouvelée plusieurs fois, à intervalles de temps, généralement de 15 jours à 1 mois. Following the usual methods, a peptide-support complex, in particular peptide-resin is administered to the animal, intradermally, in an amount of approximately 0.3 to 1 mg of peptide, in emulsion in an adjuvant capable of stimulating the maximum immune response, such as Freund's complete or incomplete adjuvant. The injection is repeated several times, at time intervals, generally from 15 days to 1 month.

Les immunsérums sont obtenus à partir des prélèvements sanguins, effectués sur les animaux immunisés, après élimination des hématies par coagulation et centrifugation. Ils sont conservés dans les conditions habituelles par exemple sous forme congelée ou lyophilisée. Immunsera are obtained from blood samples taken from immunized animals, after elimination of red blood cells by coagulation and centrifugation. They are stored under the usual conditions, for example in frozen or lyophilized form.

L'estimation du taux d'anticorps spécifiques, présents dans les immunsérums totaux recueillis tout au long du progamme d'immunisation, est réalisée par exemple grâce à une technique immunométrique dite "par capture d'anticorps", en utilisant le complexe résine-peptide comme antigène. L'apparition des anticorps est relativement rapide à partir de la première injection et leur production est croissante au cours du programme d'immunisation jusqu'à atteindre un maximum au-delà duquel elle décroit. Il a donc été possible de vérifier que le lapin, par exemple, produit des anticorps à partir d'une séquence peptidique de synthèse dont la taille est inférieure ou égale à quinze résidus d'acides aminés. The estimation of the level of specific antibodies, present in the total sera collected throughout the immunization program, is carried out for example by means of an immunometric technique called "by antibody capture", using the resin-peptide complex as an antigen. The appearance of antibodies is relatively rapid from the first injection and their production increases during the immunization program until reaching a maximum beyond which it decreases. It was therefore possible to verify that the rabbit, for example, produces antibodies from a synthetic peptide sequence whose size is less than or equal to fifteen amino acid residues.

Les immunsérums et anticorps de l'invention sont en outre caractérisés en ce qu'ils donnent lieu à une réaction du type antigène-anticorps aussi bien avec un peptide tel que défini ci-dessus, qu'avec la protéine mère renfermant la même séquence, mais qui présente une structure plus complexe avec des repliements dans l'espace de la chaîne polypeptidique, pouvant rendre les épitopes concernés inaccessibles pour les anticorps. The immune sera and antibodies of the invention are further characterized in that they give rise to a reaction of the antigen-antibody type as well with a peptide as defined above, as with the mother protein containing the same sequence, but which has a more complex structure with folds in the space of the polypeptide chain, which can make the epitopes concerned inaccessible for antibodies.

De manière avantageuse, les immunsérums et anticorps anti-peptides de l'invention, 1 confrontés aux caséines totales ainsi qu'aux différentes caséines individuelles constitutives bovines (respectivement a et kappa caséines) reconnaissent leurs épitopes dans chaque cas. Advantageously, the anti-peptide antibodies and antibodies of the invention, 1 when confronted with total caseins as well as with the various individual caseins constituting bovine (respectively a and kappa caseins) recognize their epitopes in each case.

Dans les mêmes conditions, cette reconnaissance n'est pas retrouvée quand les protéines homologues ovines ou caprines sont utilisées. Under the same conditions, this recognition is not found when the ovine or caprine homologous proteins are used.

L'invention vise en particulier des immunsérums et anticorps anti-asl caséine bovine et des immunsérums et anticorps anti-caséino-macropeptide bovin. The invention relates in particular to anti-bovine casein anti-asl antibodies and antibodies and bovine anti-casein-macropeptide antibodies and antibodies.

Les anticorps polyclonaux sont récupérés à partir des immunsérums selon les techniques classiques. Ils peuvent être purifiés par exemple par chromatographie d'affinité. Polyclonal antibodies are recovered from the sera according to conventional techniques. They can be purified for example by affinity chromatography.

Les anticorps monoclonaux tels qu'obtenus en opérant selon la technique de Kohler et Milstein dans
Nature, vol 256, p. 495, 1975, font également partie de l'invention.Monoclonal antibodies as obtained by operating according to the technique of Kohler and Milstein in
Nature, vol 256, p. 495, 1975, are also part of the invention.

Celle-ci vise également tout fragment de ces anticorps polyclonaux ou monoclonaux dès lors qu'il est capable d'interagir spécifiquement avec des épitopes de la protéine laitière à détecter. It also targets any fragment of these polyclonal or monoclonal antibodies as soon as it is capable of interacting specifically with epitopes of the milk protein to be detected.

Les études immunologiques réalisées avec les immunsérums et anticorps de l'invention mettent en évidence leur monospécificité vis-à-vis d'une protéine laitière d'une espèce donnée. Elles montrent également, comme illustré dans les exemples, que leur immunoréactivité n'est pas affectée par un traitement thermique ou une hydrolyse partielle des antigènes. The immunological studies carried out with the immune sera and antibodies of the invention demonstrate their monospecificity vis-à-vis a dairy protein of a given species. They also show, as illustrated in the examples, that their immunoreactivity is not affected by heat treatment or partial hydrolysis of the antigens.

L'invention vise donc également l'application de ces immunsérums et anticorps en tant que bioréactifs pour la détection in vitre d'une protéine laitière donnée dans un produit à contrôler. The invention therefore also relates to the application of these immune sera and antibodies as bioreagents for the in vitro detection of a given milk protein in a product to be checked.

Dans cette application, les anticorps sont libres. In this application, the antibodies are free.

En variante, ils sont fixés sur un support immunologiquement inerte.Alternatively, they are fixed on an immunologically inert support.

La méthode de contrôle de la présence de protéines laitières dans un produit est caractérisée par - la mise en contact du produit à contrôler avec une préparation d'immunsérums ou d'anticorps tels que définis ci-dessus, immobilisés sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe du type antigène-anticorps avec la protéine laitière, suivie de - la mise en évidence de la formation d'un tel complexe. The method for controlling the presence of milk proteins in a product is characterized by - bringing the product to be checked into contact with a preparation of immunsera or antibodies as defined above, immobilized on a solid support, in appropriate conditions for the production of an antigen-antibody type complex with milk protein, followed by - the demonstration of the formation of such a complex.

Pour révéler la réaction immunologique, on utilise un deuxième anticorps couplé à un groupement dont l'activité peut être mesurée telle une enzyme, comme la phosphatase alcaline, la peroxydase ou le p-galactosidase, ou un groupement fluorescent, luminescent ou encore radioactif. To reveal the immunological reaction, a second antibody is used, coupled to a group whose activity can be measured such as an enzyme, such as alkaline phosphatase, peroxidase or p-galactosidase, or a fluorescent, luminescent or even radioactive group.

Cette méthode de détection permet de révéler avec une grande sensibilité, jusqu'à 0,1 % (volume/volume) une protéine laitière d'une espèce animale donnée dans un échantillon à contrôler. This detection method makes it possible to reveal with high sensitivity, up to 0.1% (volume / volume) a dairy protein of a given animal species in a sample to be checked.

Le degré de sensibilité dépend toutefois de l'ajustement des paramètres du dosage (notamment de la dilution de l'immunsérum, de la quantité de protéine cible sensibilisant le support, de la préparation des échantillons à doser), ainsi que des performances de l'immunsérum. Ainsi d'un animal à l'autre, l'immunsérum produit aura une plus ou moins grande affinité pour ses épitopes respectifs. La meilleure sensibilité sera atteinte en utilisant des immunsérums sélectionnés pour leur affinité, ainsi qu'en déterminant, pour chacun d'eux, selon les techniques courantes dont dispose l'homme de l'art, la dilution adéquate d'utilisation et la quantité d'antigène à utiliser pour sensibiliser le support. However, the degree of sensitivity depends on the adjustment of the parameters of the assay (in particular the dilution of the immune serum, the quantity of target protein sensitizing the support, the preparation of the samples to be assayed), as well as the performance of the immune serum. Thus from one animal to another, the immune serum produced will have a greater or lesser affinity for its respective epitopes. The best sensitivity will be achieved by using immune sera selected for their affinity, as well as by determining, for each of them, according to the current techniques available to those skilled in the art, the adequate dilution of use and the amount of antigen to be used to sensitize the support.

L'échantillon à analyser provient d'un produit renfermant des protéines laitières. Il s'agit en particulier d'une part de produits alimentaires, parmi lesquels on distinguera les produits laitiers ou dérivés du lait, ainsi que la charcuterie, la confiserie comme le nougat ou les tourons, ou encore les biscuits ou autres pâtisseries ; d'autre part des produits et préparations cosmétiques renfermant des protéines laitières. The sample to be analyzed comes from a product containing dairy proteins. It is in particular a part of food products, among which a distinction will be made between dairy products and milk derivatives, as well as cold meats, confectionery such as nougat or turrets, or cookies or other pastries; on the other hand, cosmetic products and preparations containing milk proteins.

En vue de leur dosage, les produits laitiers sont au préalable soumis à une étape de délipidation, suivie de précipitation des caséines et d'ajustement du pH à environ 7,4. Les lipides sont avantageusement éliminés par centrifugation dans le cas du lait et par extraction à l'aide de solvants organiques pour les fromages. With a view to their dosing, the dairy products are first subjected to a delipidation step, followed by precipitation of the caseins and adjustment of the pH to approximately 7.4. The lipids are advantageously removed by centrifugation in the case of milk and by extraction using organic solvents for the cheeses.

L'invention vise également un kit pour la détection in vitre de la présence d'une protéine laitière d'une espèce animale donnée dans un produit renfermant des protéines laitières. The invention also relates to a kit for in vitro detection of the presence of a dairy protein of a given animal species in a product containing dairy proteins.

Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, avantageusement sensibilisée au préalable avec l'antigène de 1 'immunsérum fourni dans le kit,
- une préparation d'immunsérums ou d'anticorps selon 1' invention comme définis ci-dessus, libres ou immobilisés,
- une préparation d'un deuxième anticorps avec un groupe marqueur,
- un système de détection spécifique du marqueur,
- des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.This kit is characterized in that it includes
a suitable solid phase serving as a support for the assay, such as a micro-titration plate, advantageously sensitized beforehand with the antigen of the immune serum supplied in the kit,
- a preparation of immunsera or antibodies according to the invention as defined above, free or immobilized,
- a preparation of a second antibody with a marker group,
- a specific marker detection system,
- appropriate buffer solutions for immunological reactions and for detection reactions.

Le cas échéant, cette présentation comporte en outre des mélanges laitiers servant à l'étalonnage. If necessary, this presentation also includes milk mixtures used for calibration.

Pour la sensibilisation de la phase support utilisée pour réaliser le dosage, on utilise une concentration du marqueur immunologique (protéine purifiée ou peptide de synthèse) permettant d'obtenir la meilleure sensibilité du dosage. For the sensitization of the support phase used to carry out the assay, use is made of a concentration of the immunological marker (purified protein or synthetic peptide) allowing the best sensitivity of the assay to be obtained.

La préparation d'immunsérums ou d'anticorps spécifiques de la protéine laitière à rechercher est dosée. The preparation of specific sera or antibodies to the milk protein to be sought is dosed.

Elle se présente sous forme lyophilisée ou sous forme liquide, à la dilution d'utilisation.It is in lyophilized form or in liquid form, at use dilution.

Avantageusement, on la stabilise en ajoutant par exemple des agents bactéricides. Advantageously, it is stabilized by adding, for example, bactericidal agents.

On rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages de l'invention. In the examples which follow, other characteristics and advantages of the invention are reported.

Les figures 1 à 6 auxquelles il est fait référence représentent respectivement - les figures 1 à 3, des courbes d'étalonnage de
fromages et de lait de brebis adultérés avec du lait
de vache dans différentes conditions.Figures 1 to 6 to which reference is made respectively represent - Figures 1 to 3, calibration curves of
sheep cheese and milk adulterated with milk
of cow in different conditions.

- la figure 4, une courbe d'étalonnage de lait de vache
en poudre additionné de lactosérum présure de vache
atomisé, - la figure 5, une courbe d'étalonnage pour la détection
du lactosérum présure de vache dans les pâtés
apertisés, et - la figure 6, l'immunoréactivité d'un immunsérum de
l'invention avec différentes protéines laitières.- Figure 4, a calibration curve for cow's milk
powder with cow rennet whey
atomized, - Figure 5, a calibration curve for detection
cow rennet whey in pâtés
apertized, and - Figure 6, the immunoreactivity of an immune serum
the invention with different dairy proteins.

Exemple 1 : Peptides synthétiques
Deux types de peptides, synthétisés sur résine polyacrylique, sont donnés en exemple.EXAMPLE 1 Synthetic Peptides
Two types of peptides, synthesized on polyacrylic resin, are given as an example.

* Fragment 139-152 de la kappa caséine bovine (14 résidus d'acides aminés) 139 152 Val-Glu-Ser-Thr-Val-Ala-Thr-Leu-Glu-Asp-Ser-Pro-Glu-Val- -
RESINE
* Fragment 140-149 de l'asti caséine bovine (10 résidus d'acides aminés) 140 149
Gln-Glu-Leu-Ala-Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu--RESINE
Le support solide est une résine polyacrylique constituée par un copolymère de N-acryloylpyrrolidine et de
N-acryloyl-p-alanine réticulés par l'éthylène bis acrylamide. On utilise par exemple la résine commercialisée sous la marque Expansive ou encore les résines PepSyn
K,KA,KB ou KH, telles que commercialisées par la société
Millipore S.A.* Fragment 139-152 of bovine casein kappa (14 amino acid residues) 139 152 Val-Glu-Ser-Thr-Val-Ala-Thr-Leu-Glu-Asp-Ser-Pro-Glu-Val- -
RESIN
* Fragment 140-149 of bovine asti casein (10 amino acid residues) 140 149
Gln-Glu-Leu-Ala-Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu - RESIN
The solid support is a polyacrylic resin constituted by a copolymer of N-acryloylpyrrolidine and
N-acryloyl-p-alanine crosslinked by ethylene bis acrylamide. For example, the resin sold under the brand Expansive or the PepSyn resins are used.
K, KA, KB or KH, as marketed by the company
Millipore SA

Les synthèses ont été réalisées à partir de la résine sur laquelle sont fixés de façon covalente les dérivés Fmoc (f luorène-méthoxy carbonyl) des acides aminés correspondant à la partie C-terminale de la chaîne peptidique à synthétiser. The syntheses were carried out using the resin to which the Fmoc derivatives (fluorine-methoxy carbonyl) of the amino acids corresponding to the C-terminal part of the peptide chain to be synthesized are covalently attached.

Par exemple
* Fmoc-Ala-PepSyn-KA pour le peptide synthétique correspondant à la kappa caséine bovine.for example
* Fmoc-Ala-PepSyn-KA for the synthetic peptide corresponding to bovine casein kappa.

* Fmoc-Leu-PepSyn-KA pour le peptide synthétique correspondant à l'asti caséine bovine. * Fmoc-Leu-PepSyn-KA for the synthetic peptide corresponding to bovine asti casein.

La chaîne peptidique est alors allongée vers son extrémité N-terminale par couplage successif des dérivés
Fmoc des différents acides aminés à ajouter et l'activation de ceux-ci par le HoBt (1-hydroxybenzotriazole) sur la fonction carbonyle.The peptide chain is then extended towards its N-terminal end by successive coupling of the derivatives
Fmoc of the different amino acids to be added and the activation of these by HoBt (1-hydroxybenzotriazole) on the carbonyl function.

Le groupement Fmoc protège la fonction amine des acides aminés ; les chaînes latérales sont également protégées. Les protections sont les suivantes
Glu

OtBu ; Tyr

tBu ; Ser

tBu ; Asp

The Fmoc group protects the amino function of amino acids; the side chains are also protected. The protections are as follows
Glue

OtBu; Tyr

tBu; Ser

tBu; Asp

OtBu
Thr

tBu (tBu - Tertiobutyl)
Les dérivés Fmoc des acides aminés protégés ainsi que les réactifs nécessaires aux différentes étapes de la synthèse (rinçages, réactifs de déprotection...) sont également disponibles commercialement par exemple chez la société Millipore.OtBu
Thr

tBu (tBu - Tertiobutyl)
The Fmoc derivatives of the protected amino acids as well as the reagents necessary for the various stages of the synthesis (rinses, deprotection reagents, etc.) are also commercially available, for example from the company Millipore.

Les synthèses peptidiques ont été réalisées en flux continu sur un appareil automatique Milligen
Pepsynthesizer model 9050, commercialisé par exemple par la société Millipore.The peptide syntheses were carried out in continuous flow on a Milligen automatic device
Pepsynthesizer model 9050, sold for example by the company Millipore.

Chaque étape de la synthèse est contrôlée, car un photomètre en sortie permet de vérifier à la fois la réaction de couplage et la réaction de déprotection puisqu'aussi bien les dérivés Fmoc que le pipéridyl dibenzofulvène, produit lors de la déprotection des dérivés
Fmoc, ont une intense absorption dans l r W. L'appareil s'arrête alors de fonctionner si le couplage est incomplet.Each step of the synthesis is controlled, because an output photometer makes it possible to check both the coupling reaction and the deprotection reaction since both the Fmoc derivatives and the piperidyl dibenzofulvene, produced during the deprotection of the derivatives
Fmoc, have an intense absorption in lr W. The device then stops working if the coupling is incomplete.

Ainsi, le suivi du protocole par l'homme de l'art permet de garantir la séquence peptidique prédéterminée.Thus, monitoring the protocol by those skilled in the art makes it possible to guarantee the predetermined peptide sequence.

Une fois la synthèse effectuée, les différentes fonctions protectrices des acides aminés sont clivées par traitement au TFA (acide trifluoroacétique) 95 i / eau millipore 5 %, puis le peptide-résine est recueilli, séché 5 minutes sous azote, 30 minutes sous-vide à la trompe à eau, puis 14 heures environ sous-vide poussé à la pompe à palettes. Once the synthesis has been carried out, the various protective functions of the amino acids are cleaved by treatment with TFA (trifluoroacetic acid) 95 i / millipore water 5%, then the peptide-resin is collected, dried for 5 minutes under nitrogen, 30 minutes under vacuum with a water pump, then about 14 hours in a vacuum blown with the vane pump.

Le rendement de couplage ainsi que la composition en acides aminés des préparations sont contrôlés par analyse HPLC après hydrolyse des résine-peptides 48 heures à llO"C dans HCl 6N. The coupling yield as well as the amino acid composition of the preparations are checked by HPLC analysis after hydrolysis of the resin-peptides 48 hours at 110 ° C. in 6N HCl.

Les rendements de couplage obtenus sont, par exemple
* Peptide synthétique de kappa caséine bovine
0,351. 10-3 mole peptide/g de peptide-résine.The coupling yields obtained are, for example
* Synthetic bovine casein kappa peptide
0.351. 10-3 mole peptide / g of peptide-resin.

* Peptide synthétique de l'asl caséine bovine
0,354. 10-3 mole peptide/g de peptide-résine. * Synthetic peptide of bovine casein asl
0.354. 10-3 mole peptide / g of peptide-resin.

Exemple : Procédure d'immunisation et préparation des immunsérlns
Le complexe résine-peptide à 2 mg de peptide/ml dans une solution de NaCl 0,9% est émulsionné volume à volume dans un adjuvant huileux type adjuvant complet ou incomplet de Freund. 0,3 à 1 mg de peptide sont ainsi injectés par voie intradermique en points multiples à un lapin.Example: Immunization procedure and preparation of immunserns
The resin-peptide complex at 2 mg of peptide / ml in a 0.9% NaCl solution is emulsified volume by volume in an oily adjuvant type complete or incomplete adjuvant of Freund. 0.3 to 1 mg of peptide are thus injected intradermally at multiple points in a rabbit.

L'injection est renouvelée plusieurs fois à intervalle de temps de 15 jours à 1 mois. The injection is repeated several times at intervals of 15 days to 1 month.

Les prélèvements sanguins sont effectués une dizaine de jours après l'injection. Le sang est centrifugé pour éliminer les hématies, puis le sérum est récolté. Blood samples are taken about ten days after the injection. The blood is centrifuged to remove the red cells, then the serum is collected.

Exemple 3 : Préparation des échantillons
LAIT : Le lait est dégraissé par centrifugation, puis les caséines sont précipitées par acidification.Example 3: Sample preparation
MILK: The milk is degreased by centrifugation, then the caseins are precipitated by acidification.

Une deuxième centrifugation permet de récupérer un culot riche en caséines et une phase sérique. A second centrifugation makes it possible to recover a pellet rich in caseins and a serum phase.

Le culot est dissous par addition de NaOH 2N, dilué dans du PBS contenant 0,05% de Tween 20, puis amené à un pH de 7,4. Le lactosérum est neutralisé de la même façon par addition de NaOH 2N jusqu'à pH 7,4. The pellet is dissolved by adding 2N NaOH, diluted in PBS containing 0.05% Tween 20, then brought to a pH of 7.4. The whey is neutralized in the same way by adding 2N NaOH up to pH 7.4.

Des dilutions croissantes de chaque échantillon (caséines, lactosérum) sont alors réalisées dans du PBS
Tween.Increasing dilutions of each sample (caseins, whey) are then made in PBS
Tween.

FROMAGE : 10 g de fromage sont homogénéisés dans 25ml d'eau distillée. L'extraction des lipides est effectuée par mélanges et décantations successives de cet homogénat dans une phase organique (par exemple chloroforme-méthanol). CHEESE: 10 g of cheese are homogenized in 25 ml of distilled water. The extraction of the lipids is carried out by successive mixtures and decantations of this homogenate in an organic phase (for example chloroform-methanol).

La phase aqueuse est collectée et les traces de solvants organiques sont évaporées sous vide. L'extrait de fromage ainsi dégraissé est traité et analysé dans les mêmes conditions que le lait. The aqueous phase is collected and the traces of organic solvents are evaporated under vacuum. The cheese extract thus defatted is treated and analyzed under the same conditions as milk.

Exemple : Méthode de détection de protéines laitières d'une espèce donnée selon la technique ELISA
Le principe du dosage est le suivant
Un support, par exemple les cupules d'une plaque de microtitration, susceptible de lier de façon non covalente les protéines, est sensibilisé avec l'antigène purifié, donc la protéine cible à rechercher dans le produit à doser (asl caséine, kappa caséine ou caséinomacropeptide bovin ou peptide synthétique correspondant). L'échantillon à doser est alors incubé sur ce support en présence d'une quantité précise d'anticorps spécifiques. Au cours de cette incubation, il y a compétition pour les anticorps entre les protéines cibles adsorbées sur le support et celles libres dans le milieu.Example: Method for detecting milk proteins of a given species using the ELISA technique
The principle of the dosage is as follows
A support, for example the wells of a microtiter plate, capable of noncovalently binding the proteins, is sensitized with the purified antigen, therefore the target protein to be sought in the product to be assayed (asl casein, kappa casein or bovine caseinomacropeptide or corresponding synthetic peptide). The sample to be assayed is then incubated on this support in the presence of a precise quantity of specific antibodies. During this incubation, there is competition for the antibodies between the target proteins adsorbed on the support and those free in the medium.

A l'équilibre, les anticorps fixés par la protéine cible liée sont révélés par des anticorps anti-IgG de lapin couplés à une enzyme (par exemple la phosphatase alcaline, la peroxydase ou la p-galactosidase), puis quantifiés par la mesure de l'absorbance du produit coloré de la réaction de l'enzyme sur son substrat. At equilibrium, the antibodies bound by the bound target protein are revealed by anti-rabbit IgG antibodies coupled to an enzyme (for example alkaline phosphatase, peroxidase or p-galactosidase), then quantified by measuring the absorbance of the colored product of the reaction of the enzyme on its substrate.

Le taux d'antigène (asl caséine, kappa caséine ou caséinomacropeptide) éventuellement présent dans l'échantillon à analyser est quantifié par sa capacité d'inhiber la fixation des anticorps sur l'antigène adsorbé sur la phase solide. The level of antigen (asl casein, kappa casein or caseinomacropeptide) possibly present in the sample to be analyzed is quantified by its capacity to inhibit the binding of antibodies to the antigen adsorbed on the solid phase.

L'analyse en dilution croissante de l'échantillon inconnu, comparativement à des échantillons témoins, permet donc de déterminer la protéine étrangère présente dans 1 'échantillon. Analysis in increasing dilution of the unknown sample, compared to control samples, therefore makes it possible to determine the foreign protein present in the sample.

Exemple5 : Dosages à l'aide d'immunsérums selon l'exemple 2
Une plaque de microtitration (par exemple NUNC R
Maxisorb Type II) est sensibilisée par incubation 12 heures à 37"C d'une solution protéique d'a caséine bovine d'une part ou de kappa caséine (ou de caséinomacropeptide ou de peptide de synthèse) bovine d'autre part, ces protéines étant purifiées et utilisées à une concentration d'environ 0,2 pg/ml. Example 5: Assays Using Immunosera According to Example 2
A microtiter plate (for example NUNC R
Maxisorb Type II) is sensitized by incubation for 12 hours at 37 "C of a protein solution of bovine casein on the one hand or bovine kappa casein (or caseinomacropeptide or synthetic peptide) on the other hand, these proteins being purified and used at a concentration of about 0.2 pg / ml.

Les caséines a et kappa bovines purifiées sont obtenues par fractionnement des caséines totales acides bovines après chromatographie d'échange d'anions sur DEAE
Trysacryl R. Le caséinomacropeptide bovin est extrait de lactosérum présure de vache, par exemple par chromatographie d'exclusion.Purified bovine a and kappa caseins are obtained by fractionation of total bovine acid caseins after anion exchange chromatography on DEAE
Trysacryl R. Bovine caseinomacropeptide is extracted from cow rennet whey, for example by exclusion chromatography.

La plaque est ensuite lavée dans du PBS-Tween et les sites potentiels de fixation non spécifiques de protéines sont bloqués par incubation une heure à 37"C dans une solution de saturation à 0,5% de gélatine et 3% d'hydrolysats de gélatine (commercialisés par la société
SIGMA) dans du PBS-Tween.The plate is then washed in PBS-Tween and the potential non-specific protein binding sites are blocked by incubation for one hour at 37 "C in a saturation solution of 0.5% gelatin and 3% gelatin hydrolysates. (marketed by the company
SIGMA) in PBS-Tween.

Après un deuxième lavage de la plaque dans du PBS
Tween, les dilutions de l'échantillon à doser, préparé comme indiqué dans l'exemple 3, ainsi que l'immunsérum spécifique dilué dans du PBS-Tween sont introduits dans les puits volume à volume. La plaque est alors incubée, soit quelques heures à 37"C, soit une nuit à 4"C sous agitation.After a second wash of the plate in PBS
Tween, the dilutions of the sample to be assayed, prepared as indicated in Example 3, as well as the specific immune serum diluted in PBS-Tween are introduced into the wells volume by volume. The plate is then incubated, either for a few hours at 37 "C, or overnight at 4" C with shaking.

Cette troisième incubation est suivie d'un lavage de la plaque dans le PBS-Tween, puis d'une incubation de 2h à 37"C, en présence d'anticorps anti-IgG de lapin marqués par une enzyme (phosphatase alcaline ou peroxydase ou une autre enzyme dont le produit est un chromogène), dilués dans du PBS-Tween. This third incubation is followed by washing the plate in PBS-Tween, then an incubation for 2 h at 37 "C, in the presence of anti-rabbit IgG antibodies labeled with an enzyme (alkaline phosphatase or peroxidase or another enzyme whose product is a chromogen), diluted in PBS-Tween.

La plaque est ensuite lavée une dernière fois, puis le substrat de l'enzyme utilisé est introduit (par exemple para-nitrophenyl phosphate dans le cas de la phosphatase alcaline, ortho-phénylène diamine ou analogue pour la peroxydase). L'incubation est réalisée dans les conditions optimales pour l'activité catalytique de l'enzyme utilisée (pH, temps, température, éclairement...). The plate is then washed one last time, then the substrate of the enzyme used is introduced (for example para-nitrophenyl phosphate in the case of alkaline phosphatase, ortho-phenylene diamine or the like for peroxidase). Incubation is carried out under optimal conditions for the catalytic activity of the enzyme used (pH, time, temperature, lighting, etc.).

La mesure du signal est effectuée par lecture de la densité optique de chaque puits à l'aide d'un lecteur de microplaques, à la longueur d'onde d'absorption spécifique du produit de la réaction enzymatique. The signal is measured by reading the optical density of each well using a microplate reader, at the wavelength of specific absorption of the product of the enzymatic reaction.

Pour étalonner la réaction, on effectue sur la même plaque des essais témoins en utilisant des échantillons contenant par exemple 0,5 1 1 ; 2,5 ; 10% de lait de vache. To calibrate the reaction, control tests are carried out on the same plate using samples containing for example 0.5 1 1; 2.5; 10% cow's milk.

Etude de produits laitiers adultérés en lait de vache
Sur les figures 1 à 3, on a représenté les courbes d'étalonnages de produits laitiers adultérés.Study of adulterated dairy products in cow's milk
Figures 1 to 3 show the calibration curves for adulterated dairy products.

Le pourcentage d'adultération (abscisses) est indiqué en fonction de la concentration en protéines totales en ug/ml. The percentage of adulteration (abscissa) is indicated as a function of the total protein concentration in ug / ml.

La figure 1 donne la courbe d'étalonnage relative à des fromages à pâte persillée (type roquefort) fabriqués à partir de lait de brebis adultéré avec du lait de vache cru, jusqu'à 3 mois d'affinage. Figure 1 gives the calibration curve for blue-veined cheeses (roquefort type) made from sheep's milk adulterated with raw cow's milk, up to 3 months of ripening.

Les mesures effectuées au bout de 15 jours sont représentées par les symboles 10), au bout de 1 mois par 0, et de 3 mois par (4, la moyenne étant représentée par (9. The measurements made after 15 days are represented by the symbols 10), after 1 month by 0, and 3 months by (4, the average being represented by (9.

La figure 2 donne la courbe d'étalonnage du même produit, mais adultéré avec du lait de vache stérilisé. Figure 2 gives the calibration curve for the same product, but adulterated with sterilized cow's milk.

L'examen de ces courbes montre d'une part que la protéolyse qui se produit pendant l'affinage nota pas d'incidence sur les mesures. De même, ces dernières ne sont pas affectées par le traitement thermique subi par le lait. The examination of these curves shows on the one hand that the proteolysis which occurs during the refining noted no incidence on the measurements. Likewise, the latter are not affected by the heat treatment undergone by the milk.

Ces résultats sont corroborés par ceux obtenus avec un lait de brebis adultéré avec du lait de vache cru ou chauffé une heure à 110 C. These results are corroborated by those obtained with sheep's milk adulterated with raw cow's milk or heated for one hour at 110 C.

La courbe d'étalonnage correspondante est donnée sur la figure 3. The corresponding calibration curve is given in Figure 3.

Dosage de lactosérum dans du lait de vache en poudre. Determination of whey in powdered cow's milk.

On rapporte sur la figure 4 la courbe d'étalonnage de lait de vache en poudre additionné de lactosérum présure de vache atomisé. Le pourcentage de fraude est indiqué en abscisses et la concentration en protéines totales (pg/mî) en ordonnées. Figure 4 shows the calibration curve for powdered cow's milk supplemented with atomized cow rennet whey. The percentage of fraud is indicated on the abscissa and the concentration of total protein (pg / ml) on the ordinate.

La courbe (C1J correspond à la gamme A, c'està-dire à des étalons préparés à partir de lait de vache écrémé atomisé et de lactosérum doux présure de vache atomisé, et la courbe (O) à la gamme B, ctest-à-dire à des étalons préparés à partir de lait de vache écrémé atomisé et de lactosérum présure de vache atomisé traité thermiquement 1 h à llO"C. The curve (C1J corresponds to the A range, i.e. standards prepared from atomized skimmed cow's milk and atomized cow rennet sweet whey, and the curve (O) to the B range, ie - say to standards prepared from atomized skimmed cow milk and atomized cow rennet whey heat treated for 1 h at 110 ° C.

Dosage de lactosérum dans des charcuteries
L'utilisation des immunsérums de l'invention permet de détecter le lactosérum présure de vache présent dans des charcuteries type pâté, apertisées. Determination of whey in cold meats
The use of the immune sera of the invention makes it possible to detect the cow rennet whey present in charcuterie type pâté, apertized.

Sur la figure 5, on rapporte la courbe d'étalonnage pour la détection du lactosérum présure de vache dans des pâtés apertisés 80 min à 110 C. La concentration en protéines (pg/ml) est donnée en abscisses et le pourcentage de mélange en ordonnées représente la droite de régression et (e) les résultats expérimentaux). In FIG. 5, the calibration curve for the detection of cow rennet whey in apertized pâtés 80 min at 110 C. is reported. The protein concentration (pg / ml) is given on the abscissa and the percentage of mixture on the ordinate represents the regression line and (e) the experimental results).

10 g de pâté de foie sont dilués dans 40 ml de PBS contenant 0,05 % de Tween 20, homogénéisés à l'aide d'un ultraturrax, puis maintenus sous agitation une nuit à 25"C. 10 g of liver pâté are diluted in 40 ml of PBS containing 0.05% of Tween 20, homogenized using an ultraturrax, then kept stirring overnight at 25 "C.

L'extrait soluble est recueilli par centrifugation (20 min ; 5000 g ; 10 C) puis délipidé par extraction des graisses au chloroforme. The soluble extract is collected by centrifugation (20 min; 5000 g; 10 C) and then defatted by extraction of the fats with chloroform.

La phase aqueuse est récupérée et les traces de chloroforme sont évaporées sous vide. L'extrait soluble ainsi dégraissé est analysé dans les mêmes conditions que le lait ou le fromage. The aqueous phase is recovered and the traces of chloroform are evaporated under vacuum. The soluble extract thus degreased is analyzed under the same conditions as milk or cheese.

Exemple 6 : Etude de la réactivité de l'immunstrum anti-asl caséine bovine
Sur la figure 6, on a rapporté les résultats de l'étude de l'immunoréactivité de l'immunsérum ci-dessus avec 1) le peptide fabriqué selon l'exemple 1 ; 2) l'a caséine bovine ; 3) l'a caséine ovine ; 4) l'a caséine caprine ; 5) la caséine totale ovine et 7) la caséine totale caprine.EXAMPLE 6 Study of the Reactivity of the Anti-Asl Bovine Casein Immunstrum
In FIG. 6, the results of the study of the immunoreactivity of the above immune serum are reported with 1) the peptide produced according to example 1; 2) bovine casein; 3) ovine casein; 4) goat casein; 5) total sheep casein and 7) total goat casein.

Pour chacun de ces composés indiqués en abscisses, on rapporte en ordonnées, le pourcentage de réponses. For each of these compounds indicated on the abscissa, the percentage of responses is reported on the ordinate.

On constate à l'examen de cette figure que l'immunoréactivité de cet immunsérum est aussi bonne avec les protéines natives qui contiennent le fragment peptidique (a caséine ou mélange de caséines) qu'avec le peptide de synthèse de l'invention. On examination of this figure, it can be seen that the immunoreactivity of this immune serum is as good with the native proteins which contain the peptide fragment (a casein or mixture of caseins) as with the synthetic peptide of the invention.

De manière avantageuse, on n' observe pas de réaction croisée notable avec les fractions protéiques homologues des autres espèces, ce qui met en évidence la monospécificité des anticorps polyclonaux de l'invention. Advantageously, no significant cross-reaction is observed with the protein fractions homologous to the other species, which demonstrates the monospecificity of the polyclonal antibodies of the invention.

L'immunsérum anti-asl caséine de vache permet la détection de l'addition de lait ou de caséinates de vache à un lait de brebis. The cow's casein anti-asl immuniser allows detection of the addition of cow's milk or caseinates to sheep's milk.

L'immunsérum anti-kappa caséine de vache pemet la détection de l'addition de lait, de caséinates ou de lactosérum de vache (obtenu par coagulation présure de lait de vache) à des laits de brebis ou de chèvre. Les anticorps fabriqués sont spécifiques du fragment 139-152 de la kappa caséine situé sur le caséinomacropeptide bovin. Celui-ci, lors de la coagulation des caséines par la présure, est excisé au niveau de la liaison 106-107 de la kappa caséine et se trouve donc soluble dans la phase sérique. The anti-kappa cow casein immune serum allows the detection of the addition of milk, caseinates or cow whey (obtained by rennet coagulation of cow milk) to sheep or goat milk. The antibodies produced are specific for the fragment 139-152 of kappa casein located on the bovine caseinomacropeptide. This, during the coagulation of caseins by rennet, is excised at the 106-107 bond of kappa casein and is therefore soluble in the serum phase.

Il faut aussi noter que les marqueurs asl-caséine, kappa caséine ou caséinomacropeptide choisis pour l'espèce bovine sont thermostables ; leur antigénicité n'est donc pas affectée, quel que soit le traitement thermique qu'a subi le produit laitier ajouté à l'échantillon dont on veut contrôler la pureté. It should also be noted that the asl-casein, kappa casein or caseinomacropeptide markers chosen for the bovine species are thermostable; their antigenicity is therefore not affected, whatever the heat treatment which the dairy product added to the sample whose purity is to be checked has undergone.

Par exemple, un lait ou un lactosérum présure de vache chauffé 60 min. à 100C C est reconnu de la même façon que s'il était cru. For example, a cow rennet milk or whey rennet heated 60 min. at 100C C is recognized in the same way as if it were believed.

D'autre part, sachant que les haptènes choisis contiennent au moins 5, de préférence au moins 10 résidus d'acides aminés, plusieurs épitopes continus doivent être reconnus sur la protéine cible par les anticorps polyclonaux produits. Une disparition totale de l'immunoréactivité ne peut donc être envisagée que dans l'hypothèse d'une hydrolyse enzymatique totale, ce qui ne peut se produire, par exemple au cours de la phase d'affinage des fromages, même si on s'adresse à des fromages très affinés. On the other hand, knowing that the haptens chosen contain at least 5, preferably at least 10 amino acid residues, several continuous epitopes must be recognized on the target protein by the polyclonal antibodies produced. A total disappearance of the immunoreactivity can therefore only be envisaged in the hypothesis of a total enzymatic hydrolysis, which cannot happen, for example during the ripening phase of the cheeses, even if we are addressing very refined cheeses.

L'invention fournit donc les moyens de détecter avec une grande précision et une spécificité élevée des fraudes sur des produits laitiers ou de produits les renfermant, tels que les produits alimentaires ou les préparations cosmétiques. Il est ainsi possible de mettre en évidence des adultérations résultant de l'addition de protéines laitières d'une espèce différente de celle(s) devant être utilisée(s) pour se conformer aux normes de fabrication. On peut également détecter l'utilisation par exemple d'hydrolysats de lactosérum utilisés dans ces produits pour augmenter le volume, la capacité de rétention d'eau ou comme succédané à des protéines laitières plus coûteuses. The invention therefore provides the means of detecting with great precision and high specificity fraud in dairy products or products containing them, such as food products or cosmetic preparations. It is thus possible to highlight adulterations resulting from the addition of milk proteins of a species different from that (s) to be used (s) to comply with manufacturing standards. One can also detect the use for example of whey hydrolysates used in these products to increase the volume, the water retention capacity or as a substitute for more expensive milk proteins.

Claims

1 / Peptides, characterized in that they are capable of forming polyclonal antibodies capable of specifically recognizing, by giving rise to a reaction of the antigen-antibody type, a milk protein of a given species.

2 / Peptides according to claim 1, characterized in that their amino acid sequence is formed by a fragment of the milk protein recognized by the polyclonal antibodies.

3 / Peptides according to claim 2, characterized in that it is a bovine protein fragment, in particular a fragment containing from 5 to 20 amino acids approximately.

4 / Peptides according to claim 3, characterized in that it is a fragment of bovine casein kappa.

5 / Peptides according to claim 4, characterized in that it is a fragment corresponding to the sequence 139-152 of bovine kappa casein whose amino acid sequence is as follows 139 152 Val -Glu-Ser -Thr-Val-Ala-Thr- Leu-Glu-Asp-Ser-Pro-Glu-Val - -

RESIN

6 / Peptides according to claim 3, characterized in that it is a fragment of bovine casein asl.

7 / Peptides according to claim 6, characterized in that it is a fragment corresponding to the sequence 140-149 of bovine casein asl, the amino acid sequence of which is as follows 140 149

Gln-Glu-Leu-Ala-Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu - RESIN

8 / Peptides according to any one of claims 1 to 7, characterized in that one or more amino acids of their sequences are different, or substituted, or deleted, compared to the corresponding fragment of the milk protein, these alterations not affecting no specific recognition by the antibodies as defined in claim 1,

9 / Peptides according to any one of claims 1 to 8, characterized in that they are coupled to a support, in particular to a resin, such as an acrylic resin.

10 / Immunserums containing antibodies capable of specifically recognizing a milk protein of a given species and corresponding antibodies, as obtained by immunization of animals with a peptide according to any one of claims 1 to 9.

11 / Immunserums and antibodies according to claim 10, characterized in that they are anti-asl bovine casein or anti-bovine caseinomacropeptide.

12 / A method of obtaining immunsera according to one of claims 10 or 11, characterized in that one administers a peptide-support complex, in particular resin peptide, to the animal, intradermally, at a rate of approximately 0 , 3 to 1 mg of peptide, in emulsion in an adjuvant capable of stimulating the immune response to the maximum, such as the complete or incomplete adjuvant of

Freund, that the injection is repeated at intervals of time, generally from 15 days to 1 month, then that the red cells are eliminated.

13 / Method for controlling products containing dairy products, characterized in that it comprises - bringing the sample from the product to be analyzed into contact with an immune serum or antibody preparation as defined in one of the claims 10 or 14, under conditions suitable for the production of an antigen-antibody complex, and - the detection of the immunological binding.

14 / Kit for the in-glass detection of the presence of milk proteins of a given species in a sample of product to be analyzed, characterized in that it comprises

a suitable solid phase serving as a support for the assay, such as a micro-titration plate, advantageously sensitized beforehand with the antigen of the immune serum supplied in the kit,

a preparation of immunsera or antibodies according to the invention as defined above free or immobilized,

- a preparation of a second antibody with a marker group,

- a specific marker detection system,

- appropriate buffer solutions for immunological reactions and for detection reactions.

15 / Application of the immune sera and antibodies according to one of claims 10 or 11 to the control of products containing milk proteins in order to detect a milk protein of a given species.

16 / Application according to claim 14 to the control of food products such as dairy products or milk derivatives, as well as cold cuts, confectionery or pastry.

17 / Application according to claim 14, to the control of cosmetic products and preparations.