FR2686606A1 - New peptides, recombinant DNAs encoding these peptides and microorganisms transformed with these recombinant DNAs - Google Patents
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Abstract
Description
NOWEAUX PEPTIDES, ADN RECOMBINANTS CODANT CES PEPTIDES ET
MICROORGANISMES TRANSFORMES PAR CES ADN RECOMBINANTS
La présente invention concerne de nouveaux peptides, et plus particulièrement, des peptides obtenus à partir de l'hormone de croissance de poissons appartenant à la famille des Acipenseridae, du genre Acipenser. Ces peptides présentent des activités physiologiques.NOWEAUX PEPTIDES, RECOMBINANT DNA ENCODING THESE PEPTIDES AND
MICROORGANISMS TRANSFORMED BY SUCH RECOMBINANT DNA
The present invention relates to novel peptides, and more particularly to peptides obtained from the growth hormone of fish belonging to the family Acipenseridae, of the genus Acipenser. These peptides exhibit physiological activities.
La présente invention concerne également un ADN recombinant codant les peptides mentionnés ci-dessus, ainsi qu'un microorganisme transformé avec cet ADN recombinant. The present invention also relates to a recombinant DNA encoding the peptides mentioned above, as well as a microorganism transformed with this recombinant DNA.
Les organismes naturels, tels que les animaux, les plantes, etc., possèdent une grande quantité de substances physiologiquement actives, qui manifestent des activités biologiques dans un être vivant. Un représentant de ces substances est l'hormone de croissance, qui est un peptide secrété par la glande pituitaire chez un vertébré, et dont on sait qu'elle possède une activité physiologique favorisant la croissance du corps, comme fonction principale. Natural organisms, such as animals, plants, etc., possess a large quantity of physiologically active substances, which manifest biological activities in a living being. A representative of these substances is growth hormone, which is a peptide secreted by the pituitary gland in a vertebrate, and which is known to have a physiological activity promoting the growth of the body, as the main function.
Les structures chimiques des peptides constituant les hormones de croissance (appelées ci-après "hormones") extraites des poissons varient en fonction de la famille et du genre du poisson. On sait également que l'activité physiologique de l'hormone est spécifique pour une certaine espèce. Ceci revient à dire que, si l'on administre à un poisson une hormone obtenue à partir d'un poisson appartenant à la même espèce, cette hormone agit plus efficacement, pour ce qui est de son activité de promotion de la croissance, qu'une hormone obtenue à partir d'un poisson appartenant à une autre espèce. The chemical structures of the peptides constituting the growth hormones (hereinafter referred to as "hormones") extracted from fish vary according to the family and the genus of the fish. It is also known that the physiological activity of the hormone is specific for a certain species. This is equivalent to saying that if a fish obtained from a fish belonging to the same species is administered to a fish, that hormone acts more effectively, in terms of its growth promotion activity, than a hormone obtained from a fish belonging to another species.
En vue de faire des découvertes permettant de mettre au point de nouveaux agents pharmaceutiques, il est très important de découvrir de nouvelles hormones chez des espèces particulières de poisson, d'isoler ces hormones et de déterminer leur structure chimique, ainsi que de trouver un nouveau domaine d'application pour ces hormones. In order to make discoveries for the development of new pharmaceutical agents, it is very important to discover new hormones in particular species of fish, to isolate these hormones and to determine their chemical structure, as well as to find new ones. field of application for these hormones.
Jusqu'à présent, on a déterminé la structure chimique d'hormones de croissance extraites de vertébrés inférieurs, en particulier de poissons tels que le saumon argenté et l'anguille, et l'on s'attend à ce que ces hormones soient largement utilisées dans le domaine de la pisciculture. So far, the chemical structure of growth hormones extracted from lower vertebrates, especially fish such as silver salmon and eel, has been determined and is expected to be widely used. in the field of fish farming.
D'autre part, on est parvenu à extraire l'hormone de croissance de l'esturgeon, que l'on pêche depuis longtemps en tant que poisson comestible et dont les oeufs, appelés caviar, constituent un mets recherché, et l'on a étudié l'activité de cette hormone (Farmer, S.W.,
Hayashida, T., Papkoff, H., et Polenov. A. L.,
Endocrinology 108, pp 377-381, 1981).On the other hand, we have been able to extract growth hormone from sturgeon, which has been a long-standing fish as an edible fish and whose eggs, called caviar, are a sought-after dish, and studied the activity of this hormone (Farmer, SW,
Hayashida, T., Papkoff, H., and Polenov. AL
Endocrinology 108, pp 377-381, 1981).
Cependant, Farmer et coll. ne donne pas la structure chimique du peptide de l'hormone de croissance d'esturgeon, de sorte que l'on n'a pas fait suffisamment de découvertes pour mettre au point de nouveaux agents pharmaceutiques. En outre, comme les esturgeons ne sont capturés que par la pêche traditionnelle, les quantités extraites d'hormone de croissance d'esturgeon ne sont pas suffisantes pour être utilisées en pisciculture. However, Farmer et al. does not give the chemical structure of the sturgeon growth hormone peptide, so that insufficient discoveries have been made to develop new pharmaceutical agents. In addition, since sturgeons are caught only by traditional fishing, the quantities of sturgeon growth hormone extracted are not sufficient for fish farming.
Etant donné ce qui précède, il est souhaitable de déterminer la structure chimique du peptide de l'hormone de croissance d'esturgeon, de trouver le gène codant ce peptide à partir de sa structure chimique, et ultérieurement, de produire l'hormone de croissance à l'échelle industrielle à l'aide de microorganismes transformés avec ce gène, et de mettre au point des agents pharmaceutiques utiles ou de mettre cette hormone à la disposition de l'industrie de pisciculture. In view of the foregoing, it is desirable to determine the chemical structure of the sturgeon growth hormone peptide, to find the gene encoding this peptide from its chemical structure, and subsequently to produce growth hormone. on an industrial scale using microorganisms transformed with this gene, and to develop useful pharmaceutical agents or to make this hormone available to the fish farming industry.
La présente invention fournit un nouveau peptide (I) qui présente les propriétés physicochimiques suivantes
1) une masse moléculaire d'environ 22.000 daltons, mesurée selon la méthode d'électrophorèse en gel de polyacrylamide au SDS ;
2) un point isoélectrique de 6,0, mesuré selon la méthode d'électrofocalisation, à l'aide d'un gel contenant 2 % en poids d'ampholyte vecteur à pH 3-10
3) la composition en acides aminés indiquée cidessous, déterminée après hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique 6 N contenant 0,6 % en volume de phénol.The present invention provides a novel peptide (I) which exhibits the following physicochemical properties
1) a molecular weight of about 22,000 daltons, measured according to the SDS polyacrylamide gel electrophoresis method;
2) an isoelectric point of 6.0, measured according to the electrofocusing method, using a gel containing 2% by weight of vector ampholyte at pH 3-10
3) the amino acid composition indicated below, determined after hydrolysis with 6 N hydrochloric acid containing 0.6% by volume of phenol.
Acide aminé Teneur (mole/mole)
Cys 4,2
Asp 19,8
Glu 19,2
Ser 18,6
Gly 7,2
His 2,9
Arg 10,0
Thr 9,7
Ala 9,9
Pro 7,0
Tyr 8,2
Val 10,2
Met 4,6
Ile 6,2
Leu 25,7
Phe 12,1
Trp 0,7
Lys 13,3
La présente invention fournit aussi un nouveau peptide (II) qui présente les propriétés physicochimiques suivantes
1) une masse moléculaire d'environ 22.000 daltons, mesurée selon la méthode d'électrophorèse en gel de polyacrylamide au SDS ;
2) un point isoélectrique de 6,1, mesuré selon la méthode d'électrofocalisation, à l'aide d'un gel contenant 2 % en poids d'ampholyte vecteur à pH 3-10 ;
3) la composition en acides aminés indiquée cidessous, déterminée après hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique 6 N contenant 0,6 % en volume de phénol.Amino acid Content (mole / mole)
Cys 4.2
Asp 19.8
Glu 19.2
Ser 18.6
Gly 7.2
His 2.9
Arg 10.0
Thr 9.7
Ala 9.9
Pro 7.0
Tyr 8.2
Val 10.2
Turns 4.6
Island 6.2
Leu 25.7
Phe 12.1
Trp 0.7
Lilies 13.3
The present invention also provides a novel peptide (II) which exhibits the following physicochemical properties
1) a molecular weight of about 22,000 daltons, measured according to the SDS polyacrylamide gel electrophoresis method;
2) an isoelectric point of 6.1, measured according to the electrofocusing method, using a gel containing 2% by weight of vector ampholyte at pH 3-10;
3) the amino acid composition indicated below, determined after hydrolysis with 6 N hydrochloric acid containing 0.6% by volume of phenol.
Acide aminé Teneur (mole/mole)
Cys 4,1
Asp 19,9
Glu 19,3
Ser 18,5
Gly 7,2
His 2,8
Arg 9,9
Thr 9,8
Ala 9,3
Pro 7,0
Tyr 8,1
Val 10,7
Met 5,5
Ile 6,3
Leu 25,9
Phe 12,3
Trp 0,8
Lys 12,4
Les nouveaux peptides (I) et (II) mentionnés cidessus contiennent, en tant que composants majeurs, respectivement les peptides (a) et (b), représentés par la séquence d'acides aminés (1) indiquée ci-dessous.Amino acid Content (mole / mole)
Cys 4.1
Asp 19.9
Glu 19.3
Ser 18.5
Gly 7.2
His 2,8
Arg 9.9
Thr 9.8
Ala 9.3
Pro 7.0
Tyr 8.1
Val 10.7
Met 5.5
Island 6.3
Leu 25.9
Phe 12.3
Trp 0.8
Lily 12.4
The novel peptides (I) and (II) mentioned above contain, as major components, respectively the peptides (a) and (b) represented by the amino acid sequence (1) indicated below.
Dans cette séquence d'acides aminés (1), les 143ème 151ème Xbb ème soit Lys, Asp et Ala, soit Met, Asn et Val. Dans ce qui suit, le peptide correspondant au premier cas est appelé "peptide (a)", et le peptide correspondant au second cas est appelé "peptide (b)". In this amino acid sequence (1), the 143rd 151th Xbb th is Lys, Asp and Ala, or Met, Asn and Val. In what follows, the peptide corresponding to the first case is called "peptide (a)", and the peptide corresponding to the second case is called "peptide (b)".
Séquence d'acides aminés (1)
Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala Val Leu
5 10 15
Arg Ala Gln Tyr Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Ile Tyr Lys Asp
20 25 30
Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gln Arg His Ser Ser Lys
95 40 4
Asn Ser Pro Ser Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro
50 55 60
Thr Gly Lys Asp Glu Als Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu
65 70 75
Gln Phe Ser Leu Ala Leu Ile Gln Ser Trp Ile Se Pro Leu Gln
80 85 90
Seu Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Leu Thr Ser
95 100 105
Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Val
110 115 120
Ala Leu Met Arg Asp Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Ser Ser Thr
12S 130 135
Leu Leu Lys Leu Thr Tyr Asp Xaa Phe Asp Val Asn Leu Arg Asn
140 145 150
Xbb Asp Xcc Leu Phe Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys
155 160 i55
Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys
170 175 180
Arg Arg Phe Val Glu Ser Asn Cys Thr Leu
185 190
La présente invention fournit également un ADN recombinant codant le peptide (a) ou (b) qui présente la séquence d'acides aminés représentée par la séquence d'acides aminés (1).Sequence of amino acids (1)
Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala Val Leu
5 10 15
Arg Ala Gln Tyr Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Tyr Lys Asp
20 25 30
Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gln Arg His Ser Ser Lys
95 40 4
Asn Ser Pro Ser Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Pro Island Ala Pro
50 55 60
Thr Gly Lys Asp Glu Gln Gln Gln Arg Asp Glu Gl Leu Leu
65 70 75
Gln Phe Ser Leu Leu Leu Gln Ser Trp Ile Se Pro Leu Gln
80 85 90
Seu Leu Ser Arg Val Phe Thrn Asn Ser Leu Val Phe Leu Thr Ser
95 100 105
Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Val
110 115 120
Ala Leu Met Arg Asp Leu Gly Glu Gly Gly Phe Ser Gly Ser Ser Thr
12S 130 135
Leu Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Asp Xaa Phe Asp Asn Val Asn Leu Arg Asn
140 145 150
Xbb Asp Xcc Leu Phe Lys Asn Tyr Gly Leu Ser Ser Cys Phe Lys
155 160 i55
Lys Asp Met His Lys Val Glu Tyr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys
170 175 180
Arg Arg Phe Val Glu Ser Asn Cys Thr Leu
185,190
The present invention also provides a recombinant DNA encoding peptide (a) or (b) which has the amino acid sequence represented by the amino acid sequence (1).
La présente invention fournit également un ADN chromosomique qui contient un ADN recombinant codant le nouveau peptide (a) ou (b) mentionné plus haut, et un ADNc correspondant à cet ADN recombinant. The present invention also provides a chromosomal DNA which contains a recombinant DNA encoding the novel peptide (a) or (b) mentioned above, and a cDNA corresponding to this recombinant DNA.
La présente invention fournit en outre un microorganisme transformé avec un ADN recombinant codant le nouveau peptide (a) ou (b) mentionné plus haut. The present invention further provides a microorganism transformed with a recombinant DNA encoding the novel peptide (a) or (b) mentioned above.
On va maintenant décrire la présente invention de façon détaillée. The present invention will now be described in detail.
De la façon indiquée ci-dessous, on a isolé le nouveau peptide (I) ou (II) de la présente invention et on en a déterminé la structure. As indicated below, the novel peptide (I) or (II) of the present invention was isolated and its structure determined.
Un extrait alcalin de glande pituitaire d'esturgeon est soumis successivement à une filtration sur gel et à une chromatographie en phase liquide haute performance, selon des procédés classiques, ce qui permet d'isoler et de purifier les nouveaux peptides de l'invention. An alkaline extract of sturgeon pituitary gland is successively subjected to gel filtration and high performance liquid chromatography, according to conventional methods, which makes it possible to isolate and purify the novel peptides of the invention.
On détermine la séquence d'acides aminés des nouveaux peptides de l'invention selon la méthode d'Edman, après avoir coupé les nouveaux peptides à l'aide de réactifs chimiques et d'enzymes appropriés. Par là, on constate que les nouveaux peptides (I) et (II) de l'invention contiennent respectivement, en tant que composant majeur, c'est-à-dire en tant que fraction active des nouveaux peptides, le peptide (a) ou (b), mentionné plus haut. The amino acid sequence of the new peptides of the invention is determined according to the Edman method, after the new peptides have been cleaved with appropriate chemical reagents and enzymes. By this, it is found that the new peptides (I) and (II) of the invention respectively contain, as a major component, that is to say as an active fraction of the new peptides, the peptide (a) or (b), mentioned above.
En outre, quand on administre les nouveaux peptides de l'invention à du frai d'esturgeon et que l'on mesure la croissance de ce frai en longueur et en poids, on constate que les nouveaux peptides (I) et (II) de l'invention présentent une activité remarquable d'accélération de la croissance du frai d'esturgeon, à la fois en longueur et en poids. In addition, when the new peptides of the invention are administered to sturgeon spawning and the growth of this spawn is measured in length and weight, it is found that the new peptides (I) and (II) of the invention exhibit a remarkable activity of accelerating the growth of sturgeon spawning, both in length and weight.
D'autre part, on peut produire le peptide (I) ou (II) de l'invention par expression de 1'ADN, en utilisant un microorganisme transformé avec 1'ADN recombinant de la présente invention. De plus, en se basant sur la séquence d'acides aminés (1) des peptides de l'invention, on a déterminé que la séquence de nucléotides (1) de 1'ADN recombinant codant les peptides de la présente invention est la suivante. On the other hand, peptide (I) or (II) of the invention can be produced by expression of DNA, using a microorganism transformed with the recombinant DNA of the present invention. In addition, based on the amino acid sequence (1) of the peptides of the invention, it has been determined that the nucleotide sequence (1) of the recombinant DNA encoding the peptides of the present invention is as follows.
Séquence de nucléotides (1)
AATC ATG TAC CCG ATG ATC CCG CTG ACZ TCT CTG TTC ACT MC 44
G TAC ATG GGC TAC TAG GGC GAC TCG AGA GAC AAG TGA TTG
GCA CTT CTG GCT CAG TAC CTG CAT CAG CTG GCT GAC ATC 89
CGT CAA GAC GCA CGA GTC ATG GAC GTA GTC GhC CGA CGA CTG TAG
TAC AAA GAC TTC GAA CGT ACT TAC ATG CCG AAC GM CAG CGT CAT 134
ATG TTT CTG AAG CTT GCA TGA ATG TAC GGC TTG CTT GTC GCA GTA
TCT TCT AAA AAC TCT CCG TCT GCT TTC TGC TAC TCT GAA ACT ATC 179
AGA AGA TTT TTG AGA GGC AGA CGA MG ACG ATG AGA CTT TGA TAG
CCG GCT CCG ACT GGT AAA GAC GAA GCT CAG CAG CGT TCT GAC GTT 224
GGC CGA GGC TGA CCA TTT CTG CTT CGA GTC GTC GCA AGA CTG CAA
GAA CTG CrG CM TTC TCT CTG GCT CTG ATC CAG TCT TGG ATC TCT 269
CTT GAC GAC GTT AAG AGA GAC CGA GAC TAG GTC AGA ACC TAG AGA
CCG CTG CAG TCT CTG TCT CGT GTT TTC ACC AAC TCT CTG GTT TTC 314
GGC GAC GTC AGA GAC AGA GCA CAA AAG TGG TTG AGA GAC CAA AAG
CTG ACT TCT GAC CGT GTA TTC GAG AM CTG AAA GAC CrG GAA GAA 359
GAC TGA AGA CTG GCA CAT AAG CTC TTT GAC TTT CTG GAC CTT CTT
GGT ATC GTT GCN' CTG ATG CGT GAC CTG GGT GAA GGT GGT TTC GGT 404
CCA TAC CAA CGA GAC TAC GCA CTG GAC CCA CTT CCA CCA AAG CCA
TCT TCT ACT CTG CTG AAA CTG ACA TAT GAC AAA TTC GAC GTT AAC 449
AGA AGA TGA GAC GAC TTT GAC TGT ATA CTG TTT MG CTG CAA TTG
CTG CGT AAC GAC GAC GCA CTG TTC AAA MC TAC GGT CTA CTG TCT 494
GAC GCA TTG CTG CTG CGT GAC AAG TTT TTC ATG CCA GAT GAC AGA
TGC TTC AAA AAA GAC ATG CAT AAA GTT GAA ACT TAC CTG AAA GTT 539
ACG AAG TTT TTT CTG TAC GTA TTT CAA CTT TGA ATG GAC TTT CAA
ATG AAA TGC CGT CGT TTC GTT GAA TCT MC TGC ACT CTG TAGCTCG 565
TAC TTT ACG GCA GCA AAG CAA CTT AGA TTG ACG TGA GAC ATCGAGC
AGA 592
TCT TCGA
On choisit une fraction appropriée de cette séquence de nucléotides, et on synthétise, selon un procédé de synthèse chimique d'ADN, un fragment d'ADN constitué de 10 bases ou plus, et de préférence de 15 bases ou plus. Le fragment d'ADN ainsi obtenu est ensuite phosphorylé et apparié selon un procédé classique, ce qui permet d'obtenir un ADN double brin. L'ADN double brin est coupé avec une enzyme de restriction appropriée, ce qui donne une sonde pour 1'ADN recombinant de la présente invention.Nucleotide sequence (1)
ATC ATG TAC CCG ATG ATC CCG CTG ACZ TCT CTG TTC ACT TM 44
G TAC ATG GGC TAC TAG GGC GAC TCG AGA GAC AAG TGA TTG
GCA CTT CTG GCT CAG CATG CAT CAG CAT CTG GCT GAC ATC 89
CGT CAA GAC GCA CGA GTC ATG GAC GTA GTC GhC CGA CGA CTG TAG
TAC AAA GAC TTC GAA CGT ACT TAC ATG CCG AAC GM CAG CGT CAT 134
ATG TTT CTG AAG CTT GCA TGA ATG TAC GGC TTG CTT GTC GCA GTA
TCT TCT AAA AAC TCT CCG TCT GCT TTC TGC TAC TCT GAA ACT ATC 179
AGA AGA TT AGA AGG GGC AGA MG AGG AGG ATG AGA CTT TGA TAG
CCG GCT CCG ACT GGT AAA GAC GAA GCT CAG CAG CGT TCT GAC GTT 224
GGC CGA GGC TGA CCA TTT CTG CTT CGA GTC GTC GCA AGA CTG CAA
GAA CTG CrG CM TTC TCT CTG GCT CTG ATC CAG TCT TGG ATC TCT 269
CTT GAC GAC GTT AAG AGA GAC CGA GAC TAG GTC AGA ACC TAG AGA
CCG CTG CAG TCT CTG TCT CGT GTT TTC ACC AAC TCT CTG GTT TTC 314
GGC GAC GTC AGA GAC AGA GCA CAA AGG TGG AGA GAC AGC AGG
CTG ACT TCT GAC CGT GTA TTC GAG AM CTG AAA GAC CrG GAA GAA 359
GAC TGA AGA CTG CAT GCA CAT CTC TTT GAC TT CTG GAC CTT CTT
GGT ATC GTT GCN 'CTG ATG CGT GAC CTG GGT GAA GGT GGT TTC GGT 404
CCA TAC CAA CGA GAC TAC GCA CTG GAC CCA CTT CCA CCA AAG CCA
TCT TCT ACT CTG CTG AAA CTG ACA TAT GAC AAA TTC GAC GTT AAC 449
AGA AGA TGA GAC GAC TTT GAC TGT ATA CTG TTT MG CTG CAA TTG
CTG CGT AAC GAC GAC GCA CTG TTC AAA TM TAC GGT CTA CTG TCT 494
GAC GCA TTG CTG CTG CGT GAC AAG TT TTC ATG CCA GAT GAC AGA
TGC TTC AAA AAA GAC CAT ATG AAA GTT ACT GAA TAC CTG AAA GTT 539
ACG AAG TTT TTT CTG TAC GTA TTT CAA CTT TGA ATG GAC TTT CAA
ATG AAA TGC CGT CGT TTC GTT GAA TCT TM TGC ACT CTG TAGCTCG 565
TAC TTT ACG GCA GCA AAG CAA CTT AGA TTG ACG TGA GAC ATCGAGC
AGA 592
TCT TCGA
An appropriate fraction of this nucleotide sequence is selected, and a DNA fragment consisting of 10 or more bases, and preferably 15 bases or more, is synthesized according to a chemical DNA synthesis method. The DNA fragment thus obtained is then phosphorylated and paired according to a conventional method, which makes it possible to obtain double-stranded DNA. The double-stranded DNA is cut with a suitable restriction enzyme to provide a probe for the recombinant DNA of the present invention.
Comme méthode de synthèse d'ADN que l'on peut utiliser pour synthétiser ce fragment d'ADN, on peut mentionner la méthode au triester, la méthode au phosphoramidite, etc. On préfère cependant la méthode au phosphoramidite, parce qu'elle donne le fragment d'ADN avec un excellent rendement. As a method of DNA synthesis that can be used to synthesize this DNA fragment, mention may be made of the triester method, the phosphoramidite method, and the like. However, the phosphoramidite method is preferred because it gives the DNA fragment with excellent yield.
Comme le fragment d'ADN obtenu est chimiquement synthétisé, il est nécessaire de transférer un groupe acide phosphorique de l'adénosine triphosphate (appelé ci-après "ATP") à l'extrémité 5'-OH du fragment d'ADN. Par exemple, on peut phosphoryler l'extrémité 5'-OH à l'aide de la polynucléotide kinase de T4. Le fragment d'ADN peut être lié à l'aide d'ADN ligase de T4 et par hybridation de fragments d'ADN. Since the resulting DNA fragment is chemically synthesized, it is necessary to transfer a phosphoric acid group of adenosine triphosphate (hereinafter referred to as "ATP") to the 5'-OH end of the DNA fragment. For example, the 5'-OH end may be phosphorylated using T4 polynucleotide kinase. The DNA fragment can be ligated using T4 DNA ligase and by hybridization of DNA fragments.
On peut synthétiser l'ADN recombinant de la présente invention selon les protocoles suivants (a) à (c)
a) construction d'une bibliothèque d'ADNc à partir d'un ARNm correspondant aux peptides d'hormone de croissance présents dans la glande pituitaire d'esturgeon ;
b) sélection, dans cette bibliothèque d'ADNc, d'un clone contenant un ADNc qui peut s'hydrider avec la sonde préparée de la façon indiquée plus haut, selon le procédé classique utilisant comme sonde un fragment d'ADN partiellement synthétisé selon un procédé chimique, d'après la séquence d'acides aminés du peptide (a) ou (b) ; et
(c) synthèse du fragment d'ADN de la présente invention à partir de l'ADNc sélectionné.The recombinant DNA of the present invention can be synthesized according to the following protocols (a) to (c)
a) constructing a cDNA library from an mRNA corresponding to the growth hormone peptides present in the pituitary sturgeon gland;
b) selecting, in this cDNA library, a clone containing a cDNA which can be hydrolyzed with the probe prepared as above, according to the conventional method using as a probe a partially synthesized DNA fragment according to a chemical process, according to the amino acid sequence of peptide (a) or (b); and
(c) synthesizing the DNA fragment of the present invention from the selected cDNA.
L'ADN de la présente invention ainsi obtenu est inséré (reclonage) dans un plasmide vecteur convenable, connu comme vecteur représentatif. L'ADN plasmidique comportant le fragment inséré est ensuite introduit dans un microorganisme, tel que la souche Escherichia coli JM105, dont on a traité les cellules pour les rendre compétentes, selon le procédé de ' Hanahan (Hanahan, D., Studies on transformation of Excherichia coli with Plasmids, J. Mol. The DNA of the present invention thus obtained is inserted (recloned) into a suitable vector plasmid, known as a representative vector. The plasmid DNA with the inserted fragment is then introduced into a microorganism, such as the strain Escherichia coli JM105, the cells of which have been treated to make them competent, according to the method of Hanahan (Hanahan, D., Studies on transformation of Excherichia coli with Plasmids, J. Mol.
Biol. 166, pp 55, 1983), et l'on obtient ainsi le microorganisme de la présente invention. Par expression de l'ADN recombinant dans ce microorganisme, on peut obtenir une grande quantité du peptide de la présente invention, c'est-à-dire le peptide hormone de croissance d'esturgeon.Biol. 166, pp 55, 1983), and the microorganism of the present invention is thus obtained. By expression of the recombinant DNA in this microorganism, a large amount of the peptide of the present invention, i.e. sturgeon growth hormone peptide, can be obtained.
Le microorganisme de la présente invention, construit de la façon indiquée plus loin dans les exemples de la présente description, a été déposé au Fermentation
Research Institute, Agency of Industrial Science and
Technology, (Japon), le 17 avril 1992, sous le numéro d'accès FERM P-12923.The microorganism of the present invention, constructed in the manner indicated later in the examples of the present description, has been deposited at Fermentation.
Research Institute, Industrial Science Agency
Technology, (Japan), on April 17, 1992, under accession number FERM P-12923.
D'autres buts et avantages de l'invention seront indiqués dans la description annexée, et ils apparaitront à la lecture de cette description ou bien pourront être appris lors de la mise en pratique de l'invention. Other objects and advantages of the invention will be indicated in the attached description, and they will appear on reading this description or may be learned during the practice of the invention.
Les exemples suivants fournissent une description plus détaillée des modes préférés de réalisation de la présente invention. The following examples provide a more detailed description of the preferred embodiments of the present invention.
Exemple 1
Production d'un nouveau peptide
Sur des esturgeons pesant 11 à 16 kg, on prélève la glande pituitaire, avant la saison du frai, et on lyophilise ces glandes. On homogénéise une suspension de 0,20 g de glandes pituitaires dégraissées, dans du tampon acétate d'ammonium 50 mM (pH 9,0) contenant 5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 15 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), et l'on agite cette suspension homogène à 40C pendant 2 heures, pour réaliser ainsi l'extraction des glandes pituitaires. On soumet ensuite la solution agitée à une centrifugation à 10.000 x g pendant 30 minutes, ce qui permet d'obtenir 5 ml d'un surnageant exempt de résidus insolubles.Example 1
Production of a new peptide
On sturgeons weighing 11 to 16 kg, the pituitary gland is removed before the spawning season, and these glands are lyophilized. A suspension of 0.20 g of defatted pituitary glands is homogenized in 50 mM ammonium acetate buffer (pH 9.0) containing 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 15 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). and this homogeneous suspension is stirred at 40C for 2 hours, thereby to extract the pituitary glands. The stirred solution is then subjected to centrifugation at 10,000 xg for 30 minutes to obtain 5 ml of a supernatant free of insoluble residues.
On soumet directement le surnageant obtenu à une filtration sur gel (colonne Sephadexs G-100, 2,46 x 100 cm). The obtained supernatant is subjected directly to gel filtration (Sephadex G-100 column, 2.46 x 100 cm).
Une fois la colonne équilibrée, on réalise l'élution à 200C, à un débit de 16 ml/h, avec du tampon acétate d'ammonium 50 mM (pH 9,0). On surveille cette élution en mesurant l'absorbance de l'éluat à la longueur d'onde de 280 nm, et l'on recueille ainsi 6 fractions principales.Once the column equilibrated, elution was carried out at 200 ° C., at a flow rate of 16 ml / h, with 50 mM ammonium acetate buffer (pH 9.0). This elution is monitored by measuring the absorbance of the eluate at the wavelength of 280 nm, thereby collecting six main fractions.
On soumet 13,5 mg de la 4ème fraction à une chromatographie en phase liquide haute performance à polarité de phases inversée (colonne ODS-120T, 0,46 x 25 cm, dimension des particules 5 ym), en utilisant du gel TSK équilibré avec une solution à 0,1 % d'acide trifluoroacétique contenant 50 % d'acétonitrile. On réalise l'élution à 400C et avec un débit de 1 ml/min, avec une solution à 0,1 % d'acide trifluoroacétique et contenant de l'acétonitrile en un gradient de concentration de 50 à 80 %. On mesure l'absorbance de l'éluat à la longueur d'onde de 220 nm, et on lyophilise les fractions majeures obtenues. Deux fractions ainsi obtenues sont appelées respectivement "GH-I" et "GH-II".Les quantités de GH-I et GH-II obtenues valent respectivement 1,1 mg et 1,0 mg. 13.5 mg of the 4th fraction were subjected to reverse phase high performance liquid chromatography (ODS-120T column, 0.46 x 25 cm, particle size 5 μm), using TSK gel equilibrated with a 0.1% solution of trifluoroacetic acid containing 50% acetonitrile. Elution is carried out at 400 ° C. and at a flow rate of 1 ml / min, with a 0.1% solution of trifluoroacetic acid and containing acetonitrile in a concentration gradient of 50 to 80%. The absorbance of the eluate is measured at the wavelength of 220 nm, and the major fractions obtained are lyophilized. Two fractions thus obtained are called "GH-I" and "GH-II" respectively. The amounts of GH-I and GH-II obtained are respectively 1.1 mg and 1.0 mg.
On a ensuite déterminé les masses moléculaires et les points isoélectriques de GH-I et GH-II, ainsi que leur composition en acides aminés. The molecular weights and isoelectric points of GH-I and GH-II and their amino acid composition were then determined.
Expérience 1 (masse moléculaire)
On a établi que GH-I et GH-II sont des substances pures par filtration sur gel à l'aide d'une colonne Sephadex G-100, et par chromatographie à polarité de phases inversée sur du gel TSK (colonne ODS-120T, 0,46 x 25 cm).Experiment 1 (molecular mass)
GH-I and GH-II were determined to be pure substances by gel filtration using a Sephadex G-100 column, and reverse-phase chromatography on TSK gel (ODS-120T column, 0.46 x 25 cm).
On a déterminé la masse moléculaire des nouveaux peptides de la présente invention par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (appelée ci-après "méthode SDS-PAGE").The molecular weight of the novel peptides of the present invention was determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter referred to as "SDS-PAGE method").
Les substances GH-I et GH-II ont toutes deux une masse moléculaire valant environ 22.000 daltons.GH-I and GH-II both have a molecular weight of about 22,000 daltons.
Expérience 2 (point isoélectrique)
On soumet GH-I et GH-II à une électrofocalisation, sur du gel contenant 2 % d'ampholine (pH 3-10), puis on colore le gel obtenu avec une solution mixte contenant 0,04 % de Bleu Brillant de Coomassie G-250 et 3,5 % d'acide perchlorique. Les points isoélectriques ainsi mesurés de
GH-I et de GH-II valent respectivement 6,0 et 6,1.Experiment 2 (isoelectric point)
GH-I and GH-II are subjected to electrofocusing on gel containing 2% of ampholine (pH 3-10), and then the gel obtained is stained with a mixed solution containing 0.04% Coomassie Brilliant Blue G -250 and 3.5% perchloric acid. The isoelectric points thus measured from
GH-I and GH-II are respectively 6.0 and 6.1.
Expérience 3 (composition en acides aminés)
On soumet le nouveau peptide de l'invention à une hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique 6 N contenant 0,6 % de phénol, à 1100C pendant 24 heures, puis l'on fait réagir la solution résultante avec du phénylisothiocyanate, et l'on obtient ainsi les dérivés phénylthiocarbamylés d'acides aminés. En soumettant ces dérivés à une chromatographie en phase liquide haute performance à polarité de phases inversée (colonne ODS-80TM, 0,46 x 25 cm, dimension des particules 5 Am) sur du gel TSK, on détermine quantitativement les compositions en acides aminés de GH-I et de GH-II, en opérant avec un gradient des proportions d'éluants (solution d'acétate de sodium 0,14 M (pH 5,4) et acétonitrile).La présence de cystéine (Cys) est confirmée par la méthode d'oxydation à l'acide performique. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 1. Experiment 3 (amino acid composition)
The novel peptide of the invention is subjected to hydrolysis with 6 N hydrochloric acid containing 0.6% phenol at 1100C for 24 hours, and the resulting solution is reacted with phenylisothiocyanate, and the phenylthiocarbamyl derivatives of amino acids are thus obtained. By subjecting these derivatives to reversed-phase high-performance liquid phase chromatography (ODS-80 ™ column, 0.46 x 25 cm, particle size Am) on TSK gel, the amino acid compositions of GH-I and GH-II, operating with a gradient of the proportions of eluents (solution of 0.14 M sodium acetate (pH 5.4) and acetonitrile). The presence of cysteine (Cys) is confirmed by the performic acid oxidation method. The results obtained are given in Table 1.
Tableau 1
<tb> <SEP> Teneur
<tb> Acide <SEP> aminé <SEP> (mole/mole)
<tb> <SEP> GH-I <SEP> GH-II <SEP>
<tb> <SEP> Cys <SEP> 4,2 <SEP> 4,1
<tb> <SEP> Asp <SEP> 19,8 <SEP> 19,9
<tb> <SEP> Glu <SEP> 19,2 <SEP> 19,3
<tb> <SEP> Ser <SEP> 18,6 <SEP> 18,5
<tb> <SEP> Gly <SEP> 7,2 <SEP> 7,2
<tb> <SEP> His <SEP> 2,9 <SEP> 2,8
<tb> <SEP> Arg <SEP> 10,0 <SEP> 9,9
<tb> <SEP> Thr <SEP> 9,7 <SEP> 9,8
<tb> <SEP> Ala <SEP> 9,9 <SEP> 9,3
<tb> <SEP> Pro <SEP> 7,0 <SEP> 7,0
<tb> <SEP> Tyr <SEP> 8,2 <SEP> 8,1
<tb> <SEP> Val <SEP> 10,2 <SEP> 10,7
<tb> <SEP> Met <SEP> 4,6 <SEP> 5,5
<tb> <SEP> Ile <SEP> 6,2 <SEP> 6,3
<tb> <SEP> Leu <SEP> 25,7 <SEP> 25,9
<tb> <SEP> Phe <SEP> 12,1 <SEP> 12,3
<tb> <SEP> Trp <SEP> 0,7 <SEP> 0,8
<tb> <SEP> Lys <SEP> 13,3 <SEP> 12,4
<tb> Expérience 4 (détermination de la séquence d'acides aminés et identification de l'acide aminé N-terminal)
1) Détermination de la séquence d'acides aminés
On fait d'abord digérer le nouveau peptide de l'invention par de la lysylendopeptidase (conditions : E/S = 1/60, bicarbonate d'ammonium 0,1 M, pH 8,0, 370C, 4 heures), puis on le fait digérer par 100 mol de bromure de cyanogène (conditions : acide formique 70 %, température ambiante, obscurité, 18 heures), et enfin, on le fait digérer par de la trypsine (conditions : E/S = 1/60, acétate d'ammonium 0,2 M, pH 8,0, 370C, 4 heures).Les fragments de peptide ainsi obtenus sont séparés par chromatographie en phase liquide haute performance à polarité de phases inversée sur du gel TSK (colonne : OTS120T, 0,46 x 25 cm, dimension des particules 5 im). On détecte les fragments intéressants à une longueur d'onde de 210 nm, et on les isole. On traite les fragments obtenus dans un appareil automatique d'excision d'acides aminés, appelé "séquenceur de protéines en phase gazeuse" (modèle 470A, fabriqué et vendu par Applied Biosystems Co., Ltd.), appareil qui découpe un peptide en morceaux.On analyse ensuite les acides aminés par chromatographie en phase liquide haute performance à polarité de phases inversée (appareil SP8100, fabriqué et vendu par Spectra Physics
Co., Ltd.), en opérant avec un gradient des proportions d'éluants (solution 0,04 M d'acétate de sodium (pH 4,9)/acétonitrile), sur une colonne C8 à polarité de phases inversée (SEQ-4, 0,46 x 30 cm, fabriqué et vendu par Senshu
Kagaku Co., Ltd.).<tb><SEP> Content
<tb><SEP> Amino acid <SEP> (mole / mole)
<tb><SEP> GH-I <SEP> GH-II <SEP>
<tb><SEP> Cys <SEP> 4.2 <SEP> 4.1
<tb><SEP> Asp <SEP> 19.8 <SEP> 19.9
<tb><SEP> Glu <SEP> 19.2 <SEP> 19.3
<tb><SEP> Ser <SEP> 18.6 <SEP> 18.5
<tb><SEP> Gly <SEP> 7.2 <SEP> 7.2
<tb><SEP> His <SEP> 2.9 <SEP> 2.8
<tb><SEP> Arg <SEP> 10.0 <SEP> 9.9
<tb><SEP> Thr <SEP> 9.7 <SEP> 9.8
<tb><SEP> Ala <SEP> 9.9 <SEP> 9.3
<tb><SEP> Pro <SEP> 7.0 <SEP> 7.0
<tb><SEP> Tyr <SEP> 8.2 <SEP> 8.1
<tb><SEP> Val <SEP> 10.2 <SEP> 10.7
<tb><SEP> Met <SEP> 4.6 <SEP> 5.5
<tb><SEP> Ile <SEP> 6.2 <SEP> 6.3
<tb><SEP> Leu <SEP> 25.7 <SEP> 25.9
<tb><SEP> Phe <SEP> 12.1 <SEP> 12.3
<tb><SEP> Trp <SEP> 0.7 <SEP> 0.8
<tb><SEP> Lys <SEP> 13.3 <SEP> 12.4
<tb> Experiment 4 (Determination of the amino acid sequence and identification of the N-terminal amino acid)
1) Determination of the amino acid sequence
The novel peptide of the invention is first digested with lysylendopeptidase (conditions: E / S = 1/60, 0.1 M ammonium bicarbonate, pH 8.0, 370C, 4 hours), then digested with 100 mol of cyanogen bromide (conditions: 70% formic acid, room temperature, darkness, 18 hours), and finally digested with trypsin (conditions: E / S = 1/60, acetate 0.2M ammonium, pH 8.0, 370C, 4 hours). The peptide fragments thus obtained are separated by reversed-phase high-performance liquid phase chromatography on TSK gel (column: OTS120T, 0, 46 x 25 cm, particle size 5 μm). The fragments of interest at a wavelength of 210 nm are detected and isolated. The resulting fragments are processed in an automatic amino acid excision apparatus, referred to as a "gas phase protein sequencer" (Model 470A, manufactured and sold by Applied Biosystems Co., Ltd.), which cuts a peptide into pieces. The amino acids are then analyzed by reversed-phase high-performance liquid chromatography (SP8100, manufactured and sold by Spectra Physics).
Co., Ltd.), by operating with a gradient of proportions of eluents (0.04 M solution of sodium acetate (pH 4.9) / acetonitrile), on a column C8 reversed-phase (SEQ- 4, 0.46 x 30 cm, manufactured and sold by Senshu
Kagaku Co., Ltd.).
L'identification des acides aminés et la détermination des séquences des fragments peptidiques individuels sont effectuées à partir des résultats d'élution et de valeurs d'essais. The identification of the amino acids and the sequence determination of the individual peptide fragments are performed from the elution results and test values.
A partir des résultats concernant les séquences d'acides aminés des fragments peptidiques individuels, on détermine la séquence totale d'acides aminés en suivant la piste des séquences qui se chevauchent mutuellement. From the amino acid sequence results of the individual peptide fragments, the total amino acid sequence is determined by following the path of mutually overlapping sequences.
2) Identification de l'acide aminé N-terminal
On effectue la détermination qualitative de l'acide aminé N-terminal selon la méthode au DNS. Le résultat en est que, pour les deux peptides GH-I et GH-II, l'acide aminé N-terminal est Tyr.2) Identification of the N-terminal amino acid
The qualitative determination of the N-terminal amino acid is carried out according to the method at the DNS. As a result, for both the GH-I and GH-II peptides, the N-terminal amino acid is Tyr.
A partir des résultats des étapes (1) et (2) indiquées ci-dessus, on détermine que les peptides GH-I et GH-II de la présente invention sont respectivement les peptides (a) et (b) ayant les séquences d'acides aminés mentionnées plus haut. From the results of steps (1) and (2) indicated above, it is determined that the peptides GH-I and GH-II of the present invention are respectively the peptides (a) and (b) having the sequences of amino acids mentioned above.
Toutefois, comme les peptides de la présente invention peuvent contenir non seulement des parties essentielles pour leur activité, mais également des parties ne concernant pas directement leur activité, la présente invention englobe également dans son cadre des peptides contenant les mêmes séquences d'acides aminés que celles des peptides GH-I et GH-II. However, since the peptides of the present invention may contain not only essential parts for their activity, but also parts not directly related to their activity, the present invention also encompasses peptides containing the same amino acid sequences as those of peptides GH-I and GH-II.
Quand on administre les peptides GH-I et GH-II à du frai d'esturgeon pour étudier leurs activités physiologiques en ce qui concerne leur rôle dans l'accélération de la croissance, on constate qu'ils possèdent une remarquable activité d'accélération de la croissance du frai d'esturgeon. When the GH-I and GH-II peptides are administered to sturgeon spawning to study their physiological activities with respect to their role in accelerating growth, they are found to have remarkable activity in accelerating growth. growth of sturgeon spawning.
L'étape suivante concerne la synthèse d'un ADN recombinant codant un nouveau peptide de la présente invention, ainsi que la préparation d'un microorganisme transformé avec cet ADN recombinant pour qu'il synthétise un nouveau peptide de la présente invention. The next step is the synthesis of a recombinant DNA encoding a novel peptide of the present invention, as well as the preparation of a microorganism transformed with this recombinant DNA to synthesize a novel peptide of the present invention.
Exemple 2
Construction d'un ADN recombinant 1. Synthèse de fragments d'ADN
Pour construire l'ADN recombinant de la présente invention, on synthétise, à l'aide d'un synthétiseur d'ADN 380A (fabriqué et vendu par Applied Biosystems Co., Ltd.), selon la méthode au phosphoramidite, des ADN présentant les séquences de nucléotides 2 à 45 indiquées ci-dessous, qui représentent des fragments de la séquence de nucléotides (1). Dans ce qui suit, on appelle respectivement chacun de ces ADN "fragments d'ADN 2, 3, ... 45", et on les appelle collectivement "fragments d'ADN". Example 2
Construction of a recombinant DNA 1. Synthesis of DNA fragments
To construct the recombinant DNA of the present invention, using a 380A DNA synthesizer (manufactured and sold by Applied Biosystems Co., Ltd.), DNA using the phosphoramidite method is synthesized. nucleotide sequences 2 to 45 indicated below, which represent fragments of the nucleotide sequence (1). In what follows, each of these DNAs is referred to as "DNA fragments 2, 3, ... 45", and collectively referred to as "DNA fragments".
Séquence de nucléotides (2)
AATTCATGTA CCCGATGATC CCGCTG 26
Séquence de nucléotides (3)
ATCATCGGGT ACTG 15
Séquence de nucléotides (4)
AGCTCTCTGT TCACTAACGC AGTTCT 26
Séquence de nucléotides (5)
CGTTAGTGAA CAGAGAGCTC AGCGGG 26
Séquence de nucléotides (6)
GCGTGCTCAG TACCTGCATC AGCTGG 26
Séquence de nudéotides (7)
ATGCAGGTAC TGAGCACGCA GAACTG 26
Séquence de nucléotides (8)
CTGCTGACAT CTACAAAGAC TTCG 24
Séquence de nucléotides (g)
TTTGTAGATG TCAGCAGCCA GCTG 24
Séquence de nucléotides (10)
AACGTACTTA CATGCCGAAC GAACAG 26 séquence de nucléotides (11)
TTCGGCATGT AAGTACGTTC GAAGTC 26
Séquence de nucléotides (12)
CGTCATTCTT CTAAAAACTC TCCG 24
Séquence de nucléotides (13)
TTTTTAGAAG AATGACGCTG TTCG 24
Séquence de nucléotides (14)
TCTGCTTTCT GCTACTCTGA AACTAT 26
Séquence de nucléotides (15)
AGAGTAGCAG AAAGCAGACG GAGAG 25
Séquence de nucléotides (16)
CCCGGCTCCG ACTGGTAAAG ACG 23
Séquence de nucléotides (17)
ACCAGTCGGA GCCGGGATAG TTTC 24
Séquence de nucléotides (18)
AAGCTCAGCA GCGTTCTGAC GTTGAAC 27
Séquence de nucléotides (19)
GTCAGAACGA TGCTGAGCTT CGTCTTT 27
Séquence de nucléotides (20)
TGCTGCAATT CTCTCTGGCT CTGAT 25
Séquence de nucléotides (21)
CCAGAGAGAA TTGCAGCAGT TCAAC 25
Séquence de nucléotides (22)
CCAGTCTTGG ATCTCTCCGC TGCA 24 séquence de nucléotides (23)
GCGGAGAGAT CCAAGACTGG ATCAGAG 27
Séquence de nucléotides (24)
GTCTCTGTCT CGTGTTTTCA CCAACTCTC 29
Séquence de nucléotides (25)
GGTGAAAACA CGAGACAGAG ACTGCA 26
Séquence de nucléotides (26)
TGGTTTTCCT GACTTCTGAC CGTGTATTC 29
Séquence de nucléotides (27) GGTCAGAAGT CAGGAAAACC AGAGAGTT 28
Séquence de nucléotides (2 8)
GAGAAACTGA AAGACCTGGA AGAAGGTAT 29
Séquence de nudéotides (29)
CTTCCAGGTC TTTCAGTTTC TCGAATACAC 30
Séquence de nucléotides (30)
CGTTGCTCTG ATGCGTGACC TGGGTGAAG 29
Séquence de nucléotides (31)
CAGGTCACGC ATCAGAGCAA CGATACCTT 29
Séquence de nucléotides (32)
GTGGTTTCGG TTCTTCTACT CTGCTGAAAC 30
Séquence de nucléotides (33)
CAGAGTAGAA GAACCGAAAC CACCTTCACC 30
Séquence de nucléotides (34)
TGACATATGA CAAATTCGAC GTTAACCT séquence de nucléotides (35)
GTCGAATTTG TCATATGTCA GTTTCAG 27
Séquence de nucléotides (3 6)
GCGTAACGAC GACGCACTGT TCAAAAAACT 29
Séquence de nucléotides (37)
GAACAGTGCG TCGTCGTTAC GCAGGTTAAC 30
Séquence de nucléotides (38)
ACGGTCTACT GTCTTGCTTC AAAAAAGAC 29
Séquence de nucléotides (39)
TTGAAGCAAG ACAGTAGACC CTAGTTTTT 29
Séquence de nucléotides (40)
ATGCATAAAG TTGAAACTTA CCTGAAAGT 29
Séquence de nucléotides (41)
GTAAGTTTCA ACTTTATGCA TGTCTTTT 28
Séquence de nucléotides (42)
TATGAAATGC CGTCGTTTCG TTGAATCT 28
Séquence de nucléotides (43)
AACGAAACGA CGGCATTTCA TAACTTTCAG 30
Séquence de nucléotides (44)
AACTGCACTC TGTAGCTCGA GA
Séquence de nucléotides (45)
AGCTTCTCGA GCTACAGAGT GCAGTTAGAT TC 32
Dans l'opération de purification des fragments d'ADN individuels, on chauffe à 550C pendant 5 heures une solution d'ammoniaque qui contient des bases d'ADN protégées par des groupes protecteurs et des oligonucléotides protégés par des groupes 5'-OHprotecteurs, pour éliminer les groupes protecteurs des bases. On soumet la solution résultante à une évaporation sous pression réduite, pour éliminer l'ammoniaque, puis à une chromatographie en phase liquide haute performance à polarité de phases inversée, pour séparer les oligonucléotides protégés par des groupes 5'-OHprotecteurs. On traite la fraction ainsi obtenue avec de l'acide acétique à 80 %, à la température ambiante et pendant 15 à 30 minutes, pour éliminer les groupes protecteurs des groupes 5'-OH.Après évaporation sous pression réduite, on enlève les sels de la solution résultante, à l'aide d'une colonne de filtration sur gel (Sephadex G25), et l'on obtient les fragments individuels.Nucleotide sequence (2)
AATTCATGTA CCCGATGATC CCGCTG 26
Nucleotide sequence (3)
ATCATCGGGT ACTG 15
Nucleotide sequence (4)
AGCTCTCTGT TCACTAACGC AGTTCT 26
Nucleotide sequence (5)
CGTTAGTGAA CAGAGAGCTC AGCGGG 26
Nucleotide sequence (6)
GCGTGCTCAG TACCTGCATC AGCTGG 26
Sequence of nudeotides (7)
ATGCAGGTAC TGAGCACGCA GAACTG 26
Nucleotide sequence (8)
CTGCTGACAT CTACAAAGAC TTCG 24
Nucleotide sequence (g)
TTTGTAGATG TCAGCAGCCA GCTG 24
Nucleotide sequence (10)
AACGTACTTA CATGCCGAAC GAACAG 26 nucleotide sequence (11)
TTCGGCATGT AAGTACGTTC GAAGTC 26
Nucleotide sequence (12)
CGTCATTCTT CTAAAAACTC TCCG 24
Nucleotide sequence (13)
TTTTTAGAAG AATGACGCTG TTCG 24
Nucleotide sequence (14)
TCTGCTTTCT GCTACTCTGA AACTAT 26
Nucleotide sequence (15)
AGAGTAGCAG AAAGCAGACG GAGAG 25
Nucleotide sequence (16)
CCCGGCTCCG ACTGGTAAAG ACG 23
Nucleotide sequence (17)
ACCAGTCGGA GCCGGGATAG TTTC 24
Nucleotide sequence (18)
AAGCTCAGCA GCGTTCTGAC GTTGAAC 27
Nucleotide sequence (19)
GTCAGAACGA TGCTGAGCTT CGTCTTT 27
Nucleotide sequence (20)
TGCTGCAATT CTCTCTGGCT CTGAT 25
Nucleotide sequence (21)
CCAGAGAGAA TTGCAGCAGT TCAAC 25
Nucleotide sequence (22)
CCAGTCTTGG ATCTCTCCGC TGCA 24 Nucleotide Sequence (23)
GCGGAGAGAT CCAAGACTGG ATCAGAG 27
Nucleotide sequence (24)
GTCTCTGTCT CGTGTTTTCA CCAACTCTC 29
Nucleotide sequence (25)
GGTGAAAACA CGAGACAGAG ACTGCA 26
Nucleotide sequence (26)
TGGTTTTCCT GACTTCTGAC CGTGTATTC 29
Nucleotide sequence (27) GGTCAGAAGT CAGGAAAACC AGAGAGTT 28
Nucleotide sequence (2 8)
GAGAAACTGA AAGACCTGGA AGAAGGTAT 29
Sequence of nudeotides (29)
CTTCCAGGTC TTTCAGTTTC TCGAATACAC 30
Nucleotide sequence (30)
CGTTGCTCTG ATGCGTGACC TGGGTGAAG 29
Nucleotide sequence (31)
CAGGTCACGC ATCAGAGCAA CGATACCTT 29
Nucleotide sequence (32)
GTGGTTTCGG TTCTTCTACT CTGCTGAAAC 30
Nucleotide sequence (33)
CAGAGTAGAA GAACCGAAAC CACCTTCACC 30
Nucleotide sequence (34)
TGACATATGA CAAATTCGAC GTTAACCT Nucleotide Sequence (35)
GTCGAATTTG TCATATGTCA GTTTCAG 27
Nucleotide sequence (3 6)
GCGTAACGAC GACGCACTGT TCAAAAAACT 29
Nucleotide sequence (37)
GAACAGTGCG TCGTCGTTAC GCAGGTTAAC 30
Nucleotide sequence (38)
ACGGTCTACT GTCTTGCTTC AAAAAAGAC 29
Nucleotide sequence (39)
TTGAAGCAAG ACAGTAGACC CTAGTTTTT 29
Nucleotide sequence (40)
ATGCATAAAG TTGAAACTTA CCTGAAAGT 29
Nucleotide sequence (41)
GTAAGTTTCA ACTTTATGCA TGTCTTTT 28
Nucleotide sequence (42)
TATGAAATGC CGTCGTTTCG TTGAATCT 28
Nucleotide sequence (43)
AACGAAACGA CGGCATTTCA TAACTTTCAG 30
Nucleotide sequence (44)
AACTGCACTC TGTAGCTCGA GA
Nucleotide sequence (45)
AGCTTCTCGA GCTACAGAGT GCAGTTAGAT TC 32
In the purification operation of the individual DNA fragments, a solution of ammonia which contains DNA bases protected by protecting groups and oligonucleotides protected by 5'-OH protecting groups is heated at 550.degree. remove the protective groups from the bases. The resulting solution was subjected to evaporation under reduced pressure to remove ammonia, followed by reverse phase high performance liquid chromatography to separate the oligonucleotides protected by 5'-OH protecting groups. The fraction thus obtained is treated with 80% acetic acid at room temperature and for 15 to 30 minutes to remove the protecting groups of the 5'-OH groups. After evaporation under reduced pressure, the sodium salts are removed. the resulting solution, using a gel filtration column (Sephadex G25), and the individual fragments are obtained.
2. Phosphorylation des fragments dtADN
A un mélange contenant 100 mM de tampon Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de chlorure de magnésium, 10 mM de dithiothréitol et 1 mM d'ATP, on ajoute 400 pmol de solutions dont chacune contient respectivement l'un des fragments d'ADN 2-45 obtenus selon le protocole 1 cidessus. On y ajoute ensuite 20 unités de polynucléotide kinase de T4 (fabriquée et vendue par Toyobo Co., Ltd.), et on laisse la réaction se dérouler à 370C pendant 1 heure et 30 minutes. Une fois la réaction terminée, on chauffe le mélange réactionnel à 650C pendant 15 minutes pour inactiver l'enzyme. 2. Phosphorylation of DNA fragments
To a mixture containing 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), 10 mM magnesium chloride, 10 mM dithiothreitol and 1 mM ATP was added 400 pmol of solutions each of which contained respectively one of 2-45 DNA fragments obtained according to protocol 1 above. Twenty units of T4 polynucleotide kinase (manufactured and sold by Toyobo Co., Ltd.) were then added, and the reaction was allowed to proceed at 370 ° C. for 1 hour and 30 minutes. Once the reaction is complete, the reaction mixture is heated at 650C for 15 minutes to inactivate the enzyme.
3. Liaison des fragments d'ADN
a) Fragments d'ADN 2-23
On mélange les unes avec les autres des quantités équivalentes à 80 pmol des solutions contenant les fragments d'ADN 2 à 23 phosphorylés, obtenues selon le protocole 2 ci-dessus, puis on chauffe le tout à 900C pendant 3 minutes et on le refroidit lentement pour permettre à ces fragments d'ADN de s'hybrider. Après refroidissement, on ajoute de 1'ATP pour ajuster la concentration d'ATP du mélange réactionnel à 1 mM. On fait réagir le mélange, à 160C pendant 20 heures, avec 700 unités d'ADN ligase de T4 (fabriquée et vendue par Takara
Shuzo Co., Ltd.). Puis on y ajoute 80 unités de l'enzyme de restriction EcoRI et 120 unités de l'enzyme de restriction
PstI, et on fait réagir le tout à 370C pendant 2 heures. On soumet la solution résultante à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 5 %. On découpe dans le gel la bande correspondant au fragment d'ADN double brin d'environ 280 pb, qui représente une partie de la séquence de 1'ADN présentant la séquence de nucléotides (1) (fragment appelé ci-après "S1-l"), on trempe cette bande de gel dans une solution contenant 0,5 M d'acétate d'ammonium et 1 mM d'EDTA, et on élue ce fragment d'ADN à 370C pendant 14 heures. On élimine les sels de l'éluat au moyen d'une colonne NAP-5 (fabriquée et vendu par Pharmacia LBK
Biotechnology).3. Binding of DNA fragments
a) DNA fragments 2-23
Amounts equivalent to 80 pmol of the solutions containing the phosphorylated DNA fragments 2 to 23, obtained according to protocol 2 above, are mixed with each other and then heated at 900 ° C. for 3 minutes and cooled slowly. to allow these DNA fragments to hybridize. After cooling, ATP was added to adjust the ATP concentration of the reaction mixture to 1 mM. The mixture is reacted at 160C for 20 hours with 700 units of T4 DNA ligase (manufactured and sold by Takara
Shuzo Co., Ltd.). Then 80 units of the restriction enzyme EcoRI and 120 units of the restriction enzyme are added.
PstI, and reacted at 370C for 2 hours. The resulting solution is electrophoresed on a 5% polyacrylamide gel. The band corresponding to the approximately 280 bp double-stranded DNA fragment, which represents a portion of the sequence of the DNA having the nucleotide sequence (1) (fragment hereinafter referred to as "S1-1"), is cut from the gel. "), this gel strip was dipped in a solution containing 0.5 M ammonium acetate and 1 mM EDTA, and this DNA fragment was eluted at 370C for 14 hours. The salts of the eluate are removed by means of a NAP-5 column (manufactured and sold by Pharmacia LBK
Biotechnology).
b) Fragments d'ADN 24 à 45
On reprend pratiquement le même protocole que celui de l'étape (1) ci-dessus, sauf que l'on utilise des quantités équivalentes à 80 pmol des solutions contenant les fragments d'ADN phosphorylés 24 à 45, au lieu des solutions contenant les fragments d'ADN phosphorylés 2 à 23. On obtient, comme résultat des réactions, un fragment d'ADN double brin d'environ 310 pb, représentant une partie de la séquence de 1'ADN représentant la séquence de nucléotides (1) (fragment appelé ci-après "S1-2").b) DNA fragments 24 to 45
Substantially the same protocol as that of step (1) above is followed, except that amounts equivalent to 80 pmol of the solutions containing the phosphorylated DNA fragments 24 to 45 are used instead of the solutions containing the Phosphorylated DNA fragments 2 to 23. As a result of the reactions, a double-stranded DNA fragment of about 310 bp, representing a portion of the DNA sequence representing the nucleotide sequence (1) (fragment hereinafter referred to as "S1-2").
4. Préparation d'un ADN vecteur
On coupe 2 ,ug du plasmide pKK223-3 (fabriqué et vendu par Pharmacia LBK Biotechnology), à l'aide des enzymes de restriction EcoRI et Hind III, puis on les soumet à une électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion à 0,7 is. Après avoir coloré le gel résultant avec du bromure d'éthidium (EtBr), on obtient l'ADN vecteur souhaité, dont la longueur vaut environ 4,5 kb (appelé ciaprès "pKK223-3-E-H").4. Preparation of a vector DNA
2. μg of plasmid pKK223-3 (manufactured and sold by Pharmacia LBK Biotechnology) are cut with restriction enzymes EcoRI and Hind III and subjected to low melting point agarose gel electrophoresis. at 0.7 is. After staining the resulting gel with ethidium bromide (EtBr), the desired vector DNA, the length of which is about 4.5 kb (hereinafter referred to as "pKK223-3-EH"), is obtained.
5. Construction d'un plasmide
On fait réagir pKK223-3-E-H, S1-1 et S1-2, avec 350 unités d'ADN ligase de T4 (fabriquée et vendue par Takara
Shuzo Co., Ltd.), pour obtenir un plasmide contenant 1'ADN de la présente invention (appelé ci-après "pKK223-3-GH").5. Construction of a plasmid
PKK223-3-EH, S1-1 and S1-2 are reacted with 350 units of T4 DNA ligase (manufactured and sold by Takara
Shuzo Co., Ltd.), to obtain a plasmid containing the DNA of the present invention (hereinafter referred to as "pKK223-3-GH").
On fait ensuite dégeler de la souche Escherichia coli
JM105, destinée à être utilisée dans la transduction, qui était congelée et conservée à -700C. On ajoute 10 ng de pKK223-3-GH à 200 iil de la suspension contenant la souche
Escherichia coli JM105 dégelée. Après l'avoir refroidie sur de la glace pendant 30 minutes, on fait subir à la suspension un choc thermique, à 420C pendant 90 secondes, puis on la refroidit sur de la glace pendant 2 minutes. On ajoute ensuite à cette suspension 800 yl de milieu SOC, et on fait incuber le tout à 370C pendant 1 heure.On étale ensuite la suspension sur une plaque de milieu LB gélosé, contenant 0,1 mg/ml d'ampicilline, et on fait incuber le tout à 370C jusqu'au lendemain, pour obtenir des transformants contenant le plasmide pKK223-3-GH constitué de pKK223-3-E-H, S1-l et S1-2 (ces transformants sont appelés ci-après "JMl05/pKK223-3-GH1'). A partir de cette souche JM105/pKK223-3-GH, on isole un ADN plasmidique et on le fait digérer par les enzymes de restriction EcORI et
Hind III. On soumet les fragments de l'ADN plasmidique digéré à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %. Par coloration au EtBr, on confirme que l'un des fragments de plasmide possède une longueur de 596 pb.Escherichia coli strain is then thawed
JM105, for use in transduction, which was frozen and stored at -700C. 10 μg of pKK223-3-GH are added to 200 μl of the suspension containing the strain
Escherichia coli JM105 thawed. After cooling on ice for 30 minutes, the suspension is heat-shocked at 420 ° C. for 90 seconds and then cooled on ice for 2 minutes. 800 μl of SOC medium are then added to this suspension, and the whole is incubated at 370 ° C. for 1 hour. The suspension is then spread on a plate of LB agar medium, containing 0.1 mg / ml of ampicillin, and incubate at 370C overnight, to obtain transformants containing plasmid pKK223-3-GH consisting of pKK223-3-EH, S1-1 and S1-2 (these transformants are hereinafter referred to as "JM105 / pKK223 From this strain JM105 / pKK223-3-GH, plasmid DNA is isolated and digested with restriction enzymes EcOR1 and
Hind III. Fragments of the digested plasmid DNA were electrophoresed on 1% agarose gel. EtBr staining confirms that one of the plasmid fragments has a length of 596 bp.
On vérifie la séquence de ce fragment d'ADN au moyen du kit de séquençage Dye Deoxy Terminator Taq (fabriqué et vendu par Applied Biosystems Co., Ltd.) et du système de séquençage d'ADN, modèle 373A (fabriqué et vendu par Applied Biosystems Co., Ltd.). Ceci apporte la confirmation de ce que ce fragment est bien l'ADN présentant la séquence de nucléotides (1). I1 se confirme également que ce fragment possède une séquence complète de nucléotides, contenant un codon d'initiation, 1'ADN codant le peptide (a) ou (b) présentant la séquence d'acides aminés (1), et un codon d'arrêt. The sequence of this DNA fragment was verified using the Dye Deoxy Terminator Taq Sequencing Kit (manufactured and sold by Applied Biosystems Co., Ltd.) and the Model 373A DNA Sequencing System (manufactured and sold by Applied). Biosystems Co., Ltd.). This provides confirmation that this fragment is indeed the DNA having the nucleotide sequence (1). It is also confirmed that this fragment has a complete nucleotide sequence, containing an initiation codon, the DNA encoding the peptide (a) or (b) having the amino acid sequence (1), and a codon of stop.
Expérience 5
Expression de 1'ADN codant le peptide hormone de croissance d'esturqeon
On fait incuber les transformants JM105/pKK223-3-GH dans un milieu de bouillon L, à 370C pendant 8 heures. On récolte les transformants par centrifugation du milieu liquide de culture. Après avoir soumis les microorganismes à une lyse avec une solution tamponnée de SDS, on soumet le lysat à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 15 %, pour séparer les protéines.Experience 5
Expression of the DNA encoding the sturgeon growth hormone peptide
JM105 / pKK223-3-GH transformants are incubated in L broth at 370C for 8 hours. The transformants are harvested by centrifugation of the liquid culture medium. After subjecting the microorganisms to lysis with SDS buffered solution, the lysate was electrophoresed on 15% polyacrylamide gel to separate the proteins.
Par électrophorèse, on transfère les protéines séparées sur un papier à la nitrocellulose. On analyse les protéines en utilisant un anti-sérum lapinique contre l'hormone de croissance de rat, qui présente 71,1 % d'homologie avec l'hormone de croissance d'esturgeon (fabriqué et vendu par Chemicon International Co., Ltd.) et une IgG anti-lapin, liée à une phosphatase alcaline, comme sonde. Ceci apporte la confirmation de ce que le peptide obtenu par expression dans les transformants JM105/pKK2233-GH donne une bande située à la même position que celle que donne l'hormone de croissance d'esturgeon, possédant une masse moléculaire d'environ 22.000 daltons et extraite, isolée et purifiée à partir d'esturgeons naturels. By electrophoresis, the separated proteins are transferred to nitrocellulose paper. Proteins were analyzed using rabbit anti-serum anti-rat growth hormone, which had 71.1% homology to sturgeon growth hormone (manufactured and sold by Chemicon International Co., Ltd.). ) and an alkaline phosphatase-bound anti-rabbit IgG as a probe. This confirms that the peptide obtained by expression in transformants JM105 / pKK2233-GH gives a band located at the same position as that of sturgeon growth hormone, having a molecular mass of about 22,000 daltons. and extracted, isolated and purified from natural sturgeons.
D'autres avantages et variantes de l'invention apparaîtront facilement à l'homme du métier. Par conséquent, l'invention ne se limite pas aux détails particuliers et aux substances représentatives indiqués dans la description donnée ci-dessus. Diverses variantes peuvent donc être réalisées, sans que l'on sorte du cadre de la présente invention. Other advantages and variations of the invention will be readily apparent to those skilled in the art. Therefore, the invention is not limited to the particular details and representative substances indicated in the description given above. Various variants can therefore be made, without departing from the scope of the present invention.
Claims (10)
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| JP3130092 | 1992-01-23 | ||
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Family Applications (1)
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| FR9300913A Pending FR2686606A1 (en) | 1992-01-23 | 1993-01-25 | New peptides, recombinant DNAs encoding these peptides and microorganisms transformed with these recombinant DNAs |
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| FR (1) | FR2686606A1 (en) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN110368482A (en) * | 2019-07-18 | 2019-10-25 | 嫦娥创新（武汉）生物科技有限公司 | A kind of composition and its preparing the application in prevention and cure of cardiovascular disease drug |
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