FR2679034A1

FR2679034A1 - DETERMINATION OF MALIGNANCY OF HUMAN OR ANIMAL TUMORS, USING ENDOGENOUS LECTINS.

Info

Publication number: FR2679034A1
Application number: FR9108700A
Authority: FR
Inventors: Zanetta Jean-Pierre; Vincendon Guy; Robert Jacques; Maschke Susanna
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1991-07-10
Filing date: 1991-07-10
Publication date: 1993-01-15
Also published as: WO1993001499A1

Abstract

The use of endogenous lectins for the in vitro determination of the presence of malignant cells in a given biological sample is described, wherein said lectins are involved in the phenomena of cell adhesion and/or recognition and have a calcium-independent affinity for a site involving mannose residues on glycan ligands, and are immunologically and/or structurally related to CSL or R1, or fragments of said lectins provided that these fragments retain the affinity of the original lectin for said glycan ligands.

Description

Détermination de la malignité des cellules de tumeurs humaines ou animales, au moyen de lectines endogènes
L'invention a pour objet la détermination de la malignité des cellules de tumeurs humaines ou animales, au moyen de lectines endogènes.Determination of malignancy in human or animal tumor cells using endogenous lectins
The subject of the invention is the determination of the malignancy of human or animal tumor cells, by means of endogenous lectins.

L'invention met en oeuvre les propriétés de certaines lectines endogènes, de se fixer à des ligands glycanniques, notamment des ligands riches en mannose présents au niveau des membranes de cellules, pour détecter la présence de cellules malignes dans des échantillons biologiques. The invention uses the properties of certain endogenous lectins, to bind to glycan ligands, in particular ligands rich in mannose present at the level of cell membranes, to detect the presence of malignant cells in biological samples.

Selon les inventeurs, dans la cadre de la présente demande, la transformation maligne de cellules correspond de façon générale à une perte de l'inhibition de contact entre des cellules, résultant d'un trop grand nombre de signaux cellulaires générés par les contacts intercellulaires. Les cellules confrontées à une "surexpression" de signaux équivalents à un signal polysémique peuvent ne plus être en mesure d'interpréter ces signaux et se transformer en cellules malignes. According to the inventors, in the context of the present application, the malignant transformation of cells generally corresponds to a loss of inhibition of contact between cells, resulting from too many cellular signals generated by intercellular contacts. Cells facing an "overexpression" of signals equivalent to a polysemic signal may no longer be able to interpret these signals and transform into malignant cells.

On connaissait la propriété des glycoconjugués de surface des cellules transformées (cellules tumorales), d'être modifiés par rapport à ceux des cellules normales, qu'il s'agisse des glycoprotéines, des glycolipides ou même des protéoglycannes. We knew the property of surface glycoconjugates of transformed cells (tumor cells), to be modified compared to those of normal cells, whether glycoproteins, glycolipids or even proteoglycans.

De plus certains auteurs avaient envisagé que la présence de cellules tumorales pouvait être accompagnée de modifications de certaines lectines endogènes. In addition, some authors had envisaged that the presence of tumor cells could be accompanied by modifications of certain endogenous lectins.

La nature des lectines en cause n'avait pas cependant été identifiée. En outre aucune relation n'avait été établie entre les modifications de lectines lors de la transformation maligne de cellules et les modifications des glycannes de surface observées dans des conditions comparables. The nature of the lectins at issue had not, however, been identified. Furthermore, no relationship had been established between the modifications of lectins during the malignant transformation of cells and the modifications of surface glycans observed under comparable conditions.

Les inventeurs ont défini un groupe de lectines spécifiques, capables d'interagir avec des groupements glycanniques modifiés lors de la transformation maligne des cellules et, ont été en mesure de formuler une hypothèse sur le processus de cette transformation. Les lectines qui ont fait l'objet des études ayant conduit à cette hypothèse, sont des lectines endogènes susceptibles d'avoir un rôle dans les phénomènes d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires et donc d'intervenir dans la génération de signaux au niveau de ces cellules. Elles appartiennent principalement à deux familles. The inventors have defined a group of specific lectins capable of interacting with glycan groups modified during the malignant transformation of cells and have been able to formulate a hypothesis on the process of this transformation. The lectins which have been the subject of studies which have led to this hypothesis are endogenous lectins capable of having a role in the phenomena of intercellular adhesion and / or recognition and therefore of intervening in the generation of signals at the level of these cells. They mainly belong to two families.

Les lectines endogènes intérressantes dans le cadre de l'invention sont capables de se lier avec une affinité spécifique et forte avec la partie glycannique de ligands glycoprotéiques riches en mannose, cette liaison générant des contacts intercellulaires, par l'intermédiaire des pontages réalisés entre les glycannes portés par des glycoprotéines membranaires et de telles lectines. The endogenous lectins of interest in the context of the invention are capable of binding with a specific and strong affinity with the glycan part of glycoproteic ligands rich in mannose, this bond generating intercellular contacts, by means of the bridges made between the glycans. carried by membrane glycoproteins and such lectins.

Les inventeurs ont remarqué que les modifications de glycoconjugués membranaires, lors de la transformation maligne de cellules, comprennent une augmentation notable du nombre des ligands affines de lectines endogènes définies dans le cadre de l'invention et le cas échéant une diversification (augmentation de la quantité de ligands) de ces ligands. Ils ont émis l'hypothèse selon laquelle cette augmentation du taux de ligands de certaines lectines endogènes favoriserait la multiplication des contacts intercellulaires et par conséquent la génération de signaux en surnombre non traités par la cellule, constatée dans les processus malins. The inventors have noticed that the modifications of membrane glycoconjugates, during the malignant transformation of cells, include a notable increase in the number of endogenous lectin affine ligands defined in the context of the invention and, where appropriate, diversification (increase in the quantity of ligands) of these ligands. They hypothesized that this increase in the level of ligands of certain endogenous lectins would favor the multiplication of intercellular contacts and therefore the generation of excess signals not processed by the cell, observed in malignant processes.

L'invention met à profit cette hypothèse pour proposer un test permettant la détection in vivo de cellules tumorales, à partir d'échantillons biologiques par exemple constitués par des tissus, des lignées cellulaires, des cellules isolées ou encore des coupes histologiques. Le test défini dans le cadre de l'invention consiste à mettre en évidence l'augmentation du nombre et de la quantité de ligands glycanniques de lectines endogènes affines pour ces ligands et le cas échéant à doser leur taux. The invention takes advantage of this hypothesis to propose a test allowing the in vivo detection of tumor cells, from biological samples for example constituted by tissues, cell lines, isolated cells or histological sections. The test defined in the context of the invention consists in demonstrating the increase in the number and in the quantity of glycan ligands of endogenous affine lectins for these ligands and, if necessary, in determining their level.

L'augmentation du nombre des ligands est définie par rapport à un ligand donné présent sur des cellules normales mais en nombre inférieur. On peut en outre constater une augmentation de la quantité de ligands au sens d'une plus grande variété de ces ligands en comparaison avec le profil de cellules normales. The increase in the number of ligands is defined relative to a given ligand present on normal cells but in lower number. We can also observe an increase in the quantity of ligands in the sense of a greater variety of these ligands in comparison with the profile of normal cells.

Les lectines endogènes utilisées dans le cadre de la réalisation de ce test, sont des lectines particulières capables d'intervenir dans les phénomènes d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires, et susceptibles de se lier de façon spécifique et indépendante du calcium avec un site impliquant des résidus mannose, présent au niveau de la partie glycannique de glycoconjugués, en particulier de glycoprotéines membranaires ou solubles, habituellement présents en nombre réduit au niveau de cellules normales. The endogenous lectins used in the context of carrying out this test are particular lectins capable of intervening in the phenomena of intercellular adhesion and / or recognition, and capable of binding specifically and independently of calcium with a site. involving mannose residues, present in the glycan part of glycoconjugates, in particular membrane or soluble glycoproteins, usually present in reduced number in normal cells.

Ce groupe de lectines comporte principalement des lectines des deux familles suivantes. This group of lectins mainly comprises lectins from the following two families.

La spécificité glycannique de ces deux familles de lectines et leurs différences par rapport à d'autres lectines endogènes décrites dans la littérature ont été cernées dans l'article de Marschall et coll., Biochimie 71 (1989) 645-653. Les résultats décrits dans cet article montrent également que les deux familles de lectines possèdent des spectres de spécificité glycannique partiellement superposables. The glycan specificity of these two families of lectins and their differences compared to other endogenous lectins described in the literature were identified in the article by Marschall et al., Biochemistry 71 (1989) 645-653. The results described in this article also show that the two families of lectins have partially superimposable glycan specificity spectra.

Une première famille de lectines propres à la réalisation du test de détection précédemment décrit, est celle qui comprend la lectine endogène à mannose désignée par l'abréviation CSL (Cerebellar Soluble
Lectine). La CSL a été isolée jusqu'à présent à partir de cellules de cervelet de rat et décrite dans l'article de Zanetta et al, 1987, J. Neurochem. 51: 1250-1257). On connaissait cette lectine endogène, pour ses propriétés au niveau de la myélinisation d'une part, et au niveau du guidage de contact de la migration des neurones immatures, d'autre part cette molécule a d'ailleurs été isolée à partir du cervelet de rat. On avait également mis en évidence le rôle de la lectine endogène CSL dans le domaine de la pathologie comme cible immunologique dans la sclérose en plaques.On avait également constaté que la CSL, bien qu'initialement isolée du cervelet, est largement répandue dans les tissus de mammifères. La CSL décrite dans la publication précitée comporte au moins trois formes de sous-unités de masses moléculaires relatives (Mr) voisines de 31 500, 33 000 et 45 000 kd. Cette molécule est soluble et polyvalente, et possède une spécificité glycannique très fine pour des glycannes riches en mannose. Sa constante de dissociation pour certains glycannes endogènes peut être estimée à au moins 10-8 M (Marschall et al, 1989, Biochimie 5: 10-20).A first family of lectins specific to carrying out the detection test described above is that which includes the endogenous mannose lectin designated by the abbreviation CSL (Cerebellar Soluble
Lectin). CSL has so far been isolated from rat cerebellum cells and described in the article by Zanetta et al, 1987, J. Neurochem. 51: 1250-1257). This endogenous lectin was known, for its properties at the level of myelination on the one hand, and at the level of the contact guidance of the migration of immature neurons, on the other hand this molecule was moreover isolated from the cerebellum of rat. The role of the endogenous lectin CSL in pathology as an immunological target in multiple sclerosis was also highlighted. It was also noted that CSL, although initially isolated from the cerebellum, is widely distributed in the tissues of mammals. The CSL described in the abovementioned publication comprises at least three forms of subunits of relative molecular masses (Mr) close to 31,500, 33,000 and 45,000 kd. This molecule is soluble and versatile, and has a very fine glycan specificity for glycans rich in mannose. Its dissociation constant for certain endogenous glycans can be estimated at least 10-8 M (Marschall et al, 1989, Biochemistry 5: 10-20).

Les inventeurs se sont également intéressés à une autre famille de lectines endogènes comprenant en particulier la lectine désignée par R1 (Receptor 1) cette lectine a été décrite en 1985 (Dontenwill et al
Dave Brain Res. 17: 245-252). Cette lectine R1 avait selon la description donnée, une localisation spécifiquement neuronale dans le cervelet et était exprimée transitoirement à la surface de certaines cellules du système nerveux.Cette lectine était connue en outre pour ses propriétés de reconnaissance intercellulaire par le biais du contact entre R1, externalisé de façon transitoire, et de glycoprotéines présentes à la surface des axones. I1 a été montré que la lectine membranaire R1 n'était pas spécifique des neurones cérébelleux mais pouvait être présente dans d'autres zones du système nerveux central ou périphérique, ou encore dans d'autres cellules et notamment à la surface de cellules endothéliales, les macrophages et les muscles.The inventors are also interested in another family of endogenous lectins including in particular the lectin designated by R1 (Receptor 1) this lectin was described in 1985 (Dontenwill et al
Dave Brain Res. 17: 245-252). This lectin R1 had, according to the description given, a specifically neuronal localization in the cerebellum and was expressed transiently on the surface of certain cells of the nervous system. This lectin was also known for its intercellular recognition properties through contact between R1, transiently outsourced, and glycoproteins present on the surface of axons. I1 has been shown that the membrane lectin R1 is not specific to cerebellar neurons but may be present in other areas of the central or peripheral nervous system, or in other cells and in particular on the surface of endothelial cells, macrophages and muscles.

Les structures des lectines endogènes CSL et R1 sont donc différentes mais les inventeurs ont constaté qu'elles possèdent en commun leur spécificité vis à vis de groupements glycanniques de glycoconjugués membranaires. The structures of endogenous CSL and R1 lectins are therefore different, but the inventors have found that they have their specificity in common with respect to glycan groups of membrane glycoconjugates.

A partir des études menées sur ces deux lectines particulières, les inventeurs ont défini une famille ou groupe de lectines utilisables pour la détection de cellules malignes, caractérisées en ce qu'il s'agit de lectines endogènes intervenant dans les phénomènes d'adhésion et/ou reconnaissance cellulaire ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose et présent au niveau de ligands glycanniques et présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou en ce qu'il s'agit de fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques. From the studies carried out on these two particular lectins, the inventors have defined a family or group of lectins which can be used for the detection of malignant cells, characterized in that they are endogenous lectins involved in the phenomena of adhesion and / or cell recognition having an affinity independent of calcium for a site involving mannose residues and present at the level of glycan ligands and having an immunological and / or structural relationship with CSL, or in that they are fragments of these lectins , since these fragments retain the affinity of the original lectin with respect to glycan ligands.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention une parenté immunologique et/ou structurale d'une telle lectine existe également avec la lectine
R1.According to a particular embodiment of the invention an immunological and / or structural relationship of such a lectin also exists with the lectin
R1.

La lectine est ainsi utilisée pour détecter voire mesurer l'augmentation du nombre et le cas échéant de la quantité de liaands glycanniques membranaires de ces cellules. The lectin is thus used to detect or even measure the increase in the number and if necessary of the quantity of membrane glycan liaands of these cells.

Les inventeurs ont constaté que les ligands glycanniques augmentent à la surface de cellules tumorales dans une proportion de 1 à 100 voire plus, par rapport à la quantité de ces ligands sur des cellules normales. Cette augmentation du taux de ligands glycanniques des lectines endogènes selon l'invention, varie légèrement en fonction des tumeurs mais ne peut pas être reliée au grade du cancer. The inventors have found that the glycan ligands increase on the surface of tumor cells in a proportion of 1 to 100 or more, relative to the amount of these ligands on normal cells. This increase in the level of glycan ligands of endogenous lectins according to the invention varies slightly depending on the tumors but cannot be linked to the grade of the cancer.

Une lectine endogène répondant à cette définition présente une parenté immunologique avec la CSL, et le cas échéant avec R1, dès lors qu'elle est reconnue par des anticorps dirigés contre la CSL ou des anticorps dirigés contre R1. A cet égard des anticorps susceptibles d'être utilisés pour déterminer si une lectine endogène peut être mise en oeuvre dans le cadre de l'invention sont les anticorps suivants
- les anticorps polyclonaux obtenus chez le lapin
contre les diverses sous-unités séparées de la CSL
ou leur ensemble;
- les anticorps contenus dans le liquide céphalo
rachidien ou le sang de patients atteints de
maladie démyélinisante dont la sclérose en plaques
et donnant des résultats positifs par le test
d'immunoréplique mis au point pour le diagnostic
de la sclérose en plaques (Zanetta et coll. Lancet
335 (1990) 1282-1284, Zanetta et coll.C.R. Acad.An endogenous lectin corresponding to this definition has an immunological relationship with CSL, and where appropriate with R1, since it is recognized by antibodies directed against CSL or antibodies directed against R1. In this regard, antibodies capable of being used to determine whether an endogenous lectin can be used in the context of the invention are the following antibodies
- polyclonal antibodies obtained in rabbits
against the various separate CSL subunits
or their whole;
- the antibodies contained in the cephalo fluid
spinal cord or the blood of patients with
demyelinating disease including multiple sclerosis
and giving positive results by the test
immuno-replica developed for diagnosis
multiple sclerosis (Zanetta et al. Lancet
335 (1990) 1282-1284, Zanetta et al. CR Acad.

Sci Paris, Série III 311 (1990) 327-331);
- les anticorps monoclonaux produits chez la souris
permettant de révéler les sous-unités 31 500 et
33 000 de la CSL ou la sous-unité 45 000;
- un anticorps polyclonal produit chez le lapin
contre la lectine purifiée Rl;
- les anticorps monoclonaux anti-R1 produits chez la
souris.Sci Paris, Series III 311 (1990) 327-331);
- monoclonal antibodies produced in mice
revealing the 31,500 subunits and
33,000 from CSL or sub-unit 45,000;
- a polyclonal antibody produced in rabbits
against the purified lectin R1;
- the anti-R1 monoclonal antibodies produced in the
mouse.

Ces anticorps sont obtenus selon les techniques classiques de production d'anticorps. These antibodies are obtained according to conventional antibody production techniques.

La CSL peut être caractérisée, par les éléments décrits dans la publication de Zanetta et al 1987 cidessus référencée et en particulier par le fait qu'elle est inhibée par le mannose, l'inhibition étant obtenue pour 37,5 mM, les autres monosaccharides n'ayant aucun effet inhibiteur sur cette lectine. The CSL can be characterized, by the elements described in the publication by Zanetta et al 1987 above referenced and in particular by the fact that it is inhibited by mannose, the inhibition being obtained for 37.5 mM, the other monosaccharides n 'having no inhibitory effect on this lectin.

Parmi les ligands glycoprotéiques de la CSL, on citera les molécules suivantes
- la glycoprotéine 31 kDa (Kuchler et coll. Neuro
science 33 (1989) 111-124), la glycoprotéine
formée d'un doublet de Mr 31 et 28 000, exprimé
transitoirement à la surface des neurones;
- la glycoprotéine majeure du système nerveux
périphérique, la glycoprotéine PO (Kuchler et
coll., Cell. Molec. Biol. 35 (1989) 581-596);
- la "myelin-associated glycoprotein", MAG, glyco
protéine majeure de la myéline du système nerveux
(Kuchler et coll., Dev. Neurosci. 10 (1988) 199
212).Among the glycoprotein ligands of the CSL, the following molecules will be mentioned
- the 31 kDa glycoprotein (Kuchler et al. Neuro
science 33 (1989) 111-124), glycoprotein
formed of a doublet of Mr 31 and 28 000, expressed
transiently on the surface of neurons;
- the major glycoprotein of the nervous system
peripheral, the PO glycoprotein (Kuchler and
coll., Cell. Molec. Biol. 35 (1989) 581-596);
- the "myelin-associated glycoprotein", MAG, glyco
major myelin protein of the nervous system
(Kuchler et al., Dev. Neurosci. 10 (1988) 199
212).

Dans le cas de la lectine R1, le mannose est inhibiteur à une dose de 75 mM et les autres monosaccharides ne sont pas inhibiteurs. In the case of the lectin R1, mannose is an inhibitor at a dose of 75 mM and the other monosaccharides are not inhibitors.

Notons également que la CSL et Rl ne sont pas inhibées par de faibles concentrations de lactose (absence d'inhibition jusqu'à 75.10-3M) et de glycosaminoglycannes (concentration inférieure ou égale à 250 ,ug/ml correspondant environ à 2,5.10-4M d'unités disacchariques). Ces résultats sont obtenus en effectuant les tests d'agglutination d'érythrocytes de rats selon la technique décrite par Marschal et al (Biochimie 71 (1989) 645-653). Note also that CSL and Rl are not inhibited by low concentrations of lactose (absence of inhibition up to 75.10-3M) and glycosaminoglycans (concentration less than or equal to 250, ug / ml corresponding approximately to 2.5.10- 4M disaccharic units). These results are obtained by carrying out agglutination tests on rat erythrocytes according to the technique described by Marschal et al (Biochemistry 71 (1989) 645-653).

L'invention a donc pour objet, l'utilisation pour la détermination in vitro de la présence de cellules malignes dans un échantillon biologique donné, de lectines endogènes intervenant dans les phénomènes d'adhésion et/ou reconnaissance intercellulaires ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose au niveau de ligands glycanniques, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques. The subject of the invention is therefore, the use for the in vitro determination of the presence of malignant cells in a given biological sample, of endogenous lectins intervening in the phenomena of intercellular adhesion and / or recognition having an affinity independent of calcium for a site involving mannose residues at the level of glycan ligands, this lectin having an immunological and / or structural relationship with the CSL, or fragments of these lectins, since these fragments retain the affinity of the original lectin, vis against glycan ligands.

Les cas échéant les lectines utilisées présentent également une parenté immunologique et/ou structurale avec R1. Where appropriate, the lectins used also have an immunological and / or structural relationship with R1.

Les ligands pour lesquels les inventeurs ont constaté une affinité des lectines de l'invention peuvent être des ligands membranaires ou des ligands solubles. The ligands for which the inventors have found an affinity for the lectins of the invention may be membrane ligands or soluble ligands.

Une lectine endogène particulièrement avantageuse pour la réalisation de l'invention est la CSL sous forme purifiée et active ou encore des fragments de la
CSL ou la CSL modifiée dès lors que la parenté fonctionnelle avec la CSL s'agissant de l'affinité indépendante du calcium vis à vis des ligands glycanniques est conservée.An endogenous lectin which is particularly advantageous for carrying out the invention is CSL in purified and active form or else fragments of the
CSL or CSL modified as long as the functional relationship with CSL with regard to the independent affinity of calcium with respect to glycan ligands is preserved.

Une molécule de CSL peut être modifiée, notamment par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés de la molécule, la lectine résultant conservant toutefois sa capacité de se lier aux ligands glycanniques en particulier membranaires normalement reconnus par la CSL. A CSL molecule can be modified, in particular by addition, deletion or substitution of one or more amino acids of the molecule, the resulting lectin retaining, however, its capacity to bind to glycan ligands, in particular membrane ligands normally recognized by CSL.

Un procédé pour la purification de la CSL est décrit dans les exemples qui figurent dans les pages suivantes et l'activité de la molécule est vérifiée par un test d'agglutination des globules rouges de rat préalablement fixés par la glutaraldéhyde. Ce test est également décrit dans les pages qui suivent. A method for the purification of CSL is described in the examples which appear on the following pages and the activity of the molecule is verified by an agglutination test of the rat red blood cells previously fixed by glutaraldehyde. This test is also described in the following pages.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la CSL utilisée est obtenue par expression dans un hâte cellulaire procaryote ou eucaryote. La molécule recombinante est caractérisée comme CSL par une capacité de fixation des glycannes identique à celle de la CSL obtenue par extraction, une reconnaissance par les anticorps anti-CSL définis cidessus. Elle peut présenter une glycosylation différente ou une absence de glycosylation en particulier la présence de N-glycannes sensibles à la
N-glycanne ou endo-N-acétyl-glucosaminidase F.In an advantageous embodiment of the invention, the CSL used is obtained by expression in a prokaryotic or eukaryotic cellular haste. The recombinant molecule is characterized as CSL by a glycan binding capacity identical to that of the CSL obtained by extraction, recognition by the anti-CSL antibodies defined above. It may have a different glycosylation or an absence of glycosylation, in particular the presence of N-glycans sensitive to
N-glycan or endo-N-acetyl-glucosaminidase F.

Selon un autre aspect de la réalisation de l'invention, la lectine utilisée pour la détection in vitro de la malignité de cellules dans un échantillon biologique, est la lectine R1, ou un fragment de R1 ou R1 modifiée dès lors que la parenté fonctionnelle avec R1 s'agissant de l'affinité indépendante du calcium vis à vis des ligands glycanniques membranaires est conservée. According to another aspect of the implementation of the invention, the lectin used for the in vitro detection of cell malignancy in a biological sample, is the lectin R1, or a fragment of R1 or R1 modified as soon as the functional relationship with R1 as regards the independent affinity of calcium with respect to the membrane glycan ligands is conserved.

La détection de la présence de cellules malignes dans un échantillon biologique in vitro, par la détermination d'une augmentation du nombre des ligands glycanniques et le cas échéant le dosage de ces ligands, peut être réalisée par différentes techniques. The detection of the presence of malignant cells in a biological sample in vitro, by determining an increase in the number of glycan ligands and, where appropriate, the assay of these ligands, can be carried out by different techniques.

Un avantage de l'invention résulte de la rapidité avec laquelle le test peut être effectué et de la sensibilité des résultats obtenus.An advantage of the invention results from the speed with which the test can be carried out and from the sensitivity of the results obtained.

L'invention concerne donc l'utilisation d'une lectine ou d'un fragment de lectine répondant aux critères donnés ci-dessus, caractérisée en ce que cette lectine ou ce fragment de lectine est marqué, par exemple par un isotope radioactif (radioisotope), un marqueur fluorescent ou un marqueur d'amplification. The invention therefore relates to the use of a lectin or a fragment of lectin meeting the criteria given above, characterized in that this lectin or this fragment of lectin is labeled, for example by a radioactive isotope (radioisotope) , a fluorescent marker or an amplification marker.

A titre d'exemple de marqueur radioactif, on peut citer l'iode et comme exemple de marqueur fluorescent on peut citer le fluorophore FITC. As an example of a radioactive marker, mention may be made of iodine and, as an example of a fluorescent marker, mention may be made of the fluorophore FITC.

Un système d'amplification adapté pour la réalisation de l'invention est par exemple le système dans lequel la lectine mise en oeuvre est marquée avec de la biotine, la révélation de la liaison entre la lectine biotinylée et le gli-canne d'un glycoconjugué membranaire étant réalisée par exemple à l'aide d'avidine couplée par exemple à la phosphatasealcaline. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux dès lors que la CSL biotinylée peut être conservée pendant plusieurs années sous forme congelée, sans perdre son activité. An amplification system suitable for carrying out the invention is for example the system in which the lectin used is labeled with biotin, the revelation of the bond between the biotinylated lectin and the glycine of a glycoconjugate membrane being produced for example using avidin coupled for example with phosphatasealcaline. This embodiment is particularly advantageous since the biotinylated CSL can be stored for several years in frozen form, without losing its activity.

D'autres systèmes de marquage peuvent être également utilisés et on aura notamment recours aux marqueurs de type enzymatique tels que la peroxydase, la ss glactosidase ou des systèmes d'amplification à trois constituants faisant appel à trois anticorps (du type ABC). Other labeling systems can also be used and use will be made of markers of the enzymatic type such as peroxidase, ss glactosidase or three-component amplification systems using three antibodies (of the ABC type).

L'invention concerne également un kit pour la détermination in vitro dans un échantillon biologique donné, de la présence de cellules malignes, caractérisé en ce qu'il comprend une lectine endogène intervenant dans les réactions d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires ayant une affinité indépendante du calcium pour un site de ligands glycanniques impliquant des résidus mannose, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques, éventuellement marquée. The invention also relates to a kit for the in vitro determination in a given biological sample, of the presence of malignant cells, characterized in that it comprises an endogenous lectin involved in the adhesion and / or intercellular recognition reactions having a calcium-independent affinity for a glycan ligand site involving mannose residues, this lectin having an immunological and / or structural relationship with CSL, or fragments of these lectins, since these fragments retain the affinity of the lectin origin, with respect to glycan ligands, possibly marked.

Les lectines mises en oeuvre dans ce kit peuvent aussi présenter une parenté immunologique et/ou structurale avec R1, selon un mode particulier de réalisation l'invention. The lectins used in this kit can also have an immunological and / or structural relationship with R1, according to a particular embodiment of the invention.

Dans un mode de réalisation préféré de ce kit, la lectine utilisée est la CSL, sous forme purifiée et active. In a preferred embodiment of this kit, the lectin used is CSL, in purified and active form.

Dans un autre mode de réalisation de ce kit, la lectine mise en oeuvre est la lectine membranaire RI, sous forme purifiée et active. In another embodiment of this kit, the lectin used is the membrane lectin RI, in purified and active form.

Ce kit peut être utilisé sur différents types d'échantillons biologiques susceptibles de contenir des cellules tumorales : il peut être constitué par exemple par une biopsie, un extrait tissulaire, des cellules isolées, une coupe histologique ou encore une lignée cellulaire. This kit can be used on different types of biological samples likely to contain tumor cells: it can consist, for example, of a biopsy, a tissue extract, isolated cells, a histological section or even a cell line.

L'utilisation d'un extrait tissulaire pour rechercher la présence de cellules malignes, permet l'obtention d'un résultat quantitatif. L'utilisation de coupes histologiques permet d'effectuer une réaction immunocytochimique et conduit à l'obtention d'un résultat qualitatif qui peut être observé au microscope. The use of a tissue extract to search for the presence of malignant cells allows obtaining a quantitative result. The use of histological sections makes it possible to carry out an immunocytochemical reaction and leads to the obtaining of a qualitative result which can be observed under the microscope.

Le kit peut être appliqué dans tous les cas de tumeurs se produisant au niveau de tissus susceptibles de contenir de la CSL ou R1 et par exemple au niveau de tumeurs hépatiques (hépatomes), au niveau de neuroblastomes, de glioblastomes, de cancers du sein, de leucémies érythrocytaires, ou de cancers des ovaires. The kit can be applied in all cases of tumors occurring in tissues likely to contain CSL or R1 and for example in liver tumors (hepatomas), in neuroblastomas, glioblastomas, breast cancers, erythrocytic leukemia, or ovarian cancer.

Ces exemples ne sont toutefois pas limitatifs et le kit peut être mis en oeuvre pour la détection au niveau d'échantillons de tissus au niveau desquels on constate la présence de CSL ou d'une autre lectine répondant aux définitions données dans les pages précédentes.These examples are not, however, limiting and the kit can be used for detection at the level of tissue samples at the level of which the presence of CSL or of another lectin meeting the definitions given in the preceding pages is observed.

Le kit peut également être mis en oeuvre pour détecter la présence de cellules tumorales circulantes et ce notamment en utilisant la CSL biotinylée ou fluorescente sur des culots ou lames de cellules circulantes. The kit can also be used to detect the presence of circulating tumor cells, in particular by using biotinylated or fluorescent CSL on pellets or slides of circulating cells.

Un kit convenant à la réalisation de l'invention peut aussi contenir plusieurs types de lectines, par exemple la CSL et R1, notamment lorsqu'il s'agit de déterminer l'augmentation de ligands membranaires au niveau de cellules circulantes dont l'origine tissulaire n'est pas connue. A kit suitable for carrying out the invention may also contain several types of lectins, for example CSL and R1, in particular when it is a question of determining the increase in membrane ligands in circulating cells whose tissue origin. is not known.

Selon un mode de réalisation particulier du kit selon l'invention, la lectine utilisée peut également être marquée notamment par les marqueurs décrits plus haut de type radioactif, flurorescent ou amplificateur. According to a particular embodiment of the kit according to the invention, the lectin used can also be marked in particular by the markers described above of the radioactive, fluorescent or amplifier type.

Les lectines du kit se présentent notamment sous forme de solution ou sous forme lyophilisée ou encore sous toutes formes adaptées à la conservation des protéines. The lectins in the kit are presented in particular in the form of a solution or in lyophilized form or else in all forms suitable for the preservation of proteins.

Un kit particulier comprend en outre un témoin négatif constitué par un échantillon de cellules normales dont le taux de ligands membranaires affines pour les lectines du kit est connu. A particular kit also comprises a negative control consisting of a sample of normal cells whose level of affine membrane ligands for the lectins of the kit is known.

I1 peut contenir aussi des courbes étalons sous forme d'une gamme de concentration de matériel contenant une quantité connue de ligands caractérisés de la CSL, ces étalons doivent permettrent de définir un degré de malignité des cellules de l'échantillon. It can also contain standard curves in the form of a concentration range of material containing a known quantity of ligands characterized by CSL, these standards must allow a degree of malignancy of the cells of the sample to be defined.

Ces gammes permettent de préciser qu'un taux déterminé de ligands définis ci-dessus est corrélé avec un signal donné obtenu avec des lectines du kit après mise en contact avec cet échantillon.These ranges make it possible to specify that a determined level of ligands defined above is correlated with a given signal obtained with lectins from the kit after being brought into contact with this sample.

L'invention vise aussi un procédé pour la détermination in vitro dans un échantillon biologique donné, de la présence de cellules malignes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
- mise en contact de l'échantillon biologique testé, avec une quantité déterminée de lectines endogènes, intervenant dans les réactions d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires, ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose et présent au niveau de ligands glycanniques contenant des résidus mannose, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques, cette lectine étant en outre marquée, dans des conditions permettant la réaction de ladite lectine marquée avec des ligands glycanniques;
- élimination de la lectine n'ayant pas réagi avec les ligands;
- révélation de la presence de complexes du type lectine-ligand, caractéristiques de la malignité cellulaire;
- détermination de la quantité de ligands glycanniques ayant réagi.The invention also relates to a method for the in vitro determination in a given biological sample, of the presence of malignant cells, characterized in that it comprises the following steps
- bringing the tested biological sample into contact with a determined quantity of endogenous lectins involved in adhesion and / or intercellular recognition reactions, having an affinity independent of calcium for a site involving mannose residues and present at the level glycan ligands containing mannose residues, this lectin having an immunological and / or structural relationship with CSL, or fragments of these lectins, since these fragments retain the affinity of the original lectin, with respect to the ligands glycans, this lectin being further labeled, under conditions allowing the reaction of said labeled lectin with glycan ligands;
- elimination of the lectin which has not reacted with the ligands;
- revelation of the presence of lectin-ligand complexes, characteristic of cell malignancy;
- determination of the quantity of glycan ligands which have reacted.

La lectine mise en oeuvre dans le procédé peut en outre avoir une parenté immunologique et/ou structurale avec R1. The lectin used in the process can also have an immunological and / or structural relationship with R1.

La détermination de la quantité de ligands ayant réagi avec les lectines peut être remplacée par la détermination de l'augmentation du nombre des ligands recherchés. I1 peut aussi s'agir d'une détermination qualitative. The determination of the quantity of ligands which have reacted with the lectins can be replaced by the determination of the increase in the number of ligands sought. It can also be a qualitative determination.

Comme on l'a dit plus haut, ces ligands peuvent être membranaires ou solubles. As mentioned above, these ligands can be membrane or soluble.

Selon un mode de réalisation avantageux, la lectine utilisée pour la réalisation du procédé est la
CSL purifiée, active.According to an advantageous embodiment, the lectin used for carrying out the process is the
Purified, active CSL.

Selon un autre mode de réalisation de ce procédé, la lectine endogène utilisée est la lectine Rl. According to another embodiment of this method, the endogenous lectin used is the lectin R1.

Le procédé peut être réalisé sur les diverses formes d'échantillons dont il est question dans les sages pr- e entes et en particulier à partir 'échantil;ons dont on a préalablement extrait les protéines. Cette technique est notamment utilisée lorsque l'échantillon est constitué par une tumeur ou par des cellules en culture. The process can be carried out on the various forms of samples which are discussed in the present sages and in particular from samples from which the proteins have previously been extracted. This technique is used in particular when the sample consists of a tumor or of cells in culture.

La détermination de la présence d'une quantité de ligands d'une lectine endogène affine pour des glycannes tels que décrits ci-dessus, peut être réalisée à partir des protéines des échantillons déposés soit directement sur un support, par exemple selon une méthode analogue à l'immuno-dotting ou à la technique ELISA, soit après électrophorèse et électrotransfert (technique analogue à l'immunoblotting) sur les protéines de la tumeur préalablement séparées. The determination of the presence of a quantity of ligands of an endogenous affine lectin for glycans as described above can be carried out from the proteins of the samples deposited either directly on a support, for example according to a method analogous to immunodotting or the ELISA technique, either after electrophoresis and electrotransfer (technique analogous to immunoblotting) on the proteins of the tumor previously separated.

Une description détaillée de ces modes de réalisation est donnée dans les exemples. A detailed description of these embodiments is given in the examples.

Des supports utilisables pour déposer les protéines sont des filtres tels que les filtres de nitrocellulose, ou encore des plaques de type ELISA. Supports that can be used to deposit proteins are filters such as nitrocellulose filters, or ELISA plates.

Pour la réalisation du procédé, les lectines utilisées sont marquées selon les techniques qui ont été décrites précédemment. For carrying out the process, the lectins used are marked according to the techniques which have been described previously.

La mise en oeuvre du procédé de détection de l'invention au moyen d'une technique de dépôt des protéines de l'échantillon sur un support, permet la différenciation des tumeurs non homogènes, et en conséquence permet de déterminer dans quelle mesure une tumeur contient une partie de tissu sain, et donc le taux de malignité de la tumeur. The implementation of the detection method of the invention by means of a technique of depositing the proteins of the sample on a support allows the differentiation of non-homogeneous tumors, and consequently makes it possible to determine to what extent a tumor contains part of healthy tissue, and therefore the malignancy rate of the tumor.

Le procédé de l'invention peut également faire appel à une étape de comparaison du résultat obtenu lors de l'étape de révélation de la présence de complexes de type lectine-ligand, caractéristiques de la malignité cellulaire, avec des étalons ou des gammes de standard, éventuellement pré-établies, et qui permettent de corréler le degré de malignité d'une cellule avec le taux de ligands glycanniques. The method of the invention can also use a step of comparing the result obtained during the step of revealing the presence of lectin-ligand type complexes, characteristic of cellular malignancy, with standards or ranges of standard. , possibly pre-established, and which make it possible to correlate the degree of malignancy of a cell with the level of glycan ligands.

Ces gammes de standard ou témoin peuvent être obtenues à partir d'échantillons et notamment de cultures cellulaires dont on connait exactement la quantité de ligands glycanniques et par dilution progressive de ces échantillons. En conséquence les observations effectuées par mise en contact des lectines avec un échantillon dont on cherche à déterminer s'il contient des cellules malignes, peuvent être rapportées à un signal connu, obtenu pour un nombre de ligands glycanniques déterminé, mis en présence de lectines déterminées. These ranges of standard or control can be obtained from samples and in particular from cell cultures of which the quantity of glycan ligands is known exactly and by progressive dilution of these samples. Consequently, the observations carried out by bringing the lectins into contact with a sample for which it is sought to determine whether it contains malignant cells, can be related to a known signal, obtained for a determined number of glycan ligands, placed in the presence of determined lectins. .

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples et les figures qui suivent. Other characteristics and advantages of the invention are given in the examples and the figures which follow.

Figure 1 : contrôle électrophorétique (révélation argentique) des préparations de CSL biotinylée. Une partie aliquote des fractions obtenues après séparation sur une colonne d'Ultrogel AcA 202 des produits de biotinylation de la CSL a été déposée sur le gel. Le profil de la CSL trouvée dans des fractions du volume mort de la colonne est identique à celui de la préparation d'origine : il contient la même proportion des sous-unités 33 000 et 31 500 de la CSL et de ses produits de dégradation (bas poids moléculaire). Un profil identique est obtenu après révélation par l'avidine-phosphatase alcaline. Les nombres sur la droite indiquent la position des marqueurs de Mr.Figure 1: electrophoretic control (silver revelation) of biotinylated CSL preparations. An aliquot of the fractions obtained after separation on a column of Ultrogel AcA 202 of the biotinylation products of the CSL was deposited on the gel. The profile of the CSL found in fractions of the dead volume of the column is identical to that of the original preparation: it contains the same proportion of the 33,000 and 31,500 subunits of the CSL and of its degradation products ( low molecular weight). An identical profile is obtained after revelation by avidin-alkaline phosphatase. The numbers on the right indicate the position of the markers of Mr.

Figure 2 profils électrophorétiques des protéines révélées par le CBB (A) et des ligands de la CSL révélés par la méthode CSL-biotinylée-Avidine-AKP (B) présents dans des cellules normales ou transformées d'origine hépatique. La quantité de protéines déposées est la même (15 ,ug) pour chacun des puits. Les échantillons sont les suivants 1) hépatocytes de souris 2) hépatome Al de souris 3) hépatocytes de rat 4) hépatome H56 de rat 5) hépatome HTC de rat
On notera la quantité importante de ligands de la CSL d s les lignées tumorales.Figure 2 electrophoretic profiles of proteins revealed by CBB (A) and CSL ligands revealed by the CSL-biotinylated-Avidin-AKP (B) method present in normal or transformed cells of hepatic origin. The amount of protein deposited is the same (15 μg) for each of the wells. The samples are as follows 1) mouse hepatocytes 2) mouse A1 hepatoma 3) rat hepatocytes 4) rat H56 hepatoma 5) rat HTC hepatoma
Note the large amount of CSL ligands in the tumor lines.

Figure 3 : analyse électrophorétique des ligands de la
CSL dans des cellules et tissus d'origine nerveuse normaux ou transformés.Figure 3: electrophoretic analysis of ligands of the
CSL in normal or transformed nerve cells and tissues.

A) coloration des protéines par le CBB
B) révélation par la CSL-biotinylée.A) protein staining by CBB
B) revelation by CSL-biotinylated.

15 g de protéines ont été déposés dans chacun des puits. Le matériel déposé provient des tissus ou cellules suivants 1) cervelet de rat âgé de 14 jours 2) cervelet de rat adulte 3) neuroblastome NIE11S non différencié 4) neuroblastome NIE11S différencié par le dibutyryl
c-AMP 5) glioblastome C6 6) astrocytes 7) oligodendrocytes 8) cellules de Schwann de rat nouveau-né
On notera la quantité importante de ligands de la CSL dans les trois types de cellules tumorales
Figure 4 : analyse électrophorétique du profil des ligands de la CSL dans des cellules transformées d'origines diverses.15 g of protein were placed in each of the wells. The material deposited comes from the following tissues or cells 1) 14-day-old rat cerebellum 2) adult rat cerebellum 3) undifferentiated NIE11S neuroblastoma 4) NIE11S neuroblastoma differentiated by dibutyryl
c-AMP 5) C6 glioblastoma 6) astrocytes 7) oligodendrocytes 8) newborn rat Schwann cells
Note the large amount of CSL ligands in the three types of tumor cells
Figure 4: electrophoretic analysis of the profile of CSL ligands in transformed cells of various origins.

A) coloration des protéines par le CBB
B) révélation par la CSL biotinylée.A) protein staining by CBB
B) revelation by biotinylated CSL.

15 ,ug de protéines ont été déposés dans chacun des puits.15 µg of protein was placed in each of the wells.

1) IGROV1 2) MCF7 3) K562
On notera la quantité importante de ligands de la CSL et la similitude de leur profil.1) IGROV1 2) MCF7 3) K562
Note the large quantity of CSL ligands and the similarity of their profile.

Figure 5 : aspect en microscopie à contraste de phase des cultures de neuroblastome NIE11S non différencié
A) ou différencié par le dibutyryl-cAMP : B).Figure 5: appearance in phase contrast microscopy of cultures of undifferentiated NIE11S neuroblastoma
A) or differentiated by dibutyryl-cAMP: B).

Les barres représentent 100 Sm. On notera la présence de prolongements en B).The bars represent 100 Sm. Note the presence of extensions in B).

Figure 6 : localisation de la CSL (A) et de ses ligands (B-D) dans les cultures du neuroblastome NIE11S non différencié (A-C) ou différencié par le dibutyryl c-AMP (D). Les barres représentent 10 ,um. Figure 6: localization of CSL (A) and its ligands (B-D) in the cultures of neuroblastoma NIE11S not differentiated (A-C) or differentiated by dibutyryl c-AMP (D). The bars represent 10, um.

A) La CSL présente une localisation manifestement
intracellulaire (grosses flèches) mais se situe
également à la surface des cellules (petites
flèches). A) The CSL clearly has a location
intracellular (large arrows) but is located
also on the surface of cells (small
arrows).

B-D) Les ligands de la CSL révélés par la CSL
biotinylée, elle même révélée par l'avidine-HRP
sont localisés exclusivement à la surface des
corps cellulaires (B et C) et des prolongements
(D).BD) The CSL ligands revealed by the CSL
biotinylated, itself revealed by avidin-HRP
are located exclusively on the surface of
cell bodies (B and C) and extensions
(D).

Figure 7 : analyse électrophorétique des ligands de la
CSL dans huit (1-8) tumeurs malignes des glandes mammaires humaines.Figure 7: electrophoretic analysis of ligands of the
CSL in eight (1-8) malignant tumors of the human mammary glands.

A) coloration des protéines par le CBB
B) révélation par la CSL biotinylée 15 ,ug de protéines ont été déposés dans chacun des puits. On notera, pour la plupart des tumeurs, la présence d'une quantité importante de ligands de la
CSL. I1 existe toutefois des variations entre elles.A) protein staining by CBB
B) revelation by biotinylated CSL 15, ug of proteins were deposited in each of the wells. It will be noted, for most tumors, the presence of a significant amount of ligands of the
CSL. There are, however, variations between them.

C) témoin correpondant à la piste 7, incubé avec
1'avidine-phosphatase alcaline mais sans CSL
biotinylée.C) control corresponding to runway 7, incubated with
Alkaline avidin phosphatase but without CSL
biotinylated.

Figure 8 : représentation schématique de l'hypothèse du signal non sens de la transformation maligne.Figure 8: schematic representation of the hypothesis of the nonsense signal of the malignant transformation.

A) dans des cellules normales, le contact entre
cellules est assuré par la lectine CSL entre les
glycannes portés par un nombre limité de glycopro
téines (ici une seule). Ce contact génère un signal
intracellulaire (a) parfaitement interprété par la
cellule.A) in normal cells, the contact between
cells is ensured by the CSL lectin between the
glycans carried by a limited number of glycopro
teats (here only one). This contact generates a signal
intracellular (a) perfectly interpreted by the
cell.

B) dans la cellule transformée, le même contact assure
par la CSL se réalise à travers de nombreuses
glycoprotéines différentes générant chacune un
signal intracellulaire différent (a) (b) (c) (d)
(e). La résultante de ces signaux équivaut à un
signal polysémique non interprété par la cellule
il équivaut à un signal "non-sens". B) in the transformed cell, the same contact ensures
through CSL is achieved through numerous
different glycoproteins each generating a
different intracellular signal (a) (b) (c) (d)
(e). The result of these signals is equivalent to a
polysemic signal not interpreted by the cell
it is equivalent to a "nonsense" signal.

EXEMPLES
A) PURIFICATION DE LA CSL
Protocole d'extractions séquentielles : 20 ratons (entre 12 et 22 jours après la naissance) sont tués par décapitation et le cervelet est prélevé sur glace. Toutes les opérations sont réalisées alors à 4"C. Tous les tampons contiennent des inhibiteurs de protéases : 0,01% de l'ester méthylique de la p-tosylarginine et 0,1 mM de fluorure de phényl méthyl sulfonyle.EXAMPLES
A) PURIFICATION OF THE CSL
Sequential extraction protocol: 20 pups (between 12 and 22 days after birth) are killed by decapitation and the cerebellum is removed on ice. All operations are then carried out at 4 "C. All of the buffers contain protease inhibitors: 0.01% of the methyl ester of p-tosylarginine and 0.1 mM of phenyl methyl sulfonyl fluoride.

1) Les cervelets sont homogénéisés dans 300 ml de
tampon 10 mM Tris-HCl à pH 7,2, puis centrifugés (lh
X 200 000g). 1) The cerebellum is homogenized in 300 ml of
10 mM Tris-HCl buffer at pH 7.2, then centrifuged (lh
X 200,000g).

2) Le culot est homogénéisé dans 10 ml d'eau et l'on
ajoute 90 ml d'un tampon 11 mM Tris-HCl à pH 7,2
contenant 0,44 M de NaCl. Après homogénéisation, la
suspension est centrifugée (lh X 200 000g).2) The pellet is homogenized in 10 ml of water and
add 90 ml of an 11 mM Tris-HCl buffer at pH 7.2
containing 0.44 M NaCl. After homogenization, the
suspension is centrifuged (lh X 200,000g).

3) Le culot est homogénéisé dans 10 ml d'eau et l'on
ajoute 90 ml d'un tampon 11 mM Tris-HCl à pH 7,2,
contenant 0,44 M de NaCl. Après homogénéisation, la
suspension est centrifugée (lh X 200 000g) (idem 2).3) The pellet is homogenized in 10 ml of water and
add 90 ml of an 11 mM Tris-HCl buffer at pH 7.2,
containing 0.44 M NaCl. After homogenization, the
suspension is centrifuged (lh X 200,000g) (idem 2).

4) Le culot est homogénéisé dans 10 ml d'eau et l'on
ajoute 90 ml d'un tampon 11 mM tris-HCl à pH 7,2
contenant 0,44 M et 0,55 M de mannose. Après
homogénéisation, la suspension est centrifugée (2h X
200 000g). Cette fraction est appelée TNM1.4) The pellet is homogenized in 10 ml of water and
add 90 ml of an 11 mM tris-HCl buffer at pH 7.2
containing 0.44 M and 0.55 M mannose. After
homogenization, the suspension is centrifuged (2h X
200,000g). This fraction is called TNM1.

5) Le culot est homogénéisé dans 10 ml d'eau et l'on
ajoute 90 ml d'un tampon 11 mM Tris-HCl à pH 7,2
contenant 0,44 M de NaCl et 0,55 M de mannose. Après
homogénéisation, la suspension est centrifugée (2h X
200 000g). Cette fraction est appelée TNM2. 5) The pellet is homogenized in 10 ml of water and
add 90 ml of an 11 mM Tris-HCl buffer at pH 7.2
containing 0.44 M NaCl and 0.55 M mannose. After
homogenization, the suspension is centrifuged (2h X
200,000g). This fraction is called TNM2.

6) La fraction TNM obtenue en réunissant les fractions
TNM1 et TNM2 sert de départ pour la purification de
la CSL par immunoaffinité.6) The TNM fraction obtained by combining the fractions
TNM1 and TNM2 serve as a starting point for the purification of
CSL by immunoaffinity.

Protocole pour la purification de la CSL par immunoaffinité 1) - les anticorps polyclonaux obtenus chez le lapin
contre les diverses sous-unités séparées de la CSL
ou leur ensemble;
- les anticorps contenus dans le liquide céphalo
rachidien ou le sang de patients atteints de
maladie démyélinisante dont la sclérose en plaques
et donnant des résultats positifs par le test
d'immunoréplique mis au point pour le diagnostic
de la sclérose en plaques (Zanetta et coll. Lancet
335 (1990) 1282-1284, Zanetta et coll. C.R. Acad.Protocol for the purification of CSL by immunoaffinity 1) - the polyclonal antibodies obtained in rabbits
against the various separate CSL subunits
or their whole;
- the antibodies contained in the cephalo fluid
spinal cord or the blood of patients with
demyelinating disease including multiple sclerosis
and giving positive results by the test
immuno-replica developed for diagnosis
multiple sclerosis (Zanetta et al. Lancet
335 (1990) 1282-1284, Zanetta et al. CR Acad.

Sci Paris, Série III 311 (19g0) 327-331);
- les anticorps monoclonaux produits chez la souris
permettant de révéler les sous-unités 31 500 et
33 000 de la CSL ou la sous-unité 45 000 ayant
pour noms D36A, D36B, D36C, D36D;
Préparation des immunoglobulines : les fractions
d'immunoglobulines sont obtenues par précipitation
par le sulfate d'ammonium (250 mg/ml) à 4oC des
sérums ou plasmas contenant des anticorps anti-CSL,
suivie d'une centrifugation (lh X 100 000g). Les
culots d'immunoglobulines sont repris dans un volume
initial de tampon PBS (25 mM Phosphate de Na à pH
7,2 contenant 150 mM NaCl) puis dialysées plusieurs
fois sur une durée de 48 h contre de grands volumes
de PBS à 4"C et sous agitation.La source des immu
noglobulines peut être du sérum de lapin produisant
des anticorps anti-CSL ou des sérums ou plasmas de
patients atteints de sclérose en plaques ou d'autres
maladies dans lesquelles il existe des anticorps
anti-CSL en quantité importante.Sci Paris, Series III 311 (19g0) 327-331);
- monoclonal antibodies produced in mice
revealing the 31,500 subunits and
33,000 of the CSL or the sub-unit 45,000 having
for names D36A, D36B, D36C, D36D;
Preparation of immunoglobulins: fractions
immunoglobulins are obtained by precipitation
with ammonium sulfate (250 mg / ml) at 4oC
sera or plasmas containing anti-CSL antibodies,
followed by centrifugation (lh X 100,000g). The
immunoglobulin pellets are included in a volume
initial PBS buffer (25 mM Na phosphate at pH
7.2 containing 150 mM NaCl) then dialyzed several times
times over a period of 48 h against large volumes
of PBS at 4 "C and with stirring. The source of the immu
noglobulins can be rabbit-producing serum
anti-CSL antibodies or sera or plasmas
patients with multiple sclerosis or others
diseases in which there are antibodies
anti-CSL in large quantities.

2) Immobilisation des immunoglobulines : les immunoglo
bulines ainsi isolées sont immobilisées sur un
support (généralement de la Sepharose 4B activée par
le bromure de cyanogène) selon les protocoles
suggérés par le fabricant. Après réaction pendant
une nuit à 4"C, les sites d'activation résiduels
sont bloqués par réaction pendant 1h à 4"C avec une
solution 1M d'éthanolamine portée à pH 9,0 par de
l'acide chlorhydrique concentré. Le gel est alors
largement lavé avec du PBS, puis soumis à un cycle
d'immunoaffinité "à blanc" (comme ci-dessous, mais
sans protéines dans la fraction TNM).2) Immobilization of immunoglobulins: immunoglobulins
thus isolated bulines are immobilized on a
support (usually Sepharose 4B activated by
cyanogen bromide) according to protocols
suggested by the manufacturer. After reaction during
overnight at 4 "C, residual activation sites
are blocked by reaction for 1 hour at 4 "C with a
1M solution of ethanolamine brought to pH 9.0 with
concentrated hydrochloric acid. The gel is then
extensively washed with PBS and then cycled
"blank" immunoaffinity (as below, but
without proteins in the TNM fraction).

3) Chromatographie d'immunoaffinité : la colonne (5 cm
de longueur et 1 cm de diamètre) est équilibrée dans
du tampon 2,5 mM Tris-HCl à pH 7,2 contenant 0,1 M
de NaCl. La fraction TNM est diluée 4 fois avec de
l'eau glacée et l'on ajoute les inhibiteurs de
protéase à la concentration habituelle. Cette
fraction est passée lentement sur la colonne (30 ml
par heure au maximum). Quand tout l'échantillon est
passé, la colonne est lavée avec le tampon
d'équilibration puis avec 25 ml de PBS trois fois
concentré. Pour cette élution, le matériel sortant
de la colonne est recueilli sur un collecteur de
fractions, en fractions d'environ 0,5 ml. La colonne
est alors lavée avec 25 ml de tampon Glycine-HCl 0,2
M à pH 7,2, puis neutralisée à l'aide d'un tampon
PBS 8 fois concentré.Après un dernier lavage avec
du PBS, le gel est récupéré et stocké à 4"C dans ce
tampon auquel on ajoute de l'azide de sodium
(concentration finale 1/1000). Selon l'affinité des
anticorps, la CSL peut se trouver soit dans l'éluat
3 X PBS, soit dans l'éluat pH 2,0.3) Immunoaffinity chromatography: the column (5 cm
in length and 1 cm in diameter) is balanced in
2.5 mM Tris-HCl buffer at pH 7.2 containing 0.1 M
NaCl. The TNM fraction is diluted 4 times with
ice water and add the inhibitors
protease at the usual concentration. This
fraction is passed slowly over the column (30 ml
per hour maximum). When all the sample is
passed, the column is washed with the buffer
equilibration then with 25 ml of PBS three times
concentrated. For this elution, the outgoing material
of the column is collected on a collector of
fractions, in fractions of about 0.5 ml. The column
is then washed with 25 ml of 0.2 Glycine-HCl buffer
M at pH 7.2, then neutralized using a buffer
PBS 8 times concentrated. After a final wash with
PBS, the gel is collected and stored at 4 "C in this
buffer to which sodium azide is added
(final concentration 1/1000). According to the affinity of
antibody, CSL can be either in the eluate
3 X PBS, ie in the eluate pH 2.0.

4) Les fractions éluées par le PBS 3 fois concentré
sont gardées congélées à 80"C. Les fractions
contenant les protéines éluées par le tampon à pH
2,0 sont dyalisées plusieurs fois contre de grands
volumes de PBS à 4"C et sous agitation pendant une
période de 24h.4) The fractions eluted by PBS 3 times concentrated
are kept frozen at 80 "C. The fractions
containing the proteins eluted by the pH buffer
2.0 are dyalized several times against large
volumes of PBS at 4 "C and shaking for one
24h period.

5) Test de préparation de CSL purifiée : une partie
aliquote des fractions obtenues est mélangée avec un
volume de mélange de solubilisation de Laemmli et
soumis à une électrophorèse en gel de polyacrylamide
à 13% d'acrylamide en présence de SDS. Le gel est
ensuite coloré par le bleu de Coomassie, puis par
une coloration argentique. La qualité des
préparations se juge par l'absence de bandes autres
que celles de PM 31 500, 33 000 et 45 000
caractéristiques de la CSL.5) Purified CSL preparation test: part
aliquot of the fractions obtained is mixed with a
volume of Laemmli's solubilization mixture and
polyacrylamide gel electrophoresis
13% acrylamide in the presence of SDS. The gel is
then colored by Coomassie blue, then by
a silver color. The quality of
preparations is judged by the absence of other tapes
than those of PM 31 500, 33 000 and 45 000
characteristics of CSL.

L'activité des préparations est testée par agglutination des globules rouges de rat préalablement fixés par la glutaraldéhyde. Ces globules sont préparés selon la méthode préconisée par SIMPSON et coll.The activity of the preparations is tested by agglutination of the red blood cells of rats previously fixed with glutaraldehyde. These globules are prepared according to the method recommended by SIMPSON et al.

(Nature (1977), 266: 367-369). Des dilutions de 2 en 2 de la lectine dans du PBS sont placées dans les puits à fond rond de plaques d'agglutination, dans un volume de 100 ,ul. On ajoute 100 111 de la suspension de globules rouges et on laisse reposer pendant environ lh. (Nature (1977), 266: 367-369). 2-in-2 dilutions of lectin in PBS are placed in the round bottom wells of agglutination plates, in a volume of 100 µl. 100 111 of the suspension of red blood cells are added and the mixture is left to stand for approximately 1 hour.

L'activité agglutinante maximale observée est de l'ordre de 01-0,2 ,ug/ml. The maximum agglutinative activity observed is of the order of 01-0.2, ug / ml.

B) MARQUAGE DE LA CSL
La protéine ainsi purifiée, dont l'activité est vérifiée par sa capacité d'agglutiner des globules rouges de rat préalablement fixés par la glutaraldéhyde (Marschal et coll., Biochimie (1989), 71: 645-653) est marquée soit par un isotope radioactif (iode), soit par un fluorophore (FITC) soit par un système d'amplification (biotine, qui permet d'utiliser une révélation par l'avidine couplée par exemple à la phosphatase alcaline). Ce dernier mode de marquage et de révélation est particulièrement avantageux, la CSL biotinylée pouvant conserver son activité durant plusieurs années de congélation.B) MARKING OF THE CSL
The protein thus purified, the activity of which is verified by its ability to agglutinate rat red blood cells previously fixed by glutaraldehyde (Marschal et al., Biochemistry (1989), 71: 645-653) is labeled with either an isotope radioactive (iodine), either by a fluorophore (FITC) or by an amplification system (biotin, which allows the use of revelation by avidin coupled for example with alkaline phosphatase). This latter method of labeling and revealing is particularly advantageous, the biotinylated CSL being able to retain its activity for several years of freezing.

Protocole de biotinylation de la CSL
Toutes les opérations sont réalisées à 4"C. A 500 il d'une solution de CSL (environ 500 ,ug de protéine / ml de PBS) placés dans un tube Eppendorf de 1,5 ml, on rajoute 30 ,ul de soude 0,1 N afin de porter le pH à 9,25. On rajoute, lentement sous agitation, 10,ut d'une solution de N-hydroxy-succinimide ester de biotine (75 mM dans du diméthylformamide). On laisse ainsi agir pendant 1h à 4"C en agitant régulièrement. On ajoute alors 100 ,ul d'une solution 0,2 M de glycine afin de bloquer l'excès de réactif.On ajoute ensuite du
Triton-X-100 (concentration finale 0,1%) afin d'éviter la précipitation ultérieure de la CSL biotinylée sur la colonne de gel filtration. Cette dernière, préparée avant le début de l'expérience, est constituée d'Ultrogel AcA 202 (IBF) équilibrée dans du tampon PBS contenant 0,1% de Triton-X-100 et 1 mg/ml de BSA traitée par l'acide périodique (BSA-HIO4; Glass et coll., 1981). L'emploi de BSA-HIO4 à ce stade a pour but de saturer les sites du gel qui pourraient, par la suite, adsorber la CSL biotinylée et ainsi diminuer le rendement de cette étape. La colonne est ensuite longuement lavée dans du PBS contenant 0,1% de Triton
X-100 sans BSA-HIO4. L'échantillon est déposé sur la colonne (7 cm de longueur et 1 cm de diamètre) et élué dans ce tampon. On recueille des fractions de 1 ml environ.CSL biotinylation protocol
All the operations are carried out at 4 "C. At 500 μl of a CSL solution (approximately 500 μg of protein / ml of PBS) placed in a 1.5 ml Eppendorf tube, 30 μl of sodium hydroxide 0 are added. , 1 N in order to bring the pH to 9.25, 10 μt of a solution of biotin N-hydroxy-succinimide ester (75 mM in dimethylformamide) is added slowly with stirring. at 4 "C with regular shaking. 100 μl of a 0.2 M glycine solution are then added in order to block the excess reagent.
Triton-X-100 (final concentration 0.1%) in order to avoid the subsequent precipitation of the biotinylated CSL on the gel filtration column. The latter, prepared before the start of the experiment, consists of Ultrogel AcA 202 (IBF) balanced in PBS buffer containing 0.1% Triton-X-100 and 1 mg / ml of acid-treated BSA periodic (BSA-HIO4; Glass et al., 1981). The purpose of using BSA-HIO4 at this stage is to saturate the gel sites which could, subsequently, adsorb the biotinylated CSL and thus reduce the yield of this step. The column is then washed for a long time in PBS containing 0.1% of Triton.
X-100 without BSA-HIO4. The sample is placed on the column (7 cm in length and 1 cm in diameter) and eluted in this buffer. Fractions of about 1 ml are collected.

Une partie aliquote de 20 ,ul de chacune des fractions recueillies est déposée dans les puits d'une plaque de microtitration ELISA et on le laisse sécher. On ajoute 100 ,ul de BSA-HI04 pendant 1h à température ordinaire.An aliquot of 20 μl of each of the fractions collected is placed in the wells of an ELISA microtiter plate and allowed to dry. 100 μl of BSA-HI04 are added for 1 hour at room temperature.

Après quelques lavages avec du PBS, on ajoute 100 111 d'une solution diluée 1000 fois d'avidine couplée à la phosphatase alcaline. Après incubation pendant 1h à température ambiante, les puits sont lavés une dizaine de fois avec du PBS. Après quelques lavages à l'eau, on révèle par le substrat p-nitrophényl-phosphate de la phosphatase alcaline à 37oC pendant environ 5 min.After a few washes with PBS, 100 μl of a 1000-fold dilute solution of avidin coupled to alkaline phosphatase is added. After incubation for 1 hour at room temperature, the wells are washed ten times with PBS. After a few washes with water, the p-nitrophenyl-phosphate substrate reveals alkaline phosphatase at 37 ° C. for approximately 5 min.

L'intensité de la coloration obtenue est mesurée dans un lecteur de plaques ELISA classique.The intensity of the coloration obtained is measured in a conventional ELISA plate reader.

Ces préparations sont testées également par électrophorèse en milieu dénaturant (SDS) avec une coloration argentique. Une vérification de la biotinylation de toutes les chaines est réalisée après transfert sur filtre de nitrocellulose par révélation avec l'avidine marquée à la phosphatase alcaline (voir ci-dessous).These preparations are also tested by electrophoresis in denaturing medium (SDS) with a silver coloration. A verification of the biotinylation of all the chains is carried out after transfer to a nitrocellulose filter by revelation with avidin labeled with alkaline phosphatase (see below).

Enfin il est conseillé de vérifier l'activité de la CSL biotinylée en utilisant la technique d'hémagglutination (voir ci-dessus).Finally it is advisable to check the activity of the biotinylated CSL using the hemagglutination technique (see above).

Afin de vérifier l'intégrité de la CSL biotinylée des parties aliquotes des préparations ont été soumises à des analyses électrophorétiques suivies de coloration par le CBB (Coomassie Brilliant Blue R) ou le nitrate d'argent ou, après transfert sur filtre de nitrocellulose, révélation par 1 'avidine-phosphatase alcaline. Dans tous les cas (CSL biotinylée active ou non), on a pu vérifier qu'il n'y avait pas de protéolyse de la CSL au cours du protocole de biotinylation, et que la biotinylation portait sur toutes les chaînes CSL.En effet, il n'y a pas de modifications substantielles du profil électrophorétique de la CSL avant et après biotinylation : on retrouve le même type de profil avec les mêmes bandes (deux majeures à 31 500 et 33 000 ainsi que des bandes mineures initialement présentes vers 15 000 et correspondant à une dégradation de la
CSL) dans les mêmes proportions, toutes étant biotinylées (figure 1).In order to verify the integrity of the biotinylated CSL, the aliquots of the preparations were subjected to electrophoretic analyzes followed by staining with CBB (Coomassie Brilliant Blue R) or silver nitrate or, after transfer to a nitrocellulose filter, revelation by avidin-alkaline phosphatase. In all cases (CSL biotinylated active or not), it was possible to verify that there was no proteolysis of CSL during the biotinylation protocol, and that the biotinylation involved all the CSL chains. there is no substantial modification of the electrophoretic profile of the CSL before and after biotinylation: we find the same type of profile with the same bands (two major bands at 31 500 and 33 000 as well as minor bands initially present around 15 000 and corresponding to a degradation of the
CSL) in the same proportions, all being biotinylated (Figure 1).

C) UTILISATION DE LA CSL POUR LE DOSAGE DES LIGANDS DE
LA CSL
La détermination de quantité des ligands de la CSL peut se faire à partir des protéines des cellules tumorales ou des tumeurs, déposées soit directement en un point d'un support (analogue à l'immuno-dotting ou à llELISA), soit, après électrophorèse et électrotransfert (analogue à l'immunoblotting), sur les protéines de la tumeur préalablement séparées.C) USE OF THE CSL FOR THE DETERMINATION OF LIGANDS OF
THE CSL
The amount of CSL ligands can be determined from the proteins of tumor cells or tumors, deposited either directly at a point on a support (analogous to immunodotting or llELISA), or, after electrophoresis and electrotransfer (analogous to immunoblotting), to the previously separated tumor proteins.

1 - Techniques de cultures cellulaires
Origine des lignées cellulaires
Des lignées tumorales d'origines tissulaires et d'espèces différentes ont été étudiées. I1 s'agit
- du clone C6 dérivant d'un glioblastome de rat
induit par la nitrosurée (Benda et coll., Science
161 (1968) 370-371),
- du clone HTC dérivant de lthépatome de Morris de
rat (Thompson et coll., Proc. Natl; Acad. Sci. USA
56 (1966) 296-303),
- du clone H56 dérivant d'un hépatome de rat
(Deschatrette et Weiss, Biochimie 56 (1974) 1603
1611),
du clone NIE115 dérivant d'un neuroblastome de
souris (Lampert et al, Proc. Natl. Acad. Sci.USA
73 (1976) 3165-3167),
- du clone Al dérivant d'un hépatome de souris
(Chott et al Anticancer Drugs Vol. 191 (1989) 245
252),
- du clone MCF7 (WT 101/22/26) dérivant d'un cancer
de sein humain (Soule et coll., J. Natl. Cancer
Inst. 51 (1973) 1409-1416),
- du clone K562 dérivant d'une leucémie
érythrocytaire humaine (Lozzio et Lozzio, Blood 45
(1975) 321-334),
- du clone IGROV1 dérivant d'un cancer des ovaires
humains (Bénard et coll., Cancer Res. 45 (1985)
4970-4979),
- astrocytes de rat (Pettmann et coll., Dev.1 - Cell culture techniques
Origin of cell lines
Tumor lines of tissue origin and different species have been studied. It is
- of the clone C6 deriving from a rat glioblastoma
induced by nitrosurea (Benda et al., Science
161 (1968) 370-371),
- of the HTC clone deriving from the Morris hepatoma
rat (Thompson et al., Proc. Natl; Acad. Sci. USA
56 (1966) 296-303),
- clone H56 derived from a rat hepatoma
(Deschatrette and Weiss, Biochemistry 56 (1974) 1603
1611),
of the clone NIE115 deriving from a neuroblastoma of
mouse (Lampert et al, Proc. Natl. Acad. Sci.USA
73 (1976) 3165-3167),
- of the clone Al deriving from a mouse hepatoma
(Chott et al Anticancer Drugs Vol. 191 (1989) 245
252),
- of the clone MCF7 (WT 101/22/26) deriving from a cancer
of human breast (Soule et al., J. Natl. Cancer
Inst. 51 (1973) 1409-1416),
- from clone K562 deriving from leukemia
human erythrocyte (Lozzio and Lozzio, Blood 45
(1975) 321-334),
- from the IGROV1 clone derived from ovarian cancer
humans (Bénard et al., Cancer Res. 45 (1985)
4970-4979),
- rat astrocytes (Pettmann et al., Dev.

Neurosci. 4 (1981) 37-45),
oligodendrocytes (McCarthy et DeVellis, J. Cell
Biol. 85 (1980) 890-902).Neurosci. 4 (1981) 37-45),
oligodendrocytes (McCarthy and DeVellis, J. Cell
Biol. 85 (1980) 890-902).

Techniques de cultures cellulaires
Les cellules sont cultivées dans des boîtes en polystyrene en présence des milieux indiqués ci-après, auxquels on a ajouté les antibiotiques suivants pénicilline (100 U/ml) et streptomycine (1 mg/ml).Cell culture techniques
The cells are cultured in polystyrene dishes in the presence of the media indicated below, to which the following antibiotics penicillin (100 U / ml) and streptomycin (1 mg / ml) have been added.

- pour le clone C6 milieu de Dulbecco modifié
selon Eagle (DMEM) complétés avec 10% de sérum de
veau foetal (SVF)
- pour le clone HTC : milieu DMEM + 10% SVF
- pour le clone H56 : milieu DMEM + 5% SVF
- pour le clone Al : mélange nutrionnel F-12 HAM +
10% SVF
- pour le clone NIE11S : milieu DMEM + 10% SVF
- pour le clone IGROVI : milieu RPMI-1640 (RPMI) +
10% SVF
- pour le clone MCF7 : RPMI + 10% SVF
Toutes les cultures sont maintenues à 37"C dans une atmosphère d'air contenant 5% de CO2. Les milieux de culture sont changés deux fois par semaine.- for the clone C6 medium from Dulbecco modified
according to Eagle (DMEM) supplemented with 10% serum
fetal calf (SVF)
- for the HTC clone: DMEM medium + 10% SVF
- for clone H56: DMEM medium + 5% SVF
- for clone Al: nutritional mixture F-12 HAM +
10% SVF
- for the NIE11S clone: DMEM medium + 10% SVF
- for the IGROVI clone: RPMI-1640 medium (RPMI) +
10% SVF
- for the clone MCF7: RPMI + 10% SVF
All cultures are maintained at 37 "C in an air atmosphere containing 5% CO2. The culture media are changed twice a week.

Repiquage des cultures
Pour la plupart des cultures en phase solide, à l'exception des neuroblastomes de souris, on rince les boîtes de culture avec du milieu frais. On détache ensuite mécaniquement les cellules à l'aide d'un "policeman" et on les dissocie par plusieurs passages à travers une aiguille de 0,8 mm de diamètre et de 4 cm de longueur. La suspension cellulaire ainsi obtenue à partir d'une culture sur support solide, ainsi que celles obtenues à partir des cultures en milieu liquide, sont centrifugées (5 - 10 min x 400 g). On élimine alors le surnageant et on resuspend le culot dans un volume convenable de milieu de culture que l'on répartit dans plusieurs boîtes. Transplanting crops
For most solid phase cultures, with the exception of mouse neuroblastomas, the culture dishes are rinsed with fresh medium. The cells are then mechanically detached using a "policeman" and they are dissociated by several passages through a needle 0.8 mm in diameter and 4 cm in length. The cell suspension thus obtained from a culture on a solid support, as well as those obtained from cultures in a liquid medium, are centrifuged (5-10 min x 400 g). The supernatant is then removed and the pellet is resuspended in a suitable volume of culture medium which is distributed in several dishes.

Pour le repiquage des neuroblastomes, on procède par trypsinisation des cellules on aspire le milieu de culture, puis on met les cellules en contact avec une solution contenant 0,25% de trypsine pendant 2 à 3 min.For the subculturing of the neuroblastomas, the cells are trypsinized, the culture medium is aspirated, then the cells are brought into contact with a solution containing 0.25% of trypsin for 2 to 3 min.

On ajoute ensuite du milieu de culture frais qui neutralise l'action de la trypsine et l'on détache les cellules en agitant doucement la bote par des mouvements de rotation. Les cellules alors en suspension sont dissociées par passage à travers une seringue de 0,8 mm de diamètre. La suspension cellulaire est alors reprise dans un volume convenable de milieu et répartie dans plusieurs boîtes.Fresh culture medium is then added which neutralizes the action of trypsin and the cells are detached by gently shaking the box with rotational movements. The cells then in suspension are dissociated by passage through a 0.8 mm diameter syringe. The cell suspension is then taken up in a suitable volume of medium and distributed in several boxes.

Conservation des lignées cellulaires
Lorsqu'elles arrivent à confluence, les cultures en phase solide sont lavées avec du milieu frais, alors que les cultures en suspension sont centrifugées (5 10 min x 400 g). Les cellules sont alors mises en suspension dans du milieu frais de façon à obtenir une concentration cellulaire d'environ 5 x 106 cellules par ml en présence de 10% de sérum de veau foétal et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). La suspension cellulaire ainsi obtenue est conservée dans l'azote liquide.Storage of cell lines
When they arrive at confluence, the solid phase cultures are washed with fresh medium, while the suspension cultures are centrifuged (5 10 min x 400 g). The cells are then suspended in fresh medium so as to obtain a cell concentration of approximately 5 × 10 6 cells per ml in the presence of 10% of fetal calf serum and 10% of dimethyl sulfoxide (DMSO). The cell suspension thus obtained is stored in liquid nitrogen.

2 - Méthodes d'extraction des protéines des cultures
de cellules ou de tumeurs:
Pour les tumeurs, on ajoute au tissu du SDS 1% dans l'eau de façon à avoir une concentration de l'ordre de 2mg/ml en protéines (les protéines représentent environ 10% du poids frais d'un tissu). Pour les cultures de cellules, il est nécessaire d'effectuer deux lavages avec du PBS avant de dissoudre le matériel dans le SDS 1%.2 - Methods of extracting proteins from cultures
cells or tumors:
For tumors, 1% of SDS is added to the tissue in water so as to have a concentration of the order of 2 mg / ml of protein (proteins represent approximately 10% of the fresh weight of a tissue). For cell cultures, it is necessary to perform two washes with PBS before dissolving the material in 1% SDS.

Pour les tumeurs du sein, conservées dans l'azote liquide, le tissu est d'abord dissocié manuellement à sec, immédiatement après l'avoir retiré de l'azote liquide, dans un homogénéisateur de Potter conique en verre muni d'un piston de téflon. Le tissu dissocié est alors homogénéisé mécaniquement dans une solution de
SDS à 1% de çon à obtenir une concentration protéique finale d'environ 2 mg/ml. Les extraits protéiques ainsi obtenus sont conservés à -20 C. For breast tumors, stored in liquid nitrogen, the tissue is first dissociated manually to dryness, immediately after removing it from liquid nitrogen, in a conical glass Potter homogenizer fitted with a plunger. teflon. The dissociated tissue is then mechanically homogenized in a solution of
SDS at 1% lesson to obtain a final protein concentration of around 2 mg / ml. The protein extracts thus obtained are stored at -20 C.

La concentration protéique exacte des homogénats est déterminée selon le protocole préconisé par Lowry et coll (1951, J. Biol. Chem. 193: 265-275). Avant électrophorèse, les extraits sont dilués dans le mélange de dissociation de Laemmli (Laemmli, 1970,
Nature 227: 680-685) de façon à obtenir une concentration protéique de 1 mg/ml et chauffés pendant 5 min à 90"C. The exact protein concentration of the homogenates is determined according to the protocol recommended by Lowry et al (1951, J. Biol. Chem. 193: 265-275). Before electrophoresis, the extracts are diluted in the Laemmli dissociation mixture (Laemmli, 1970,
Nature 227: 680-685) so as to obtain a protein concentration of 1 mg / ml and heated for 5 min at 90 "C.

3) - Techniques électrophorétiques
Les électrophorèses en présence de SDS sur gel de polyacrylamide sont réalisées dans le système tampon de
Laemmli (Nature (1970), 227: 680-685). Habituellement, des gels à 13% d'acrylamide (0,75 mm d'épaisseur) sont utilisés, ils permettent une bonne résolution des protéines de bas poids moléculaires et de poids moléculaires moyens, protéines parmi lesquelles se trouvent les ligands majeurs de la CSL). Les protéines sont colorées avec du Bleu de Coomassie Brilliant R (CBB). La quantité déposée sur les gels est de 15 Ag environ pour les colorations protéiques, de 1 à 5 pg pour les révélations des ligands de la CSL.Les protéines des gels sont alors transférées sur filtres de nitrocellulose (pore de 0,22 ou 0,45 ,um de diamètre) dans le sytème de tampon développé par Towbin et coll.3) - Electrophoretic techniques
Electrophoresis in the presence of SDS on polyacrylamide gel is carried out in the buffer system of
Laemmli (Nature (1970), 227: 680-685). Usually, 13% acrylamide gels (0.75 mm thick) are used, they allow good resolution of proteins of low molecular weight and of average molecular weight, proteins among which are the major ligands of CSL ). Proteins are stained with Coomassie Brilliant R Blue (CBB). The quantity deposited on the gels is approximately 15 Ag for the protein stains, from 1 to 5 μg for the revelations of the CSL ligands. The proteins of the gels are then transferred to nitrocellulose filters (pore of 0.22 or 0, 45, um in diameter) in the buffer system developed by Towbin et al.

(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979), 76: 4350-4354) avec la différence que du SDS (0,04%) est ajouté au tampon afin de faciliter le transfert de protéines hautement hydrophobes. Les blots sont rincés plusieurs fois à l'eau distillée, puis séchés entre des feuilles de papier filtre et conservés ainsi jusqu'à leur utilisation.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979), 76: 4350-4354) with the difference that SDS (0.04%) is added to the buffer in order to facilitate the transfer of highly hydrophobic proteins. The blots are rinsed several times with distilled water, then dried between sheets of filter paper and thus stored until they are used.

4 - Dépôt des échantillons en dots
Les protéines dissoutes dans le SDS 1% à la concentration de lmg/ml sont déposées à l'aide d'une microseringue sur le filtre de nitrocellulose. On dépose des volumes de 0,1-0,25-0,5-0,75 et 1,ul de matériel et de témoins correspondants et l'on sèche sous courant d'air. La plaque est alors rincée plusieurs fois à l'eau distillée et séchée entre des feuilles de papier filtre jusqu'à leur utilisation.4 - Deposit of dowry samples
The proteins dissolved in the 1% SDS at a concentration of 1 mg / ml are deposited using a microsyringe on the nitrocellulose filter. Volumes of 0.1-0.25-0.5-0.75 and 1 μl of material and corresponding controls are deposited and dried under a stream of air. The plate is then rinsed several times with distilled water and dried between sheets of filter paper until they are used.

5 - Technique pseudo-ELISA
L'échantillon dissous dans du SDS 1% à la concentration de lmg/ml est dilué 10 fois dans du PBS. Une partie aliquote de 10,lu1 est déposée dans un puits d'une plaque
ELISA et laissée à sécher dans une étuve ventilée portée à 37"C. Le puits est alors lavé rapidement avec 5 fois 100 ,ul de PBS, puis 200 ,lLl de BSA-HIO4 sont ajoutés et laissés pendant 1h à température ordinaire.5 - Pseudo-ELISA technique
The sample dissolved in 1% SDS at a concentration of 1 mg / ml is diluted 10 times in PBS. An aliquot of 10, lu1 is deposited in a well of a plate
ELISA and left to dry in a ventilated oven brought to 37 "C. The well is then washed rapidly with 5 times 100 μl of PBS, then 200 μl of BSA-HIO4 are added and left for 1 h at ordinary temperature.

Après trois lavages rapides par du PBS et une fois par de l'eau, les plaques sont retournées et laissées à sécher. Elles peuvent être gardées à l'abri de la poussière jusqu'à leur utilisation.After three rapid washes with PBS and once with water, the plates are inverted and left to dry. They can be kept dust-free until needed.

6 - Révélation
A partir de ce matériel fixé sur le support, on détecte les glycoprotéines ligands de la lectine CSL. Cette détection peut être réalisée de différentes façons suivant la nature du procédé permettant la détection de la CSL fixée sur ses ligands. I1 peut s'agir de CSL marquée par un radio-élément (iode en particulier), le marquage étant révélé par autoradiographie ou techniques plus récentes. I1 peut s'agir de la CSL rendue fluorescente ou de la CSL marquée de façon covalente par tout autre fluorophore visualisé en lumière ultra-violette. I1 peut s'agir d'un système amplificateur comprenant, par exemple, la CSL-biotinylée, révélée par un système du type avidine-phosphatase alcaline (ou avidine couplée à tout autre moyen classique de détection). Cette dernière technique, de la CSL biotinylée associée à une révélation par l'avidine, elle-même couplée à la phosphatase alcaline, constitue un système efficace et très sensible mais qui n'exclut pas les autres méthodes de détection des protéines.6 - Revelation
From this material fixed on the support, the ligands glycoproteins of the lectin CSL are detected. This detection can be carried out in different ways depending on the nature of the method allowing the detection of the CSL fixed on its ligands. I1 can be CSL marked by a radio-element (iodine in particular), the marking being revealed by autoradiography or more recent techniques. It may be the CSL rendered fluorescent or the CSL covalently labeled by any other fluorophore viewed in ultraviolet light. It can be an amplifier system comprising, for example, biotinylated CSL, revealed by a system of the avidin-alkaline phosphatase type (or avidin coupled to any other conventional means of detection). The latter technique, biotinylated CSL associated with revelation by avidin, itself coupled with alkaline phosphatase, constitutes an efficient and very sensitive system but which does not exclude other methods of protein detection.

Protocole de révélation des ligands de la CSL par la méthode CSL-biotinylée/Avidine-phosphatase alcaline sur filtre de nitrocellulose
Les filtres de nitrocellulose sont mouillés dans du PBS puis incubés pendant 1h à température ordinaire dans de la BSA-HIO4 à 3t dans du PBS. On ajoute alors la CSL biotinylée (lng/ml) et l'on laisse réagir pendant 4h avec agitation. On lave avec du PBS pendant 2h toutes les 10 minutes. On incube pendant environ 30 min avec de la BSA-HIO4 à 3% dans du PBS puis on ajoute une solution diluée 1/1500 d'avidine-phosphatase alcaline.Protocol for revealing CSL ligands by the CSL-biotinylated / Avidin-alkaline phosphatase method on nitrocellulose filter
The nitrocellulose filters are wetted in PBS and then incubated for 1 h at ordinary temperature in 3t BSA-HIO4 in PBS. The biotinylated CSL (lng / ml) is then added and the mixture is left to react for 4 h with stirring. Wash with PBS for 2 h every 10 minutes. Incubate for about 30 min with 3% BSA-HIO4 in PBS and then add a dilute solution 1/1500 of avidin-alkaline phosphatase.

On laisse incuber pendant la nuit à 4"C sous agitation, puis on lave comme ci-dessus. On rince finalement avec du TBS pendant 5 min avant la révélation. On révèle par le réactif NBT-BCIP de la phosphatase alcaline (Leary et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 40454049). Après un rapide rinçage à l'eau distillée, les filtres de nitrocellulose sont séchés avec du papier filtre.The mixture is incubated overnight at 4 "C. with shaking, then washed as above. Finally, it is rinsed with TBS for 5 min before the development. The NBT-BCIP reagent reveals alkaline phosphatase (Leary et al. ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 40454049) After rapid rinsing with distilled water, the nitrocellulose filters are dried with filter paper.

Protocole de révélation des ligands de la CSL par la méthode CSL-biotinylée/Avidine-phosphatase alcaline en technique pseudo-ELISA
Les puits des plaques de microtitration sont mouillés dans du PBS puis incubés pendant 1h à température ordinaire dans de la BSA-HIO4 à 3% dans du PBS. On ajoute alors la CSL biotinylée (lng/ml) et l'on laisse réagir pendant 4h avec agitation. On lave avec du PBS pendant 2h toutes les 10 minutes environ. On incube pendant environ 30 min avec de la BSA-HI04 à 3% dans du
PBS puis de nouveau pendant 2h toutes les 10 minutes avec du PBS. On incube ensuite pendant 30 min avec de la BSA-HIO4 à 3% dans du PBS puis on ajoute une solution diluée 1/1500 d'avidine-phosphatase alcaline.Protocol for revealing CSL ligands by the CSL-biotinylated / Avidin-alkaline phosphatase method in pseudo-ELISA technique
The wells of the microtitration plates are wetted in PBS and then incubated for 1 h at ordinary temperature in 3% BSA-HIO4 in PBS. The biotinylated CSL (lng / ml) is then added and the mixture is left to react for 4 h with stirring. It is washed with PBS for 2 hours every 10 minutes approximately. Incubate for approximately 30 min with 3% BSA-HI04 in
PBS then again for 2 h every 10 minutes with PBS. Then incubated for 30 min with 3% BSA-HIO4 in PBS and then added a dilute solution 1/1500 of avidin-alkaline phosphatase.

On laisse incuber pendant la nuit à 4"C sous agitation, puis on lave comme ci-dessus. On rince finalement avec du TBS pendant 5 min avant la révélation. On révèle par le réactif p-nitrophényl-phosphatase de la phosphatase alcaline à 37"C. La coloration dans les puits des plaques de microtitration est mesurée à l'aide du lecteur automatique de plaques ELISA. It is incubated overnight at 4 "C. with shaking, then washed as above. Finally, it is rinsed with TBS for 5 min before the development. The alkaline phosphatase is revealed by the reagent p-nitrophenylphosphatase at 37 "VS. The staining in the wells of the microtiter plates is measured using the automatic ELISA plate reader.

7 - Détection histologique des ligands de la CSL I1 est possible de mettre en évidence les ligands de la
CSL sur des coupes histologiques de tissus tumoraux ou sur des préparations de cellules tumorales en utilisant la CSL marquée. Ce marquage de la CSL peut être réalisé avec un fluorophore convenable (FITC, TRITC, etc), soit à un composé coloré (or colloïdal par exemple), soit à l'aide d'une méthode indirecte, utilisant par exemple biotinylation suivie d'une détection de la biotine par l'avidine marquée (par la phosphatase alcaline ou la peroxydase par exemple). Etant donné que les constituants révélés par la CSL sont essentiellement de nature glycoprotéique, le traitement des préparations par des solvants organiques ne modifie en rien la réaction.De même, les ligands révélés étant de nature glucidique, ils ne sont pas modifiés par les fixateurs de nature aldéhydique généralement utilisés pour fixer cellules ou tissus. Par contre, il est très fortement déconseillé d'utiliser des traitements oxydants (periodate) ou acides, susceptibles, eux, de détruire les glycannes reconnus. On peut donc utiliser cette technique sur tous les types de coupes de tissus classiques (paraffine, cryostat, vibratome) sur tissus fixés ou non par les aldéhydes (paraformaldéhyde et glutaraldéhyde).7 - Histological detection of the CSL ligands I1 is possible to highlight the ligands of the
CSL on histological sections of tumor tissue or on tumor cell preparations using labeled CSL. This labeling of the CSL can be carried out with a suitable fluorophore (FITC, TRITC, etc.), either with a colored compound (colloidal gold for example), or using an indirect method, using for example biotinylation followed by detection of biotin by labeled avidin (by alkaline phosphatase or peroxidase for example). Since the constituents revealed by CSL are essentially glycoprotein in nature, the treatment of the preparations with organic solvents does not in any way modify the reaction. Likewise, the ligands revealed being of glucidic nature, they are not modified by the fixatives of aldehyde type generally used to fix cells or tissues. On the other hand, it is very strongly advised not to use oxidizing (periodate) or acid treatments, likely, them, to destroy recognized glycans. We can therefore use this technique on all types of conventional tissue sections (paraffin, cryostat, vibratome) on tissue fixed or not by aldehydes (paraformaldehyde and glutaraldehyde).

Protocole préconisé pour la mise en évidence des ligands de la CSL par les techniques histochimiques
Les cellules sont d'abord fixées pendant 1h à 4oC avec une solution contenant 4% de paraformaldéhyde et 0,1% de glutaraldéhyde dans du tampon PBS. Les cellules sont ensuite incubées avec une solution de CSL biotinylée à une concentration d'environ 1,ug/ml pendant 4h à température ambiante. Après 2h de lavages dans du PBS, les cellules sont incubées avec l'avidine couplée à la peeoxydase de Raifort (avidine-HRP) à la dilution de 1/100 dans du PBS pendant une nuit à 4"C. Après plusieurs lavages dans du PBS l'activité peroxydasique est révélée par la méthode à la 3,3'-diaminobenzidine (DAB) (Graham et Karnovsky, 1966 J.Histochem. Cytochem.Protocol recommended for the demonstration of CSL ligands by histochemical techniques
The cells are first fixed for 1 hour at 4 ° C. with a solution containing 4% of paraformaldehyde and 0.1% of glutaraldehyde in PBS buffer. The cells are then incubated with a biotinylated CSL solution at a concentration of approximately 1 μg / ml for 4 h at room temperature. After 2 h of washes in PBS, the cells are incubated with avidin coupled to horseradish peeoxidase (avidin-HRP) at a dilution of 1/100 in PBS overnight at 4 "C. After several washes in PBS peroxidase activity is revealed by the 3,3'-diaminobenzidine (DAB) method (Graham and Karnovsky, 1966 J. Histochem. Cytochem.

14 291-302) et les coupes sont observées à l'aide d'un microscope optique Orthoplan Leitz.14 291-302) and the sections are observed using an Orthoplan Leitz optical microscope.

Comme variante on pourra employer la CSL préalablement rendue fluorescente selon la technique classique (FITC/Célite), suivie d'une étape de gel filtration identique à celle utilisée pour purifier la CSL biotinylée. Elle possède l'avantage d'être une méthode directe donc plus rapide. Par contre elle nécessite une observation au microscope à fluorescence.As a variant, it is possible to use CSL previously made fluorescent according to the conventional technique (FITC / Celite), followed by a gel filtration step identical to that used to purify the biotinylated CSL. It has the advantage of being a direct method therefore faster. On the other hand, it requires observation under a fluorescence microscope.

D) RESULTATS CONCERNANT LA DETECTION DES LIGANDS DE LA
CSL DANS LES CELLULES OU TISSUS TUMORAUX 1- Les ligands de la CSL dans les cellules normales et
transformées origine hépatique
Hépatomes et hépatocytes de souris
Comme le montre la figure 2, il existe des variations qualitatives importantes entre les profils protéiques des cellules tumorales (Al) et les hépatocytes de souris cultivés pendant 3 jours. Mais cette différence est bien moins prononcée que celle qui existe pour les ligands de la CSL. En effet, dans les hépatocytes de souris (figure 2, ligne 1), on distingue une bande majeure de masse moléculaire relative (Mr) voisine de 100 000 et une plus faible de basse Mr 19 900 (ligne 2). D'autres ligands sont également présents mais en quantité infimes. Dans les cellules Al le nombre et la quantité de ligands sont considérablement plus élevés.D) RESULTS CONCERNING THE DETECTION OF LIGANDS FROM THE
CSL IN TUMOR CELLS OR TISSUES 1- CSL ligands in normal cells and
transformed liver origin
Mouse hepatomas and hepatocytes
As shown in FIG. 2, there are significant qualitative variations between the protein profiles of tumor cells (Al) and the hepatocytes of mice cultured for 3 days. However, this difference is much less pronounced than that which exists for CSL ligands. Indeed, in mouse hepatocytes (FIG. 2, line 1), there is a major band of relative molecular mass (Mr) close to 100,000 and a weaker band of low Mr 19,900 (line 2). Other ligands are also present but in minute quantities. In A1 cells the number and quantity of ligands are considerably higher.

Les ligands majeurs révélés ont des Mr très variées avec trois groupes majeurs : un groupe de masse Mr (inférieure à 20 000),un groupe de Mr voisine de 30 000 et un groupe de Mr supérieure à 50 000. On pourra noter que le ligand de la CSL dans les hépatocytes de souris n'est pas augmenté de façon proportionnelle dans llhépatome Al puisqu'à ce niveau de Mr, on ne retrouve que des constituants mineurs.The major ligands revealed have very varied Mr with three major groups: a group of mass Mr (less than 20,000), a group of Mr close to 30,000 and a group of Mr greater than 50,000. We can note that the ligand of the CSL in the hepatocytes of mice is not increased proportionally in the hepatoma A1 since at this level of Mr, only minor constituents are found.

Hépatomes et hépatocytes de rats
Pour les hépatocytes de rat (figure 2, lignes 3-5), le profil des ligands de la CSL est plus complexe que celui observé pour les hépatocytes de souris, puisque l'on distingue 5 constituants, de Mr respectives 100 000, 52 300, un triplet vers 33 000, 31 000 et 20 000. Hepatomas and rat hepatocytes
For rat hepatocytes (Figure 2, lines 3-5), the profile of CSL ligands is more complex than that observed for mouse hepatocytes, since there are 5 constituents, of respective Mr 100,000, 52,300 , a triplet around 33,000, 31,000 and 20,000.

Dans leux deux hépatomes examinés, la situation est notablement plus complexe. D'une part la quantité de ces ligands est considérablement augmentée, et, d'autre part, le nombre de ligands majeurs de la CSL est très élevé. Comme pour les hépatomes Al de souris, on distingue trois groupes de ligands intenses, mais on retrouve également pour HTC (figure 2, ligne 5) des bandes importantes situées entre ces zones. H56 (figure 2, ligne 4), par contre, possède un profil tout à fait voisin de celui de 1'hépatome murin Al. In two of the hepatomas examined, the situation is notably more complex. On the one hand, the quantity of these ligands is considerably increased, and, on the other hand, the number of major ligands of the CSL is very high. As for mouse A1 hepatomas, there are three groups of intense ligands, but we also find for HTC (Figure 2, line 5) large bands located between these areas. H56 (Figure 2, line 4), on the other hand, has a profile quite similar to that of the murine hepatoma Al.

2- Les ligands de la CSL dans les cellules normales et
transformées origine nerveuse
Cellules d'origine neuronale
Cellules du neuroblastome différencié ou non
Comme le montre la figure 3 (lignes 3-4), les cellules de neuroblastome NIE11S non différenciées ou différenciées par le dibutyryl-cAMP, possèdent une quantité et un nombre considérables de ligands de la
CSL. Cette situation est très différente de celle que l'on peut trouver pour des neurones. A cet égard, il est très difficile d'obtenir un bon témoin neuronal du neuroblastome NIE11S et c'est la raison pour laquelle il a été comparé à un tissu particulièrement riche en matériel neuronal, le cervelet de rat.Bien que les ligands de la CSL soient présents en grande quantité dans cet organe au 14ème jour postnatal, on constate que pratiquement 5 ligands majeurs connus pour avoir une origine neuronale sont détectés (figure 3, ligne 1). La situation dans le neuroblastome est donc considérablement modifiée par rapport aux profils observés in vivo dans le système nerveux central. On remarquera que le fait que le clone NIE11S soit différencié sous les effets du dibutyryl-cAMP, ne modifie en rien la complexité du profil des ligands de la CSL. On peut constater (figure 3, lignes 3-4) que cette différenciation s'accompagne d'une légère augmentation de la quantité des ligands de la CSL. 2- The CSL ligands in normal cells and
transformed nervous origin
Neuronal cells
Neuroblastoma cells, differentiated or not
As shown in Figure 3 (lines 3-4), neuroblastoma cells NIE11S not differentiated or differentiated by dibutyryl-cAMP, have a considerable quantity and number of ligands of the
CSL. This situation is very different from that which can be found for neurons. In this respect, it is very difficult to obtain a good neuronal witness for neuroblastoma NIE11S and this is the reason why it has been compared to a tissue particularly rich in neuronal material, the rat cerebellum. Although the ligands of the CSL are present in large quantities in this organ on the 14th postnatal day, we see that practically 5 major ligands known to have a neuronal origin are detected (Figure 3, line 1). The situation in neuroblastoma is therefore considerably modified compared to the profiles observed in vivo in the central nervous system. It will be noted that the fact that the NIE11S clone is differentiated under the effects of dibutyryl-cAMP, does not in any way modify the complexity of the profile of the CSL ligands. We can see (Figure 3, lines 3-4) that this differentiation is accompanied by a slight increase in the quantity of CSL ligands.

Localisation de la CSL et de ses ligands dans une
cellule tumorale : le neuroblastome NIE11S I1 était important, au terme de ces études montrant une augmentation considérable des ligands de la CSL dans des cellules tumorales, de savoir si ces ligands étaient présents à l'intérieur ou à la surface des cellules et si la CSL elle même était présente à la surface cellulaire. Ce type d'étude a été conduit pour ce qui concerne la CSL, sur les cellules dlhépatomes et sur les cellules ovariennes de hamster (CHO).Une démonstration directe de la présence extracellulaire des ligands de la CSL est possible en utilisant d'une part la CSL biotinylée détectée par l'avidine couplée à la peroxydase pour les ligands, et d'autre part, les anticorps anti-CSL et la technique immunocytochimique indirecte pour la CSL elle-même.Location of CSL and its ligands in a
tumor cell: the neuroblastoma NIE11S I1 was important, at the end of these studies showing a considerable increase in the ligands of the CSL in tumor cells, to know if these ligands were present inside or on the surface of the cells and if the CSL she herself was present on the cell surface. This type of study was conducted for CSL, on hepatoma cells and on hamster ovary cells (CHO). A direct demonstration of the extracellular presence of CSL ligands is possible using on the one hand biotinylated CSL detected by avidin coupled to peroxidase for ligands, and on the other hand, anti-CSL antibodies and the indirect immunocytochemical technique for CSL itself.

Cette étude a été réalisée sur le neuroblastome NIE11S qui présentait un intérêt tout particulier dans la mesure où l'on peut facilement le faire se différencier et donc étudier la CSL et ses ligands dans deux situations ou les cellules sont morphologiquement différentes (figure 5). Comme le montre la figure 6A, la CSL est présente dans les cellules de neuroblastome à la fois à l'intérieur et à l'extérieur des cellules.This study was carried out on the neuroblastoma NIE11S which presented a very particular interest insofar as one can easily make it differentiate and therefore study the CSL and its ligands in two situations where the cells are morphologically different (Figure 5). As shown in Figure 6A, CSL is present in neuroblastoma cells both inside and outside the cells.

Cette localisation est observée tant dans les cellules NIE11S non différenciées que dans celles qui l'ont été.This localization is observed both in undifferentiated NIE11S cells and in those which have been.

Dans ce dernier cas, une réactivité notable est associée à des prolongements neuritiques et en particulier aux régions ayant l'aspect des cônes de croissance. Les arguments pour affirmer cette dualité de localisation intra et extra cellulaire proviennent de l'observation du liseré entourant la cellule (traduisant le marquage de la membrane) et de l'aspect irrégulier, en granulation notamment (traduisant la présence d'antigène dans des vésicules intracellulaires, localisation assez caractéristique de la CSL (Zanetta et coll., 1987, J. Neurochem. 49: 12501257).In the latter case, notable reactivity is associated with neuritic prolongations and in particular with regions having the appearance of growth cones. The arguments to affirm this duality of intra and extra cellular localization come from the observation of the border surrounding the cell (translating the marking of the membrane) and the irregular aspect, in granulation in particular (translating the presence of antigen in vesicles intracellular, fairly characteristic localization of CSL (Zanetta et al., 1987, J. Neurochem. 49: 12501257).

Pour ce qui concerne les ligands de la CSL (figure 6,
B-D), le marquage est exclusivement de surface en microscopie optique, ce point ayart été vérifié en microscopie électronique.As regards the CSL ligands (Figure 6,
BD), the marking is exclusively surface by optical microscopy, this point has been verified by electron microscopy.

Cellules d'origine gliale
Comme le montre la figure 3 (lignes 6-8), les astrocytes, les oligodendrocytes et les cellules de
Schwann immatures possèdent respectivement un nombre limité de ligands de la CSL. Un nombre de ligands de basse Mr (une bande majeure à 21 000 pour les astrocytes et les oligodendrocytes, un triplet vers 21 000 pour les cellules de Schwann), un groupe de Mr intermédiaire entre 30 000 et 50 000 (une bande majeure à 38 000 pour les cellules de Schwann) et un groupe de haute Mr (comprenant la MAG). Par contre, pour le glioblastome C6, le profil des ligands de la CSL est extrèmement complexe et leur quantité est très élevée (figure 3, ligne 5).Glial cells
As shown in Figure 3 (lines 6-8), astrocytes, oligodendrocytes and cells from
Immature Schwanns respectively have a limited number of CSL ligands. A number of low Mr ligands (a major band at 21,000 for astrocytes and oligodendrocytes, a triplet around 21,000 for Schwann cells), a group of intermediate Mr between 30,000 and 50,000 (a major band at 38 000 for Schwann cells) and a group of high Mr (including MAG). In contrast, for glioblastoma C6, the profile of CSL ligands is extremely complex and their quantity is very high (Figure 3, line 5).

3- Les ligands de la CSL dans les autres cellules
tumorales
Nous avons étudié également des cellules tumorales d'origines diverses notamment d'origine humaine. Les résultats concernant ces cellules sont regroupés dans la figure 4. On notera dans ces cellules la quantité importante des ligands de la CSL et leur hétérogénéité. 3- CSL ligands in other cells
tumor
We have also studied tumor cells of various origins, notably of human origin. The results concerning these cells are grouped in FIG. 4. In these cells, the large quantity of CSL ligands and their heterogeneity will be noted.

On pourra constater que les résultats obtenus sur le neuroblastome NIE11S et le glioblastome C6 présentent une extrème similitude de profils, du moins pour ce qui concerne les ligands majeurs de la CSL.It will be seen that the results obtained on the neuroblastoma NIE11S and the glioblastoma C6 have an extreme similarity of profiles, at least as regards the major ligands of the CSL.

Les ligands de la CSL dans les tumeurs mammaires humaines
Pour compléter les études précédentes réalisées sur des cellules tumorales cultivées in vivo, une vingtaine de tumeurs humaines malignes du sein ont été étudiées.CSL ligands in human breast tumors
To complement the previous studies carried out on tumor cells cultured in vivo, around twenty malignant human breast tumors were studied.

I1 apparaît que la plupart d'entre elles présentent des niveaux importants de ligands de la CSL (figure 7). It appears that most of them have significant levels of CSL ligands (Figure 7).

D'après l'intensité des marquages obtenus, on peut considérer que le taux de ces ligands est plus faible que dans les autres cellules tumorales examinées.According to the intensity of the markings obtained, it can be considered that the level of these ligands is lower than in the other tumor cells examined.

Néanmoins, il est très nettement supérieur à celui que l'on peut obtenir à partir d'un tissu adulte sain (foie, cerveau par exemple). Selon les tumeurs, il existe des variations qualitatives notables des profils. Ces différences ne sont pas en relation avec ce que les cancérologues définissent comme le "grade" de la tumeur.However, it is much higher than that which can be obtained from healthy adult tissue (liver, brain for example). Depending on the tumors, there are notable qualitative variations in the profiles. These differences are not related to what cancerologists define as the "grade" of the tumor.

E) TECHNIQUE DE CLONAGE DE LA CSL
La technique de clonage de la CSL a consisté en un criblage par divers anticorps anti-CSL des produits exprimés par les clones d'une banque cDNA dans ZAP2.E) CLONING TECHNIQUE OF THE CSL
The CSL cloning technique consisted of screening by various anti-CSL antibodies for the products expressed by the clones of a cDNA library in ZAP2.

Cette banque de cDNA a été fabriquée à partir de mRNA de cervelet de rat de 14 jours. Les anticorps anti-CSL utilisés pour le criblage de la banque sont
- un anticorps polyclonal dirigé contre la CSL
totale (mélange des sous-unités sous-unités 45,33
et 31,5 kDa)
- un anticorps contre la sous-unité 45 kDa purifiée
- un anticorps entre la sous-unité 33 kDa purifiée
- un anticorps contre la sous-unité 31,5 kDa
purifiée
- un anticorps monoclonal anti-CSL
- une préparation d'immunoglobuline de patient
atteint de sclérose en plaques.This cDNA library was made from 14-day rat cerebellum mRNA. The anti-CSL antibodies used for screening the library are
- a polyclonal antibody directed against CSL
total (mixture of sub-units sub-units 45.33
and 31.5 kDa)
- an antibody against the purified 45 kDa subunit
- an antibody between the purified 33 kDa subunit
- an antibody against the 31.5 kDa subunit
purified
- an anti-CSL monoclonal antibody
- a patient immunoglobulin preparation
suffering from multiple sclerosis.

Les anticorps sont préparés selon les techniques classiques, par immunisation d'un animal avec la CSL ou avec une sous-unité de la CSL décrite plus haut. Les anticorps polyclonaux peuvent être récupérés à partir du sérum de l'animal immunisé. Pour produire les anticorps monoclonaux, des cellules spléniques de l'animal immunisé avec la CSL ou une sous-unité sont fusionnées avec des cellules de myélome pour former des hybridomes. Ces hybridomes sont clonés et sélectionnés pour leur capacité à reconnaître spécifiquement la CSL ou au moins l'une de ses sous-unités.Antibodies are prepared according to conventional techniques, by immunizing an animal with CSL or with a CSL subunit described above. Polyclonal antibodies can be recovered from the serum of the immunized animal. To produce the monoclonal antibodies, spleen cells from the animal immunized with CSL or a subunit are fused with myeloma cells to form hybridomas. These hybridomas are cloned and selected for their ability to specifically recognize CSL or at least one of its subunits.

Ces anticorps utilisés pour le criblage de la banque permettent de sélectionner les séquences spécifiques de la CSL. These antibodies used for screening the library make it possible to select the specific sequences of the CSL.

Claims

1. Use for the in vitro determination of the presence of malignant cells in a given biological sample, of endogenous lectins intervening in the phenomena of intercellular adhesion and / or recognition having a specific affinity independent of calcium, for a site involving mannose residues in level of glycan ligands, this lectin having an immunological and / or structural relationship with the CSL, or fragments of these lectins, since these fragments retain the affinity of the original lectin, with respect to the glycan ligands.

2. Use of an endogenous lectin according to claim 1, characterized in that this lectin is CSL in purified and active form or in that they are fragments of CSL or of modified CSL as soon as the functional relationship with the CSL as regards the independent affinity of calcium with respect to glycan ligands is preserved.

3. Use of an endogenous lectin according to claim 1, characterized in that this lectin is R1, or a fragment of R1 or R1 modified as soon as the functional relationship with R1 with regard to the independent affinity of calcium with respect to glycan ligand screw is retained.

4. Use of a lectin or a lectin fragment according to any one of claims 1 to 3, characterized in that this lectin or this lectin fragment is labeled for example with a radioactive isotope, a fluorescent label or a amplification marker.

5. Kit for the in vitro determination, in a given biological sample, of the presence of malignant cells, characterized in that it comprises an endogenous lectin involved in adhesion and / or intercellular recognition reactions having an affinity independent of calcium for a site involving mannose residues at the level of glycan ligands, this lectin having an immunological and / or structural relationship with the CSL, or fragments of these lectins, since these fragments retain the affinity of the original lectin, with respect to glycan ligands, possibly marked.

6. Kit according to claim 1, characterized in that the lectin is CSL in purified and active form.

7. Kit according to claim 1, characterized in that the lectin is the membrane lectin R1 in purified and active form.

8. Kit according to any one of claims 5 to 7, characterized in that the biological sample capable of containing tumor cells, consists of a tissue extract, isolated cells, a histological section of tissue or a cell line.

9. Kit according to any one of claims 5 to 8, characterized in that the lectin is marked with a radioactive marker, for example iodine.

10. Kit according to any one of claims 5 to 8, characterized in that the lectin is marked with a fluorescent marker, for example the fluorophore.

11. Kit according to any one of claims 5 to 8, characterized in that the lectin is marked by an amplification system, for example biotin.

12. Method for the in vitro determination in a given biological sample, of the presence of malignant cells, characterized in that it comprises the following steps

- putting the tested biological sample intact, with a determined quantity of endogenous lectins involved in the phenomena of intercellular adhesion and / or recognition, having an affinity independent of calcium for a site involving mannose residues at the level of glycan ligands , this lectin having an immunological and / or structural relationship with the CSL, or fragments of these lectins, since these fragments retain the affinity of the original lectin, with respect to glycan ligands, this lectin also being labeled, under conditions allowing the reaction of said labeled lectin with glycan ligands ;;

- elimination of the lectin which has not reacted with the ligands;

- revelation of the presence of lectin-ligand type complexes, characteristic of cellular malignancy;

- determination of the quantity of glycan ligands which have reacted.

13. Method according to claim 12, characterized in that the endogenous lectin is the purified, active CSL.

14. Method according to claim 12, characterized in that the endogenous lectin is R1.

15. Method according to any one of claims 12 to 14, characterized in that the biological sample tested consists of tumor cells, a tumor extract, if necessary prepared in the form of a histological section.

16. Method according to claim 15, characterized in that the tumor cells or the tumor extract are dissolved.

17. Method according to any one of claims 12 to 15, characterized in that the biological sample tested is previously fractionated by electrophoresis and transferred by electrotransfer.

18. Method according to claim 17, characterized in that the biological sample is treated in order to dissolve the proteins.

19. Method according to any one of claims 15 or 16, characterized in that the sample containing the dissolved proteins is deposited on a filter, for example a nitrocellulose filter.

20. Method according to any one of claims 15 or 16, characterized in that the sample containing the dissolved proteins is deposited on an ELISA type plate.

21. Method according to any one of claims 12 to 20, characterized in that the lectins are labeled with a radioisotope, for example iodine.

22. Method according to any one of claims 12 to 20, characterized in that the lectins are marked with a fluorescent marker, for example the fluorophore.

23. Method according to any one of claims 12 to 20, characterized in that the lectins are marked with an amplification marker such as biotin.